L'utilizzo di microscala Silicon cantilever per valutare Cellular contrattile Funzione In Vitro

Lo scopo del seguente esperimento è quello di misurare l'attività contrattile di fibre muscolari in coltura in risposta alla stimolazione in un ambiente controllato in vitro. Ciò si ottiene placcando cellule muscolari dissociate su cantilever di silicio su microscala e inducendo la fusione di queste cellule mononucleate per formare fibre chiamate miotubi. Questi chip a sbalzo che supportano le cellule muscolari differenziate vengono quindi trasferiti a un microscopio elettrofisiologico modificato per supportare un laser e un fotorivelatore utilizzato per misurare la deflessione a sbalzo in risposta alla contrazione muscolare dopo il posizionamento del chip nel rig.

Il laser è posizionato in modo da concentrarsi sulla punta del cantilever e il fotorilevatore è allineato allo stesso modo in modo da catturare il raggio deviato Si ottengono risultati che mostrano il grado di deflessione del cantilever, che è causato dalla contrazione muscolare in risposta a un trattamento elettrico o chimico, fornendo una misurazione diretta del profilo di contrazione delle cellule seminate in tempo reale. In definitiva, lo spostamento a sbalzo può essere elaborato per fornire una lettura della forza. Questo sistema è multiplexato per fornire un potenziale banco di prova ad alto rendimento per la valutazione dei cambiamenti nella funzione contrattile in risposta a protocolli di trattamento farmacologico, malattia, stato o esercizio.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'elettrofisiologia del patch clamp, è che questo metodo per l'analisi funzionale non è invasivo e facilmente adattabile per studi ad alto rendimento. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dello sviluppo di farmaci, come l'identificazione di concentrazioni dose-risposta appropriate prima della valutazione clinica. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia di molteplici malattie muscolari perché fornisce i mezzi per studiare le prestazioni funzionali di cellule di diversi fenotipi patologici In tempo reale, tuttavia, questo metodo può fornire informazioni sulle patologie del muscolo

Può essere utilizzato anche per altri sistemi tissutali come il cuore e la muscolatura liscia Sterilizzato, chip a sbalzo precedentemente preparati e vetrini copritutto 13 F in soluzione di etanolo al 70% e lasciare asciugare all'aria in una cappa a flusso. Quindi posizionare i singoli trucioli a sbalzo sopra i vetrini coprioggetto 13 F. All'interno di una piastra standard da 12 pozzetti, rivestire i cantilever con il biopolimero o la modifica della superficie ottimizzata per il tipo di cellula utilizzata Secondo i protocolli standard di coltura cellulare, il rivestimento superficiale richiede 30 minuti utilizzando il nostro metodo di preparazione, ma può essere modificato a seconda del protocollo di coltura specifico dello sperimentatore.

Reese ha utilizzato le cellule nel loro specifico mezzo di crescita fino alla concentrazione desiderata, quindi centinaia di microlitri di sospensione cellulare sulla superficie del chip a sbalzo, assicurando che la bolla di terreno coprisse completamente le finestre a sbalzo. Trasferire la piastra contenente i chip in un incubatore e lasciare che le celle aderiscano per almeno un'ora dopo questo periodo di placcatura. Utilizzare una pinza sterile per trasferire il chip in un pozzetto pulito senza un vetrino coprioggetti a 13 F e aggiungere un millilitro di terreno di crescita a ciascuno.

Rimettere bene la piastra nell'incubatore, mantenere le cellule secondo il loro protocollo standard per il mantenimento in vitro. Sui vetrini, posizionare un piatto di coltura riscaldato sul tavolino di un microscopio elettrofisiologico verticale. Aggiungere tre millilitri dell'attuale terreno di alimentazione cellulare al microscopio riscaldato.

Elettrodi in acciaio inossidabile montati su tavolino all'interno del piatto di coltura riscaldato a una distanza di separazione di 15 millimetri. Collegali a un generatore di impulsi in grado di produrre stimolazione di campo, impulsi di varia intensità, frequenza e forma d'onda per consentire al sistema di produrre stimolazione di campo delle cellule quando appropriato. Imbullonare un laser al neon ad elio montato su tavolini di traslazione XY sul lato inferiore del tavolo del microscopio.

Quindi regolare il laser in modo che il raggio laser sia diretto attraverso la base del piatto di coltura riscaldato con un angolo di 30 gradi rispetto al piano del cantilever. Il bullone successivo, un modulo fotorivelatore a quadrante montato su stadi di traslazione XY sul lato inferiore del tavolino del microscopio. Regolare la sua posizione in modo che il raggio laser riflesso atterri al centro dei quattro quadranti.

Scrivere un programma software per controllare gli attuatori lineari che scansionano i cantilever con riferimento al diagramma di flusso fornito nel protocollo di testo. Attivare l'hardware di analisi a sbalzo e il software associato. Inserire il tavolino riscaldato ther mrta nel fluido e attendere che legga 37 gradi Celsius.

Quindi, inserire il chip a sbalzo nel tavolino con i cantilever orientati verso il lato destro del palco. Accendere la sorgente luminosa del microscopio. Focalizzare il microscopio per portare in vista i bordi dei cantilever e utilizzare il software di controllo del fotorilevatore laser per posizionare il raggio laser sulla punta di quello a sbalzo, supponendo che i cantilever siano orientati a destra del cantilever del tavolino.

Uno è quello posizionato in alto a sinistra dell'array e i numeri scendono a 16. In basso a sinistra. Il cantilever 17 si trova nella posizione in alto a destra e arriva a 32.

In basso a destra premere play sul software di registrazione. Posizionare il fotorilevatore in modo che il segnale legga zero in entrambi i fotogrammi x e y regolando i motori passo-passo che controllano il fotorilevatore. Quindi impostare la posizione del cantilever di uno nel software di controllo del fotorilevatore laser.

Quindi, spostare il laser sulla punta del cantilever 16. Ripetere il posizionamento del fotorilevatore e impostare la posizione del cantilever 16 nel software di controllo del fotorilevatore laser. Ora sposta il laser sulla punta del cantilever 32.

Ripetere il posizionamento del fotorilevatore e impostare la posizione del cantilever 32 nel software di controllo del fotorilevatore laser. Infine, spostare il laser sulla punta del cantilever 17. Ripetere il posizionamento del fotorilevatore e impostare la posizione del cantilever 17 nel software di controllo del fotorilevatore laser.

Spegnere la sorgente luminosa del microscopio e poi la luce dall'alto in laboratorio. Premere il tasto di registrazione sul software di registrazione. Impostare l'hardware del generatore di impulsi su impulsi da 40 millisecondi e cinque volt, una frequenza di un hertz.

Quindi accendere la macchina Utilizzando il software di controllo del fotorilevatore laser, impostare l'hardware per la scansione attraverso l'array di 32 cantilever. Fermandosi per cinque secondi a ciascuno. Al termine della scansione dei 32 cantilever, spegnere lo stimolatore.

Quindi arrestare il software di registrazione e visualizzare il file di dati. Esaminare la traccia registrata da ciascun cantilever. Per la prova dell'attività contrattile.

Una contrazione è definita come un picco. Se la deflessione è di almeno 0,1 volt al di sopra della linea di base, prendere nota di ciascun cantilever con risposte positive. Rimuovere eventuali cantilever non reattivi dal protocollo di scansione sul software di controllo del fotorilevatore laser.

I cantilever attivi possono quindi essere riscansionati senza stimolazione per ottenere una lettura dell'attività contrattile spontanea della cellula. Successivamente, aggiungere un composto terapeutico al terreno per osservarne l'effetto sull'output funzionale delle cellule in coltura. Dopo l'aggiunta di scansioni composte con o senza stimolazione elettrica ad ampio campo, eseguire valutazioni della fatica stimolando elettricamente le cellule per periodi prolungati, seguite da scansioni dei livelli di contrattilità per misurare quanto tempo impiega la forza di picco a scendere al di sotto di una soglia specifica.

Negli esperimenti in cui i motoneuroni sono mantenuti in co-coltura con il muscolo misurano la formazione della giunzione neuromuscolare attraverso il trattamento di cocolture a sbalzo del tubo mio-neuro motorio con uno stimolante neuronale o un inibitore sinaptico e la scansione di aumenti e diminuzioni dell'attività spontanea, procedere all'analisi dei dati di deflessione a sbalzo come dettagliato nel protocollo di testo. La coltura di successo di cellule contrattili su cantilever è una procedura relativamente semplice che utilizza tecniche di coltura cellulare standard. Il software elettrofisiologico standard può essere utilizzato per analizzare i dati grezzi facilitando il calcolo delle proprietà funzionali rilevanti, come il tempo di forza di picco alla forza di picco e il tempo di rilassamento parziale.

Protocolli di stimolazione estesi forniscono i mezzi per valutare i tassi di affaticamento nelle cellule in coltura, ampliando così il livello di dati fisiologici ottenibili da questo sistema. Il sistema di coltura a sbalzo può essere modificato per includere i motoneuroni nel sistema di coltura con miotubi muscolari scheletrici, in modo da consentire la valutazione della formazione di sinapsi neuromuscolari in vitro. In tali colture, i tassi di attività contrattile spontanea sono confrontati con i tassi di contrazione in risposta al trattamento con uno stimolante neuronale specifico come il glutammato.

Qualsiasi aumento osservato indotto dal glutammato nei tassi di contrazione suggerisce l'attivazione di neuroni in coltura che porta al rilascio di acetilcolina e alla successiva attivazione del miotubo Il trattamento con inibitori sinaptici come il bloccante del recettore dell'acetilcolina, dtu rina che porta alla cessazione dell'attività indotta dal glutammato fornisce ulteriori prove della presenza di sinapsi neuromuscolari funzionali in queste colture. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare i cantilever in silicio su microscala per valutare le proprietà funzionali del muscolo scheletrico in coltura.