Abstract
Den udbredte brug af Next Generation Sequencing har åbnet nye muligheder for kræftforskning og diagnose. NGS vil bringe enorme mængder af nye data om kræft, og især kræft genetik. Nuværende viden og fremtidige opdagelser vil gøre det nødvendigt at undersøge et stort antal gener, der kunne være involveret i en genetisk disposition til kræft. I denne forbindelse har vi udviklet et NEXTERA design at studere 11 komplette gener involveret i DNA beskadigelse reparation. Denne protokol blev udviklet til sikkert studere 11 gener (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAD80 og TP53) fra promotor til 3'-UTR i 24 patienter samtidigt. Denne protokol, der er baseret på transposasen teknologi og gDNA berigelse, giver en stor fordel i form af tid til genetisk diagnose takket være prøve multiplexing. Denne protokol kan sikkert bruges med blod gDNA.
Introduction
I 2010 næsten 1,5 millioner mennesker (primært kvinder) udviklede brystkræft i hele verden. Det anslås, at 5 til 10% af disse tilfælde var arvelig. Næsten 20 år siden blev BRCA1 og BRCA2 identificeret som involveret i arvelig brystkræft og ovariecancer 1. Da omkring 15 år siden, har BRCA1 og BRCA2 kodningsregioner blevet sekventeret for at bestemme den genetiske disposition til brystkræft og ovariecancer. Ændringer i BRCA1 og BRCA2 detekteres i 10 til 20% af udvalgte familier 2 tyder på, at analysen af disse regioner er ikke tilstrækkeligt til en effektiv screening. For nylig analyse af ikke-kodende sekvenser (promoter, introner, 3-'UTR) af BRCA1 og BRCA2 fremhævet, at nye mutationer / variationer kunne knyttes til en højere risiko for brystkræft 3-6.
BRCA1 og BRCA2 proteiner er involveret i homolog rekombination Reparation (HHR), som suppleres af mange samarbejdspartnere 7. Mens ændringer i BRCA1 eller BRCA2 inducere defekter i DNA-reparation, kan de andre partnere også påvirke risikoen for brystkræft. Denne hypotese synes at være blevet valideret siden BRIP1 8 og PALB2 9 har en dokumenteret effekt på livmoderhalskræft og brystkræft, hhv. Desuden kan to andre "moderat risiko" brystkræft modtagelighed gener, ATM og CHEK2, også undersøges rutinemæssigt 10.
I forlængelse af disse undersøgelser, besluttede vi at udvikle en protokol til at analysere 11 gener (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAP80 og TP53) i 24 patienter samtidig benytter et meget let og forholdsvis hurtig protokol baseret på transposasen teknologi, med berigelse og sekventering på et medium gennemløb enhed. Takdenne teknik, vi sekventeret komplette gener fra starten af promotoren til enden af 3'-UTR undtagen RAP80, for hvilket et intronisk region 2.500 bp ikke var dækket (CHR5: 176,381,588-176,390,180). Dette udgør i alt omkring 1.000.300 bp studeret med 2.734 sonder. Normalt er BRCA1 og BRCA2 exonic sekvenser analyseret ved Sanger sekventering, som har brug for 1,5 måneder for mindre end 20 patienter. Med den nuværende protokol (figur 1), i samme tid, 11 komplette gener for mere end 75 patienter kunne analyseres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Vurdering af gDNA (genomisk DNA) Udbytte
- Kvantificere frisk udvundet gDNA før forberedelse af biblioteket. Brug fluorometriske udbytte vurdering metode til at kvantificere intakt gDNA (undgå at bruge et spektrofotometer til gDNA udbytte evaluering). Mål (260/280 nm) forhold og sikre, at det er mellem 1,8 og 2. BEMÆRK: 50 ng gDNA er nødvendige for eksperimentet.
2. gDNA Berigelse: Dag 1 Morgen
- Inden start
- Fra DNA berigelse kit (se tabel Materialer / udstyr), tø DNA-buffer (TD) og DNA-enzym (TDE1) løsninger på is. Mindst 30 minutter før brug, bringe rensning magnetiske perler og stoppe mål (ST) buffer til stuetemperatur (RT). Tilsæt 20 ul gDNA prøve ved 2-2,5 ng / ul direkte ind i en 96-brønds plade, en godt per prøve. VIGTIGT: Brug en positiv kontrol for at validere protokollen (prøve med kendt sekvens variation).
- Tagmentation
- Mix alle reagenser grundigt ved at vende 5x og centrifuger kortvarigt. Ved stuetemperatur tilsættes 25 ul TD buffer til hver brønd indeholdende 50 ng (20 ul) af gDNA og derefter 5 pi TDE1 puffer. Indstil pipette til 50 pi, pipettér forsigtigt hele mængden op og ned 10x.
- Dæk pladen med en selvklæbende folie og centrifugeres i 1 minut ved 280 xg ved 20 ° C. Derefter placere pladen i et termocykler (dækning opvarmet til 100 ° C) og køre følgende program: 55 ° C i 5 min og 10 ° C i ubegrænset tid.
- Under denne inkubering forberede prøven ark med Eksperiment Manager til at definere de indekser, der skal anvendes.
- Tagmentation Oprensning
BEMÆRK: Dette trin er kritisk. Vær meget forsigtig.- Tjek for fraværet af bundfald i rensning magnetiske perler og ST buffer. Hvis bundfald er til stede, varme op løsninger i hænderne. Tø resuspensionsbuffer (RSB) på is.
- Hos RT vortex ST løsning og tilføj15 ul til hver brønd indeholdende prøve. Indstil pipette til 65 pi, pipettér forsigtigt hele mængden op og ned 10x. Inkuber i 5 minutter ved stuetemperatur. Dæk pladen og centrifugeres i 1 minut ved 280 xg ved 20 ° C.
- Tilføj 52 pi tidligere blandet rensning magnetiske perler i hver brønd. Indstil pipette til 117 pi, pipettér forsigtigt hele mængden op og ned 10x. Inkuber i 10 minutter ved stuetemperatur. Dæk pladen og centrifugeres i 1 minut ved 280 xg ved 20 ° C.
- Fjern klæbende film. Placer 96-brønds plade på et magnetisk stativ i 2 minutter ved stuetemperatur. Sørg for, at supernatanten forekommer helt klar.
- Forbered en frisk 80% ethanol opløsning (for 24 prøver, tilsættes 2 ml destilleret vand til 8 ml ethanol). Fjern og kassér supernatanten pas på ikke at forstyrre perlerne.
- Mens holde pladen på magnetisk stativ, tilsættes 200 pi af frisk fremstillet 80% ethanol til hver brønd uden at forstyrre perlerne og inkuberes pladen i mindst 30 sekved stuetemperatur. Supernatanten fjernes, og gentage denne vask en anden gang. Sørg for, at ethanol er blevet fjernet. Lad tørre ved stuetemperatur i 10 minutter eller indtil fuldstændig fordampning af ethanol.
- Fjern pladen fra magnetiske stå og tilføje 22,5 ul RSB buffer. Sæt pipetten til 22,5 pi, pipettér forsigtigt hele mængden op og ned 10x. Placer 96-brønds plade på magnetisk stativ og inkuberes i 2 min. Sørg for, at supernatanten forekommer helt klar. Overføre forsigtigt 20 ul af supernatanten i en ny 96-brønds plade.
BEMÆRK: Eventuelt bestemme størrelsen af de tagmented prøver ved anvendelse af et fragment analysatoren. I stedet for de trin, der er nævnt ovenfor, anvender høj opløsning acrylamid gelelektroforese. Fragmenter skal være mellem 150 bp og 1000 bp.
- 1. PCR-amplifikation
- Thaw PCR Master Mix indeholder polymerase (LP-PMM), indeks 1 primer og indeks 2 primer løsninger på is. Match kombinationen of indekser med Eksperiment udlejer prøve ark. For multiplexing, forberede anderledes i7 fra indeks 1 (i7, N7xx) for hver prøve.
- I hver brønd tilsættes 20 ul LP-PMM, 5 pi indeks 1, og 5 pi Indeks 2. Indstil pipetten til 50 pi, pipettér forsigtigt hele mængden op og ned 10x. Dæk pladen med en klæbende microseal film. Centrifugeres i 1 minut ved 280 xg ved 20 ° C.
- Pladen anbringes i en thermocycler (dækning opvarmet til 100 ° C) og kør programmet 1 (tabel 1).
BEMÆRK: Proceduren kan stoppes til dette punkt, og reaktionerne opbevaret natten over i thermocycleren eller 2 dage mellem 2 og 8 ° C.
3. gDNA Berigelse: Dag 1, Eftermiddag
- Inden start
- Tø oligoer (CSO), fange mål buffer 1 (NCT1), og RSB løsninger på is. Mindst 30 minutter før brug, bringe rensning magnetiske perler til RT.
- PCR Oprensning
- Centrifugeres pladen fra trin 2.4, i 1 minut ved 280 xg ved 20 ° C.
- Ved stuetemperatur tilsættes 45 ul blandet rensning magnetiske perler i hver brønd. Sæt pipetten til 95 pi, pipettér forsigtigt hele mængden op og ned 10x. Inkuber i 10 minutter ved stuetemperatur. Placer 96-brønds plade på et magnetisk stativ i 2 minutter ved stuetemperatur.
- Sørg for, at supernatanten forekommer helt klar. Forbered en frisk 80% ethanol opløsning (for 24 prøver, tilsættes 2 ml destilleret vand til 8 ml ethanol). Supernatanten pas på ikke at forstyrre bundfaldet.
- Mens holde pladen på magnetisk stativ, tilsættes 200 pi af frisk fremstillet 80% ethanol til hver brønd uden at forstyrre perlerne og inkuberes pladen i 30 sekunder ved stuetemperatur. Supernatanten fjernes, og gentage denne vask en anden gang. Sørg for, at ethanol er blevet fjernet. Lad tørre ved stuetemperatur i 15 minutter.
- Fjern pladen fra magnetiske stå og tilføje 40 pi RSB buffer. Sæt rørettte til 40 pi, pipettér forsigtigt hele mængden op og ned 10x.
- Placer 96-brønds plade på magnetisk stativ og inkuberes i 2 min. Supernatanten skal vises helt klar. Overføre forsigtigt 38 ul af supernatanten i en ny 96-brønds plade.
- Bestem udbyttet af hver prøve ved en fluorimetrisk metode. Denne første del af protokollen vil blive valideret, hvis de vurderede udbytter er mellem 30 og 50 ng / ul.
- 1. Hybridisering
- Pool op til 12 prøver pr pulje i denne fase ved at blande 500 ng af hver prøve i en ny 96-brønds plade. Sørg for, at den endelige mængde af hver pulje ikke overstiger 40 ul.
BEMÆRK: Hvis det er nødvendigt, mindske mængden af puljer ved hjælp af et vakuum koncentrator enhed på RT (Advarsel: koncentrationen af DNA kan ikke ændres ved opvarmning, selv ved 30 ° C som opvarmning forårsager DNA-nedbrydning). Det endelige rumfang justeres til 40 pi ved at tilføje RSB løsning. - Blandes grundigtNCT1 opløsning. For hver brønd indeholdende 40 ul puljede DNA-prøver, tilsættes 50 ul NCT1, og 10 pi af CSO. Sæt pipetten til 100 ul, pipettér forsigtigt hele mængden op og ned 10x. Forsegl plade og centrifugeres i 1 minut ved 280 xg ved 20 ° C.
- Pladen anbringes i en thermocycler (dækning opvarmet til 100 ° C) og kør programmet 2 (tabel 1).
- Pool op til 12 prøver pr pulje i denne fase ved at blande 500 ng af hver prøve i en ny 96-brønds plade. Sørg for, at den endelige mængde af hver pulje ikke overstiger 40 ul.
4. gDNA Berigelse: Dag 2 Morgen
- Inden start
- Fra DNA berigelse kit (se tabel Materialer / Udstyr) tø 2 N NaOH (HP3), target elueringspuffer 1 (ET1), målrette elueringsbuffer 1 ET2, streptavidin- magnetiske perler (SMB), vask løsning 1 (WS1), vask Løsning 2 (WS2), vask løsning 3 (WS3), CSO, og NCT1 løsninger på RT.
- 1. Hybridisering Wash
- Fjern plade med 96 brønde fra thermocycler og centrifugeres 1 minut ved 280 xg ved 20 ° C. Fjern den selvklæbende dæksel meget carefully.
- Overfør 100 ul reaktionsblanding fra pladen til en ny MIDI-plade med 96 brønde, og der tilsættes 250 pi godt hvirvelbehandlet SMB-løsning. Sæt pipetten til 350 pi, pipettér forsigtigt hele mængden op og ned 10x. Forsegl pladen og inkuber ved stuetemperatur i 30 minutter.
- Centrifugeres i 1 minut ved 280 xg ved 20 ° C, fjerne den klæbende forsegling og placere pladen på magnetisk stativ i 2 min. Sørg for, at supernatanten forekommer helt klar. Supernatanten fjernes, og fjern pladen fra den magnetiske bevoksning.
- Tilsæt 200 pi godt blandet WS1 løsning i brønden indeholder perlerne. Sæt pipetten til 200 mikroliter og pipettér forsigtigt hele mængden op og ned 15x undgå dannelsen af bobler / skum.
- Pladen anbringes på magnetisk stativ i 2 min. Sørg for, at supernatanten forekommer helt klar. Supernatanten fjernes, og fjern pladen fra den magnetiske bevoksning.
- Tilsæt 200 pi godt blandet WS2 løsning i brønde containing perler. Sæt pipetten til 200 mikroliter og pipettér forsigtigt hele mængden op og ned 15x undgå dannelse af bobler / skum.
- Pladen anbringes på magnetisk stativ i 2 min. Sørg for, at supernatanten forekommer helt klar. Supernatanten fjernes, og fjern pladen fra den magnetiske bevoksning.
- Tilsæt 200 pi godt blandet WS2 løsning i brønde, der indeholder perler. Sæt pipetten til 200 mikroliter og pipettér forsigtigt hele mængden op og ned 15x.
- Overfør hele mængden i en ny plade med 96 brønde. Forsegle skiltet og placere pladen i et termocykler (dækning opvarmet til 100 ° C). Start thermocycler ved 42 ° C i 30 minutter.
- Imediately placere pladen på magnetisk stativ i 2 min. Sørg for, at supernatanten forekommer helt klar. Fjern forseglingen og kasseres alle supernatanten. Fjern derefter pladen fra den magnetiske bevoksning.
- Tilsæt 200 pi WS2 i brønde, der indeholder perler. Sæt pipetten til 200pi og pipettér forsigtigt hele mængden op og ned 15x undgå dannelse af bobler / skum. Forsegle skiltet og placere pladen i et termocykler (dækning opvarmet til 100 ° C). Start thermocycler ved 42 ° C i 30 minutter.
- Umiddelbart placere pladen på magnetisk stativ i 2 min. Sørg for, at supernatanten forekommer helt klar. Fjern forseglingen og kasseres alle supernatanten. Fjern derefter pladen fra den magnetiske bevoksning.
- Tilsæt 200 pi godt blandet WS3 løsning i brønde, der indeholder perler. Sæt pipetten til 200 mikroliter og pipettér forsigtigt hele mængden op og ned 15x.
- Pladen anbringes på magnetisk stativ i 2 min. Sørg for, at supernatanten forekommer helt klar. Kassér alle supernatanten og fjern pladen fra den magnetiske bevoksning.
- Gentag WS3 vaskes en anden gang.
- Efter fjernelse supernatant, forsegle pladen og kort centrifuge til at trække ned resterende supernatant. Placer pladen påmagnetisk stativ i 2 min. Kassér den resterende supernatant.
- I et 0,2 ml rør, blandes 28,5 pi ET1 og 1,5 pi HP3 løsninger. Denne blanding er for 1 pulje, hvis flere puljer er forberedt, multipliceres disse mængder med antallet af puljer forberedt.
- Fjern pladen fra magnetiske bevoksning. Tilføj 23 ul af den ovenfor fremstillede blanding. Sæt pipetten til 23 pi og pipettér forsigtigt hele mængden op og ned 15x. Forsegl pladen og lad i 5 minutter ved stuetemperatur. Centrifugeres i 1 minut ved 280 xg ved 20 ° C.
- Pladen anbringes på magnetisk stativ i 2 min. Sørg for, at supernatanten forekommer helt klar. Fjern den selvklæbende film og overføre 21 pi supernatant til en ny 96-brønds plade.
- Tilsæt 4 pi ET2 opløsning til hver brønd. Sæt pipetten til 25 pi og pipettér forsigtigt hele mængden op og ned 10x og forsegle pladen.
BEMÆRK: Proceduren kan stoppes til dette punkt, og de reaktioner, opbevares i op til 7 dage ved -15 ° C. Hvis pladen er frosset helt tø før du starter 2. hybridisering.
- 2. Hybridisering
- Centrifugeres pladen i 1 minut ved 280 xg ved 20 ° C. Fjern den selvklæbende film og tilsættes 50 ul NCT1, 10 pi CSO, og 15 pi af PCR-kvalitet vand til de 25 pi biblioteket. Sæt pipetten til 100 ul og pipettér forsigtigt hele mængden op og ned 10x.
- Forsegl plade og centrifugeres i 1 minut ved 280 xg ved 20 ° C.
- Pladen anbringes i en thermocycler (dækning opvarmet til 100 ° C) og kør programmet 2 (tabel 1).
5. gDNA Berigelse: Dag 2, Eftermiddag
- Inden start
- Thaw ET1, ET2, SMB, WS1, WS2, WS3 og HP3 løsninger på RT for hybridisering vask. Fra DNA berigelse kit, tø PCR Master-blanding indeholdende polymerase (TC-PMM), PCR-primer cocktail (PPC) og RSB løsninger på is til PCR-amplifikation.
- 2. Hybridisering Vask
- Følg nøjagtig den samme protokol som 4,2 - 1. hybridisering vask.
- PCR-amplifikation
- I en ny 96-brønds plade, blandes 20 ul eluering fra trin 5.2, 25 ul TC-PMM, og 5 pi af PPC. Sæt pipetten til 50 pi og pipettér forsigtigt hele mængden op og ned 10x. Forsegl plade og centrifugeres i 1 minut ved 280 xg ved 20 ° C.
- Pladen anbringes i en thermocycler (dækning opvarmet til 100 ° C) og kør programmet 3 (tabel 1).
6. gDNA Berigelse: Dag 3
- Inden start
- Thaw RSB løsning på is. Mindst 30 minutter før brug, bringe rensning magnetiske perler til RT.
- PCR Oprensning
- Centrifugeres pladen fra trin 5.3 i 1 minut ved 280 xg ved 20 ° C og fjerne limen dækslet.
- Ved stuetemperatur tilsættes 90 ul af previously blandet rensning magnetiske perler i hver brønd. Sæt pipetten til 140 pi, pipettér forsigtigt hele mængden op og ned 10x. Inkuber i 15 minutter ved stuetemperatur. Placer 96-brønds plade på et magnetisk stativ i 5 minutter ved stuetemperatur. Sørg for, at supernatanten forekommer helt klar.
- Forbered en frisk 80% ethanol opløsning (for 2 prøver, tilsættes 200 pi destilleret vand til 800 ul ethanol). Supernatanten pas på ikke at forstyrre bundfaldet.
- Mens holde pladen på magnetisk stativ, tilsættes 200 pi af frisk fremstillet 80% ethanol til hver brønd uden at forstyrre perlerne og inkuberes pladen i 30 sekunder ved stuetemperatur. Supernatanten fjernes, og gentage denne vask en gang mere. Sørg for, at ethanol er blevet fjernet. Lad tørre ved stuetemperatur i 15 minutter eller indtil fuldstændig afdampning af ethanol, mens pladen er på magnetisk stativ.
- Fjern pladen fra magnetiske stå og tilsættes 30 ul RSB buffer. Sæt pipetten til 30 pi, og forsigtigt pipette than hele mængden op og ned 10x. Inkubér pladen i 2 minutter ved stuetemperatur.
- Placer 96-brønds plade på magnetisk stativ og inkuberes i 5 minutter, eller indtil supernatanten forekommer helt klar. Overføre forsigtigt 28 ul af supernatanten i en ny 96-brønds plade (pladetypen: TCY).
BEMÆRK: Proceduren kan stoppes på dette stadium, og reaktionerne opbevaret ved -15 ° C i op til 7 dage.
- Bibliotek Validering og kvantificering
- Bestemme kvaliteten af biblioteket ved anvendelse af et fragment analysatoren. Høj opløsning acrylamid gelelektroforese kan anvendes til at erstatte de trin, der er nævnt ovenfor, men anbefales ikke. Fragmenter skal være mellem 150 bp og 1000 bp.
BEMÆRK: Anbefalet: Kvantificerer biblioteket ved qPCR at opnå det bedste antal klynger i løbet af sekventering. - Som reference anvendes en valideret bibliotek (2 Nm). Hvis det første bibliotek er under udarbejdelse, skal du bruge fag-PhiX DNA (10 nm), i henhold til kalibrering af sequencing enhed.
- Forbered seriefortyndinger af positiv kontrol for at opnå 7 point ved 20, 16, 8, 6, 4, 2 og 1:00 i EBT (EB elueringspuffer + 0,1% Tween 20). Fortynd biblioteket af interesse på 1/1000 og 1 / 2.000. Hvert punkt skal analyseres i tre eksemplarer.
- Forbered følgende mix (formere mængder med antallet af boringer anvendt): for 1 brønd tilsættes 10 ul SYBR grøn indeholdende qPCR Master Mix (2x), 0,2 ul fremadrettede primer (10 um, AATGATACGGCGACCACCGAGAT), 0,2 ul revers primer (10 uM, CAAGCAGAAGACGGCATACGA), og 7,6 ul PCR-kvalitet vand.
- Efter blanding afsætte i en 96-brønds plade, 18 pi af blandingen i hver brønd, og 2 pi af positive kontrolprøver og bibliotek fortyndinger. Forsegl plade og centrifugeres i 1 minut ved 280 xg ved 20 ° C. Derefter placere pladen i en kvantitativ PCR termocyklusapparat og kør programmet 4 (tabel 1).
- Analyser resultaterne som konventionel absolut kvantificering at opnå udbyttet af hver library. Fordelen ved qPCR er, at det kun kvantificerer DNA, der vil interagere med flowcellen.
BEMÆRK: Brug ikke fluorimetriske kvantificering af DNA på grund af tilstedeværelsen af DNA-mimetiske molekyler i en af reagenser. Denne kvantificering metode ville overvurdere biblioteket udbytte og dermed undervurdere klyngedannelse score.
- Bestemme kvaliteten af biblioteket ved anvendelse af et fragment analysatoren. Høj opløsning acrylamid gelelektroforese kan anvendes til at erstatte de trin, der er nævnt ovenfor, men anbefales ikke. Fragmenter skal være mellem 150 bp og 1000 bp.
- Sequencing Oplæg
- Fortynd hvert bibliotek ved 4 nM i et slutvolumen på 30 pi elueringspuffer (EB), og samle alle biblioteker og bland godt.
- Klargør en frisk 0,2 N NaOH-opløsning i EB buffer og bland 10 pi af denne NaOH-opløsning med 10 pi af poolede biblioteker. Bland godt og inkuber præcis 5 minutter ved stuetemperatur.
- Efter 5 min, straks tilsættes 980 pi af hybridiseringspuffer (fra sekventering patron) og bland godt. Derefter blandes 400 ul af denne blanding med 600 pi af hybridiseringspuffer. Bland godt og overføre 600 pi til en 300 cyklus kassetten (2 x 150) for en indsprøjtning af 8kl. Launch sekventering.
7. Dataanalyse
- Når enheden er behandlet dataene, overføre .bam og .vcf-filer til en ny computer.
BEMÆRK: transposase fragmentering inkorporerer fodspor. Derfor softwaren automatisk trimmer disse data. - Saml genetiske variationer opnået med analyseindretningen.
- Analyser eksporterede filer (.bam, .vcf) med en anden software (Alamut) ved at følge producentens instruktioner. Derefter sammenligner genetiske variationer opnået med begge metoder. Kun detekterede variationer gange betragtes stede.
Tabel 1. PCR-betingelser
| Program | Temperatur | Tid | Antal. gentagelser | |||
| 1 | 72 ° C | 3 min | 1 | 98 ° C | 30 sek | 1 |
| 98 ° C | 10 sek | 10 | ||||
| 60 ° C | 30 sek | |||||
| 72 ° C | 30 sek | |||||
| 72 ° C | 5 min | 1 | ||||
| 10 ° C | ubegrænset | |||||
| 2 | 95 ° C | 10 min | 1 | |||
| 93 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 91 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 89 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 87 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 85 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 83 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 81 ° C 1 min | 1 | |||||
| 79 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 77 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 75 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 71 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 69 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 67 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 65 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 63 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 61 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 59 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 58 ° C | 1 min | 16-18 timer | ||||
| 3 | 98 ° C | 30 sek | 1 | |||
| 98 ° C | 10 sek | 10 | ||||
| 60 ° C | 30 sek | |||||
| 72 ° C | 30 sek | |||||
| 72 ° C | 5 min | 1 | ||||
| 10 ° C | ubegrænset | |||||
| 4 | 95 ° C | 10 min | 1 | |||
| 95 ° C | 15 sek | 40 | ||||
| 60 ° C | 1 min | |||||
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Prøve QC Resultater
Evnen af denne fremgangsmåde til at bestemme sekvenser af målgener er baseret på kvaliteten af gDNA (figur 2A), og kvaliteten af tagmentation trin. Hvis tagmentation ikke er tilstrækkelig (figur 2B, øverste panel), vil sekventeringen ikke være tilfredsstillende. Som nævnt ovenfor, efter tagmentation oprensning blev den gDNA bør tagmented i fragmenter fra 150 bp til 1000 bp, med de fleste af fragmenterne omkring 300 bp (figur 2B, nedre panel).
Ved udgangen af biblioteket præparat er bibliotek kvalitet kontrolleres ved hjælp af en Bioanalyser. Profilen opnåede skal være omtrent den samme som efter tagmentation, men med et større antal fragmenter (figur 2C). Hvis biblioteket kvalitet er ikke identisk med figur 1C, bør sekventering ikke udføres.
Når sekventering er lanceret påsekvensering enhed, klyngedannelse scoren er tilgængelig efter 9 cykler og bør være mellem 800.000 og 1.100.000 klynger / mm ² (figur 3A). Hvis dette antal er lavere, vil sekventeringen ikke være tilfredsstillende, især i dybden af læse. Hvis det er højere, vil de blive slørede (figur 3B), og ingen analyse vil ske fordi det er umuligt at skelne klynger.
Ved slutningen af kørslen, er det vigtigt at kontrollere kvaliteten score. Ved at følge protokollen beskrevet ovenfor, vil kvaliteten score kørslen svarer til figur 4. Kvaliteten af sekventering er repræsenteret ved en Q-score (Q-30). For at validere eksperimentet, mindst omkring 75% af sekvenser (klynger), bør have en Q-score større end eller lig med 30.
Sekventering Resultater
Dette eksperiment blev designet til at studere konstitutionelle genetiske abnormiteter. I dette tilfælde er den genetisk abnormitet er prESENT på 50% i genomet. På grund af dette, sekventering dybde er ikke meget vigtigt. Heri, vi forberedt og sekventeret samtidigt 2 biblioteker af 12 patienter for 11 komplette gener. For at opnå høj sekventering dybde, antallet af multiplexede patienter skal være nedsat. Da gDNA berigelse er baseret på fangst af sonder, berigelsen ikke er homogent (figur 5). Med vores protokol, vi genereret omkring 6 Gb læser, inducerer en gennemsnitlig dækning på 150 lyder for hver base, med et minimum på 20 og højst 330 reads. Disse aflæste dybder er i overensstemmelse med brugen af NGS i klinisk praksis 11. På trods af den heterogenitet læste dybder, sandsynligvis på grund af gDNA berigelse af fangst, og ikke den store omlægning af gener, er det vigtigt at bemærke, at Q-score var altid overlegen til 30 (figur 5), således validering af sekventering.
Ikke desto mindre er det vigtigt at validere teknologien ved at sammenligne resultatetS opnået med dem, der opnås med Sanger-sekventering. I de 17 patienter sekventeret ved både Sanger sekventering (kodende sekvenser af BRCA1 og BRCA2) og transposasen baseret teknologi, vi har registreret de samme 330 genetiske variationer (SNP og mutationer). Som et eksempel blev en punktmutation i BRCA1 genet (figur 6 til venstre) og en deletion på 4 baser i BRCA2 genet (figur 6 til højre) påvises ved både Sanger og transposase-baserede metoder. Som BRCA1 er på bagsiden streng af kromosom 13, er det vigtigt at bemærke, at det er nødvendigt at supplere (men ikke vendes) sekvensen opnået, mens der for BRCA2 (på fremad streng), er den opnåede sekvens ikke skal suppleres . Som angivet i figur 5, NGS teknologi giver en estimeret frekvens af den genetiske variation, mens Sanger metoden ikke. Desuden, især for Indel variationer, fortolkningen er nemmere med NGS teknologi. Som vist i figur 6 til højre, Indel variation sekvenser vises som en kodet elektroferogram der har brug for frem og bak sekventering at dechifrere den indsatte eller slettede sekvens. Med NGS analyse, den indsatte eller slettede sekvens bestemmes direkte, og dermed mindske risikoen for fejlfortolkning. Endelig transposasen baseret teknologi tilladt os at analysere et større antal målgener, og vi fandt mange nye genetisk variation sekvenser, der ikke var dækket af Sanger-sekventering. Disse resultater vil blive offentliggjort andetsteds.
Figur 1. Skematisk arbejdsgang af proceduren. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Kvalitetskontrol før og efter bibliotek forberedelse. A. Spektrofotometrisk profil gDNA der kan sikkert bruges til tagmentation. DNA udbytte skal være større end 5 ng / ul, skal 260/280 og 260/230 forholdene være overlegen til 1,8 og 2, henholdsvis. B. Fragment analyzer profiler tagmented gDNA. Overpanel repræsenterer utilstrækkeligt tagmented gDNA. Lavere panel viser en perfekt tagmented prøve. C. Fragment analysator profil forberedt bibliotek lige før sekventering lancering. Fragment størrelse er den samme som tagmented gDNA (B, nederste panel), men med en forstærket beløb. Klik her for at se en større version af dette tal.
> 
Figur 3. Kontrol klynge generation. A. Skærmbillede af sekventering enheden under kørslen. Klynge tæthed skal være mellem 800 og 1.000 K / mm ². B. Forskellige billeder svarer til lav densitet (øverste panel), høj densitet (nederste del) og perfekt tæthed (midterste panel). Klik her for at se en større version af dette tal .
Figur 4. Kontrol af Q-score. Ved slutningen af kørslen, skal valideres sekventering have mindst 75% af de genererede klynger med en Q-score overlegen 30.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. At repræsentere datadækning og deres tilsvarende Q-score. Read dybde er uensartet langs dækket gen. Ikke desto mindre Q-score på dækket regioner er altid bedre end Q-30. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6. Repræsentative resultater opnået med Sanger sekventering og med transposasen-baseret teknologi. Alle genetiske variationer observeret med Sanger sekventering blev detected med transposasen-baseret teknologi. Betragtninger punktmutationer er nemme at fortolke, Indel ændringer er til tider ganske vanskeligt at studere med Sanger metoden. Med transposasen-baseret teknologi forbundet med en medium gennemløb enhed, Indel ændringer er nemt at opdage. Ikke desto mindre er det vigtigt at bemærke, at det er nødvendigt at supplere (men ikke vendes) sekvenser opnået, når målgenet er placeret på minus streng (her BRCA1 genet). Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den udbredte brug af NGS enheder og teknologier har givet nye muligheder i studiet af kræft og genetiske sygdomme. Ud over hele genomsekvensering eller RNA sekventering, analyse af en stor mængde af udvalgte gDNA sekvenser i mange patienter, som samtidig giver store perspektiver i diagnosen. Her har vi udviklet et specifikt design (tilgængelige on-demand) ved hjælp NEXTERA teknologi til at studere 11 komplette gener hos 24 patienter samtidig med en mellemlang anordning throughput sekventering (Table of Materials / udstyr). Denne protokol giver hurtig generering af data, der muliggør en hurtig reaktion på patienternes bekymringer med en lav risiko for fejl. Som illustreret i figur 6, blev alle genetiske detekterede variationer med Sanger sekventering også registreres ved hjælp af transposasen-baseret præparat kit. Denne metode er pålidelig og let at fortolke, især for komplekse Indel ændringer, der analyseres direkte. Ikke desto mindre er det vigtigt,at bemærke, at gener lokaliseret i minus streng, er det nødvendigt at supplere (uden bakker) nukleotider. Den nuværende arbejde blev udført med et design til analyse af 11 komplette gener, men protokollen er det samme uanset design valgt. Transposase-baseret teknologi kan også anvendes til biblioteket præparat fra langtrækkende PCR-produkter 12. Faktisk algoritmen (udviklet af producenten), der bruges til design (producentens hjemmeside værktøj, se tabel Materialer / udstyr) er specifikt dedikeret til denne protokol. Ud over at transposasen-baseret teknologi, to andre mekanismer i DNA-fragmentering, før biblioteket forberedelse er også tilgængelige: mekanisk fragmentering og enzymatisk fragmentering. Mekanisk DNA-fragmentering er reproducerbar, men har brug for en ultrasonikator, og forberedelse bibliotek er dyrere og mere tidskrævende. Enzymatisk DNA-fragmentering ofte fremkalder problemer for DNA-indfangning skyldes restriktionsenzym-steder, hvilket resultereri manglende målsekvens dækning. Ikke desto mindre, hver strategi for DNA-fragmentering har fordele og ulemper, men synes at give ganske lignende resultater, i det mindste for lang række PCR-produkt fragmentering 13. Anvendelsen af et nyt enzym cocktail syntes at give de samme resultater som dem, der opnås med mekanisk DNA-fragmentering 14. Transposase-baseret teknologi har brug for DNA høj kvalitet (ikke for DNA ekstraheret fra FFPE væv). Desuden aktiviteten af transposasen behov fragmenter på mere end 300 bp, hvilket tyder på, at fragmenter af interesse, skal være længere end denne længde. Denne særregel forklarer behovet for høj kvalitet, un-fragmenteret DNA.
Indtil nu har genetiske variationer af BRCA1 og BRCA2 blevet undersøgt i familiær bryst og ovariecancer. Men inddragelse af BRCA gener, og især BRCA2, er nu mistænkt i andre kræftformer, især i bugspytkirtlen 15, prostata16, og testis cancer 17. Den genetiske ændring af PALB2, partner i BRCA gener, er også forbundet med kræft i bugspytkirtlen 18. Desuden er det for nylig fremgik det, at patienter, der huser BRCA mutationer, og i mindre grad PALB2 mutationer, viste en bedre respons på deres bugspytkirtelkræft til PARP-inhibitorer 19. Som BRCA1, BRCA2, og PALB2 er forbundet med en familiær risiko for kræft, og muligvis forbundet med følsomhed over for specifikke behandlinger, synes det vigtigt at udforske BRCA1 og BRCA2 partnere i screening for risiko familiær kræft og screening for kræftbehandling respons.
Ud fra disse data, at analyse af DNA break reparation gener synes at være vigtigt, ikke blot til screening af følsomhed, men også for et formodet indikator for behandlingsrespons. Desuden kunne det komplette gen analyse foreslås med denne protokol covER Hele ændringer der kunne være medfødt stede (og til stede i kræftceller), såsom mutationer i promotoren, splejsning sites eller regulatoriske splejsningssteder placeret i introns. Til dato har ændringer i ikke-kodende sekvenser af gener ikke blevet undersøgt i dybden, men udviklingen af genom-dækkende forening undersøgelser kunne fremhæve vigtige funktioner i disse sekvenser.
Konklusionen er, at transposasen-baseret design er udviklet i dette papir er en interessant måde at udforske genetiske abnormiteter i kræft modtagelighed gener involveret i DNA-skader reparation. Muligheden for at sekventere 11 komplette gener for 24 patienter, som samtidig er en vigtig fordel sammenlignet med Sanger sekventering metoden, som er ganske vanskelig teknik til screening.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MiSeq | Illumina | SY-410-1001 | Sequencing/medium throughput device |
| Nextera Enrichment kit | Illumina | FC-123-1208 | Transposase based technology |
| 300 cycle cartridge | Illumina | 15033624 | |
| AMPure beads | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic purification beads |
| Magnetic stand | Alpaqua | A32782 | |
| 96-well Plates | Life Technologies | 4306737 | |
| MIDI 96-well plates | Biorad | AB0859 | |
| Microseal A | Biorad | MSA-5001 | This seal is necessary only for PCR amplification. Other standard seals can be used throughout the experiment |
| MiSeq | Illumina | Provided with the sequencing device Experiment Manager software Internet adress: http://designstudio.illumina.com/NexteraRc/project/new Manufacturer website tool |
References
- Cornelisse, C. J., Cornelis, R. S., Devilee, P. Genes responsible for familial breast cancer. Pathol. Res. Pract. 192 (7), 684-693 (1996).
- Culver, J., Lowstuter, K., Bowling, L. Assessing breast cancer risk and BRCA1/2 carrier probability. Breast Dis. 27, 5-20 (2007).
- Cox, D. G., et al. Common variants of the BRCA1 wild-type allele modify the risk of breast cancer in BRCA1 mutation carriers. Hum. Mol. Genet. 20 (23), 4732-4747 (2011).
- Maia, A. T., et al. Effects of BRCA2 cis-regulation in normal breast and cancer risk amongst BRCA2 mutation carriers. Breast Cancer Res. 14 (2), 63 (2012).
- Anczuków, O., et al. BRCA2 deep intronic mutation causing activation of a cryptic exon: opening toward a new preventive therapeutic strategy. Clin. Cancer Res. 18 (18), 4903-4909 (2012).
- Brewster, B. L., et al. Identification of fifteen novel germline variants in the BRCA1 3'UTR reveals a variant in a breast cancer case that introduces a functional miR-103 target site. Hum. Mutat. 33 (12), 1665-1675 (2012).
- Roy, R., Chun, J., Powell, S. N. BRCA1 and BRCA2: different roles in a common pathway of genome protection. Nat Rev Cancer. 12 (1), 68-78 (2012).
- Ma, X. D., et al. First evidence for the contribution of the genetic variations of BRCA1-interacting protein 1 (BRIP1) to the genetic susceptibility of cervical cancer. Gene. 524 (2), 208-213 (2013).
- Haanpää, M., Pylkäs, K., Moilanen, J. S., Winqvist, R. Evaluation of the need for routine clinical testing of PALB2 c.1592delT mutation in BRCA negative Northern Finnish breast cancer families. BMC Med. Genet. 14, 82 (2013).
- Southey, M. C., Teo, Z. L., Winship, I. PALB2 and breast cancer: ready for clinical translation. Appl. Clin. Genet. 6, 43-52 (2013).
- Ulahannan, D., Kovac, M. B., Mulholland, P. J., Cazier, J. B., Tomlinson, I. Technical and implementation issues in using next-generation sequencing of cancers in clinical practice. Br. J. Cancer. 109, 827-835 (2013).
- Hernan, I., Borràs, E., de Sousa Dias, M., Gamundi, M. J., Mañé, B., Llort, G., Agúndez, J. A., Blanca, M., Carballo, M. Detection of genomic variations in BRCA1 and BRCA2 genes by long-range PCR and next-generation sequencing. J. Mol. Diagn. 14, 286-293 (2012).
- Knierim, E., Lucke, B., Schwarz, J. M., Schuelke, M., Seelow, D. Systematic comparison of three methods for fragmentation of long-range PCR products for next generation sequencing. Plos One. 6, e28240 (2011).
- de Sousa Dias, M., Hernan, I., Pascual, B., Borràs, E., Mañé, B., Gamundi, M. J., Carballo, M. Detection of novel mutations that cause autosomal dominant retinitis pigmentosa in candidate genes by long-range PCR amplification and next-generation sequencing. Mol. Vis. 19, 654-664 (2013).
- The Breast Cancer Linkage Consortium. Cancer Risks in BRCA2 Mutation Carriers. J. Natl. Cancer Inst. 91, 1310-1316 (1999).
- Levy-Lahad, E., Friedman, E. Cancer risks among BRCA1 and BRCA2 mutation carriers. Br. J. Cancer. 96 (1), 11-15 (2007).
- Risch, H. A., et al. Population BRCA1 and BRCA2 mutation frequencies and cancer penetrances: a kin-cohort study in Ontario, Canada. J. Natl. Cancer Inst. 98 (23), 1694-1706 (2006).
- Slater, E. P., et al. PALB2 mutations in European familial pancreatic cancer families. Clin. Genet. 78, 490-494 (2010).
- Brennan, G. T., Relias, V., Saif, M. W.
