Summary
암 줄기 세포 (암줄 기세포는) 때문에 chemoresistance에 종양 재발에 관여하고 있습니다. 우리는 선택 및 난소 암 세포주에서의 확장 된 CSC 프로토콜을 최적화했다. 화학 요법 시스플라틴 세포를 치료하고 우리는 비 부착 CSC 문화에 대한 풍부 미디어를 홍보 줄기 세포에서 배양.
Abstract
암 줄기 세포 (CSC 추가)는 느린 사이클 및 높은 증식 침습적 생성하는 비대칭 분할 미분화 세포 및 chemoresistant 종양 세포의 서브 세트로서 정의된다. 따라서 암줄 기세포는 치료 대상으로 세포의 매력적인 인구입니다. CSC 추가는 혈액, 뇌, 폐, 위장관, 전립선, 난소 및 사람들을 포함한 종양의 종류의 수에 기여할 것으로 예측된다. 격리하고 암줄 기세포에 대한 종양 세포의 인구는 암줄 기세포의 특성, 유전학 및 치료 반응을 연구하는 연구원을 가능하게 할 것이다 풍부. 우리는 재현성 난소 암 세포주 (SKOV3 및 OVCA429)에서 난소 암 된 CSC위한 풍요롭게 프로토콜을 생성. 셀 라인은 삼일에 20 μM 시스플라틴으로 처리됩니다. 살아남은 세포는 사이토 카인 및 성장 인자를 포함하는 무 혈청 줄기 세포 배지에서 배양하고 절연한다. 우리는 K 용 절연 세포를 분석하여 이들의 정제 된 CSC의 농축을 보여nown 세포 마커 인 Oct4, Nanog를하고 Prom1 (CD133) 및 CD177 및 CD133의 세포 표면 발현을 줄기. 암줄 기세포 전시 chemoresistance 증가했다. 암줄 기세포의 분리를위한이 방법은 chemoresistance 종양 재발에 암줄 기세포의 역할을 연구하는데 유용한 도구입니다.
Protocol
1 셀 난소 암 세포주의 문화와 형광 표지
- SKOV3 매체를 준비 : 10 % 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충 된 맥코이 매체는 0.1mm의 L-글루타민, 50 U / ㎖ 페니실린, 50 μg / ml의 스트렙토 마이신. 10 % FBS, 1 mM 피루브산 나트륨, 0.1 mM의의 L-글루타민, 50 U / ㎖의 페니실린으로 보충 된 최소 필수 매체 (MEM)에 OVCA429 세포 및 50 μg / ml의 스트렙토 마이신을 유지한다.
- 5 % CO 2와 37 ° C에서 가습 배양기에서 293 및 OVCA429 세포주를 전파. 40-50%의 포화 상태로 세포를 성장.
- 시험 관내 및 생체 내에서 생존 능력을 모니터하기 위해 적색 형광 단백질 (RFP)를 발현하는 세포를 생성한다.
- , RFP를 발현하는 293 세포를 생성하는 72 시간 동안 페니실린과 스트렙토 마이신의 부재에서 293 미디어에 RFP 및 10 μg / ㎖의 폴리 브렌을 표현 렌티 바이러스 입자를 추가합니다.
- 72 시간 후, RFP에 대한 형광 활성화 된 셀 Sorti에 의해 양성 세포를 선택NG (FACS)를 다음과 같이 RFP를 Trypsinize의 비 RFP 발현 세포, 5 분 동안 125 XG에 원심 분리기, 0.1 % BSA를 함유하는 PBS에 107 세포 / ml로 재현 탁 세포. 셀 소터에 정렬 파라미터를 결정하는 비 - RFP 셀을 사용한다. 그런 다음 561 nm의 레이저를 사용하여 높은 RFP를 발현하는 세포를 수집합니다.
- 렌티 바이러스 플라스미드는 항생제 내성 카세트를 발현하는 경우 또는, 적절한 항생제에서 배양함으로써 RFP 발현 세포에 대해 선택 (예 : 10 ㎎ / ㎖ 블라스트). 참고 : 일괄 처리 및 세포 유형에 따라 다를 수 있습니다 사용될 필요가 렌티 바이러스 입자의 양. 적정 렌티 바이러스 역가 각 세포 유형에 대해 결정되어야한다.
암 줄기 세포의 2 심화
- 72 시간 동안 시스플라틴의 20 μM과 293, 293-RFP 또는 OVCA429 세포 라인을 취급합니다. 주의 : 시스플라틴 독성이다. 보호 복 / 장갑을 사용하여 피부와 점막과의 접촉을 피하십시오. 시스플라틴 내가 처리하지 마십시오n 개의 폐수.
- CSC 매체를 준비 : 무 혈청 DMEM / F12 매체 5㎍을 / ㎖ 인슐린, 10 ng의 / ml의 인간 재조합 표피 성장 인자 (EGF), 10 ng의 / ㎖ 염기성 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF), 12 ng의 / ㎖ 백혈병 억제 인자로 보충 및 0.4 % 소 혈청 알부민 (BSA).
- 를 Trypsinize 세포. 문화 CSC 미디어에서 세포 생존.
참고 : 문화 비 부착 회전 타원체에서 이일이 형성됩니다 후. - 미디어 세포를 포함하고 5 분 동안 125 XG에서 원심 분리 수집하여 모든 이일 미디어를 변경합니다. 그리고 신선한 CSC 미디어에서 펠렛을 재현 탁. 세포를 계산 및 트리 판 블루 배제를 수행하여 모든 이일 생존을 위해 세포를 확인합니다.
- (: 137 밀리미터의 NaCl, 2.7 mM의 KCl을, 11.9 mM의 인산염 완충액 pH 7.4의 PBS)와 그 다음 5 분 동안 129 XG를 원심 분리 및 페놀 함유 아니 디늄 thiocynate (RNA), 인산염 완충 생리 식염수에 펠렛을 재현 탁하여 추가 실험을위한 암줄 기세포를 수집 (유동 세포 계측법에 대한) 0.1 % BSA, 또는 CSC 매체는 계속세포를 배양.
- 20 배와 40 배 배율 광학 현미경을 사용하여 CSC의 세포 형태를 모니터링합니다.
줄기 세포 마커에 대한 유전자 발현 분석을 통해 3 CSC의 특성
- 매체는 5 분 동안 129 XG에서 원심 분리, 세포를 포함하는 수집, 및 페놀 함유 아니 디늄 thiocynate의 용액에 펠릿을 재현 탁하여 CSC 추가의 3 제제를 수집 (RNA 추출을위한 다른 방법이 사용될 수있다).
- 제조 업체의 프로토콜에 따라 트리 졸 사용하여 총 RNA를 준비합니다. 시판 cDNA를 역전사 키트를 사용하여 RNA 0.1 μg으로부터의 상보 적 DNA (cDNA를)를 합성한다.
- 정량 역전사 중합 효소 연쇄 반응 (QRT-PCR)을 수행한다.
- 샘플 당 8 μl를 총 QRT-PCR 믹스, 프라이머, 및 물을 포함하는 프라이머의 각 세트에 대한 마스터 믹스를 확인합니다 (다른 형광체와 프라이머는 같은 잘에서 증폭 할 수 있습니다.) 예를 들어, 생성인 Oct4-FAM, Nanog를 16 진수 및 GAPDH-CY5에 대한 하나의 마스터 믹스. 네 스틴 및 Prom1에 대해 별도의 마스터 믹스를 생성합니다. 샘플 당 cDNA를 템플릿의 2 μl를 추가합니다.
NOTE : 본 연구를 위해 QRT-PCR은 표 1에 프라이머를 사용하여 수행 하였다. - 다중 형광을 검출 할 수있는 실시간 PCR 용 열 순환기를 사용하여 각 샘플에 대해 중복 모든 QRT-PCR을 수행한다. 어떤 템플릿 컨트롤을 포함하지 않습니다.
- ΔΔC T 방법을 사용하여 각 샘플에 대해 GAPDH 발현에 줄기 세포의 유전자 발현을 정규화한다.
- 샘플 당 8 μl를 총 QRT-PCR 믹스, 프라이머, 및 물을 포함하는 프라이머의 각 세트에 대한 마스터 믹스를 확인합니다 (다른 형광체와 프라이머는 같은 잘에서 증폭 할 수 있습니다.) 예를 들어, 생성인 Oct4-FAM, Nanog를 16 진수 및 GAPDH-CY5에 대한 하나의 마스터 믹스. 네 스틴 및 Prom1에 대해 별도의 마스터 믹스를 생성합니다. 샘플 당 cDNA를 템플릿의 2 μl를 추가합니다.
| 월 4-FAM | 프라이머 1 : 5'-CCCAAGGAATAGTCTGTAGAAGTG-3 ' |
| 프라이머 2 : 5'-TGCATGAGTCAGTGAACAGG-3 ' | |
| FAM 프로브 : 5'-CTTCCAAGC / ZEN / TGCCCACCTAACTTCT / 3IABkFQ -3 ' | |
| NANOG-HEX | 프라이머 1 : 5'-CCTTCTGCGTCACACCATT-3 ' |
| 프라이머 2 : 5'-AACTCTCCAACATCCTGAACC-3 ' | |
| HEX 프로브 : 5'-CTGCCACCT / ZEN.CTTAGATTTCATTCTCTGGT / 3IABkFQ-3 ' | |
| GAPDH-CY5 | 프라이머 1 : 5'-TGTAGTTGAGGTCAATGAAGGG-3 ' |
| 프라이머 2 : 5'-ACATCGCTCAGACACCATG-3 ' | |
| CY5 프로브 : 5'-AAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGTC / 3IABRQSP-3 ' | |
| 네 스틴-FAM | 프라이머 1 : 5'-AGGACCTGAGCGATCTGG-3 ' |
| 프라이머 2 : 5'-CGTTGGAACAGAGGTTGGAG-3 ' | |
| FAM 프로브 : 5'-AACTTTTCA / ZEN / GTAGCCCGCAGCC / 3IABkFQ -3 ' | |
| CD133-HEX | 프라이머 1 : 5'-ACTCTCTCCAACAATCCATTCC-3 ' |
| 프라이머 2 : 5'-AAACAATTCACCAGCAACGAG-3 ' | |
| HEX 프로브 : 5'-ACAATCACT / ZEN / GAGCACTCTATACCAAAGCG / 3IABkFQ-3 |
QRT-PCR에 의한 CSC 특성에 사용되는 표 1 프라이머.
e_title "> 4. 세포 표면 마커 CD117 및 CD133에 대한 분석 암줄 기세포- 미디어 세포를 포함하고 5 분 동안 125 XG에서 원심 분리에 의해 수확 된 CSC 수집. 해체하는 세포를 비 단백질 분해 세포 분리 용액 500 μl를 추가합니다. 5 분 동안 125 XG에 원심 세포 세포 분리 용액을 제거한다. 그런 다음 차가운 PBS로 두 번 세포를 씻으십시오.
- 종래 라벨링 셀 1 시간 동안 정상적인 성장 배지에서 배양한다. 129의 X g에서 5 분 동안 세포를 스핀 다운. 항-CD133-PE 및 항-CD117-FITC와 함께 0.1 % BSA와 함께 PBS에 세포를 재현 탁.
- 1 % 파라 포름 알데히드 하룻밤 세포를 수정. 주의 : 파라 포름 알데히드는 독성 (발암 물질로 의심)입니다. 흄 후드에서 확인하고 주일 이내에 사용한다.
- (PE에 접합 된 항-CD133)와 CD133 및 플로우 사이토 미터에 세포 표면 발현 (FITC에 접합 된 항-CD117)와 CD117를 분석하기 위해 유세포 분석기를 수행한다. 채널 (PE 용) (FITC에 대한) FL1과 FL3 세포에서 데이터를 수집 할 수 있습니다. 모두 발현하는 세포에 대한 게이트를 생성FITC와 PE. 4 사분면 (FITC- 및 PE-, FITC + PE-, FITC- PE + 및 FITC + 및 PE +)와 도트 플롯을 생성하고 각 사분면에 세포의 수를 결정합니다.
(5) 치료 반응에 대한 암줄 기세포 분석
- 플레이트 하룻밤 96 웰 플레이트에 5,000 셀 아니라 당 (293, 293-RFP, 293 CSC와 293-RFP 암줄 기세포).
- 96 시간 동안 시스플라틴 (0, 1, 10, 100 및 1000 μM) 또는 파클리탁셀 (0, 0.01, 0.1, 1, 10 및 100 μM)로 처리.
- MTT (3 - (4,5 - 디메틸 -2 - 일) -2,5 - 디 페닐 테트라 졸륨 브로마이드) 세포 생존 분석을 수행한다.
- 96 웰 플레이트에 잘 당 100 μL 당 플레이트 5000 세포 (중복에 판 세포와 미디어는 우물을 제어 포함).
- 24 시간 후, 10 ㎎ / ㎖ MTT의 10 μl를 추가합니다. (침전물이 형성 될 때까지) 2-4 시간 동안 37 ° C에서 품어.
- MTT 용매 4 mM의 염산 100 ㎕, 이소프로판올 0.1 % NP-40을 추가합니다. 어둠 속에서 15 분 동안 품어.
- 접시의 연구에 570 nm에서 판을 읽고eader.
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Representative Results
우리는 시스플라틴 치료를 이용한 난소 암 세포주에서 고립 된 CSC를 입증하기 위해, 우리는 먼저 사전 처리 및 선택 후 세포 라인의 이미지를 획득. 우리는 부착 (치료) 293 및 OVCA429 세포와 293 및 OVCA429 암줄 기세포 (그림 1)의 이미지를 캡처하기 위해 광학 현미경을 사용했다. CSC 추가는 조직 배양 접시에 부착하지 둥근 표시 (도 1 및도 2). 우리는 더 RFP 형질 293 세포는 세포 (그림 2B) 가능한 것을 보여주는 암줄 기세포의 분리 후 자신의 형광을 유지하는 것으로 나타났다.
실행 가능한 CSC 문화는 약물 치료에 대한 반응에 대해 평가 하였다. 암줄 기세포는 시스플라틴 (특히 100 μM)과 파클리탁셀 (10 μM) (그림 3)에 대한 저항의 증가를 보여 주었다. CSC 추가는 종종 줄기 세포의 유전자 발현을 특징으로한다. CD133의 발현 (도 Prom1로 알려진), 네 스틴, Nanog를, 그리고 인 Oct4를 조사 하였다. CD133은 크게 치료 (제어) 세포 (도 4a)에 비해 293 CSC 문화 유도했다. CD133도 16 배와 OVCA429 및 OVCA429-RFP 세포의 13 배에 의해 처리되지 않은 대조군에 비해 CSC의 문화에서 유도 (데이터가 표시되지 않음). 초기 실험에서 인 Oct4, Nanog를, 그리고 네 스틴은 미처리 비교 SKOV3 CSC 배양에서 증가하였으나 통계적으로 유의 한 결과 (도 4a)가 없었다. 반복되면이 실험 인 Oct4와 Nanog를 부모의 제어 세포 (그림 4B)에 비해 293 암줄 기세포에 증가했다. 인 Oct4가 4.7 배와 CSC 농축 프로토콜 다음 OVCA429 및 OVCA429-RFP 세포에서 8 배 증가 하였다 (도시하지 않음). 마지막으로, 293 암줄 기세포 전시 (그림 5) CSC 마커 CD117의 세포 표면 발현을 증가했다. 결론적으로,이 방법은 난소 암에서 가능한 회전 타원체 암줄 기세포 (표현 줄기 세포 마커)를 선택할 수 있습니다줄기 세포 배지에서 시스플라틴과 선택 성장에 의한 세포주.
293 및 OVCA429 세포. 위상차 현미경은 293과 OVCA429 세포 치료 아르와 암줄 기세포 (구형)으로 선정되었습니다 (부착)를 묘사에서 선택 293 및 OVCA429 세포와 암 줄기 세포의 그림 1 형태론 (암줄 기세포).
암줄 기세포에 대한 그림 2 농축 비 부착 구 상체를 얻을 수 있습니다. (A) SKOV3 세포 (60X 배율). (B) 미처리 아르 SKOV3 RFP-세포 및 비 처리 된 CSC 용 풍부 (a 및 b)에 대한 농축 된 CSC 또는 (c D). 왼쪽 패널은 위상차 이미지를 묘사 및 우측 패널은 형광을 도시한다. 원래 배율 40 배. 스케일 바 = 400 미크론.
그림 3 암줄 기세포 전시 치료 세포주에 비해 chemoresistance 증가했다. 293 (A와 B) 및 293-RFP (C와 D), 293 암줄 기세포 (A와 B) 및 293-RFP 암줄 기세포 (C와 D)가 다양한 처리 하였다 시스플라틴 (A 및 C) 또는 파클리탁셀 (탁솔) (B와 D)의 농도. 96 시간 처리 후 MTT 분석을 수행 하였다. 실험은 n≥3에서 수행하고 통계는 두 일원 분산 분석을 사용하여 계산 하였다 * p <0.05, *** p < ;. 0.0005 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
처리되지 않은 세포에 비해 암줄 기세포의 그림 4 줄기 세포 마커의 발현. QRT-PCR 분석 (A) CD133 (Prom1), 네 스틴, Nanog를. 293 (제어) 및 293 암줄 기세포 수행하고 OCT4는 (GAPDH에 정상화). ( B) 293-RFP의 암줄 기세포가 처리되지 않은 세포에 비해 높은 OCT4와 Nanog를이 프로토콜 수익률 세포에서 얻은 것을 보여주는 추가 실험. 결과는 GAPDH 식 정규화 하였다. N = 3 및 통계는 학생 T-test를 이용하여 계산 하였다; ** p <0.02, *** p <0.002.
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293 세포에서 줄기 세포 마커의 그림 5 유동 세포 계측법 분석 및 293 암줄 기세포 단독으로 또는 형질 도입 또는 RFP없이. CD133, CD117 및 CD133 (A) 293에서 / CD117의 발현 (치료 / 제어) 세포, (B) 293 암줄 기세포, (C) 293-RFP 치료 세포를, 그리고 (D) 293-RFP의 암줄 기세포. 실험을 회 반복 실시 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
치료에 저항하는 암줄 기세포 차 종양의 치료 후 재발에 대한 책임을 질 수 있습니다. 암줄 기세포의 특성은 난소 암에 대한 개선 된 치료법으로 이어질 수 있습니다. 상기 프로토콜을 사용 chemoresistant 된 CSC의 확립에 중요한 파라미터는 화학 요법 치료의 길이 및 화학 요법 농도 타이밍된다. 엄마 외의 프로토콜을 사용하는 경우. 그것은 시스플라틴과 파클리탁셀 치료의 칠일 후에 더 가능한 세포가 네 남아없는 것으로 나타났습니다. (20 μM 시스플라틴 대신 40 μM 시스플라틴 및 10 μM 파클리탁셀) 삼일에 치료를 줄임으로써 가능한 chemoresistant 세포와 암줄 기세포 개발. 길이 및 치료의 투여 량은 다른 난소 암 세포주에 대해 변경 될 필요가있다.
이 프로토콜의 주요 제한은 암줄 기세포가 가능한 남아있는 길이입니다. 이 프로토콜을 이용 된 CSC는 주 미만위한 가능한 남아있다. 따라서, 일CSC 추가에 대한 실험 및 분석 전자 타입은 신중 초과해야한다.
암줄 기세포의 또 다른 특성은 수행 될 필요가있다. 이들 세포 유형 사이의 유사성 및 차이를 결정하는 CSC 생성하는 다른 방법으로 된 CSC이 방법과 비교하는 것이 유용 할 것이다. 생체 분석을위한 줄기 세포 마커, 치료에 대한 반응과 최고의 시스템의 비교 암줄 기세포의 생성 / 선택을위한 다른 방법 사이에 실시 될 필요가있다. 이것은 줄기 세포 마커의 다른 발현 패턴 및 환자 10-12에 다른 예후 도울 수도 프로토콜에 의해 생성 된 CSC의 유형의 이와 상기 정의와 CSC 추가의 다른 종류들이 인간의 악성 종양에 관한 방법을 결정할 수 있다는 것을 제안되어왔다 . 마지막 순서 엄격 세포 제한 희석 분석에서 면역이 생쥐에 주입 할 필요가이 프로토콜에서 분리 된 CSC가 확정 된 CSC하다는 것을 입증한다. 이CSC 추가 분석은 낮은 밀도에서 난소 종양을 생성 할 수 있음을 보여준다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| McCoy | Life Technologies | 16600-108 | Warm to 37 °C prior to use |
| DMEM / F12 serum free | Life Technologies | 11320-033 | Warm to 37 °C prior to use |
| Minimal Essential Media | Life Technologies | 42360032 | Warm to 37 °C prior to use |
| Sodium pyruvate | Life Technologies | 11360070 | |
| Polybrene | Millipore | TR-1003-G | |
| Blasticidin | Life Technologies | R21001 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlas Biologicals | F-0500-A | |
| Penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | |
| Cisplatin | Sigma-Aldrich | T7402-5MG | Caution: Toxic. Use precautions |
| pLenti-suCMV-Rsv | Gentarget | LVP023 | BSL2 approval needed |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I-1882 | |
| Human Recombinant EGF | Cell Signaling Technology | 8916LC | |
| bFGF | BD biosciences | 354060 | |
| LIF | Santa Cruz | sc-4988A | |
| Bovine Serum Albumin | Roche | 03 116 956 001 | |
| TRIzol | Life Technologies | 15596-018 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368813 | |
| IQ Multiplex Powermix | BioRad | 1725849 | |
| Accumax | Millipore | ||
| Primers | Integrated DNA Technology | individually designed and ordered (see protocol for sequnces) | |
| Anti-CD133 PE | Milenyl | 130-098-826 | Primer/probe sets are light sensitive |
| CD117-Biotin | Miltenly | 130-098-570 | |
| AntiBiotin-FITC | Miltenly | 130-098-796 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | Caution: Toxic. Always prepare in hood and make fresh. |
| Trypsin | Life Technologies | 25300062 | |
| MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) | Sigma-Aldrich | 25200-072 | |
| EVOS Fl Epifluorescence and Transmitted Light Microscope | Advanced Microscopy Group | ||
| Biorad CFX96 C1000 System | Biorad | ||
| Beckman Coulter FC500 Flow Cytometer | Beckman Coulter | ||
| Spectramax 340PC384 | Molecular Devices |
References
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