Name: Lutilizzo di microscala Silicon cantilever per valutare Cellular contrattile Funzione In Vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Scopri come misurare la contrattilità muscolare in vitro utilizzando microcantilever di silicio. Questo metodo non invasivo permette analisi in tempo reale della funzione cellulare per studi di fisiologia e screening farmacologico ad alto rendimento.

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Questa ricerca è stata finanziata dal National Institute of numeri di sovvenzione Salute R01NS050452 e R01EB009429. Fabbricazione dei chip a sbalzo è stata eseguita esternamente da collaboratori presso l&#39;impianto di nanofabbricazione situato presso la Cornell University. Tutte le apparecchiature utilizzate nel processo di fabbricazione a sbalzo era situato in questa struttura. Un ringraziamento speciale a Mandy Esch e Jean-Matthieu Prot per la loro assistenza con cantilever micro-fabbricazione. Animazione Video di funzionalità cantilever è stato generato da Charles Hughes, Alex Zelenin ed Eric Imperiale dal Laboratorio di Realtà sintetica a UCF.

1 Cantilever Chip Fabrication Dettagli illustrati delle fasi di fabbricazione descritti sono forniti in Figura 1. <ol><li> Posizionare wafer di silicio su isolante (SOI) in un forno e cuocere a 125 ° C per 20 min a disidratarsi loro. </li><li> Depositare uno spesso strato di ossido di silicio 1,5 micron sullo strato maniglia del wafer SOI disidratato usando un potenziato a plasma Chemical Vapor Deposition (PECVD) dell'utensile. </li><li> Posizionare la cialda sul mandrino di spin coater con lo strato dispositivo rivolto verso l'alto. Assicurarsi wafer è centrata, dispensare 2 ml di P20 Primer sul centro della fetta, e centrifuga a 3000 rpm per 60 sec a un'accelerazione di 1.000 giri / sec. P20 Primer promuove l'adesione del fotoresist allo strato dispositivo. </li><li> Mentre il wafer è ancora sul mandrino di spin coater, dispensare 2 ml di S1818 fotoresist sul centro della fetta, e centrifuga a 3000 rpm per 60 sec a un'accelerazione di 1.000 giri / sec obtain uno spesso strato di resina fotosensibile 1,5 micron. </li><li> Inserire la cialda su una piastra calda ed effettuare una cottura morbida a 115 ° C per 1 min. </li><li> Eseguire un'esposizione contatto UV disco utilizzando un contatto fotolitografia maschera allineatore per trasferire il disegno dalla maschera sbalzo per il fotoresist sullo strato del dispositivo. Calcolare il tempo di esposizione in base al valore energetico di esposizione di 125 mJ / cm 2 per S1818 photoresist. </li><li> Sviluppare il photoresist immergendo la fetta in una MIF autore fotoresist 726 per 1 min, agitando delicatamente il wafer avanti e indietro. </li><li> Sciacquare il wafer con (DI) di acqua deionizzata e asciugare, preferibilmente utilizzando uno spin risciacquo biancheria (SRD) strumento. </li><li> Rimuovere il fotoresist dal bordo del wafer (fino a 5 mm dal bordo) usando un batuffolo di cotone imbevuto di acetone. </li><li> Caricare il wafer in un Reactive Ion Etch (DRIE) strumento profonda, con il lato fotosensibile rivolto verso l'alto, ed eseguire una ricetta per incidere lo strato di silicio modellato attraverso la devistrato di ce. Le funzioni di strato di ossido sepolto come un arresto etch, quindi eseguire un attacco con il 50% al 100% più cicli che si prevede sarà necessario per garantire una completa etch. </li><li> Posizionare la cialda in una soluzione bagno photoresist caldo per 20 minuti a nudo il photoresist. Trasferire la cialda di un rapido-dump-sciacquatrice (QDR) per sciacquare la cialda con acqua deionizzata. Dopo la striscia di photoresist, caricare la cialda in uno strumento di dominio di risorse condivise per sciacquare e asciugare il wafer. Controllare il wafer al microscopio per assicurare lo schema cantilever visualizza come previsto. </li><li> Depositare uno strato di ossido di silicio drogato un-1 micron sullo strato periferica del wafer con un attrezzo PECVD. Funzioni di questo strato di ossido, come uno strato protettivo per i cantilever durante ulteriori fasi di lavorazione. </li><li> Posizionare il wafer sul mandrino rotazione coater con lo strato rivolto verso l'alto la maniglia per iniziare l'elaborazione del lato posteriore del wafer. Garantire wafer è centrata, dispensare 2 ml di P20 Primer sul centro della fetta, e centrifuga a 3000 rpmper 60 sec a un'accelerazione di 1.000 giri / sec. </li><li> Mentre il wafer è ancora sul mandrino di spin coater, dispensare 2 ml di SPR220-4.5 fotoresist sul centro della fetta, e centrifugare a 2000 rpm per 45 sec a un'accelerazione di 1.000 giri / sec per ottenere uno spesso strato di 6,5 micron photoresist. </li><li> Inserire la cialda su una piastra calda vicinanza effettuare una cottura morbida a 115 ° C per 2 min. </li><li> Utilizzando un contatto fotolitografia allineatore grado di anteriore / posteriore allineamento, allineare la maschera finestra posteriore al modello cantilever lato anteriore ed eseguire un hard esposizione ai raggi UV contatto per trasferire il disegno dalla maschera finestra posteriore per il fotoresist sullo strato maniglia. Utilizzare un tempo di esposizione calcolato in base al valore energetico di esposizione di 480 mJ / cm 2 per SPR220-4.5 photoresist. </li><li> Dopo l'esposizione ai raggi UV, lasciare che i wafer rimangono in una zona scura per 30 minuti prima della prossima fase di lavorazione. </li><li> Sviluppare il photoresist immergendo il wafer inuno sviluppatore 726 MIF photoresist per 2 minuti mentre delicatamente scuotendo il wafer avanti e indietro. </li><li> Sciacquare il wafer con (DI) di acqua deionizzata e asciugare, preferibilmente utilizzando uno spin risciacquo biancheria (SRD) strumento. </li><li> Posizionare i wafer in un forno a 90 ° C per 12 ore. </li><li> Etch lo strato di ossido di silicio sul retro del wafer utilizzando un sistema RIE con gas fluorurati e una ricetta per incisione ossido. L'ossido modellata sul retro della fetta agisce come una maschera di attacco per l'ulteriore elaborazione. Controllare i wafer al microscopio per assicurare che l'ossido di silicio nella finestra esposta è completamente inciso. </li><li> Rimuovere il photoresist sul bordo del wafer (fino a 5 mm dal bordo) usando una camera tampone pulito imbevuto in acetone. </li><li> Caricare il wafer in un utensile con DRIE ed eseguire una ricetta per incidere lo strato maniglia modellata ad una profondità di 500 micron con il funzionamento strato di ossido sepolto come arresto etch. Dividere questo etch in più piste per impedire un eccessivo riscaldamento delwafer, che provoca incisione incoerente del silicio. Questo passaggio etch rimuove completamente il silicio sotto i cantilever. </li><li> Eseguire una fase di attacco umido utilizzando il 25% diluito HF mordenzante, per togliere lo strato di ossido sepolto sotto i cantilever e lo strato di ossido protettivo sulla parte superiore del cantilever. NOTA: Questo passaggio rilascia la superficie inferiore dei cantilever in silicio e apre una finestra sotto per fornire un accesso per sondare la mensola con il laser. </li><li> Sciacquare la cialda con una serie di bagni di acqua deionizzata e asciugare accuratamente con azoto. Dal momento che i cantilever sono supportate solo alle loro basi, non utilizzare spray forti d'acqua DI o gas inerte direttamente sui cantilever. </li><li> Cleave i singoli chip dal wafer lungo le linee Cleave prodotti durante la fase maniglia strato etch. </li></ol> Cultura 2. cellulare <ol><li> Preparare 13F coprioggetto secondo i metodi precedentemente pubblicati 17. NOTA: Se 13F coverslips non sono disponibili, qualsiasi superficie idrofobica con un angolo di contatto sopra 95 ° può essere utilizzato. </li><li> Sterilizzare chip a sbalzo e 13F coprioggetto in una soluzione di etanolo al 70% e lasciare asciugare in una cappa a flusso. </li><li> Posizionare singoli chip a sbalzo sulla parte superiore del 13F vetrini all'interno di una piastra standard 12 bene. </li><li> Rivestire le cantilever con la modifica biopolimero o superficie ottimizzata per il tipo di cellule utilizzate secondo i protocolli standard di coltura cellulare. </li><li> Risospendere le cellule nel loro terreno di crescita specifico alla concentrazione desiderata. NOTA: Questo protocollo si tradurrà in un notevole numero di cellule che cadono attraverso la finestra a sbalzo e non aderenti alla superficie cantilever desiderato. Preparazioni di cellule devono pertanto essere 3-4 volte più concentrato di quello per le preparazioni coprioggetto standard. Ad esempio, la semina di cellule satelliti muscolari scheletrico di ratto è tipicamente effettuata con una densità di semina di 500 e 700 cellule / quadrato mm 15,16, E sono usati con supporti a sbalzo a 2.000 cellule / mm quadrato. Esperimenti di ottimizzazione devono essere effettuate con le nuove fonti di cellule per accertare una adeguata densità di semina. </li><li> Pipettare 200 microlitri della sospensione cellulare sulla superficie del chip cantilever, assicurando la bolla di media copre le finestre a sbalzo interamente. Se il mezzo assorbe attraverso la finestra e non forma una bolla statica sulla parte superiore del cantilever sostituire il coprioggetto 13F e ritentare il fasciame. </li><li> Trasferire il piatto contenente i chip di un incubatore e permettono alle cellule di aderire per almeno 1 ora (preferibilmente 2-3 ore). </li><li> Dopo questo periodo di placcatura, utilizzare pinze sterili per trasferire il chip di un ben pulito, senza coprioggetto 13F, e rabboccare la cultura con 1 ml di terreno di coltura. </li><li> Riportare la piastra per l'incubatore. </li><li> Mantenere le cellule in base alla loro protocollo standard per la manutenzione in vitro su vetrini. Per le cellule del muscolo scheletrico,un interruttore di media composizione per indurre la formazione di miotubi una volta le cellule diventano confluenti sarà necessario. </li></ol> 3 Configurazione di hardware e software per l'analisi sbalzo Flessione <ol><li> Posizionare un piatto di coltura riscaldato nella fase di un microscopio elettrofisiologia in posizione verticale. </li><li> Aggiungere 3 ml del mezzo di alimentazione delle celle sono attualmente sospesi in (HEPES mM + 10) alla fase microscopio riscaldata. </li><li> Montare elettrodi inox sulla parte interna del piatto cultura riscaldata ad una distanza di 15 mm e collegarli ad un generatore di impulsi, in grado di produrre impulsi di stimolazione campo di varia intensità, frequenza e forma d'onda, per permettere al sistema di produrre stimolazione del campo delle cellule quando appropriato. </li><li> Fissare un laser a elio-neon, montato su fasi di traslazione XY, alla parte inferiore del tavolo microscopio e regolare in modo che il fascio laser è diretto attraverso la base del piatto cultura riscaldata a 30 ° relativposta al piano del cantilever. </li><li> Fissare un modulo foto-rilevatore quadrante, montato su fasi di traslazione XY, alla parte inferiore del palco microscopio e regolare la posizione in modo che i riflessi terre raggio laser al centro dei quattro quadranti. Figura 2 fornisce una panoramica dell'hardware istituito necessarie per l'attuazione del protocollo descritto. </li><li> Scrivere un programma software per controllare gli attuatori lineari che scandiscono attraverso i cantilever. Scrivere il programma software con riferimento al diagramma di flusso illustrato nella Figura 3. L'interfaccia grafica programmato per l'uso con questo sistema è fornito in Figura 4. </li></ol> 4 Registrazione Cantilever deflessione dei dati <ol><li> Accendere l'hardware di analisi cantilever e software associato. </li><li> Inserire il palco termistore riscaldato nel mezzo e attendere che la lettura a 37 ° C. </li><li> Inserire il chip a sbalzo in fase con il cantilevers orientati verso il lato destro del palco. </li><li> Accendere la sorgente di luce del microscopio. </li><li> Mettere a fuoco il microscopio per portare i bordi dei cantilever in vista e utilizzare il software di controllo laser / foto-rilevatore per posizionare il raggio laser sulla punta del cantilever 1 NOTA: Supponendo che i cantilever sono orientati alla destra del palco, cantilever 1 è quello posizionato in alto a sinistra della matrice e numeri scendono a 16 in basso a sinistra. Mensola 17 è nella posizione in alto a destra e corre a 32 in basso a destra (Figura 5A). </li><li> Premere il tasto "play" sul software di registrazione. </li><li> Posizionare la foto-rivelatore in modo che il segnale indica "0" in entrambi x ed y fotogrammi regolando i motori passo-passo che controllano la foto-rivelatore. </li><li> Impostare cantilever 1 posizione nel software di controllo laser / foto-rilevatore (Figura 4). </li><li> Spostare il laser alla punta del cantilever 16, ripetere il punto 4.7., E impostare cantilever 16 posizione nel software di controllo laser / foto-rivelatore. </li><li> Spostare il laser alla punta del cantilever 32, ripetere il punto 4.7., E impostare sbalzo 32 posizione nel software di controllo laser / foto-rivelatore. </li><li> Spostare il laser alla punta del cantilever 17, ripetere il punto 4.7., E impostare sbalzo 17 posizione nel software di controllo laser / foto-rivelatore. </li><li> Spegnere la fonte di luce microscopio e la plafoniera in laboratorio. </li><li> Premere il tasto "record" sul software di registrazione. </li><li> Impostare l'hardware generatore di impulsi di 40 msec, 5 V impulsi ad una frequenza di 1 Hz, e accendere la macchina. NOTA: In alternativa, impiegare protocolli di stimolazione ottimizzate per fonti di cellule specifiche, a questo punto, le impostazioni indicate sono linee guida basate su dati raccolti utilizzando fonti umane e cellule di roditore 12,13,15,16. </li><li> Utilizzando il software di controllo laser / foto-rivelatore, impostare l'hardware per eseguire la scansione attraverso la matrice 32 cantilever, fermandosi per 5 secondi ad ogni sue. </li><li> Quando la scansione dei 32 cantilever è completata, spegnere lo stimolatore, quindi arrestare il software di registrazione e aprire il file di dati. </li><li> Esaminare la traccia registrata da ogni sbalzo per prove di attività contrattile. Prendere nota di ciascuna mensola con le risposte positive. Una contrazione è definito come un picco se la deviazione è di almeno 0,1 V sopra la linea di base. </li><li> Rimuovere qualsiasi cantilever che non rispondono dal protocollo di scansione sul software di controllo laser / foto-rivelatore. </li><li> I cantilever attivi possono quindi essere riesaminati senza stimolazione al fine di ottenere una lettura di spontanea attività contrattile della cellula. </li><li> Eseguire scansioni con o senza stimolazione elettrica vasto campo, dopo aggiunta di un composto terapeutico al mezzo per osservare il suo effetto sull'uscita funzionale delle cellule in coltura. </li><li> Effettuare valutazioni fatica stimolando elettricamente le cellule per lunghi periodi e livelli di scansione di contr actility per misurare quanto tempo ci vuole per forza di picco a scendere al di sotto di una determinata soglia. </li><li> Negli esperimenti in cui i neuroni motori sono mantenuti in co-coltura con il muscolo, misurare la formazione di giunzione neuromuscolare attraverso il trattamento dei motoneuroni-myotube sbalzo co-culture con uno stimolante neuronale (come il glutammato) o inibitore sinaptica (ad esempio, D-tubocurarina) e scansione per aumenti e diminuzioni di attività spontanea, rispettivamente 16. </li><li> Eseguire scansioni specifiche dettate dalle esigenze degli esperimenti pianificati. </li></ol> 5 Analisi di sbalzo deflessione dati <ol><li> Usa modificato equazioni di Stoney 15 (di seguito dettagliate) per convertire i dati cantilever grezzi deflessione (in Volt) in una lettura di stress nello strato di cellule o miotubi (in Pascal), e una misura diretta della forza contrattile cellulare (in nano-newton): annuncio / 51866 / 51866eq1.jpg "/&gt; Equazione 1 <img alt="Equazione 2" fo:content-width="2in" width="300" src="/files/ftp_upload/51866/51866eq2.jpg"> Equazione 2 </li><li> Dove δ = sbalzo punta flessione e lo stress prodotti dalla myotube, σ c = lo stress prodotto dal myotube, assumendo un film di spessore uniforme l'intera larghezza del cantilever, C rivelatore = coefficiente specifica del sistema relativa tensione di posizione laser sulla foto -detector, θ = l'angolo del laser e rivelatore rispetto al piano del cantilever, E Si = modulo elastico di silicio, t Si = spessori del cantilever, t f = spessore miotubi, v Si = coefficiente di veleno silicio, L = lunghezza a sbalzo, lunghezza P = percorso del laser dalla punta a sbalzo a rivelatore, e w Figura 6. </li><li> Assumendo il miotubi è un film uniforme, la forza nella miotubi è uguale alla forza del film, portando a equazione 3, uguagliando il calcolo della forza da stress e l'area della sezione trasversale cella assunto che è stato utilizzato per l'applicazione di Stoney di equazione. <img alt="Equazione 3" fo:content-width="1.5in" src="/files/ftp_upload/51866/51866eq3.jpg"> Equazione 3 </li><li> Dopo la raccolta dei dati funzionali, fissare i chip a sbalzo per l'analisi immunocitochimica o utilizzare le celle per proteine ​​o DNA analisi utilizzando tecniche standard. </li><li> Facoltativamente, tornare le cellule al incubatore invece di preparare per l'analisi molecolare, al fine di rivalutare le prestazioni funzionali in un momento-momento successivo. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Le fasi critiche analizzando cantilever microscala per prove di contrazione cellulare sono il posizionamento del chip a sbalzo all&#39;interno della fase di microscopio, e il successivo allineamento del laser e foto-rivelatore con la punta del cantilever angolari nella matrice. Se questo non viene fatto accuratamente, quindi il software sarà in grado di estrapolare le posizioni dei rimanenti cantilever nella matrice, potenzialmente conseguente accumulo di falsi negativi durante la raccolta dei dati. Gli operatori devono...

La coltura in vitro di cellule muscolari provenienti sia da fonti umane che da roditori è possibile da decenni1,2. Tuttavia, mentre le preparazioni standard di vetrino coprioggetti sono utili per la valutazione biochimica, non facilitano l'analisi dell'output funzionale primario della cellula (contrattilità) e quindi hanno un valore piuttosto limitato come mezzo per valutare la maturazione e le prestazioni cellulari. Al fine di massimizzare la quantità di dati ottenibili da tali colture in vitro, è necessario far avanzare lo sviluppo di sistemi in grado di alloggiare tali cellule in configurazioni che consentano la valutazione in tempo reale delle loro prestazioni funzionali. La creazione di una moltitudine di modelli muscolari tridimensionali ha fatto alcuni progressi verso il soddisfacimento di questa esigenza, e tali sistemi sono stati utilizzati in numerose pubblicazioni come mezzo per valutare la capacità contrattile di cellule muscolari in coltura in vitro3-5. Sebbene tali sistemi siano inestimabili per la modellazione e gli studi di ricostruzione dei tessuti, sono limitati nella loro applicabilità per gli studi sulle risposte di singole cellule. Nei casi in cui sono necessari studi su singole fibre, le metodologie ex vivo complesse e laboriose rimangono l'unica opzione6-10. Inoltre, l'attuale movimento verso lo sviluppo di piattaforme complesse e multiorgano per lo sviluppo di farmaci e protocolli di screening richiede la creazione di sistemi non invasivi, facilmente scalabili e che si integrino facilmente con cellule di supporto e modelli tissutali11. 
I cantilever su microscala offrono un metodo semplice per valutare la capacità contrattile funzionale di singole cellule/piccole popolazioni di cellule12,13. La tecnica si basa sulla tecnologia modificata della microscopia a forza atomica (AFM)14 e utilizza un sistema laser e un foto-rivelatore per misurare la deflessione a sbalzo su microscala in risposta all'attività contrattile del miotubo in coltura. Le equazioni di Stoney modificate vengono quindi utilizzate per calcolare lo stress nel miotubo e la forza esercitata dal miotubo per generare la deflessione del substrato osservata15. È stato scritto un programma di scansione che consente la valutazione simultanea di array cantilever multiplexati, offrendo potenziali applicazioni di throughput da moderato ad alto per studi di tossicità/efficacia dei farmaci15,16. Tale tecnologia può rivelarsi preziosa nello sviluppo di saggi funzionali e preclinici per prevedere l'efficacia dei farmaci in vivo. Inoltre, la fabbricazione di chip cantilever in silicio non ostacola l'elaborazione post-analisi delle cellule per saggi biomolecolari standard come l'immunocolorazione, il western blotting e la PCR. 
Questo manoscritto fornisce istruzioni dettagliate sulla fabbricazione e la preparazione di cantilever in silicio su microscala, la configurazione hardware e software e le linee guida operative per valutare la funzionalità delle cellule contrattili coltivate su questi chip. Le tecniche standard di coltura cellulare possono essere implementate per la placcatura e la manutenzione delle cellule su queste superfici, quindi qualsiasi tipo di cellula contrattile per la quale esistono parametri di coltura affidabili dovrebbe essere in grado di integrarsi facilmente con questo dispositivo. I parametri di coltura 2D relativamente semplici utilizzati in questo sistema rendono semplice l'integrazione di altri modelli cellulari o l'aggiunta di tipi di cellule che possono interagire con il muscolo (come l'innervazione dei neuroni), aumentando notevolmente l'applicabilità di questo modello nello sviluppo di saggi funzionali in vitro più complessi e modelli multiorgano di sistemi di mammiferi.

<table><tbody><tr>Terreno <td></td><td></td><td></td><td>primario di crescita muscolare di ratto</td></tr><tr><td>Mezzo neurobasale</td><td>Life Technologies</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>B27 (50x)</td><td>Life Technologies</td><td>17504044</td><td>1x</td></tr><tr><td>Glutamax (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>35050061</td><td>1x</td></tr><tr><td>integratore G5</td><td>Life Technologies</td><td>17503-012</td><td>1x</td></tr><tr><td>Derivato da Glia Fattore Neurotrofico</td><td>Scienze Cellulari</td><td></td><td>CRG400B 20 ng/ml</td></tr><tr><td>Fattore Neurotrofico Derivato dal Cervello</td><td>Scienze Cellulari</td><td>CRB600B</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>Fattore Neurotrofico Ciliare</td><td>Scienze Cellulari</td><td>CRC400A</td><td>40 ng/ml</td></tr><tr><td>Neurotropina-3</td><td>Scienze Cellulari</td><td>CRN500B</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>Neurotropina-4</td><td>Scienze Cellulari</td><td>CRN501B</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>Fattore di crescita acido dei fibroblasti</td> Life <td>Technologies</td><td>13241-013&nbsp;</td><td>25 ng/ml</td></tr><tr><td>Cardiotrofina-1</td><td>Scienze cellulari</td><td>CRC700B</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>di eparina solfato</td><td>Sigma</td><td>D9809&nbsp;</td><td>100 ng/ml</td></tr><tr><td>Fattore inibitorio della leucemia</td><td>Sigma</td><td>L5158&nbsp;</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>Vitronectin</td><td>Sigma</td><td>V0132</td><td>100 ng/ml</td></tr><tr>Mezzo <td></td><td></td><td></td><td>primario di differenziazione muscolare del ratto</td></tr><tr><td>NB Activ 4</td><td>Brain Bits LLC</td><td>NB4-500</td><td></td></tr><tr><td>Attrezzatura</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laser a diodi rossi di classe 2</td><td>Newport</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fotorivelatore</td><td>Noah Industries</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Modello 2100 Pulse sistemi</td><td>A-M Multiclamp</td><td></td><td></td></tr><tr><td>700B Digitalizzatore</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio e tavolino Patch clamp</td> Controller per piastre di coltura <td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Delta T4</td><td>Bioptechs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software per assoscopio</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software LabVIEW</td><td>National Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 oC, 5% CO2 incubatore</td><td>NAPCO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Classe 2 cappa a flusso microbiologico</td><td>Labconco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette e puntali</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

l'utilizzo di microscala silicon cantilever per valutare cellular contrattile funzione in vitro

Utilization of Microscale Silicon Cantilevers to Assess Cellular Contractile Function In Vitro

Lo sviluppo di test più predittivi e biologicamente rilevanti in vitro si basa sulla promozione dei sistemi di coltura di cellule versatili che facilitano la valutazione funzionale delle cellule teste di serie. A tal fine, la tecnologia cantilever microscala offre una piattaforma con cui misurare la funzionalità contrattile di una gamma di tipi cellulari, incluse scheletrico, cardiaco e cellule muscolari lisce, attraverso la valutazione della contrazione indotta substrato piegatura. Applicazione di matrici a sbalzo multiplex fornisce i mezzi per sviluppare moderata a protocolli di high-throughput per valutare l&#39;efficacia dei farmaci e la tossicità, fenotipo della malattia e la progressione, così come le interazioni neuromuscolari e altri cellula-cellula. Questo manoscritto fornisce i dettagli per la fabbricazione di matrici a sbalzo affidabili per questo scopo, ed i metodi necessari al successo le cellule di coltura su queste superfici. Ulteriore descrizione è fornita sui passi necessari per eseguire anale funzionaleYsis di tipi di cellule contrattili mantenuta su tali array utilizzando un nuovo sistema laser e foto-rilevatore. I dati rappresentativi forniti evidenzia la precisione e la natura riproducibile dell&#39;analisi della funzione contrattile possibile utilizzare questo sistema, così come la vasta gamma di studi cui tale tecnologia può essere applicata. Adozione diffusa di successo di questo sistema potrebbe fornire gli investigatori i mezzi per eseguire rapidi, studi funzionali a basso costo in vitro, portando a previsioni più accurate delle prestazioni dei tessuti, lo sviluppo della malattia e la risposta al trattamento terapeutico.

Cultura di successo di cellule contrattili su cantilever è una procedura relativamente semplice, utilizzando tecniche standard di coltura cellulare (Figura 5). La percentuale di cellule di supporto cantilever amministrazioni varierà a seconda del tipo di cellula in esame e specifica cultura tecnica impiegata. Utilizzo di cellule embrionali primarie derivate da ratto arti posteriori, l'attività contrattile è stata rilevata il 12% di cantilever esaminati (n = 4). Analisi della funzione contrattile utilizz...

Questo protocollo descrive l&#39;uso di cantilever silicio microscala come superfici di coltura flessibili per misurare la contrattilità delle cellule muscolari in vitro. Contrazione cellulare provoca cantilever flessione, che può essere misurata, registrata e convertita in letture di forza, fornendo un sistema non invasivo e scalabile per misurare funzione contrattile in vitro.

L'utilizzo di microscala Silicon cantilever per valutare Cellular contrattile Funzione In Vitro

The development of more predictive and biologically relevant in vitro assays is predicated on the advancement of versatile cell culture systems which ...

Lo scopo del seguente esperimento è quello di misurare l'attività contrattile di fibre muscolari in coltura in risposta alla stimolazione in un ambiente controllato in vitro. Ciò si ottiene placcando cellule muscolari dissociate su cantilever di silicio su microscala e inducendo la fusione di queste cellule mononucleate per formare fibre chiamate miotubi. Questi chip a sbalzo che supportano le cellule muscolari differenziate vengono quindi trasferiti a un microscopio elettrofisiologico modificato per supportare un laser e un fotorivelatore utilizzato per misurare la deflessione a sbalzo in risposta alla contrazione muscolare dopo il posizionamento del chip nel rig.Il laser è posizionato in modo da concentrarsi sulla punta del cantilever e il fotorilevatore è allineato allo stesso modo in modo da catturare il raggio deviato Si ottengono risultati che mostrano il grado di deflessione del cantilever, che è causato dalla contrazione muscolare in risposta a un trattamento elettrico o chimico, fornendo una misurazione diretta del profilo di contrazione delle cellule seminate in tempo reale. In definitiva, lo spostamento a sbalzo può essere elaborato per fornire una lettura della forza. Questo sistema è multiplexato per fornire un potenziale banco di prova ad alto rendimento per la valutazione dei cambiamenti nella funzione contrattile in risposta a protocolli di trattamento farmacologico, malattia, stato o esercizio.Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'elettrofisiologia del patch clamp, è che questo metodo per l'analisi funzionale non è invasivo e facilmente adattabile per studi ad alto rendimento. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dello sviluppo di farmaci, come l'identificazione di concentrazioni dose-risposta appropriate prima della valutazione clinica. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia di molteplici malattie muscolari perché fornisce i mezzi per studiare le prestazioni funzionali di cellule di diversi fenotipi patologici In tempo reale, tuttavia, questo metodo può fornire informazioni sulle patologie del muscolo scheletrico scheletrico.Può essere utilizzato anche per altri sistemi tissutali come il cuore e la muscolatura liscia Sterilizzato, chip a sbalzo precedentemente preparati e vetrini copritutto 13 F in soluzione di etanolo al 70% e lasciare asciugare all'aria in una cappa a flusso. Quindi posizionare i singoli trucioli a sbalzo sopra i vetrini coprioggetto 13 F. All'interno di una piastra standard da 12 pozzetti, rivestire i cantilever con il biopolimero o la modifica della superficie ottimizzata per il tipo di cellula utilizzata Secondo i protocolli standard di coltura cellulare, il rivestimento superficiale richiede 30 minuti utilizzando il nostro metodo di preparazione, ma può essere modificato a seconda del protocollo di coltura specifico dello sperimentatore.Reese ha utilizzato le cellule nel loro specifico mezzo di crescita fino alla concentrazione desiderata, quindi centinaia di microlitri di sospensione cellulare sulla superficie del chip a sbalzo, assicurando che la bolla di terreno coprisse completamente le finestre a sbalzo. Trasferire la piastra contenente i chip in un incubatore e lasciare che le celle aderiscano per almeno un'ora dopo questo periodo di placcatura. Utilizzare una pinza sterile per trasferire il chip in un pozzetto pulito senza un vetrino coprioggetti a 13 F e aggiungere un millilitro di terreno di crescita a ciascuno.Rimettere bene la piastra nell'incubatore, mantenere le cellule secondo il loro protocollo standard per il mantenimento in vitro. Sui vetrini, posizionare un piatto di coltura riscaldato sul tavolino di un microscopio elettrofisiologico verticale. Aggiungere tre millilitri dell'attuale terreno di alimentazione cellulare al microscopio riscaldato.Elettrodi in acciaio inossidabile montati su tavolino all'interno del piatto di coltura riscaldato a una distanza di separazione di 15 millimetri. Collegali a un generatore di impulsi in grado di produrre stimolazione di campo, impulsi di varia intensità, frequenza e forma d'onda per consentire al sistema di produrre stimolazione di campo delle cellule quando appropriato. Imbullonare un laser al neon ad elio montato su tavolini di traslazione XY sul lato inferiore del tavolo del microscopio.Quindi regolare il laser in modo che il raggio laser sia diretto attraverso la base del piatto di coltura riscaldato con un angolo di 30 gradi rispetto al piano del cantilever. Il bullone successivo, un modulo fotorivelatore a quadrante montato su stadi di traslazione XY sul lato inferiore del tavolino del microscopio. Regolare la sua posizione in modo che il raggio laser riflesso atterri al centro dei quattro quadranti.Scrivere un programma software per controllare gli attuatori lineari che scansionano i cantilever con riferimento al diagramma di flusso fornito nel protocollo di testo. Attivare l'hardware di analisi a sbalzo e il software associato. Inserire il tavolino riscaldato ther mrta nel fluido e attendere che legga 37 gradi Celsius.Quindi, inserire il chip a sbalzo nel tavolino con i cantilever orientati verso il lato destro del palco. Accendere la sorgente luminosa del microscopio. Focalizzare il microscopio per portare in vista i bordi dei cantilever e utilizzare il software di controllo del fotorilevatore laser per posizionare il raggio laser sulla punta di quello a sbalzo, supponendo che i cantilever siano orientati a destra del cantilever del tavolino.Uno è quello posizionato in alto a sinistra dell'array e i numeri scendono a 16. In basso a sinistra. Il cantilever 17 si trova nella posizione in alto a destra e arriva a 32.In basso a destra premere play sul software di registrazione. Posizionare il fotorilevatore in modo che il segnale legga zero in entrambi i fotogrammi x e y regolando i motori passo-passo che controllano il fotorilevatore. Quindi impostare la posizione del cantilever di uno nel software di controllo del fotorilevatore laser.Quindi, spostare il laser sulla punta del cantilever 16. Ripetere il posizionamento del fotorilevatore e impostare la posizione del cantilever 16 nel software di controllo del fotorilevatore laser. Ora sposta il laser sulla punta del cantilever 32.Ripetere il posizionamento del fotorilevatore e impostare la posizione del cantilever 32 nel software di controllo del fotorilevatore laser. Infine, spostare il laser sulla punta del cantilever 17. Ripetere il posizionamento del fotorilevatore e impostare la posizione del cantilever 17 nel software di controllo del fotorilevatore laser.Spegnere la sorgente luminosa del microscopio e poi la luce dall'alto in laboratorio. Premere il tasto di registrazione sul software di registrazione. Impostare l'hardware del generatore di impulsi su impulsi da 40 millisecondi e cinque volt, una frequenza di un hertz.Quindi accendere la macchina Utilizzando il software di controllo del fotorilevatore laser, impostare l'hardware per la scansione attraverso l'array di 32 cantilever. Fermandosi per cinque secondi a ciascuno. Al termine della scansione dei 32 cantilever, spegnere lo stimolatore.Quindi arrestare il software di registrazione e visualizzare il file di dati. Esaminare la traccia registrata da ciascun cantilever. Per la prova dell'attività contrattile.Una contrazione è definita come un picco. Se la deflessione è di almeno 0,1 volt al di sopra della linea di base, prendere nota di ciascun cantilever con risposte positive. Rimuovere eventuali cantilever non reattivi dal protocollo di scansione sul software di controllo del fotorilevatore laser.I cantilever attivi possono quindi essere riscansionati senza stimolazione per ottenere una lettura dell'attività contrattile spontanea della cellula. Successivamente, aggiungere un composto terapeutico al terreno per osservarne l'effetto sull'output funzionale delle cellule in coltura. Dopo l'aggiunta di scansioni composte con o senza stimolazione elettrica ad ampio campo, eseguire valutazioni della fatica stimolando elettricamente le cellule per periodi prolungati, seguite da scansioni dei livelli di contrattilità per misurare quanto tempo impiega la forza di picco a scendere al di sotto di una soglia specifica.Negli esperimenti in cui i motoneuroni sono mantenuti in co-coltura con il muscolo misurano la formazione della giunzione neuromuscolare attraverso il trattamento di cocolture a sbalzo del tubo mio-neuro motorio con uno stimolante neuronale o un inibitore sinaptico e la scansione di aumenti e diminuzioni dell'attività spontanea, procedere all'analisi dei dati di deflessione a sbalzo come dettagliato nel protocollo di testo. La coltura di successo di cellule contrattili su cantilever è una procedura relativamente semplice che utilizza tecniche di coltura cellulare standard. Il software elettrofisiologico standard può essere utilizzato per analizzare i dati grezzi facilitando il calcolo delle proprietà funzionali rilevanti, come il tempo di forza di picco alla forza di picco e il tempo di rilassamento parziale.Protocolli di stimolazione estesi forniscono i mezzi per valutare i tassi di affaticamento nelle cellule in coltura, ampliando così il livello di dati fisiologici ottenibili da questo sistema. Il sistema di coltura a sbalzo può essere modificato per includere i motoneuroni nel sistema di coltura con miotubi muscolari scheletrici, in modo da consentire la valutazione della formazione di sinapsi neuromuscolari in vitro. In tali colture, i tassi di attività contrattile spontanea sono confrontati con i tassi di contrazione in risposta al trattamento con uno stimolante neuronale specifico come il glutammato.Qualsiasi aumento osservato indotto dal glutammato nei tassi di contrazione suggerisce l'attivazione di neuroni in coltura che porta al rilascio di acetilcolina e alla successiva attivazione del miotubo Il trattamento con inibitori sinaptici come il bloccante del recettore dell'acetilcolina, dtu rina che porta alla cessazione dell'attività indotta dal glutammato fornisce ulteriori prove della presenza di sinapsi neuromuscolari funzionali in queste colture. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare i cantilever in silicio su microscala per valutare le proprietà funzionali del muscolo scheletrico in coltura.

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Presentato qui è un protocollo per valutare le proprietà contraili dei miofibrili muscolari striati con risoluzione nano-Newton. Il protocollo utilizza una configurazione con una sonda a forza ottica basata sull'interferometria. Questa configurazione genera dati con un elevato rapporto segnale-rumore e consente la valutazione della cinetica contrattinale delle miofibrils.

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