Summary
癌幹細胞（CSCは）による化学療法耐性に対する腫瘍の再発に関与している。私たちは、選択および卵巣癌細胞株からのCSCの拡張のためのプロトコールを最適化した。化学療法剤シスプラチンで細胞を処理し、私たちは非接着CSC培養液を濃縮するメディアを促進幹細胞で培養することによる。
Abstract
癌幹細胞（CSCが）をゆっくりサイクリング、高度に増殖性の侵襲性生成するために非対称的に分裂未分化細胞、および化学療法抵抗性の腫瘍細胞のサブセットとして定義される。そのため、CSCは、治療標的とする細胞の魅力的な集団である。 CSCは、血液、脳、肺、胃腸管、前立腺、および卵巣のものを含む悪性腫瘍の種類の数に貢献すると予想される。単離とのCSCのための腫瘍細胞集団を濃縮すると、プロパティ、遺伝学、およびのCSC治療反応を研究する研究者ができるようになります。私たちは、再現可能に卵巣癌細胞株（SKOV3及びOVCA429）から卵巣癌のCSCが富化プロトコルを生成しました。細胞株は、3日間20μMのシスプラチンで処理される。生存細胞は、サイトカインおよび成長因子を含む血清を含まない幹細胞培地中で単離され、培養される。私たちは、kの単離した細胞を分析することによって、これらの精製のCSCの濃縮を実証ノウン細胞マーカーのOct4、Nanogの、およびPROM1（CD133）およびCD177およびCD133の細胞表面発現ステム。 CSCは展示は化学療法抵抗性を増加させた。 CSCを単離するためのこの方法は、化学療法抵抗性および腫瘍の再発でのCSCの役割を研究するための有用なツールである。
Protocol
卵巣癌細胞株の1。細胞培養および蛍光標識
- 10％ウシ胎児血清（FBS）を補充したマッコイ培地、0.1 mMのL-グルタミン、50 U / mlペニシリン、および50μg/ mlストレプトマイシン：SKOV3メディアを準備する。 10％FBS、1mMピルビン酸ナトリウム、0.1 mMのL-グルタミン、50 U / mlペニシリン、および50μg/ mlのストレプトマイシンを補充した最小必須培地（MEM）でOVCA429細胞を維持する。
- 5％のCO 2、37℃で加湿インキュベーター中SKOV3とOVCA429細胞株を伝播します。 40〜50％の集密度に細胞を成長させる。
- インビトロおよびインビボでの生存率を監視するために、赤色蛍光タンパク質（RFP）を発現する細胞を生成する。
- RFPを発現してSKOV3細胞を生成するには、72時間ペニシリンおよびストレプトマイシンが存在しない場合に、RFPとSKOV3メディアへの10μg/ mlのポリブレンを発現するレンチウイルス粒子を添加する。
- 72時間後、蛍光活性化細胞SortiによってRFP陽性の細胞を選択するngの（FACS）を以下のようにトリプシン処理のRFPおよび非RFP発現細胞を、5分間、125×gで遠心分離、0.1％BSAを含有するPBS中で10 7細胞/ mlで再懸濁細胞。セルソーターに、選別パラメータを決定する非RFP細胞を使用する。その後、561 nmのレーザーを用いて高RFPを発現する細胞を集める。
- レンチウイルスプラスミドは、抗生物質耐性カセットを表現する場合には別の方法として、適切な抗生物質中で培養することによってRFP発現する細胞を選択します（例えば10 mg / mlのブラストサイ）。注：使用する必要があるレンチウイルス粒子の量は、バッチによっておよび細胞型によって変化することができる。適切なレンチウイルス力価は、各細胞型について決定されるべきである。
がん幹細胞の2。エンリッチメント
- 72時間のシスプラチン、20μMとSKOV3、SKOV3-RFP、またはOVCA429細胞株を扱う。注意：シスプラチンは毒性が強い。防護服/手袋を使用し、皮膚や粘膜の膜との接触を避ける。シスプラチン私に捨てないでくださいn個の排水。
- CSCメディアの準備：5μg/ mlのインスリン、10ng / mlのヒト組換え上皮成長因子（EGF）、10ng / mlの塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）を補充した無血清DMEM / F12培地を、12 / mlの白血病抑制因子および0.4％ウシ血清アルブミン（BSA）。
- 細胞をトリプシン処理。 CSC培地中で生存細胞培養。
注：文化非接着スフェロイド中2日後に形成することになる。 - 細胞を含有し、5分間125×gで遠心分離し、メディアを収集することにより、2日おきにメディアを変更します。そして、新鮮なCSC培地でペレットを再懸濁します。細胞を計数し、トリパンブルー排除を実行することにより、2日ごとに実行可能性のために細胞を確認してください。
- その後、5分間129×gでの遠心分離グアニジニウムthiocynate（RNA）を含むフェノールペレットを再懸濁することにより更なる実験のためのCSCを収集、リン酸緩衝生理食塩水（PBS：137mMのNaCl、2.7mMのKCl、11.9 mMリン酸緩衝液、pH7.4）で（フローサイトメトリー用の）0.1％のBSA、またはCSCメディアが継続する細胞を培養する。
- 20Xと40Xの倍率で光学顕微鏡を用いてCSC細胞形態を監視します。
幹細胞マーカーのための遺伝子発現解析を経由して3のCSCキャラ
- メディアは5分間129×gで遠心分離し、細胞を含有する収集、およびフェノールを含むグアニジニウムthiocynateの溶液中にペレットを再懸濁することにより、CSCの3製剤を集める（RNA抽出のための他の方法を用いることができる）。
- 製造業者のプロトコールに従ってTRIzolを使用して全RNAを準備します。市販のcDNA逆転写キットを用いてRNAの0.1μgのから相補的DNA（cDNA）を合成する。
- 定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（QRT-PCR）を行う。
- サンプルあたり8μlの総するQRT-PCRミックス、プライマー、および水を含むプライマーのセットごとにマスターミックスを構成する（異なる蛍光体を有するプライマーは、同じウェルで増幅することができる）。例えば、生成する1のOct4-FAM用のマスターミックス、Nanogの、ヘックス、およびGAPDH-CY5。ネスチンとPROM1に個別のマスターミックスを生成します。サンプルあたりのcDNA鋳型の2を添加する。
注記：この研究のために、QRT-PCRは、表1に列挙されたプライマーを用いて行った。 - 複数のフルオロフォアを検出することが可能なリアルタイムPCRサーモを使用して、各サンプルについてはすべて2重QRT-PCRを実行します。何テンプレートコントロールが含まれていない。
- ΔΔCT法を用いて、各サンプルについてGAPDHの発現に対する幹細胞の遺伝子発現を正規化する。
- サンプルあたり8μlの総するQRT-PCRミックス、プライマー、および水を含むプライマーのセットごとにマスターミックスを構成する（異なる蛍光体を有するプライマーは、同じウェルで増幅することができる）。例えば、生成する1のOct4-FAM用のマスターミックス、Nanogの、ヘックス、およびGAPDH-CY5。ネスチンとPROM1に個別のマスターミックスを生成します。サンプルあたりのcDNA鋳型の2を添加する。
| 10月 - 4-FAM | プライマー1：5'-CCCAAGGAATAGTCTGTAGAAGTG-3 ' |
| プライマー2：5'-TGCATGAGTCAGTGAACAGG-3 ' | |
| FAMプローブ：5'-CTTCCAAGC / ZEN / TGCCCACCTAACTTCT / 3IABkFQ -3 ' | |
| のNanog-HEX | プライマー1：5'-CCTTCTGCGTCACACCATT-3 ' |
| プライマー2：5'-AACTCTCCAACATCCTGAACC-3 ' | |
| HEXプローブ：5'-CTGCCACCT / ZEN.CTTAGATTTCATTCTCTGGT / 3IABkFQ-3 ' | |
| GAPDH-CY5 | プライマー1：5'-TGTAGTTGAGGTCAATGAAGGG-3 ' |
| プライマー2：5'-ACATCGCTCAGACACCATG-3 ' | |
| CY5プローブ：5'-AAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGTC / 3IABRQSP-3 ' | |
| ネスチン-FAM | プライマー1：5'-AGGACCTGAGCGATCTGG-3 ' |
| プライマー2：5'-CGTTGGAACAGAGGTTGGAG-3 ' | |
| FAMプローブ：5'-AACTTTTCA / ZEN / GTAGCCCGCAGCC / 3IABkFQ -3 ' | |
| CD133-HEX | プライマー1：5'-ACTCTCTCCAACAATCCATTCC-3 ' |
| プライマー2：5'-AAACAATTCACCAGCAACGAG-3 ' | |
| HEXプローブ：5'-ACAATCACT / ZEN / GAGCACTCTATACCAAAGCG / 3IABkFQ-3 |
QRT-PCRにより、CSCの特徴付けに使用表1プライマー。
e_title "> 4。細胞表面マーカーCD117及びCD133のためのCSCの分析- 細胞を含有し、5分間125×gで遠心分離媒体を収集することによって収穫のCSC。細胞を、破壊するために、非タンパク質分解細胞剥離溶液500μlを追加します。 5分間125×gで遠心分離細胞は、細胞剥離液を除去した。その後、冷たいPBSで2回細胞を洗浄する。
- 標識細胞の前に1時間、通常の増殖培地中でインキュベートする。 129×gで5分間細胞をスピンダウン。抗CD133-PEおよび抗CD117-FITC 0.1％BSAを含むPBSで細胞を再懸濁する。
- 1％パラホルムアルデヒド中で一晩細胞を固定します。注意：ホルムアルデヒドは有毒（被疑物質）である。ドラフト内で行って、一週間以内に使用しています。
- CD117（FITCと結合した抗CD117付き）と（PEに結合した抗CD133付き）CD133フローサイトメーター上の細胞表面発現を分析するために、フローサイトメトリーを実行します。チャネル（PE用）（FITC用）FL1とFL3のセルのデータを収集します。の両方を発現する細胞についてゲートを生成するFITCおよびPE。 4象限（FITC-とPE-、FITC + PE-、FITC- PE +、およびFITC +およびPE +）とのドットプロットを生成し、各象限における細胞の数を決定します。
5。治療反応のためのCSCの分析
- プレートを一晩96ウェルプレート上にウェル当たり5,000細胞（SKOV3、SKOV3-RFP、SKOV3 CSCとSKOV3-RFPのCSC）。
- 96時間シスプラチン（0、1、10、100、1000μM）またはパクリタキセル（0、0.01、0.1、1、10、及び100μM）で処理する。
- MTT（3 - （4,5 - ジメチルチアゾール2 - イル）-2,5 - ジフェニルテトラブロミド）細胞生存率アッセイを行う。
- プレート5000 96ウェルプレート上のウェルあたり100μlあたりの細胞（連でプレート細胞および培地のみ対照ウェルが含まれる）。
- 24時間後、10 mg / mlのMTTを10μlを加える。 （沈殿物が形成されるまで）2-4時間、37℃でインキュベートする。
- MTT溶剤4 mMのHClを100μlの、イソプロパノール中の0.1％NP-40を追加します。暗所で15分間インキュベートします。
- プレートrに570nmでプレートを読むeader。
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Representative Results
私たちは、シスプラチン処理を用いて上皮性卵巣癌細胞株からのCSCを単離することを実証するために、最初の治療の前および選択後の細胞系の画像を取得した。私たちは、付着性（未処理）SKOV3とOVCA429細胞およびSKOV3とOVCA429のCSC（ 図1）の画像をキャプチャするために、光学顕微鏡を使用していました。 CSCはラウンド表示され、組織培養プレート（ 図1および図2）に取り付けられていない。今後も、RFPで形質導入SKOV3細胞は、細胞が（ 図2B）生存していることを実証するのCSCを単離した後、その蛍光を保持していることを示している。
生存可能なCSC培養物は薬物療法に対する応答について評価した。 CSCは（特に100μMで）シスプラチンとパクリタキセル（10μM）（ 図3）に対する耐性の増加を示した。のCSCは、しばしば幹細胞遺伝子の発現によって特徴付けられる。 CD133の発現は（もPROM1としても知られている）、ネスチン、Nanogの、およびOct4を検討した。 CD133が大幅に未処理（対照）細胞（ 図4A）と比較して、SKOV3 CSC培養で誘導した。 CD133はまた、OVCA429とOVCA429-RFP細胞（データは示さず）で16倍、13倍、未処理対照と比較して、CSCの培養物において誘導した。最初の実験ではあるOct4、Nanogの、そしてネスチンは、未処理と比較して、SKOV3 CSC培養で上昇していたが、結果は統計的に有意な（ 図4A）はありませんでした。これらの実験を繰り返してたらOct4およびNanogのは、ペアレンタルコントロール細胞（ 図4B）と比較して、SKOV3のCSCで増加した。 Oct4のは、CSCの濃縮プロトコル（図示せず）は、次のOVCA429とOVCA429-RFP細胞で4.7倍及び8倍増加した。最後に、SKOV3のCSCの展示は、CSCマーカーCD117（ 図5）の細胞表面発現を増加させた。結論として、この方法は、卵巣癌において（幹細胞マーカーを発現する）実行可能なスフェロイドのCSCの選択を可能にする幹細胞培地中のシスプラチンと成長との選択による細胞株。
SKOV3とOVCA429細胞から選択図SKOV3の1形態とOVCA429細胞とがん幹細胞（CSCを）。位相差顕微鏡は、未処理であるとのCSC（回転楕円体）に設定されています。SKOV3とOVCA429細胞（接着性）を示す。
CSCは図2.濃縮は非付着性スフェロイドが得られます。未処理である（A）SKOV3細胞の未処理とのCSC（60X倍率）について濃縮。（B）SKOV3-RFP細胞（aとb）またはCSCはについて濃縮（C d）。左パネルは、位相コントラスト画像を表しており、右のパネルは、蛍光を示す。オリジナルの倍率40倍。スケールバー= 400ミクロン。
図3のCSCの展示は、未処理の細胞株と比較して化学療法抵抗性を増加させた。SKOV3（AおよびB）およびSKOV3-RFP（C及びD）、SKOV3のCSC（AおよびB）およびSKOV3-RFPのCSC（C及びD）はさまざまなで処理したシスプラチンの濃度（AおよびC）またはパクリタキセル（タキソール）、（BおよびD）。 96時間処置後のMTTアッセイを行った。実験は≧3で実施し、統計情報は、双方向ANOVAを用いて計算した。 *はp <0.05、***はp < ;。0.0005 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
未処理細胞と比較してのCSCにおける図4の幹細胞マーカーの発現。QRT-PCR解析をSKOV3（コントロール）とSKOV3のCSCを行った。（A）CD133（PROM1）、ネスチン、Nanogの、およびOCT4（GAPDHに対して正規化された）。（ B）さらなる実験は、SKOV3-RFPのCSCを、未処理細胞と比較して高められたOCT4およびNanog、このプロトコル収率細胞から得られることを実証する。結果は、GAPDH発現を標準化した。 N = 3と統計は、学生T検定を用いて計算した。 ** P <0.02、*** P <0.002。
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SKOV3細胞における幹細胞マーカーの図5。フローサイトメトリー分析とSKOV3のCSC単独で、または形質導入またはRFPなしで。CD133、CD117、およびCD133（A）SKOV3イン/ CD117の発現（未処理/対照）細胞、（B）SKOV3 CSCは、 （C）SKOV3-RFP未処理細胞、および（D）SKOV3-RFPのCSC。実験は三連で実施した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
治療に抵抗性であるCSCは、原発腫瘍の治療後の再発に責任があります。 CSCはの特徴付けは、卵巣癌のための改善された治療法につながる可能性があります。上記のプロトコルを使用して、化学療法抵抗性のCSCの確立において重要なパラメータは、化学療法による治療の長さおよび化学療法の濃度チャートである。 Ma らにプロトコルを使用する場合。それは、シスプラチン及びパクリタキセルによる治療の7日後に、生存可能な細胞が4残っていないことが判明した。 （20μMシスプラチンの代わりに40μMのシスプラチンと10μMのパクリタキセルと）3日に治療を低減することにより、実行可能な化学療法抵抗性の細胞とCSCは開発しました。治療の長さおよび用量は、異なった卵巣癌細胞株のために改変される必要があり得る。
このプロトコルの主な制限は、CSCがが生存したままの長さである。このプロトコルを使用すると、CSCは週未満のための実行可能なままである。そのため、目CSCはのための実験および解析のEタイプは、慎重にタイミングを合わせる必要がある。
のCSCのさらなる特徴付けを行う必要がある。これは、これらの細胞型の間の類似性および差異を決定するために、CSCの生成の他の方法のCSCは、この方法を比較することが有用であろう。幹細胞マーカー、治療に対する応答、およびin vivoでの分析のための最良のシステムを比較すると、のCSC /選択を生成するための異なる方法の間で行われる必要がある。したがって、このプロトコルによって生成されたCSCのどのようなタイプのさらなる定義は、それらがヒトの悪性腫瘍にどのように関連するかを判断するのに役立ちうる、幹細胞マーカーと患者の10〜12に対して異なる予後の異なる発現パターンを有するのCSCの異なる種類があることが示唆されている。最後に、厳密にCSCは、このプロトコルから単離されたことを実証するために決定的であるCSCは、細胞は、限界希釈アッセイにおいて、免疫不全マウスに注射する必要がある。このアッセイは、CSCは、低密度で卵巣腫瘍を生成することができることを示している。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| McCoy | Life Technologies | 16600-108 | Warm to 37 °C prior to use |
| DMEM / F12 serum free | Life Technologies | 11320-033 | Warm to 37 °C prior to use |
| Minimal Essential Media | Life Technologies | 42360032 | Warm to 37 °C prior to use |
| Sodium pyruvate | Life Technologies | 11360070 | |
| Polybrene | Millipore | TR-1003-G | |
| Blasticidin | Life Technologies | R21001 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlas Biologicals | F-0500-A | |
| Penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | |
| Cisplatin | Sigma-Aldrich | T7402-5MG | Caution: Toxic. Use precautions |
| pLenti-suCMV-Rsv | Gentarget | LVP023 | BSL2 approval needed |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I-1882 | |
| Human Recombinant EGF | Cell Signaling Technology | 8916LC | |
| bFGF | BD biosciences | 354060 | |
| LIF | Santa Cruz | sc-4988A | |
| Bovine Serum Albumin | Roche | 03 116 956 001 | |
| TRIzol | Life Technologies | 15596-018 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368813 | |
| IQ Multiplex Powermix | BioRad | 1725849 | |
| Accumax | Millipore | ||
| Primers | Integrated DNA Technology | individually designed and ordered (see protocol for sequnces) | |
| Anti-CD133 PE | Milenyl | 130-098-826 | Primer/probe sets are light sensitive |
| CD117-Biotin | Miltenly | 130-098-570 | |
| AntiBiotin-FITC | Miltenly | 130-098-796 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | Caution: Toxic. Always prepare in hood and make fresh. |
| Trypsin | Life Technologies | 25300062 | |
| MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) | Sigma-Aldrich | 25200-072 | |
| EVOS Fl Epifluorescence and Transmitted Light Microscope | Advanced Microscopy Group | ||
| Biorad CFX96 C1000 System | Biorad | ||
| Beckman Coulter FC500 Flow Cytometer | Beckman Coulter | ||
| Spectramax 340PC384 | Molecular Devices |
References
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