Summary
Раковые стволовые клетки (ЦОК) вовлечены в рецидива опухоли за счет химической устойчивости. Мы оптимизировали протокол для отбора и расширения ЦОНов от рака яичников клеточных линий. По обработке клеток химиотерапевтического цисплатин и культивирование в стволовой клетки содействия СМИ мы обогащаем для неадгезивных культур CSC.
Abstract
Раковые стволовые клетки (ЦОК) определяются как подмножество медленной езды на велосипеде и недифференцированных клеток, которые делятся асимметрично генерировать высоко пролиферативные, инвазивные и химиорезистентных опухолевых клеток. Поэтому, CSCs являются привлекательным популяция клеток целевой терапевтически. ОКК по прогнозам, способствовать ряда видов злокачественных опухолей в том числе в крови, мозге, легких, желудочно-кишечного тракта, предстательной железы, яичника и. Изоляция и обогащения популяции опухолевых клеток для ЦОНов позволит исследователям изучать свойства, генетика, и терапевтический ответ ЦОНов. Мы создали протокол, который воспроизводимо обогащает для яичников ЦОНов рака яичников линий раковых клеток (SKOV3 и OVCA429). Клеточные линии, которые обрабатывают 20 мкМ цисплатина в течение 3 дней. Выжившие клетки выделяют и культивируют в не содержащей сыворотки среде стволовых клеток, содержащей цитокины и факторы роста. Мы демонстрируем обогащение этих очищенных ЦОНов, анализируя отдельные клетки для кNown маркеров стволовых клеток Oct4, Nanog, и Prom1 (CD133) и клеточной поверхности экспрессию CD177 и CD133. CSCs обладают повышенной химической устойчивости. Этот метод для изоляции ЦОНов является полезным инструментом для изучения роли ЦОНов в химиорезистентность и опухоли рецидива.
Protocol
1 Культура клеток и Флуоресцентная маркировка яичников линиях раковых клеток
- Подготовка SKOV3 носитель: МакКой, дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 0,1 мМ L-глутамина, 50 Ед / мл пенициллина и 50 мкг / мл стрептомицина. Поддержание OVCA429 клеток в минимальной необходимой массовой информации (MEM) с добавлением 10% FBS, 1 мМ пирувата натрия, 0,1 мМ L-глутамина, 50 Ед / мл пенициллина и 50 мкг / мл стрептомицина.
- Размножаются SKOV3 и OVCA429 клеточных линий в увлажненном инкубаторе при температуре 37 ° С с 5% СО 2. Рост клеток в 40-50% слияния.
- Генерация клетки, экспрессирующие красный флуоресцентный белок (RFP) в целях контроля за жизнеспособность в пробирке и в естественных условиях.
- Для генерации SKOV3 клетки, экспрессирующие RFP, добавить лентивирусов частиц выражения RFP и 10 мкг / мл полибрена к SKOV3 средах в отсутствие пенициллина и стрептомицина в течение 72 часов.
- После 72 часов, выберите для RFP-положительных клеток от клеток с возбуждением флуоресценции Sortiнг (FACS) следующим образом: Trypsinize RFP и не RFP выражая клетки, центрифуги при 125 мкг в течение 5 мин, ресуспендирования клеток в 10 7 клеток / мл в PBS, содержащим 0,1% БСА. На мобильном сортировщика, использовать не RFP клетки для определения сортировки параметров. Тогда собрать клетки, которые выражают высокую ЗП, используя 561 нм лазер.
- С другой стороны, если лентивирусов плазмида экспрессирует антибиотик кассету сопротивления, выбрать для RFP экспрессирующих клеток при культивировании в соответствующий антибиотик (например, 10 мг / мл бластицидин). Примечание: объем лентивирусов частиц, который должен быть использован могут варьироваться в зависимости от партии и от типа клеток. Правильное лентивирусов титр должен быть определен для каждого типа клеток.
2 Обогащение раковых стволовых клеток
- Лечить SKOV3, SKOV3-RFP, или OVCA429 клеточных линий 20 мкм цисплатина в течение 72 часов. ВНИМАНИЕ: Цисплатин является токсичным. Используйте защитную одежду / перчатки и избегать контакта с кожей и слизистых оболочек. Не выбрасывайте цисплатин Iн сточных вод.
- Подготовьте носитель CSC: свободный DMEM / F12 массовой информации в сыворотке с добавлением 5 мкг / мл инсулина, 10 нг / мл человеческого рекомбинантного фактора роста эпидермиса (EGF), 10 нг / мл основного фактора роста фибробластов (bFGF), 12 нг / мл фактора ингибирования лейкемии , и 0,4% бычьего сывороточного альбумина (БСА).
- Trypsinize клетки. Культура выживших клеток в CSC СМИ.
ПРИМЕЧАНИЕ: После 2 дней в культуре неадгезивных сфероидов сформирует. - Изменение среды каждые 2 дня, собирая средой, содержащей клетки и центрифугированием при 125 х г в течение 5 мин. Тогда ресуспендируют осадок в пресной CSC СМИ. Проверьте клетки для жизнеспособности каждые 2 дня, считая клетки и выполнения трипанового синего.
- Затем собирают CSCs для дальнейших экспериментов центрифугированием 129 х г в течение 5 мин и ресуспендирования осадка в фенол, содержащий гуанидина thiocynate (РНК), забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS: 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, и 11,9 мМ фосфатного буфера, рН 7,4) с 0,1% BSA (для проточной цитометрии), или CSC СМИ продолжатькультивирования клеток.
- Монитор CSC морфологию клеток с помощью светового микроскопа на 20x и 40х увеличении.
3 CSC Характеристика помощью анализа экспрессии генов для маркеров стволовых клеток
- Собирают 3 препараты CSCs путем сбора среды, содержащей клетки, центрифугированием при 129 х г в течение 5 мин и ресуспендирования осадка в растворе фенол, содержащий гуанидина thiocynate (могут быть использованы другие способы для экстракции РНК).
- Подготовка общей РНК с помощью TRIzol соответствии с протоколом производителя. Синтезировать комплементарную ДНК (кДНК) от 0,1-1 мкг РНК с использованием коммерчески доступного обратной транскрипции кДНК комплект.
- Выполнение количественного обратной транскрипции полимеразной цепной реакции (QRT-PCR).
- Составляют основной смеси для каждого набора праймеров, содержащих QRT-PCR смесь, грунтовки, и вода до общего объема 8 мкл каждого образца (праймеры с различными флуорофоров может быть усилен в той же скважине). Например, генерируютодин хозяин смесь для Oct4-FAM, Nanog-Hex, и GAPDH-Cy5. Генерация отдельные главные миксов для нестин и Prom1. Добавить 2 мкл матрицы кДНК в образце.
Примечание: В данном исследовании QRT-ПЦР проводили с использованием праймеров, перечисленных в таблице 1. - Выполните все QRT-PCR в двух экземплярах для каждого образца с помощью ПЦР в реальном времени амплификаторе способный обнаруживать несколько флуорофоры. не включают элементы управления шаблона.
- Нормализовать гена клеток выражение штока к выражению GAPDH для каждого образца с помощью метода ΔΔC T.
- Составляют основной смеси для каждого набора праймеров, содержащих QRT-PCR смесь, грунтовки, и вода до общего объема 8 мкл каждого образца (праймеры с различными флуорофоров может быть усилен в той же скважине). Например, генерируютодин хозяин смесь для Oct4-FAM, Nanog-Hex, и GAPDH-Cy5. Генерация отдельные главные миксов для нестин и Prom1. Добавить 2 мкл матрицы кДНК в образце.
| Oct-4-FAM | Праймер 1: 5'-CCCAAGGAATAGTCTGTAGAAGTG-3 ' |
| Праймер 2: 5'-TGCATGAGTCAGTGAACAGG-3 ' | |
| FAM зонд: 5'-CTTCCAAGC / ZEN / TGCCCACCTAACTTCT / 3IABkFQ -3 ' | |
| Nanog-HEX | Праймер 1: 5'-CCTTCTGCGTCACACCATT-3 ' |
| Праймер 2: 5'-AACTCTCCAACATCCTGAACC-3 ' | |
| HEX зонд: 5'-CTGCCACCT / ZEN.CTTAGATTTCATTCTCTGGT / 3IABkFQ-3 ' | |
| GAPDH-Cy5 | Праймер 1: 5'-TGTAGTTGAGGTCAATGAAGGG-3 ' |
| Праймер 2: 5'-ACATCGCTCAGACACCATG-3 ' | |
| Cy5 зонд: 5'-AAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGTC / 3IABRQSP-3 ' | |
| Нестин-FAM | Праймер 1: 5'-AGGACCTGAGCGATCTGG-3 ' |
| Праймер 2: 5'-CGTTGGAACAGAGGTTGGAG-3 ' | |
| FAM зонд: 5'-AACTTTTCA / ZEN / GTAGCCCGCAGCC / 3IABkFQ -3 ' | |
| CD133-HEX | Праймер 1: 5'-ACTCTCTCCAACAATCCATTCC-3 ' |
| Праймер 2: 5'-AAACAATTCACCAGCAACGAG-3 ' | |
| HEX зонд: 5'-ACAATCACT / ZEN / GAGCACTCTATACCAAAGCG / 3IABkFQ-3 |
Таблица 1 Праймеры, используемые для определения характеристик CSC по QRT-PCR.
e_title "> 4. Анализ ЦОК для сотового поверхностных маркеров CD117 и CD133- Урожай CSCs собирая среды, содержащие клетки и центрифугирования при 125 мкг в течение 5 мин. Добавить 500 мкл из не-протеолитической клеток отряда решение для распада клеток. Центрифуга клетки при 125 мкг в течение 5 мин для удаления клеток отряд решение. Затем промыть клетки дважды холодным ФСБ.
- Инкубировать в нормальном питательной среды в течение 1 часа до маркировки клеток. Спин вниз клетки в течение 5 минут при 129 х г в. Ресуспендируют клеток в PBS с 0,1% BSA с анти-CD133-PE и анти-CD117-FITC.
- Fix клеток в течение ночи в 1% параформальдегиде. Внимание: Параформальдегид токсичен (канцероген). Сделайте в вытяжном шкафу и использовать в течение недели.
- Выполните проточной цитометрии для анализа CD117 (с анти-CD117, конъюгированного с FITC) и CD133 (с анти-CD133, конъюгированное с РЕ) на клеточной поверхности выражением на проточной цитометрии. Сбор данных на клетки в FL1 (для FITC) и FL3 (для ПЭ) каналов. Генерация ворота для клеток, экспрессирующих какFITC и PE. Создайте точечный участок с 4 квадранта (FITC- и ПЭ, FITC + ПЭ, FITC- PE + и FITC + и PE +) и определить количество клеток в каждом квадранте.
5 Анализируя CSCs для терапевтического ответа
- Plate 5000 клеток на лунку (SKOV3, SKOV3-RFP, SKOV3 CSC и SKOV3-RFP ЦОНов) на 96-луночных планшетах на ночь.
- Treat с цисплатином (0, 1, 10, 100, и 1000 мкм) или паклитаксел (0, 0,01, 0,1, 1, 10 и 100 мкМ) в течение 96 часов.
- Выполнение МТТ (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолийбромид) жизнеспособность клеток для анализа.
- Пластинчатые 5000 клеток на 100 мкл на лунку на 96-луночный планшет (пластинчатые элементы в двух экземплярах и включать в себя носители только контрольные лунки).
- После 24 часов, добавляют 10 мкл 10 мг / мл МТТ. Инкубируют при 37 ° С в течение 2-4 ч (до осадка форм).
- Добавить 100 мкл МТТ растворителя 4мМ HCl, 0.1% NP-40 в изопропанола. Выдержите в течение 15 мин в темноте.
- Читайте пластин при 570 нм на тарелке гeader.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Чтобы продемонстрировать, что мы изолированы CSCs из эпителиальных клеточных линий рака яичников с помощью лечение цисплатином, сначала полученных изображений из клеточных линий до обработки и после отбора. Мы использовали световой микроскопии для захвата изображений приверженца (необработанный) SKOV3 и OVCA429 клетки и SKOV3 и OVCA429 ЦОК (Рисунок 1). ОКК появляются вокруг и не прикреплен к ткани культуральных планшетах (фиг.1 и 2). Кроме того, мы показали, что SKOV3 трансдуцированных RFP сохраняют свою флуоресценции после выделения из ЦОК, демонстрирующих, что клетки являются жизнеспособными (фиг.2В).
Жизнеспособные культуры CSC были оценены по их реакции на лекарственную терапию. ОКК продемонстрировал повышенную устойчивость к цисплатина (в частности, на 100 мкм) и паклитаксел (10 мкМ) (рисунок 3). ОКК часто характеризуются их экспрессии генов стволовых клеток. Выражение CD133 (также известный как Prom1), Нестин, Nanog, и Oct4 был рассмотрен. CD133 значительно индуцируется в SKOV3 CSC культур по сравнению с необработанных (контрольных) клеток (фиг.4А). CD133 также индуцируется в CSC культур по сравнению с необработанными контрольными от 16-кратного до 13-кратного в клетках OVCA429 и OVCA429-RFP (данные не показаны). В начальных экспериментах Oct4, Nanog, и Нестин были повышены в SKOV3 CSC культур по сравнению с необработанными, но результаты не были статистически значимыми (4А). Повторяя эти эксперименты Oct4 и Nanog увеличился в SKOV3 ЦОНов по сравнению с родительскими клетками управления (Рисунок 4б). Oct4 был увеличен на 4,7 раза и в 8 раз в OVCA429 и OVCA429-RFP клеток после протокола обогащения CSC (не показано). Наконец, SKOV3 CSCs обладают повышенной клеточной поверхности выражение КБК маркера CD117 (рисунок 5). В заключение, этот метод дает возможность выбора жизнеспособных сфероидных ЦОНов (выражающих маркеров стволовых клеток) в рака яичниковклеточные линии по выбору с цисплатин и роста стволовых клеток СМИ.
Рис.1 Морфология SKOV3 и OVCA429 клеток и раковых стволовых клеток (ЦОК), выбранный из SKOV3 и OVCA429 клеток. Фаза контрастной микроскопии изображает SKOV3 и OVCA429 клетки (клейкий), которые без лечения и были отобраны ЦОНов (сфероида).
Рисунок 2 Обогащение ЦОНов дает неадгезированных сфероидов. (А) Клетки необработанной SKOV3, а обогащенные для CSCs (60X кратное увеличение). (В) SKOV3-RFP клетки, которые обрабатывали (А и В) или обогащенный для CSCs (C г). Левые панели изображают контрастные изображения фазовых и правая панели изображают флуоресценции. Оригинальный увеличение 40X. Шкалы = 400 мкм.
Рисунок 3 ОКК демонстрируют повышенную химическую устойчивость по сравнению с необработанными клеточных линий. SKOV3 (А и В) и SKOV3-ЗП (C и D), SKOV3 ОКК (А и В) и SKOV3-RFP ОКК (C и D) обрабатывали различными концентрации цисплатин (А и С) или паклитаксела (таксола) (B и D). 96 часов после обработки МТТ-анализ был выполнен. Эксперименты проводились в n ³ 3 и статистические данные были рассчитаны с использованием Two Way ANOVA; * Р <0,05, *** р < ;. 0,0005 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4 стволовых клеток экспрессия маркеров в ЦОНов по сравнению с необработанными клетками. Анализ QRT-ПЦР проводили для SKOV3 (контроль) и SKOV3 ЦОНов. () CD133 (Prom1), Нестин, Nanog, и OCT4 (нормированная на GAPDH). ( B) Дополнительный эксперимент демонстрирует, что SKOV3-RFP CSCs получены из настоящего Протокола доходности клеток с повышенным OCT4 и Nanog сравнению с необработанными клетками. Результаты были нормализованы с выражением GAPDH. N = 3 и статистические данные были рассчитаны с использованием студентов Т-теста; ** Р <0,02, *** р <0,002.
5 "FO: контент-ширина =" 5 дюймов "SRC =" / файлы / ftp_upload / 51891 / 51891fig5highres.jpg "ширина =" 500 "/>
Рисунок 5 проточной цитометрии Анализ маркеров стволовых клеток в SKOV3 клеток и в одиночку или трансдуцировали или без ЗП SKOV3 ЦОК. CD133, CD117, CD133 и / CD117 выражение в (А) SKOV3 (без лечения / контроля) клетки, (B) SKOV3 ЦОК, (С) SKOV3-ЗП необработанных клеток, и (D) SKOV3-RFP ОКК. Эксперименты проводили в трех экземплярах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ЦОК, которые устойчивы к терапии может нести ответственность за рецидив после лечения первичной опухоли. Характеристика ЦОНов может привести к улучшению лечения для рака яичников. Критические параметры в создании химиорезистентных ЦОНов с вышеприведенной схемой являются временными длину лечения химиотерапией и концентрацию химиотерапии. При использовании протокола в Ма соавт. было установлено, что после 7 дней лечения с цисплатином и паклитакселом, не жизнеспособные клетки оставались 4. При снижении лечение до 3 дней (с 20 мкМ цисплатина вместо 40 мкм цисплатин и 10 мкМ паклитакселом), жизнеспособные химиорезистентных клетки и CSCs разработаны. Длина и доза лечения возможно, должны быть изменены для различных линий раковых клеток яичников.
Основным недостатком этого протокола является длина, что ЦОК остаются жизнеспособными. Используя этот протокол, в ЦОК оставаться жизнеспособными в течение менее чем за неделю. Поэтому йе типа экспериментов и анализа для ЦОНов необходимо тщательно просчитано.
Далее характеристика ЦОНов должна проводиться. Было бы полезно сравнить этот метод CSCs к другим методам поколения CSC, чтобы определить сходство и различие между этими типами клеток. Сравнение маркеров стволовых клеток, реакции на терапию, и лучшей системой для анализа в естественных условиях должна проводиться между различными методами для создания / выбора ЦОНов. Было высказано предположение, что существуют различные типы ЦОНов с различными моделями экспрессии маркеров стволовых клеток и различных прогнозом для пациентов 10-12, таким образом, дальнейшего определения, какой тип ЦОНов генерируются этого протокола поможет определить, как они относятся к человеческой злокачественности . Наконец, для того, чтобы тщательно показывают, что ОКК, выделенные из этого протокола являются окончательными ОКК, клетки должны быть введены в ослабленным иммунитетом мышей в ограничительном разбавления анализа. ЭтоАнализ показывает, что ОКК способны генерировать опухоли яичников при низкой плотности.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| McCoy | Life Technologies | 16600-108 | Warm to 37 °C prior to use |
| DMEM / F12 serum free | Life Technologies | 11320-033 | Warm to 37 °C prior to use |
| Minimal Essential Media | Life Technologies | 42360032 | Warm to 37 °C prior to use |
| Sodium pyruvate | Life Technologies | 11360070 | |
| Polybrene | Millipore | TR-1003-G | |
| Blasticidin | Life Technologies | R21001 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlas Biologicals | F-0500-A | |
| Penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | |
| Cisplatin | Sigma-Aldrich | T7402-5MG | Caution: Toxic. Use precautions |
| pLenti-suCMV-Rsv | Gentarget | LVP023 | BSL2 approval needed |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I-1882 | |
| Human Recombinant EGF | Cell Signaling Technology | 8916LC | |
| bFGF | BD biosciences | 354060 | |
| LIF | Santa Cruz | sc-4988A | |
| Bovine Serum Albumin | Roche | 03 116 956 001 | |
| TRIzol | Life Technologies | 15596-018 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368813 | |
| IQ Multiplex Powermix | BioRad | 1725849 | |
| Accumax | Millipore | ||
| Primers | Integrated DNA Technology | individually designed and ordered (see protocol for sequnces) | |
| Anti-CD133 PE | Milenyl | 130-098-826 | Primer/probe sets are light sensitive |
| CD117-Biotin | Miltenly | 130-098-570 | |
| AntiBiotin-FITC | Miltenly | 130-098-796 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | Caution: Toxic. Always prepare in hood and make fresh. |
| Trypsin | Life Technologies | 25300062 | |
| MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) | Sigma-Aldrich | 25200-072 | |
| EVOS Fl Epifluorescence and Transmitted Light Microscope | Advanced Microscopy Group | ||
| Biorad CFX96 C1000 System | Biorad | ||
| Beckman Coulter FC500 Flow Cytometer | Beckman Coulter | ||
| Spectramax 340PC384 | Molecular Devices |
References
- Pennington, K., Pulaski, H., Pennington, M., Liu, J. R. Too Much of a Good Thing: Suicide Prevention Promotes Chemoresistance in Ovarian Carcinoma. Curr Cancer Drug Targets. 10, 575-583 (2010).
- Thigpen, T. A rational approach to the management of recurrent or persistent ovarian carcinoma. Clin Obstet Gynecol. 55, 114-130 (2012).
- Burgos-Ojeda, D., Rueda, B. R., Buckanovich, R. J. Ovarian cancer stem cell markers: prognostic and therapeutic implications. Cancer letters. 322, 1-7 (2012).
- Ma, L., Lai, D., Liu, T., Cheng, W., Guo, L. Cancer stem-like cells can be isolated with drug selection in human ovarian cancer cell line SKOV3. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 42, 593-602 (2010).
- Bonnet, D., Dick, J. E. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nature Medicine. 3, 730-737 (1997).
- Alison, M. R., Lim, S. M., Nicholson, L. J. Cancer stem cells: problems for therapy. The Journal of pathology. 223, 147-161 (2011).
- Luo, X., Dong, Z., Chen, Y., Yang, L., Lai, D. Enrichment of ovarian cancer stem-like cells is associated with epithelial to mesenchymal transition through an miRNA-activated AKT pathway. Cell proliferation. 46, 436-446 (2013).
- Wang, L., Mezencev, R., Bowen, N. J., Matyunina, L. V., McDonald, J. F. Isolation and characterization of stem-like cells from a human ovarian cancer cell line. Molecular and cellular biochemistry. 363, 257-268 (2012).
- Abubaker, K., et al. Short-term single treatment of chemotherapy results in the enrichment of ovarian cancer stem cell-like cells leading to an increased tumor burden. Molecular cancer. 12, 24 (2013).
- Conic, I., Dimov, I., Tasic-Dimov, D., Djordjevic, B., Stefanovic, V. Ovarian epithelial cancer stem cells. ScientificWorldJournal. 11, 1243-1269 (2011).
- Liu, K. C., et al. Ovarian cancer stem-like cells show induced translineage-differentiation capacity and are suppressed by alkaline phosphatase inhibitor. Oncotarget. 4 (12), 2366-2382 (2013).
- Liu, T., Cheng, W., Lai, D., Huang, Y., Guo, L. Characterization of primary ovarian cancer cells in different culture systems. Oncology reports. 23, 1277-1284 (2010).
