Summary
Этот протокол описывает использование микромасштабных кремниевых кантилеверов, гибких культуры поверхностей для измерения сократимость мышечных клеток в пробирке. Сотовый сокращение вызывает изгиба кантилевера, которое может быть измерено, записанного, и превращается в считываниями силы, обеспечивая неинвазивный и масштабируемую систему для измерения сократительной функции в пробирке.
Abstract
Развитие более интеллектуального и биологически соответствующих в пробирке анализов основывается на продвижении универсальных системах клеточных культур, которые облегчают функциональную оценку посеянных клеток. С этой целью, микромасштабная технологии консольные предлагает платформу, с которой для измерения функциональность сократительную диапазоне типов клеток, в том числе скелетных, сердечных, и гладкомышечных клеток, путем оценки сокращения, вызванного субстратом изгиба. Применение мультиплексированных массивов консольных предоставляет средства для разработки протоколов умеренной до высокой пропускной оценки эффективности лекарственного средства и токсичности, фенотип болезни и прогрессирования, а также нервно-мышечных и других межклеточных взаимодействий. Эта рукопись предоставляет детали для изготовления надежных массивов консольные для этой цели, и методы, необходимые для успешного культивирования клетки на этих поверхностях. Далее краткое описание приведено на ряд шагов, необходимых для выполнения приллиз типов сократительная клеток поддерживается на таких массивах, используя лазер нового и системы фото-детектора. Представительные данные, предоставленные моменты точность и воспроизводимость характер анализа функции возможного сократительной используя эту систему, а также широкий спектр исследований, в которой такая технология может быть применена. Успешное широкое внедрение этой системы может предоставить следователи с помощью выполнять быстрые, низкая стоимость функциональные исследования в пробирке, что приводит к более точными предсказаниями производительности тканей, развития заболевания и ответ на нового терапевтического лечения.
Protocol
1 Консольные Чип Изготовление
Иллюстрированные сведения описанных шагов изготовления предоставляются на рисунке 1.
- Поместите кремний-на-изоляторе (SOI) пластин в духовку и выпекать при 125 ° С в течение 20 мин для обезвоживания их.
- Депозит толстый слой оксида кремния 1,5 мкм на ручки слоем обезвоженного SOI пластины с использованием усиленного плазмой отложение химического пара (PECVD) инструмент.
- Поместите пластину на спин нанесения покрытий патрона с уровня устройств вверх. Обеспечить пластина по центру, обойтись 2 мл P20 грунтовки по центру пластины, и спина в 3000 оборотах в минуту в течение 60 сек при ускорении 1000 об / сек. P20 праймер способствует адгезии фоторезиста на слое устройства.
- В то время как пластина по-прежнему на спин нанесения покрытий патрона, обойтись 2 мл S1818 фоторезиста по центру пластины, и спина в 3000 оборотах в минуту в течение 60 с с ускорением 1000 об / сек до выводаbtain толстый слой фоторезиста 1,5 мкм.
- Поместите пластину на горячей плите и выполнить мягкую запекать при 115 ° С в течение 1 мин.
- Выполните жесткий контакт воздействие УФ лучей, используя фотолитографии контактную маски выпрямитель для того, чтобы передать картину от консольной маски для фоторезиста на уровне устройств. Рассчитайте время экспозиции на основе энергетической ценности экспозиции 125 мДж / см 2 для S1818 фоторезиста.
- Разработка фоторезиста путем погружения пластины в 726 MIF фоторезиста разработчика в течение 1 мин при осторожном встряхивании пластины назад и вперед.
- Промыть пластины деионизированной (ДИ) водой и высушите его, предпочтительно с помощью инструмента спин полоскания сушилка (SRD).
- Удалить фоторезиста от края пластины (до 5 мм от края) с помощью ватного тампона, смоченного в ацетоне.
- Загрузите пластины в Deep Reactive Ion Etch (DRIE) инструмента, с фоторезиста стороной вверх, и запустить рецепт для травления узорной кремниевый слой через девисе слой. Скрытой оксидной слой функционирует как травление, так что выполнить травление с 50% до 100% более циклов, чем ожидается, будет необходимо обеспечить полное травления.
- Поместите пластину в горячем растворе фоторезиста бане в течение 20 мин, чтобы лишить фоторезиста. Перенести пластины к быстрому-самосвала ополаскивателем (QDR) для полоскания пластины с дистиллированной водой. После фоторезиста полосу, загрузите пластины в инструменте SRD полоскать и сушить пластины. Осмотрите пластину под микроскопом, чтобы обеспечить появляется картина консольные, как ожидалось.
- Депозит толстый слой не-легированного оксида кремния 1 мкм на уровне устройств пластины с помощью инструмента PECVD. Этот оксидный слой действует как защитный слой для консолей в ходе дальнейших стадий обработки.
- Поместите пластины на спине нанесения покрытий патрона с ручкой слоя, обращенной вверх, чтобы начать обработку задней стороне пластины. Убедитесь, пластина по центру, обойтись 2 мл P20 грунтовки по центру пластины, и спина в 3000 оборотов в минутув течение 60 с с ускорением 1000 об / сек.
- В то время как пластина по-прежнему на спин нанесения покрытий патрона, обойтись 2 мл SPR220-4.5 фоторезиста на центр пластины, и спина в 2000 оборотах в минуту в течение 45 сек при ускорении 1000 оборотов в минуту / с, чтобы получить толстый слой 6,5 мкм фоторезиста.
- Поместите пластину на близости горячей плите выполнять программный запекать при 115 ° С в течение 2 мин.
- Использование фотолитографии контактную выпрямитель способен передней / задней выравнивания, выравнивания окна задней маску к парадной картины сторона кантилевера и выполнения аппаратного контактную воздействие УФ лучей для передачи образец от маски окна задней фоторезисту на ручке слоя. Используйте время экспозиции рассчитывается на основе энергетической ценности экспозиции 480 мДж / см 2 для SPR220-4.5 фоторезиста.
- После УФ-облучения, пусть вафли остаются в темноте в течение 30 мин до начала следующего этапа обработки.
- Разработка фоторезиста путем погружения пластины в726 MIF фоторезиста разработчиком в течение 2 мин при осторожном встряхивании пластины назад и вперед.
- Промыть пластины деионизированной (ДИ) водой и высушите его, предпочтительно с помощью инструмента спин полоскания сушилка (SRD).
- Поместите пластины в сушильном шкафу при 90 ° С в течение 12 часов.
- Протравите оксида кремния слой на обратной стороне подложки с использованием системы с RIE фторсодержащих газов и рецепт для травления оксида. Оксид рисунком на задней стороне пластины действует в качестве маски травления для дальнейшей обработки. Проверьте пластины под микроскопом, чтобы гарантировать, что оксид кремния в открытой окна полностью травлению.
- Удалить фоторезиста на краю пластины (до 5 мм от края), используя чистую номера тампоном, смоченным в ацетоне.
- Загрузите пластины в DRIE инструмента с и запустить рецепт для травления узорной ручкой слой на глубину 500 мкм с погребенной функционирования оксидного слоя в качестве травление. Сплит этот травления на несколько трасс для предотвращения чрезмерного нагревавафельные, который вызывает противоречивую травление кремния. Этот шаг травление полностью удаляет кремний зоне под консолями.
- Выполните влажную шаг травления с использованием 25% разбавленный ВЧ травителя, чтобы лишить похоронили оксидного слоя ниже консолей и защитный слой оксида на вершине консолей.
Примечание: Этот шаг освобождает нижней поверхности кремниевых кантилеверов, а также открывает окно внизу, чтобы обеспечить доступ для зондирования кантилевера с лазером. - Промыть пластины, используя серию DI водяные бани и тщательно просушите азотом. Поскольку консоли поддерживаются только на своих базах, не используйте силовые брызги дистиллированной водой или инертным газом непосредственно на консолях.
- Клив отдельные чипы от пластины вдоль скола линии, возникающие во время стадии ручка слой травления.
2 Культура клеток
- Подготовьте 13F покровные согласно ранее опубликованным методов 17.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если 13F бухтаrslips не доступны, любой гидрофобная поверхность с краевым углом выше 95 ° может быть использован. - Стерилизовать консольные фишки и 13F покровные в 70% растворе этанола и дайте высохнуть на воздухе в капюшоне потока.
- Место отдельных чипов консольные на верхней части 13F покровные внутри стандартного 12-луночного планшета.
- Покрывают консоли с биополимера или модификации поверхности, оптимизированной для типа клеток используется в соответствии со стандартными протоколами клеточных культур.
- Повторное приостановить клеток в их конкретной среде роста до желаемой концентрации.
Примечание: Этот протокол может привести к значительному числу падающих клеток через окно кантилевера, а не прилипших к желаемой поверхности кантилевера. Поэтому Клеточные препараты должны быть сделаны 3-4x более концентрированный, чем для стандартных препаратов покровное. Например, посев скелетной мышце крысы сателлитных клеток, как правило, проводят с использованием плотности посева от 500 до 700 клеток / мм квадрат 15,16, И могут быть использованы с консольными подложки при 2000 клеток / кв мм. Оптимизация эксперименты следует проводить с новыми источниками клеток, чтобы установить соответствующую плотности посева. - Внесите 200 мкл клеточной суспензии на поверхность кантилевера чипа, обеспечивая пузырь среды охватывает консольные окна полностью. Если среда фитили через окно и не образует статическое пузырь в верхней части консолей заменить покровное 13F и повторить попытку в покрытие.
- Передача пластину, содержащую фишки в инкубаторе и позволяют клетки придерживаться в течение по крайней мере 1 ч (предпочтительно 2-3 ч).
- После этого периода покрытия, используют стерильные щипцы для передачи чип на чистую скважины, без покровного 13F и долить культуру с 1 мл ростовой среды.
- Вернуться пластину в инкубатор.
- Поддерживать клетки в зависимости от их стандартного протокола для поддержания в пробирке на покровные. Для клетки скелетных мышц,выключатель состава среды, чтобы вызвать myotube образование сразу клетки сливаться будет необходимо.
3 Настройка оборудования и программного обеспечения для анализа отклонений кантилевера
- Поставьте подогревом культуры блюдо в стадию вертикальном электрофизиологии микроскопом.
- Добавить 3 мл среды, питающих клеток, суспендированных в настоящее время (+ 10 мМ HEPES) к нагретой столике микроскопа.
- Установите электроды из нержавеющей стали на внутренней нагретой блюдо культуры на расстоянии не 15 мм и соединить их с генератором импульсов, способных производить поле стимуляции импульсы разной интенсивности, частоты и формы сигнала, чтобы позволить системе выдавать поля стимуляции клеток, когда это необходимо.
- Болт лазер гелий-неоновый, установленный на этапах поступательных XY, к нижней части таблицы микроскопа и регулировать его таким образом, что лазерный луч направляется через основание нагретой чашки для культивирования при 30 ° угла Relativ вэлектронной плоскости кантилевера.
- Болт квадранта модуль фото-детектора, установленный на этапах трансляционных XY, к нижней столик микроскопа и отрегулировать положение так, что отраженные земли лазерный луч в центре 4 квадрантов. Рисунок 2 представлен обзор аппаратных средств, созданной необходимы для осуществления, описанный протокол.
- Написать программу для управления линейные приводы, которые сканируют через консолей. Напишите программу со ссылкой на блок-схеме, представленной на рисунке 3. Графический интерфейс запрограммирован для использования с этой системы обеспечивается на рисунке 4.
4 Запись кантилевера данных
- Включите аппаратного анализа консольные и соответствующего программного обеспечения.
- Вставьте подогревом этап термистор в среде и ждать его, чтобы прочитать 37 ° C.
- Вставьте чип консольную в сцене с cantileveRS ориентированные на правой стороне сцены.
- Включение источника света микроскопа.
- Фокус микроскоп, чтобы принести края консолей в поле зрения и использовать программное обеспечение управления лазерной / фото-детектор позиционировать лазерный луч на кончике кантилевера 1 ПРИМЕЧАНИЕ: Если предположить, что консолей ориентированы справа от сцены, консольного 1 является один расположен в левой верхней части массива и числа бегут к 16 в левом нижнем углу. Консольные 17 находится в верхнем правом положении и работает до 32 в правом нижнем углу (рисунок 5А).
- Нажмите "играть" на программное обеспечение для записи.
- Поместите фотодетектора таким образом, что сигнал считывает "0" в обоих х и у кадров, регулируя шаговых двигателей, контролирующие фотодетектора.
- Установите консольные 1 позиция в программном обеспечении управления лазерной / фото-детектор (Рисунок 4).
- Перемещение лазер на кончике кантилевера 16, повторите шаг 4,7., И установить cantilevэ 16 позиция в программном обеспечении управления лазерной / фото-детектора.
- Перемещение лазер на кончике кантилевера 32, повторите шаг 4,7., И установить консольные 32 позицию в программном обеспечении управления лазерной / фото-детектора.
- Перемещение лазер на кончике кантилевера 17, повторите шаг 4,7., И установить консольные 17 позицию в программном обеспечении управления лазерной / фото-детектора.
- Выключите источник микроскоп света и верхний свет в лаборатории.
- Нажмите "запись" на программное обеспечение для записи.
- Установите генератор импульсов оборудования до 40 мс, 5 V импульсов с частотой 1 Гц, и включите устройство.
ПРИМЕЧАНИЕ: При желании, использовать оптимизированные протоколы стимуляции для конкретных источников клеток в этой точке, указанные параметры руководящие принципы, основанные на собранных данных, используя человека и грызунов клетки источники 12,13,15,16. - С помощью программного обеспечения управления лазерной / фото-детектор, установить оборудование для сканирования через массив 32 кантилевера, останавливаясь в течение 5 сек на каждый наэ.
- Когда сканирование из 32 консолей завершена, выключите стимулятор, затем остановите программное обеспечение для записи и воспитывать файл данных.
- Изучите графической кривой от каждой консоли для доказательства сократительной активности. Запишите каждого кантилевера с положительных ответов. Сжатие определяется как пика, если отклонение составляет по меньшей мере 0,1 В выше базовой линии.
- Удалите все не отвечающих консолей из протокола сканирования на программное обеспечение управления лазерной / фото-детектора.
- Активные консоли могут быть повторно сканировать без стимуляции, чтобы получить чтение спонтанной сократительной активности клетки.
- Запустите сканирование с или без широкого поля электрической стимуляции, после добавления терапевтического соединения в среду для того, чтобы наблюдать его влияние на функциональное выходе культивируемых клеток.
- Провести усталость оценки электрически стимулируя клетки в течение длительных периодов и уровней сканирования центральным замком actility измерить, сколько времени потребуется для достижения максимальной силы, чтобы опуститься ниже определенного порога.
- В экспериментах, где двигательные нейроны, поддерживаемых в совместной культуре с мышцей, измерения образование нервно-мышечном соединении через лечения мотонейронов-myotube консольных совместных культурах нейронов с стимулятор (например, глутамат) или ингибитор синаптическую (например, D-тубокурарин) и сканирование по увеличение и уменьшение спонтанной активности соответственно 16.
- Выполните конкретные сканирования как продиктованные потребностями запланированных экспериментов.
5 Анализ отклонений кантилевера данных
- Использование модифицированных уравнений Стони 15 (подробно изложено ниже) для преобразования необработанных данных кантилевера (в вольтах) в считывании напряжения в слое клеток или myotube (в Па), и прямого измерения сотовой силы сокращения (в нано-ньютонов):
объявление / 51866 / 51866eq1.jpg "/> Уравнение 1
Уравнение 2 - Где δ = кантилевера наконечник и стресс производится по myotube, σ с = стресс производится по myotube, в предположении равномерного Толстопленочный всю ширину кантилевера, C детектора = коэффициент система конкретных относящиеся напряжение лазерного позиции на фотографию -detector, θ = угол лазерного и детектора по отношению к плоскости кантилевера, Е Si = модуль упругости кремния, т Si = толщин кантилевера, П = толщина myotube, V = Si соотношение по poison кремния, L = длина консольные, длина P = путь лазера от консольной кончика до детектора, и ш
- Если предположить, что myotube является однородная пленка, сила в myotube равна силе в фильме, что приводит к уравнению 3, приравнивая расчет силы от стресса и область предполагается кросс клеток сечения, который был использован для нанесения Стони Уравнение.
Уравнение 3 - После сбора функциональной данных, исправить консольные чипы для иммуноцитохимического анализа или использовать клетки для белка или ДНК-анализа с использованием стандартных методов.
- При желании, вернуть клетки в инкубатор, а не готовится к молекулярного анализа для того, чтобы переоценить эксплуатационные качества на более поздний временной точке.
Уравнение 2 Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Успешная культура сократительных клеток на консолях является относительно простой процедурой, с использованием стандартных методов культивирования клеток (рисунок 5). Процент консолей, поддерживающих договаривающиеся клетки будут варьироваться в зависимости от типа клеток рассматривается и конкретные методы культура используется. Использование первичных эмбриональных клеток крысы, полученных из задних конечностей, сократительной активности был обнаружен на 12% обследованных консолей (N = 4). Анализ сократительной функции с помощью лазера, и фотодетектор систему, описанную обеспечивает получение точных данных в режиме реального времени, относящихся к функциональной зрелости посеянных клеток. Использование стандартного электрофизиологических программного обеспечения, то можно использовать для анализа исходных данных, облегчая расчет соответствующих функциональных свойств, таких как пик силы, время пиковой силы, и время достижения половины релаксации, как показано на рисунке 7. Коллекцию последующих данных от культурах, обработанных с терапевтических соединений позволяетСравнение функциональных свойств и без лекарственной того, что позволяет оценить активность соединения и последующего предсказания реакции в естественных условиях. Кроме того, расширенные протоколы стимуляции предоставить средства для оценки степени усталости в культивируемых клетках, тем самым расширяя уровень физиологических данных, получаемых из этой системы (рисунок 8).
Консольные культура может быть модифицирован, чтобы включать в себя двигательные нейроны в системе культуры с скелетных мышц мышечные трубки 16, таким образом, чтобы обеспечить оценку нервно-мышечной формирования синапсов в пробирке (фигура 9). В таких культур, уровень спонтанного сократительной активности по сравнению с темпами сжатие в ответ на лечение с нейрона конкретных стимулятора, например, глутамат. Любые наблюдаемые глутамата индуцируется рост уровня сжатия предложить активацию культивируемых нейронов, что приводит к высвобождения ацетилхолина и последующего миоАктивация трубки. Лечение синаптических ингибиторов, таких как ацетилхолин блокатор рецепторов D-тубокурарина, ведущих к прекращению глутамата индуцируется деятельности являются еще одним свидетельством на наличие функциональных нервно-мышечных синапсов в этих культур 16.
Рис.1 Принципиальная процесс изготовления подробно консольные поток. Цифры, указанные на схеме соотносятся с шагов протокола в разделе Методы названием "изготовление чип Консольные." Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2 ОборудованиеДетали системы лазерной / фото-детектора, используемого для оценки клеточного сокращение на консолях. () Фотография модифицированной электрофизиологических микроскопом, используемой для оценки консольной. Лазер (я) и фото-детектор (II) установлены под сцену на этапах трансляционных XY. Прозрачной чашки для культивирования смонтирован на стадии (III), что позволяет лазерный переход к консольной матрицей через нижней части сцены. (Б) Схематическое "сверху-вниз" в перспективе на столике микроскопа. XY трансляционные этапы позволяют движение лазера и фото-детектора в Х и Y плоскостях (красные стрелки), облегчения перемещения лазера допросить каждого кантилевера в массиве. Консольные чипы (III) должна быть помещена в стадии с консолей, которые направлены в правой части сцены для того, чтобы система правильной работы. (С) Закрыть фотографию лазера (I) ифото-детектор (II) установлен под столик микроскопа. Лазер расположен на 30 ° по отношению к плоскости чипа консольные (θ). (D) Закрыть фотографию чашки для культивирования. Широкое поле электростимуляция применяется с помощью пары электродов расположены серебра 15 мм друг от друга (IV). Нагревательный элемент (V), прикрепленный к нижней стороне тарелки используется для поддержания культуру при 37 ° С в течение анализа. Контроль температуры является динамическим, и регулируется с помощью термистора, помещенного в среду (не показано). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3 Блок-схема логики, лежащая в основе программного обеспечения к контролю. сканирование лазерного и фото-детектор два программных петли Motion Control: основной цикл для ввода данных пользователем и петлей, которая контролирует движение сканирования. Настройка осуществляется в то время как в основном цикле, с последующей активацией второго цикла для средних и сбора данных с высокой пропускной способностью. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4 Графический интерфейс пользователя программного обеспечения, используемого для контроля лазерных и фото-детектора позиции при оценке консольной. (A) Кнопки ручного управления лазерные и фото-детектора позиции в Х и Y плоскостях. (B) управления для ручной настройки положения угловых консолей 4 (1, 16, 17, и 32), что позволяет программное обеспечение дляэкстраполировать позиции остальных консолей в массиве. (C) Управление позволяя пользователям выбрать консолей включить в каждый сканирования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5. Изображения пользовательского построен чип консольной для использования в этой системе, и представительные изображения клеток поддерживается на подобных поверхностях. () Фотография одного, построения своей консольной чипа. Каждый чип содержит 32 консолей, расположенных в 2 ряда 16 кантилевера 1 расположен в нижней левой части изображения и консоли 32 в правом верхнем углу. Консольные чипы 15 х 15 мм 2. (B) фазового контраста изображения первичных крысиных клетках скелетных мышц вырос на консолис. Каждый кантилевер 750 мкм длиной, шириной 100 мкм и 4 мкм. (С) Иммуноцитохимическая пятно первичного myotube крыс держали на консоли. Клетки окрашивали с помощью зонда антитела для тяжелой цепи миозина. Обратите внимание, поперечно-полосатой внешний вид культивируемых волокна, что указывает на созревание сократительной техники. Консольные края были искусственно выделены этого изображения, чтобы обеспечить индикацию масштаба. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 6 Схема, иллюстрирующая термины, используемые в уравнениях Стони для получения силы, создаваемой мышечные трубки на консолях. Δ = кантилевера наконечник и стресс производится по myotube, CДетектор = коэффициент от системы, относящиеся к лазерному напряжение положении на фотодетектора, θ = угол лазерного и детектора по отношению к плоскости кантилевера, Е Si = модуль упругости кремния, т Si = толщин консольные, П = толщина myotube, V Si = отношение poison в кремния, длина L = консольные, и длина P = путь лазера от консольной кончика до детектора. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Фигура 7. Представитель исходные данные и анализ формы сократительной с использованием системы консольную описанный. (А) Пример исходного следа данных от широкого поля электрической стимуляции первичных мышечных трубок крысы на консолях. Лучшие следов = лазерного отклонения (в вольтах) на оси х, что указывает на длине нагрузки на консоли. Ближний следов = лазерного отклонения (в вольтах) на оси ординат, что указывает на деформации кручения через кантилевера. Нижний след = Индикация временной позицией электрических импульсов, используемых, чтобы вызвать сокращение myotube в этой системе. (B), используя стандартное программное обеспечение электрофизиологии, можно измерить пиковое усилие (PF), время Пиковое усилие (ТТП) и времени до половины релаксации (1/2 RT) из собранного сырца данных. (C) С подборкой данных сжатие (п = 11) от первичного скелетной мышце крысы мышечные трубки. Применение уравнения модифицированной Стони позволяет рассчитать консольной стресса от показаний необработанных данных в вольт. Исходя из этих данных, непосредственное вычисление силы (в ньютонах) также могут быть получены. Опубликованные данные перепечатанные жIth разрешение 13. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рис.8 Представительства данные, демонстрирующие анализ скелетных мышечной усталости в консольных культур. Сырые данные (в вольт) был преобразован в измерении myotube силу (в нано-ньютонов) и вновь построенной. Данные иллюстрирует величину myotube сокращений на консолях в ответ на 1 Гц широкого поля электрических импульсов после 0 мин (черный след) и 120 мин (серый трассировки) непрерывного стимуляции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 9. Представитель следы от анализа скелетных мышц-мотонейрона сокультуре обслуживаемой консолей, демонстрируя функциональные последствия мотонейроного стимуляции с и без добавления нервно-мышечного блокатора. Сырые данные (в вольт) был преобразован в измерении myotube Усилие (в нано-Н) и повторно нанесены. (А) Измерение спонтанных сокращений по культивируемых мышечных трубок без стимуляции нейронов. (б) Измерение сжатия myotube следующие стимуляции нейронов путем добавления 200 мкМ глютамата. (С) Измерение myotube сокращение следующие глутамата и 12,5 мкМ лечения D-тубокурарин. Опубликованные данные Печатается с разрешения 16. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
В следующих таблицах конкретные реагенты, используемые для культивирования клеток в экспериментах проверки описанных, а также оборудование, необходимые для выполнения оценки консольный. Пожалуйста, обратите внимание, что культура используемые реагенты не надо и эта система должна быть легко интегрирована с культурой протоколов любой лаборатории, поддерживая сократительные клетки в пробирке. Перечисленные реагенты, представленные должны следователи хочу повторить конкретные экспериментальные результаты, описанные.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Критические шаги в анализе микромасштабной консолей для доказательства сотовой сокращения являются размещение чипа консольной в столике микроскопа, и последующее выравнивание лазера и фотодетектора с наконечником из угловых консолей в массиве. Если это не будет сделано точно, то программное обеспечение не сможет экстраполировать позиции остальных консолей в массиве, что потенциально ведет к накоплению ложных негативов во время сбора данных. Операторы должны позаботиться о том, что чип консольные лежит на одном уровне с нижней части чашки для культивирования до калибровки лазерных позиции. Если чип находится под углом в чашке, он будет изменить путь отклоненного луча лазера и смешивать сбора данных.
Функциональная воздух-таблица должна быть использована, чтобы отменить фоновые вибрации во время сбора данных. Малая толщина (примерно 4 мкм) из консолей используемые в этом исследовании прovides высокая чувствительность к сократительной активности, но имеет побочный эффект повышенной чувствительности к вибрациям. Операторы должны позаботиться, чтобы передвигаться по аппаратным как можно меньше во время записи данных, чтобы уменьшить показания фона. Наконец, при размещении чип консольную в сцене, следить за тем, чип не вступают в контакт с стимулирующих серебряными электродами в культуре хорошо. Применение широкого поля стимуляции с электродом касаясь чип будет изменять текущий путь и негативно сказаться на способности системы эффективно стимулировать культивируемые клетки.
Для того, чтобы получить более точные показания выход силы в скелетных мышечных трубок мышечных, настоятельно рекомендуется выполнять иммуноокрашивание культивируемых клеток одновременно функциональное завершения анализа. Уравнения перечисленные требуют ввод области myotube в поперечном сечении (CSA) для расчета силы. В то время как предполагается, значение может быть использовано на основе рrevious данных, измерение точным CSA myotube в с помощью конфокальной методы визуализации обеспечит более точную оценку силе, действующей организацией-заказчиком myotube. Относительно необработанные данные сжатия к физических характеристик ячейки в вопросе ценно в результатах нормализации по нескольким консолей и между экспериментальных условиях 15, и, следовательно, важно для генерации точные прогнозы ответов цельной ткани в лекарственной терапии или заболевания. Уравнения Стони предположим, что мышечные трубки исследованные охватывают всю длину кантилевера так усилия должны быть сделаны, чтобы включать только данные, полученные из клеток, которые отвечают этим предположением. Если это невозможно, анализ методом конечных элементов могут быть использованы, чтобы обеспечить точное измерение силы мышечных трубок из более мелких, как описано ранее 15. Это аналитический метод является гораздо более трудоемким, и поэтому плохо подходит для более высоких пропускной, но может быть необходимо, если оптимизированаклеточные культуры, соответствующие предположения Стони не могут быть получены.
Как уже говорилось, параметры культуры могут быть переданы от стандартных препаратов покровное. Тем не менее, рекомендуется рассмотреть вопрос об использовании сыворотки среде композиции и небиологических субстратов для использования этой системы в скрининга лекарств приложений. В связи с неопределенной природы сывороток животных, эффект новой терапии могут быть путать с включением таких добавок в культуральной среде. Бессывороточных препараты СМИ доступны как для грызуна и культур скелетных мышц человека 18-21 и обеспечивают более контролируемый, вполне определенной среды для выполнения оценки соединения. Аналогичным образом, использование биологических покрытий (коллаген, ламинин и т.д.) на кантилеверов вводит изменчивость в клеточных препаратов, которые можно избежать путем применения не-биологических субстратов. Отложение силановыми самоорганизующихся монослоев на культуры поверхностей были показаны эксинтенсивно поддерживать сцепление и развитие нескольких типов клеток 16,18,20,22-31, и представляют собой средства для создания полностью определенных поверхностей в надежной и воспроизводимым образом.
В связи с диапазоне от сократительных клеток, присутствующих в системах млекопитающих, применение этой модели для анализов в пробирке относительно широким. Хотя оптимизированы с помощью скелетные мышечные клетки, система потенциально применима к клеткам гладких мышц и кардиомиоцитов, а, обеспечивая средства для выполнения быстрой оценки ответов доз для новой терапии в этих клетках в реальном времени. Текущие чипы консольные состоят из множества кантилеверов 32 (фиг.5А), но могут быть легко изменены, чтобы включать в себя многие другие. Анализ таких массивов производит значительное количество точек данных из одной культуры, тем самым значительно увеличивая статистической мощности любых наблюдаемых различий. Как видно из рис 8, клетки культивируютВ этой системе пройти усталость в течение долгого времени, в ответ на непрерывное стимулирование широкого поля, что позволяет оценить эффекты препарата на уровне выносливость клеток в пробирке. Добавление иннервирующих двигательных нейронов в этой модели культуры также позволяет оценить формирования синапсов через измерения мышцы сокращение в ответ на нейронных стимуляторов (Рисунок 9). В то время как измерение базовых функциональных параметров в мультиплексированному анализа (Рисунок 7) имеет очевидные преимущества по сравнению со стандартной биомолекулярной оценки культур в пробирке, способность оценить функциональность нервно-мышечной и выносливость из посеянных клеток значительно повышает применимость этой модели для скрининга лекарственных средств и моделирования заболевания приложения. Описанная методика предлагает следователи средства на выполнение быстрый, низкой стоимости функциональную оценку как у здоровых и больных мышечных клеток в пробирке. Универсальность системы культуры, и чУровень кайф функциональной подробно, получаемой из анализа исходных данных, должны получать более точные прогнозы в естественных условиях ответов тканей к новым патологических и химических проблем.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Это исследование было профинансировано Национальным институтом номера грантов Здоровье R01NS050452 и R01EB009429. Изготовление консольных чипов была выполнена внешне сотрудниками в нанофабрикацию фонда, расположенного в Корнельском университете. Все оборудование, используемое в процессе изготовления кантилевера был расположен в этом учреждении. Отдельное спасибо Мэнди Эш и Жан-Матье Prot за помощь с консольной микро-производства. Видео анимация функциональности консольной был создан Карлом Хьюз, Алекс Зеленин и Эрик Imperiale из синтетической реальности Lab на УКУ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary rat muscle growth medium | |||
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| B27 (50x) | Life Technologies | 17504044 | 1x |
| Glutamax (100x) | Life Technologies | 35050061 | 1x |
| G5 supplement | Life Technologies | 17503-012 | 1x |
| Glial-Derived Neurotrophic Factor | Cell sciences | CRG400B | 20 ng/ml |
| Brain-Derived Neurotrophic Factor | Cell sciences | CRB600B | 20 ng/ml |
| Ciliary Neurotrophic Factor | Cell sciences | CRC400A | 40 ng/ml |
| Neurotrophin-3 | Cell sciences | CRN500B | 20 ng/ml |
| Neurotrophin-4 | Cell sciences | CRN501B | 20 ng/ml |
| Acidic Fibroblast Growth Factor | Life Technologies | 13241-013 | 25 ng/ml |
| Cardiotrophin-1 | Cell sciences | CRC700B | 20 ng/ml |
| Heparin Sulphate | Sigma | D9809 | 100 ng/ml |
| Leukemia Inhibitory Factor | Sigma | L5158 | 20 ng/ml |
| Vitronectin | Sigma | V0132 | 100 ng/ml |
| Primary rat muscle differentiation medium | |||
| NB Activ 4 | Brain Bits LLC | NB4-500 | |
| Equipment | |||
| Class 2 red diode laser | Newport | ||
| Photo-detector | Noah Industries | ||
| Model 2100 Pulse stimulator | A-M systems | ||
| Multiclamp 700B Digitizer | Axon Instruments | ||
| Patch clamp microscope and stage | Olympus | ||
| Delta T4 culture dish controller | Bioptechs | ||
| Axoscope software | Molecular Devices | ||
| LabVIEW software | National Instruments | ||
| 37 oC, 5% CO2 incubator | NAPCO | ||
| Class 2 microbiological flow hood | Labconco | ||
| Pipettes and tips | Eppendorf |
References
- Bischoff, R. Enzymatic liberation of myogenic cells from adult rat muscle. Anat. Rec. 180, 645-661 (1974).
- Yasin, R., et al. A quantitative technique for growing human adult skeletal muscle in culture starting from mononucleated cells. J. Neurol. Sci. 32, 347-360 (1977).
- Dennis, R. G., Kosnik, P. E., 2nd, Excitability and isometric contractile properties of mammalian skeletal muscle constructs engineered in vitro. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 36, 327-335 (2000).
- Khodabukus, A., Baar, K. Defined electrical stimulation emphasizing excitability for the development and testing of engineered skeletal muscle. Tissue Eng Part C Methods. 18, 349-357 (2012).
- Langelaan, M. L. P., et al. Advanced maturation by electrical stimulation: Differences in response between C2C12 and primary muscle progenitor cells. Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 5, 529-539 (2011).
- Stephenson, G. M., O'Callaghan, A., Stephenson, D. G. Single-fiber study of contractile and biochemical properties of skeletal muscles in streptozotocin-induced diabetic rats. Diabetes. 43, 622-628 (1994).
- Harber, M., Trappe, S. Single muscle fiber contractile properties of young competitive distance runners. Journal of applied physiology (Bethesda, Md: 1985). 105, 629-636 (2008).
- Hvid, L. G., et al. Four days of muscle disuse impairs single fiber contractile function in young and old healthy men. Experimental gerontology. 48, 154-161 (2013).
- Edman, K. A.
- Krivickas, L. S., Walsh, R., Amato, A. A. Single muscle fiber contractile properties in adults with muscular dystrophy treated with MYO-029. Muscle Nerve. 39, 3-9 (2009).
- Sung, J. H., et al. Microfabricated mammalian organ systems and their integration into models of whole animals and humans. Lab on a chip. 13, 1201-1212 (2013).
- Wilson, K., Molnar, P., Hickman, J. J. Integration of functional myotubes with a Bio-MEMS device for non-invasive interrogation. Lab on a chip. 7, 920-922 (2007).
- Wilson, K., Das, M., Wahl, K. J., Colton, R. J., Hickman, J. Measurement of contractile stress generated by cultured rat muscle on silicon cantilevers for toxin detection and muscle performance enhancement. PLoS ONE. 5, (2010).
- Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C.
- Pirozzi, K. L., Long, C. J., McAleer, C. W., Smith, A. S., Hickman, J. J. Correlation of embryonic skeletal muscle myotube physical characteristics with contractile force generation on an atomic force microscope-based bio-microelectromechanical systems device. Applied physics letters. 103, 83108 (2013).
- Smith, A., Long, C., Pirozzi, K., Hickman, J. A functional system for high-content screening of neuromuscular junctions in vitro. Technology. 1, 37-48 (2013).
- Stenger, D. A., et al. Coplanar molecular assemblies of amino- and perfluorinated alkylsilanes: characterization and geometric definition of mammalian cell adhesion and growth. Journal of the American Chemical Society. 114, 8435-8442 (1992).
- Das, M., Rumsey, J. W., Bhargava, N., Stancescu, M., Hickman, J. J. A defined long-term in vitro tissue engineered model of neuromuscular junctions. Biomaterials. 31, 4880-4888 (2010).
- Rumsey, J. W., Das, M., Bhalkikar, A., Stancescu, M., Hickman, J. J. Tissue engineering the mechanosensory circuit of the stretch reflex arc: Sensory neuron innervation of intrafusal muscle fibers. Biomaterials. 31, 8218-8227 (2010).
- Das, M., Rumsey, J. W., Bhargava, N., Stancescu, M., Hickman, J. J. Skeletal muscle tissue engineering: A maturation model promoting long-term survival of myotubes, structural development of the excitation-contraction coupling apparatus and neonatal myosin heavy chain expression. Biomaterials. 30, 5392-5402 (2009).
- Das, M., et al. Developing a novel serum-free cell culture model of skeletal muscle differentiation by systematically studying the role of different growth factors in myotube formation. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 45, 378-387 (2009).
- Stenger, D. A., Pike, C. J., Hickman, J. J., Cotman, C. W. Surface determinants of neuronal survival and growth on self-assembled monolayers in culture. Brain research. 630, 136-147 (1993).
- Hickman, J. J., et al. Rational pattern design for in vitro cellular networks using surface photochemistry. Journal of Vacuum Scienc., & Technology A: Vacuum, Surfaces, and Films. 12, 607-616 (1994).
- Das, M., Molnar, P., Devaraj, H., Poeta, M., Hickman, J. J. Electrophysiological and morphological characterization of rat embryonic motor neurons in a defined system. Biotechnology progress. 19, 1756-1761 (2003).
- Rumsey, J. W., et al. Node of Ranvier formation on motor neurons in vitro. Biomaterials. 30, 3567-3572 (2009).
- Murugan, R., Molnar, P., Rao, K. P., Hickman, J. J. Biomaterial Surface patterning of self assembled monolayers for controlling neuronal cell behavior. International journal of biomedical engineering and technology. 2, 104-134 (2009).
- Guo, X., Johe, K., Molnar, P., Davis, H., Hickman, J. Characterization of a human fetal spinal cord stem cell line, NSI-566RSC, and its induction to functional motoneurons. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 4, 181-193 (2010).
- Varghese, K., et al. A new target for amyloid beta toxicity validated by standard and high-throughput electrophysiology. PLoS ONE. 5, e8643 (2010).
- Natarajan, A., et al. Patterned cardiomyocytes on microelectrode arrays as a functional, high information content drug screening platform. Biomaterials. 32, 4267-4274 (2011).
- Davis, H., et al. Rat Cortical Oligodendrocyte-Embryonic Motoneuron Co-Culture: An Axon-Oligodendrocyte Interaction Model. Journal of biomaterials and tissue. 2, 206-214 (2012).
- Natarajan, A., DeMarse, T., Molnar, P., Hickman, J. Engineered In Vitro Feed-Forward Networks. J Biotechnol Biomater. 3, 2 (2013).
