Abstract
Den utbredte bruken av Next Generation Sequencing har åpnet nye veier for kreftforskning og diagnostikk. NGS vil bringe store mengder nye data om kreft, og spesielt kreft genetikk. Dagens kunnskap og fremtidige funn vil gjøre det nødvendig å studere et stort antall gener som kan være involvert i en genetisk predisposisjon for kreft. I denne forbindelse har vi utviklet en Nextera design for å studere 11 komplette gener involvert i DNA-skade reparasjon. Denne protokollen ble utviklet for å trygt studere 11 gener (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAD80, og TP53) fra arrangøren til 3'-UTR hos 24 pasienter samtidig. Denne protokollen, basert på transposase teknologi og gDNA berikelse, gir en stor fordel i form av tid for genetisk diagnostikk takket være prøve multipleksing. Denne protokollen kan trygt brukes med blod gDNA.
Introduction
I 2010, nesten 1,5 millioner mennesker (hovedsakelig kvinner) utviklet brystkreft på verdensbasis. Det er anslått at 5 til 10% av tilfellene var arvelig. Nesten 20 år siden, ble BRCA1 og BRCA2 identifisert som involvert i arvelig bryst-og eggstokkreft en. Siden ca 15 år siden, har BRCA1 og BRCA2 koding regioner blitt sekvensert å bestemme genetisk predisposisjon for bryst og eggstokk kreft. Endringer i BRCA1 og BRCA2 er påvist i 10 til 20% av utvalgte to familier antyder at analysen av disse regionene ikke er tilstrekkelig for effektiv filtrering. Nylig, analyse av ikke-kodende sekvenser (Arrangøren, introner, 3-'UTR) av BRCA1 og BRCA2 fremhevet at nye mutasjoner / varianter kan være knyttet til en høyere risiko for brystkreft 3-6.
BRCA1 og BRCA2 proteiner er involvert i homolog rekombinasjon Repair (HHR), som er utført av mange partnere 7. Mens endringer i BRCA1 eller BRCA2 indusere defekter i DNA-reparasjon, kan de andre partnerne også påvirke risikoen for brystkreft. Denne hypotesen synes å ha blitt validert siden BRIP1 8 og PALB2 9 har en bevist effekt på livmorhals og brystkreft, henholdsvis. I tillegg kan to andre "moderat risiko" brystkreftresistensgener, minibank og CHEK2, også bli undersøkt rutinemessig 10.
Etter på fra disse studiene, har vi besluttet å utvikle en protokoll for å analysere 11 gener (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAP80, og TP53) i 24 pasienter samtidig ved hjelp av en veldig enkel og relativt fort protokoll basert på transposase-teknologi, med anrikning og sekvensering på et medium gjennomstrømning enhet. Takktil denne teknikk, har vi sekvensert fullstendige gener fra starten av promoteren til enden av 3'-UTR, bortsett RAP80, hvor en intronic regionen i 2500 bp ble ikke dekket (Chr5: 176,381,588-176,390,180). Dette representerer totalt ca 1.000.300 bp studert med 2734 sonder. Vanligvis er BRCA1 og BRCA2 exonic sekvenser analysert ved Sanger-sekvensering, som trenger 1,5 måneder for mindre enn 20 pasienter. Med den foreliggende protokoll (figur 1), på samme tid, 11 komplette gener for mer enn 75 pasienter kunne bli analysert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Vurdering av gDNA (genomisk DNA) Yield
- Kvantifisere nylig hentet gDNA før utarbeidelse av biblioteket. Bruk fluorometrisk avkastning vurderings metode for å kvantifisere intakt gDNA (unngå å bruke et spektrofotometer for gDNA avkastning vurdering). Mål (260/280 nm) ratio, og sikre at det er mellom 1,8 og 2. MERK: 50 ng av gDNA er nødvendig for forsøket.
2. gDNA Enrichment: Dag 1, Morgen
- Før start
- Fra DNA berikelse kit (se tabell av materiell / utstyr), tine DNA buffer (TD) og DNA enzym (TDE1) løsninger på is. Minst 30 min før bruk, bringe rensing magnetiske perler og stoppe target (ST) buffer til romtemperatur (RT). Tilsett 20 pl av gDNA prøven ved 2-2,5 ng / mL direkte inn i en 96-brønners plate, en godt per prøve. VIKTIG: Bruk en positiv kontroll for å validere protokollen (prøven med kjent sekvens variasjon).
- Tagmentation
- Mix alle reagenser grundig ved å invertere 5x, og spinne ned en kort stund. Ved RT, tilsett 25 pl av TD-buffer til hver brønn inneholdende 50 ng (20 pl) for gDNA, og deretter 5 mL av TDE1 buffer. Sett pipetten til 50 mL, pipetter forsiktig hele volumet opp og ned 10x.
- Dekk plate med et klebefilm og sentrifuger i 1 min ved 280 x g ved 20 ° C. Deretter plasserer platen i en thermocycler (cover oppvarmet ved 100 ° C) og kjøre det følgende program: 55 ° C i 5 min og 10 ° C i ubegrenset tid.
- I løpet av denne inkubasjon, forberede prøven ark med Experiment Manager-programvare til å definere indekser som vil bli brukt.
- Tagmentation Rensing
MERK: Dette trinnet er kritisk. Vær svært forsiktig.- Sjekk for fraværet av bunnfallet i rensing magnetiske kuler og ST buffer. Dersom utfellinger er til stede, varme opp løsninger i hendene. Tine resuspensjon buffer (RSB) på is.
- Ved RT, vortex ST løsning og legge15 ul til hver brønn inneholdende prøven. Sett pipetten til 65 mikroliter, pipetter forsiktig hele volumet opp og ned 10x. Inkuber i 5 min ved RT. Dekker platen og sentrifuger i 1 min ved 280 x g ved 20 ° C.
- Legg 52 pl av tidligere blandede rensing magnetiske kuler i hver brønn. Sett pipetten til 117 mikroliter, forsiktig pipette hele volumet opp og ned 10x. Inkuber i 10 min ved RT. Dekker platen og sentrifuger i 1 min ved 280 x g ved 20 ° C.
- Fjern klebefilmen. Plasser 96-brønns plate i et magnetisk stativ i 2 minutter ved RT. Sørg for at supernatanten vises helt klart.
- Tilbered en frisk 80% etanol-løsning (for 24 prøver, tilsett 2 ml destillert vann i 8 ml etanol). Fjern og kast supernatanten tar seg ikke å forstyrre perlene.
- Mens holde platen på magnetisk stativ, tilsett 200 pl av nylaget 80% etanol til hver brønn uten å forstyrre perlene og Inkuber platen i minst 30 sekved romtemperatur. Kast supernatanten og gjenta denne vaske en gang. Sørg for at etanol har blitt fjernet. La tørke ved romtemperatur i 10 min eller inntil fullstendig fordamping av etanol.
- Fjern platen fra magnetstativet og tilsett 22,5 mL av RSB-buffer. Sett pipetten til 22,5 mL, pipetter forsiktig hele volumet opp og ned 10x. Plasser 96-brønn plate på magnetstativet og inkuberes i 2 min. Sørg for at supernatanten vises helt klart. Forsiktig overfør 20 pl av supernatanten i en ny 96-brønners plate.
MERK: Eventuelt bestemme størrelsen av de tagmented prøvene ved hjelp av et fragment analysator. I stedet for fremgangsmåten som er nevnt ovenfor, bruker høy oppløsning akrylamid gel elektroforese. Fragmenter bør være mellom 150 bp og 1000 bp.
- 1. PCR Amplification
- Thaw PCR Master Mix inneholder polymerase (LP-PMM), Indeks 1 primer, og Index to primer løsninger på is. Matche kombinasjonen of indekser med Experiment sjef prøvearket. For multiplexing, forberede forskjellig i7 fra indeks 1 (i7, N7xx) for hver prøve.
- I hver brønn, tilsett 20 mL av LP-PMM, 5 mL av Indeks 1 og 5 mL av Indeks 2. Sett pipetten til 50 mL, forsiktig pipette hele volumet opp og ned 10x. Dekk plate med et klebe microseal film. Sentrifuger i 1 min ved 280 x g ved 20 ° C.
- Sett platen i en thermocycler (cover oppvarmet ved 100 ° C), og kjøre programmet 1 (tabell 1).
MERK: prosedyren kan bli stoppet på dette punktet, og reaksjonene lagret over natten i thermocycler eller for 2 dager mellom 2 og 8 ° C.
3. gDNA Enrichment: Dag 1, Afternoon
- Før start
- Tine oligos (CSO), fangst målet buffer 1 (NCT1), og RSB løsninger på is. Minst 30 min før bruk, ta rensing magnetiske kuler til RT.
- PCR Purification
- Sentrifuger plate fra trinn 2.4, i 1 min ved 280 x g ved 20 ° C.
- Ved RT, tilsett 45 mL av blandet rensing magnetiske kuler i hver brønn. Sett pipetten til 95 mikroliter, forsiktig pipette hele volumet opp og ned 10x. Inkuber i 10 min ved RT. Plasser 96-brønns plate i et magnetisk stativ i 2 minutter ved RT.
- Sørg for at supernatanten vises helt klart. Tilbered en frisk 80% etanol-løsning (for 24 prøver, tilsett 2 ml destillert vann i 8 ml etanol). Kast supernatanten tar seg ikke å forstyrre pelleten.
- Mens holde platen på magnetisk stativ, tilsett 200 pl av nylaget 80% etanol til hver brønn uten å forstyrre perlene og Inkuber platen i 30 sekunder ved romtemperatur. Kast supernatanten og gjenta denne vaske en gang. Sørg for at etanol har blitt fjernet. La tørke ved romtemperatur i 15 min.
- Fjern platen fra magnetstativet og tilsett 40 pl av RSB-buffer. Sett rørettte til 40 pl, forsiktig pipette hele volumet opp og ned 10x.
- Plasser 96-brønn plate på magnetstativet og inkuberes i 2 min. Supernatanten skal vises helt klart. Forsiktig overføre 38 ul av supernatanten til en ny 96-brønners plate.
- Bestem utbyttet av hver prøve av en fluorimetrisk metode. Denne første delen av protokollen vil bli validert hvis de vurderte avkastning er mellom 30 og 50 ng / mL.
- 1 st Hybridisering
- Pool opptil 12 prøver per pool på dette stadium ved å blande 500 ng av hver prøve i en ny 96-brønners plate. Sikre at det endelige volumet av hver pool ikke overstiger 40 mikroliter.
MERK: Hvis nødvendig, redusere volumet av badene ved hjelp av et vakuum konsentrator-enheten ved romtemperatur (Forsiktig: konsentrasjonen av DNA kan ikke endres ved oppvarming, selv ved 30 ° C som forårsaker oppvarming DNA degradering). Juster det endelige volumet til 40 pl ved å tilsette RSB løsning. - BlandNCT1 løsning. For hver brønn inneholdende 40 pl av sammenslåtte DNA-prøver, tilsett 50 pl NCT1, og 10 ul av CSO. Sett pipetten til 100 mL, pipetter forsiktig hele volumet opp og ned 10x. Forsegl plate og sentrifuger i 1 min ved 280 x g ved 20 ° C.
- Sett platen i en thermocycler (cover oppvarmet ved 100 ° C) og kjøre program 2 (tabell 1).
- Pool opptil 12 prøver per pool på dette stadium ved å blande 500 ng av hver prøve i en ny 96-brønners plate. Sikre at det endelige volumet av hver pool ikke overstiger 40 mikroliter.
4. gDNA Enrichment: Dag 2, Morgen
- Før start
- Fra DNA berikelse kit (se tabell av materiell / utstyr) tøvær 2 N NaOH (HP3), target elueringsbuffer 1 (ET1), målrette elueringsbuffer en ET2, streptavidin magnetiske kuler (SMB), vaskeløsning 1 (WS1), vask løsning 2 (WS2), vaskeløsning 3 (WS3), CSO, og NCT1 løsninger på RT.
- 1 st Hybridisering Wash
- Fjern 96-brønns plate fra thermocycler og sentrifuger 1 min ved 280 x g ved 20 ° C. Fjern limet dekselet svært carefully.
- Overfør 100 ul reaksjonsblanding fra platen i et nytt MIDI 96-brønns plate og tilsett 250 ul av vortex-blandet godt SMB-løsning. Sett pipetten til 350 mikroliter, pipetter forsiktig hele volumet opp og ned 10x. Forsegl platen og inkuber ved romtemperatur i 30 min.
- Sentrifuger i 1 min ved 280 x g ved 20 ° C, fjerner det klebende forsegling og plassere platen på magnetisk stativ i 2 minutter. Sørg for at supernatanten vises helt klart. Kast supernatanten og fjerne platen fra magnetstativet.
- Tilsett 200 pl av godt blandet WS1 oppløsning i brønnen inneholdende perler. Sett pipetten til 200 mL og forsiktig pipette hele volumet opp og ned 15x unngå dannelse av bobler / skum.
- Sett platen på den magnetiske stå i 2 min. Sørg for at supernatanten vises helt klart. Kast supernatanten og fjerne platen fra magnetstativet.
- Tilsett 200 pl av godt blandet WS2 løsning i brønner containing perler. Sett pipetten til 200 mL og forsiktig pipette hele volumet opp og ned 15x unngå dannelse av bobler / skum.
- Sett platen på den magnetiske stå i 2 min. Sørg for at supernatanten vises helt klart. Kast supernatanten og fjerne platen fra magnetstativet.
- Tilsett 200 pl av godt blandet WS2 løsning i brønner inneholdende perler. Sett pipetten til 200 mL og pipetter forsiktig hele volumet opp og ned 15x.
- Overfør hele volumet i en ny 96-brønners plate. Forsegl platen og plassere platen i en thermocycler (cover oppvarmet ved 100 ° C). Start thermocycler ved 42 ° C i 30 min.
- Imediately plassere platen på magnetisk stativ i 2 minutter. Sørg for at supernatanten vises helt klart. Fjern tetningen og kast alle supernatanten. Deretter fjerne platen fra magnetstativet.
- Tilsett 200 pl av WS2 i brønner inneholdende perler. Sett pipetten til 200ul og forsiktig pipette hele volumet opp og ned 15x unngå dannelse av bobler / skum. Forsegl platen og plassere platen i en thermocycler (cover oppvarmet ved 100 ° C). Start thermocycler ved 42 ° C i 30 min.
- Umiddelbart plassere platen på magnetisk stativ i 2 minutter. Sørg for at supernatanten vises helt klart. Fjern tetningen og kast alle supernatanten. Deretter fjerne platen fra magnetstativet.
- Tilsett 200 pl av godt blandet WS3 løsning i brønner inneholdende perler. Sett pipetten til 200 mL og pipetter forsiktig hele volumet opp og ned 15x.
- Sett platen på den magnetiske stå i 2 min. Sørg for at supernatanten vises helt klart. Kast all supernatanten og fjerne platen fra magnetstativet.
- Gjenta WS3 vaske en gang til.
- Etter å ha fjernet supernatant, forsegle plate og kort sentrifuge å trekke ned restsupernatant. Sett platen påmagnetisk stativ i 2 minutter. Kast restsupernatant.
- I en 0,2 ml tube, bland 28,5 mL av ET1 og 1,5 mL av HP3 løsninger. Denne blandingen er for en pool, hvis flere bassenger er forberedt, multiplisere disse volumene med antall bassenger forberedt.
- Fjern platen fra magnetstativet. Legg 23 ul av den ovenfor fremstilte blanding. Sett pipetten til 23 mikroliter og pipetter forsiktig hele volumet opp og ned 15x. Forsegle platen og la stå i 5 min ved RT. Sentrifuger i 1 min ved 280 x g ved 20 ° C.
- Sett platen på den magnetiske stå i 2 min. Sørg for at supernatanten vises helt klart. Fjern klebefilmen og overføre 21 ul supernatant til en ny 96-brønners plate.
- Tilsett 4 mL av ET2-løsning til hver brønn. Sett pipetten til 25 mL og pipetter forsiktig hele volumet opp og ned 10x og forsegle plate.
MERK: prosedyren kan bli stoppet på dette punktet, og reaksjonene lagres i opp til 7 dager ved -15 ° C. Hvis platen er frosset, helt tine før den 2. hybridisering.
- 2. Hybridisering
- Sentrifuger plate i 1 min ved 280 x g ved 20 ° C. Fjern klebefilmen og tilsett 50 pl NCT1, 10 mL av CSO, og 15 ul av PCR-grade vann til 25 ul av biblioteket. Sett pipetten til 100 mL og pipetter forsiktig hele volumet opp og ned 10x.
- Forsegl plate og sentrifuger i 1 min ved 280 x g ved 20 ° C.
- Sett platen i en thermocycler (cover oppvarmet ved 100 ° C) og kjøre program 2 (tabell 1).
5. gDNA Enrichment: Dag 2, Afternoon
- Før start
- Thaw ET1, ET2, SMB, WS1, WS2, WS3 og HP3 løsninger på RT for hybridisering vask. Fra DNA-oppformering kit, tine PCR konsentrat-blanding inneholdende polymerase (TC-PMM), PCR-primer cocktail (PPC), og RSB løsninger på is for PCR amplifikasjon.
- 2. Hybridisering Wash
- Følg nøyaktig samme protokoll som for 4,2 til 1 st hybridisering vask.
- PCR Amplification
- I en ny 96-brønners plate, bland 20 ul av eluering fra trinn 5.2, 25 pl av TC-PMM, og 5 pl av PPC. Sett pipetten til 50 mL og pipetter forsiktig hele volumet opp og ned 10x. Forsegl plate og sentrifuger i 1 min ved 280 x g ved 20 ° C.
- Sett platen i en thermocycler (cover oppvarmet ved 100 ° C), og kjøre programmet 3 (tabell 1).
6. gDNA Enrichment: Dag 3
- Før start
- Tine RSB løsning på is. Minst 30 min før bruk, ta rensing magnetiske kuler til RT.
- PCR Purification
- Sentrifuger plate fra trinn 5.3 i 1 min ved 280 x g ved 20 ° C, og fjerne den klebende dekke.
- Ved RT, tilsett 90 mL av previously blandet rensing magnetiske kuler i hver brønn. Sett pipetten til 140 mikroliter, pipetter forsiktig hele volumet opp og ned 10x. Inkuber i 15 min ved RT. Plasser 96-brønns plate i et magnetisk stativ i 5 min ved RT. Sørg for at supernatanten vises helt klart.
- Tilbered en frisk 80% etanol-løsning (for 2 prøver, tilsett 200 pl destillert vann til 800 pl etanol). Kast supernatanten tar seg ikke å forstyrre pelleten.
- Mens holde platen på magnetisk stativ, tilsett 200 pl av nylaget 80% etanol til hver brønn uten å forstyrre perlene og Inkuber platen i 30 sekunder ved romtemperatur. Kast supernatanten og gjenta denne vaske en gang til. Sørg for at etanol har blitt fjernet. La tørke ved RT i 15 min eller inntil fullstendig fordamping av etanol, mens platen er i magnetisk stativ.
- Fjern platen fra magnetstativet og tilsett 30 pl av RSB-buffer. Sett pipetten til 30 mikroliter, og forsiktig pipette than hele volumet opp og ned 10x. Inkuber platen i 2 min ved RT.
- Plasser 96-brønn plate på magnetisk stativ og inkuberes i 5 min eller inntil den overliggende væske vises helt klart. Forsiktig overføre 28 ul av supernatanten til en ny 96-brønners plate (plate Type: TCY).
MERK: Prosedyren kan bli stoppet på dette stadiet og reaksjonene oppbevares ved -15 ° C i opptil 7 dager.
- Bibliotek Validering og Kvantifisering
- Bestemme kvaliteten av biblioteket ved hjelp av et fragment analysator. Høyoppløselig akrylamid gelelektroforese kan bli brukt til å erstatte de trinn som er nevnt ovenfor, men er ikke anbefalt. Fragmenter bør være mellom 150 bp og 1000 bp.
MERK: Anbefalt: Kvantifisere biblioteket ved qPCR for å oppnå best antall klynger under sekvensering. - Som en referanse, kan du bruke en validert bibliotek (2 nM). Hvis det første biblioteket er under utarbeidelse, bruker fagen pHix DNA (10 nM) sørget for kalibrering av-sekvensening enhet.
- Forbered serielle fortynninger av positiv kontroll for å oppnå 7 punkter ved 20, 16, 8, 6, 4, 2, og 13:00 i EBT (EB elueringsbuffer + 0,1% Tween 20). Fortynne bibliotek av interesse på 1/1000 og 1/2000. Hvert punkt må analyseres i triplikat.
- Forbered følgende mix (formere volumer med antall brønner som brukes): for en brønn, tilsett 10 mL av SYBR grønt inneholder qPCR Master Mix (2x), 0,2 mL av forward primer (10 mm, AATGATACGGCGACCACCGAGAT), 0,2 mL av revers primer (10 mM, CAAGCAGAAGACGGCATACGA), og 7,6 pl PCR grade vann.
- Etter blanding avsette i en 96-brønners plate, for 18 mL av blandingen i hver brønn og 2 ul av positive kontroll og bibliotek fortynninger. Forsegl plate og sentrifuger i 1 min ved 280 x g ved 20 ° C. Deretter plasserer platen i et kvantitativ PCR thermocycler og kjør program 4 (tabell 1).
- Analyser av resultatene som konvensjonelt absolutt kvantifisering for å oppnå utbytte av hver libliotek. Fordelen med qPCR er at det bare kvantifiserer DNA som skal kommunisere med strømningscellen.
MERK: Ikke bruk fluorimetrisk kvantifisering av DNA på grunn av tilstedeværelsen av DNA-mimetiske molekyler i en av reagensene. Dette kvantifisering metoden ville overvurdere biblioteket yield og dermed undervurderer clustering poengsum.
- Bestemme kvaliteten av biblioteket ved hjelp av et fragment analysator. Høyoppløselig akrylamid gelelektroforese kan bli brukt til å erstatte de trinn som er nevnt ovenfor, men er ikke anbefalt. Fragmenter bør være mellom 150 bp og 1000 bp.
- Sekvense Lansering
- Fortynn hver bibliotek ved 4 nM i et sluttvolum på 30 ul elueringsbuffer (EB), og samle alle bibliotek og bland godt.
- Tilbered en frisk 0,2 N NaOH-løsning i buffer EB og bland 10 ul av denne NaOH-oppløsning med 10 pl av sammenslåtte biblioteker. Bland godt og inkuberes nøyaktig 5 min på RT.
- Etter 5 min, umiddelbart tilføre 980 mL av hybridiseringsbuffer (fra sekvense patron) og bland godt. Deretter blandes 400 pl av denne blandingen med 600 ul Hybridisering-buffer. Bland godt og overfør 600 pl 300 inn i en syklus patron (2 x 150) for en injeksjon av 8PM. Launch sekvensering.
7. Data Analysis
- Når enheten har behandlet data, overføre .bam og VCF-filer til en ny datamaskin.
MERK: Transposase fragmentering inkorporerer fotavtrykk. Derfor trimmer programvaren automatisk disse dataene. - Samle genetiske variasjoner oppnådd med analyse enheten.
- Analyser eksporterte filer (.bam, .vcf) med en annen programvare (Alamut) ved å følge instruksjonene fra produsenten. Deretter sammenligne de genetiske variasjonene som oppnås med begge analysene. Bare varianter oppdages to ganger anses stede.
Tabell 1. PCR-forhold
| Program | Temperatur | Tid | Num. repetisjoner | |||
| 1 | 72 ° C | 3 min | 1 | 98 ° C | 30 sek | 1 |
| 98 ° C | 10 sek | 10 | ||||
| 60 ° C | 30 sek | |||||
| 72 ° C | 30 sek | |||||
| 72 ° C | 5 min | 1 | ||||
| 10 ° C | ubegrenset | |||||
| 2 | 95 ° C | Ti minutter | 1 | |||
| 93 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 91 ° C | 1 minutter | 1 | ||||
| 89 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 87 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 85 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 83 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 81 ° C 1 min | 1 | |||||
| 79 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 77 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 75 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 71 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 69 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 67 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 65 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 63 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 61 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 59 ° C | 1 min | 1 | ||||
| : 58 ° C | 1 min | 16-18 hr | ||||
| 3 | 98 ° C | 30 sek | 1 | |||
| 98 ° C | 10 sek | 10 | ||||
| 60 ° C | 30 sek | |||||
| 72 ° C | 30 sek | |||||
| 72 ° C | 5 min | 1 | ||||
| 10 ° C | ubegrenset | |||||
| 4 | 95 ° C | Ti minutter | 1 | |||
| 95 ° C | 15 sek | 40 | ||||
| 60 ° C | 1 min | |||||
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Eksempel QC Resultater
Evnen av denne metode for å bestemme sekvenser av målgener er basert på kvaliteten av gDNA (figur 2A), og kvaliteten av tagmentation trinn. Hvis tagmentation ikke er tilstrekkelig (figur 2B, øvre panel), vil sekvense ikke være tilfredsstillende. Som nevnt ovenfor, etter at tagmentation rensing, den gDNA bør tagmented til fragmenter fra 150 bp til 1000 bp med flertallet av fragmenter rundt 300 bp (figur 2B, nedre panel).
Ved slutten av biblioteket preparat, er biblioteket kvalitet kontrolleres ved hjelp av en Bioanalyser. Profilen innhentet bør være omtrent den samme som etter tagmentation men med et høyere antall fragmenter (figur 2C). Dersom biblioteket kvalitet ikke er identisk med figur 1C, bør sekvensering ikke utføres.
Når sekvensering er lansert påsekvenser enhet, er clustering poengsum tilgjengelig etter 9 sykluser og bør være mellom 800.000 og 1.100.000 klynger / mm² (figur 3A). Hvis dette nummer er lavere, vil sekvense ikke være tilfredsstillende, spesielt i dybden for å lese. Hvis den er høyere, vil bildene bli uskarpe (Figur 3B), og ingen analyse vil bli gjort på grunn av at det er umulig å skille klynger.
På slutten av løpet, er det viktig å sjekke kvaliteten poengsum. Ved å følge protokollen beskrevet ovenfor, vil kvaliteten score på rømmen tilsvarer Figur 4. Kvaliteten på sekvensering er representert med en Q-score (Q-30). For å validere eksperimentet, i det minste omkring 75% av sekvenser (klynger) bør ha en Q-stillingen overlegen eller lik 30.
Sekvense Resultater
Dette eksperimentet er designet for å studere grunnlovs genetiske avvik. I dette tilfellet, er den genetiske abnormitet present ved 50% i genomet. På grunn av dette, er det sekvense dybden ikke veldig viktig. Heri, utarbeidet vi og sekvensert samtidig to biblioteker av 12 pasienter for 11 komplette gener. For å oppnå høy sekvense dybde, har antallet multipleksede pasienter til å bli redusert. Som gDNA anrikning er basert på fangst av sonder, er den anrikning ikke er homogen (figur 5). Med vår protokoll, genererte vi omtrent 6 GB leser, indusere en midlere dekning av 150 leser for hver base, med et minimum 20 og maksimum 330 leser. Disse lese dybder er i samsvar med bruken av NGS i klinisk praksis 11. Til tross for heterogeniteten av lese dybder, sannsynligvis på grunn gDNA anrikning av fangst, og ikke den store omorganisering av gener, er det viktig å merke seg at den Q-stillingen alltid var overlegne i forhold til 30 (figur 5), således validere sekvensering.
Ikke desto mindre er det viktig å validere teknologi ved å sammenligne resultatets oppnådd med de som ble oppnådd med Sanger-sekvensering. I de 17 pasientene sekvensert av både Sanger-sekvensering (koding sekvenser av BRCA1 og BRCA2) og transposase basert teknologi, vi har oppdaget de samme 330 genetiske variasjoner (SNP og mutasjoner). Som et eksempel ble en punktmutasjon i BRCA1 genet (figur 6 til venstre) og en delesjon av fire baser i BRCA2-genet (figur 6 til høyre) detektert ved både Sanger og transposase-baserte metoder. Som BRCA1 er på den motsatte tråd av kromosom 13, er det viktig å merke seg at det er nødvendig å utfylle (men ikke invertere) sekvensen oppnådd, mens for BRCA2 (på den fremre tråd), blir den oppnådde sekvensen trenger ikke å bli komplettert . Som angitt i figur 5, gir NGS-teknologi en estimert frekvens av den genetiske variasjon, mens Sanger-metoden gjør det ikke. Videre, spesielt for indel variasjoner, er enklere med NG tolkningenS-teknologi. Som vist i figur 6 rett, vises indel variasjon sekvenser som en egge electropherogram som trenger forover og bakover sekvense å dechiffrere den innsatte eller slettet sekvensen. Med NGS analysen, er satt inn eller slettet sekvensen direkte bestemt, og dermed redusere risikoen for feiltolkning. Endelig transposase basert teknologi tillater oss å analysere et større antall mål gener, og vi fant mange nye genetisk variasjon sekvenser som ikke var omfattet av Sanger-sekvensering. Disse resultatene vil bli publisert andre steder.
Figur 1. Skjematisk arbeidsflyt av prosedyren. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. kvalitetskontroller før og etter bibliotek forberedelse. A. Spektrofotometrisk profilen gDNA som trygt kan brukes for tagmentation. DNA utbyttet må være høyere enn 5 ng / mL, 260/280 og 260/230 forhold må være overlegen i forhold til 1,8 og 2, respektivt. B. Fragment analysator profiler av tagmented gDNA. Øvre panel representerer utilstrekkelig tagmented gDNA. Nedre panel viser en perfekt tagmented prøve. C. Fragment analysator profilen forberedt biblioteket like før sekvense lansering. Fragment størrelse er den samme som tagmented gDNA (B, nedre panel), men med en forsterket beløp. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
> 
Figur 3. Kontrollere klynge generasjon. A. Skjermbilde av sekvense enhet under kjøringen. Cluster tetthet bør være mellom 800 og 1000 K / mm². B. Forskjellige bilder tilsvarer lav tetthet (øvre panel), høy tetthet (nedre panel) og perfekt tetthet (midtpanelet). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren .
Figur 4. Kontroll av Q-stillingen. På slutten av kjøringen skal valideres sekvense ha minst 75% av genererte klynger med en Q-stillingen overlegen til 30.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Sikter dekningsdata og deres tilsvarende Q-poengsum. Lese dybden er heterogen langs hele dekket genet. Likevel, Q-score på dekket regioner er alltid bedre enn Q-30. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. Representative resultater oppnådd med Sanger-sekvensering og med transposase-basert teknologi. Alle genetiske variasjonene som observeres med Sanger-sekvensering ble detected med transposase-basert teknologi. Mens punktmutasjoner er enkle å tolke, Indel endringer er noen ganger ganske vanskelig å studere med Sanger-metoden. Med transposase-basert teknologi i forbindelse med en medium gjennomstrømming enhet, Indel endringer er enkle å oppdage. Likevel er det viktig å merke seg at det er nødvendig å utfylle (men ikke invertere) sekvenser oppnådd når målet genet ligger på minus strand (her BRCA1-genet). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den utbredte bruken av NGS enheter og teknologier har gitt nye muligheter i studiet av kreft og genetiske lidelser. I tillegg til hele genomet sekvensering eller RNA-sekvensering, gir analysen av en stor mengde av utvalgte gDNA sekvenser i en rekke pasienter som samtidig gode utsikter i diagnose. Her har vi utviklet en bestemt design (tilgjengelig på forespørsel) bruker Nextera teknologi for å studere 11 komplette gener hos 24 pasienter samtidig med et medium throughput sekvense enhet (Table of Materials / utstyr). Denne protokollen gir rask generasjon av data som muliggjør rask respons på pasientenes bekymringer med en lav risiko for feil. Som illustrert i figur 6, ble samtlige genetiske variasjoner oppdages med Sanger-sekvensering også detektert ved hjelp av transposase-basert preparat kit. Denne metode er pålitelig og lett å tolke, spesielt for komplekse indel forandringer som er analysert direkte. Ikke desto mindre er det viktigå merke seg at for gener lokalisert i minus tråd, er det nødvendig å komplettere (uten rygging) nukleotider. Den foreliggende arbeid ble utført med en utforming for analyse av 11 komplette gener, men protokollen er den samme uansett utformingen valgt. Transposase-basert teknologi kan også brukes til biblioteket forberedelse fra langtrekkende PCR-produkter 12. Faktisk algoritmen (utviklet av produsenten) som brukes for design (produsent hjemmeside verktøyet, se tabell av materiell / utstyr) er spesielt dedikert for denne protokollen. I tillegg til transposase-basert teknologi, to andre mekanismer for DNA-fragmentering før biblioteket forberedelse er også tilgjengelig: mekanisk fragmentering og enzymatisk fragmentering. Mekanisk DNA fragmentering er reproduserbar, men trenger en ultrasonicator og bibliotek forberedelse er dyrere og mer tidkrevende. Enzymatisk DNA fragmentering induserer ofte problemer for DNA-opptak på grunn av restriksjonsenzymsete steder, noe som resultereri en mangel på target-sekvens dekning. Ikke desto mindre, har hver strategi for DNA-fragmentering fordeler og ulemper, men ser ut til å gi ganske lignende resultater, i det minste for lang PCR-produkt 13 fragmentering. Bruken av et nytt enzym cocktail syntes å gi de samme resultater som dem som oppnås med mekanisk DNA fragmentering 14. Transposase-basert teknologi trenger høy kvalitet DNA (gjelder ikke for DNA ekstrahert fra FFPE- vev). Videre er aktiviteten av transposase behov fragmenter på mer enn 300 bp, noe som tyder på at fragmenter av interesse må være lengre enn denne lengden. Dette spesifisitet forklarer behovet for høy kvalitet, un-fragmentert DNA.
Inntil nå har genetiske varianter av BRCA1 og BRCA2 blitt studert i familiær bryst og eggstokkreft. Men, involvering av BRCA-gener, og spesielt BRCA2, er nå mistenkt i andre krefttyper, spesielt i bukspyttkjertelen 15, prostata16, og testis kreft 17. Den genetiske endring av PALB2, en partner av BRCA-gener, er også assosiert med kreft i bukspyttkjertelen 18. Videre det nylig dukket opp at pasienter husing BRCA mutasjoner, og i mindre grad PALB2 mutasjoner, viste en bedre respons av deres kreft i bukspyttkjertelen til PARP-hemmere 19. Som BRCA1, BRCA2, og PALB2 er forbundet med en familiær risiko for kreft, og muligens forbundet med mottakelighet for spesifikke behandlinger, synes det er viktig å utforske BRCA1 og BRCA2 partnere i screening for familiær kreftrisiko og i screening for kreft behandlingsrespons.
Fra disse data synes analyse av DNA-reparasjons break-relaterte gener for å være viktig, ikke bare for screening av følsomhet, men også for en antatt indikator på behandlingsrespons. Dessuten kan hele genet analyse slått med denne protokoll coveh alle endringer som kan være medfødt stede (og foreliggende i kreftceller), så som mutasjoner i promoteren, skjøtesteder eller regulerende skjøtesteder som ligger i introner. Hittil har endringer i ikke-kodende sekvenser av gener ikke studert i dybden, men utviklingen av genomassosiasjonsstudier kan markere viktige funksjoner i disse sekvensene.
Konklusjonen er at transposase-basert design utviklet i dette papiret er et interessant måte å utforske genetiske avvik i kreftresistens gener involvert i DNA-skader repareres. Muligheten for å sekvensere 11 komplette gener for 24 pasienter er samtidig en viktig fordel sammenlignet med Sanger-sekvensering metoden, som er ganske vanskelig teknikk for screening.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MiSeq | Illumina | SY-410-1001 | Sequencing/medium throughput device |
| Nextera Enrichment kit | Illumina | FC-123-1208 | Transposase based technology |
| 300 cycle cartridge | Illumina | 15033624 | |
| AMPure beads | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic purification beads |
| Magnetic stand | Alpaqua | A32782 | |
| 96-well Plates | Life Technologies | 4306737 | |
| MIDI 96-well plates | Biorad | AB0859 | |
| Microseal A | Biorad | MSA-5001 | This seal is necessary only for PCR amplification. Other standard seals can be used throughout the experiment |
| MiSeq | Illumina | Provided with the sequencing device Experiment Manager software Internet adress: http://designstudio.illumina.com/NexteraRc/project/new Manufacturer website tool |
References
- Cornelisse, C. J., Cornelis, R. S., Devilee, P. Genes responsible for familial breast cancer. Pathol. Res. Pract. 192 (7), 684-693 (1996).
- Culver, J., Lowstuter, K., Bowling, L. Assessing breast cancer risk and BRCA1/2 carrier probability. Breast Dis. 27, 5-20 (2007).
- Cox, D. G., et al. Common variants of the BRCA1 wild-type allele modify the risk of breast cancer in BRCA1 mutation carriers. Hum. Mol. Genet. 20 (23), 4732-4747 (2011).
- Maia, A. T., et al. Effects of BRCA2 cis-regulation in normal breast and cancer risk amongst BRCA2 mutation carriers. Breast Cancer Res. 14 (2), 63 (2012).
- Anczuków, O., et al. BRCA2 deep intronic mutation causing activation of a cryptic exon: opening toward a new preventive therapeutic strategy. Clin. Cancer Res. 18 (18), 4903-4909 (2012).
- Brewster, B. L., et al. Identification of fifteen novel germline variants in the BRCA1 3'UTR reveals a variant in a breast cancer case that introduces a functional miR-103 target site. Hum. Mutat. 33 (12), 1665-1675 (2012).
- Roy, R., Chun, J., Powell, S. N. BRCA1 and BRCA2: different roles in a common pathway of genome protection. Nat Rev Cancer. 12 (1), 68-78 (2012).
- Ma, X. D., et al. First evidence for the contribution of the genetic variations of BRCA1-interacting protein 1 (BRIP1) to the genetic susceptibility of cervical cancer. Gene. 524 (2), 208-213 (2013).
- Haanpää, M., Pylkäs, K., Moilanen, J. S., Winqvist, R. Evaluation of the need for routine clinical testing of PALB2 c.1592delT mutation in BRCA negative Northern Finnish breast cancer families. BMC Med. Genet. 14, 82 (2013).
- Southey, M. C., Teo, Z. L., Winship, I. PALB2 and breast cancer: ready for clinical translation. Appl. Clin. Genet. 6, 43-52 (2013).
- Ulahannan, D., Kovac, M. B., Mulholland, P. J., Cazier, J. B., Tomlinson, I. Technical and implementation issues in using next-generation sequencing of cancers in clinical practice. Br. J. Cancer. 109, 827-835 (2013).
- Hernan, I., Borràs, E., de Sousa Dias, M., Gamundi, M. J., Mañé, B., Llort, G., Agúndez, J. A., Blanca, M., Carballo, M. Detection of genomic variations in BRCA1 and BRCA2 genes by long-range PCR and next-generation sequencing. J. Mol. Diagn. 14, 286-293 (2012).
- Knierim, E., Lucke, B., Schwarz, J. M., Schuelke, M., Seelow, D. Systematic comparison of three methods for fragmentation of long-range PCR products for next generation sequencing. Plos One. 6, e28240 (2011).
- de Sousa Dias, M., Hernan, I., Pascual, B., Borràs, E., Mañé, B., Gamundi, M. J., Carballo, M. Detection of novel mutations that cause autosomal dominant retinitis pigmentosa in candidate genes by long-range PCR amplification and next-generation sequencing. Mol. Vis. 19, 654-664 (2013).
- The Breast Cancer Linkage Consortium. Cancer Risks in BRCA2 Mutation Carriers. J. Natl. Cancer Inst. 91, 1310-1316 (1999).
- Levy-Lahad, E., Friedman, E. Cancer risks among BRCA1 and BRCA2 mutation carriers. Br. J. Cancer. 96 (1), 11-15 (2007).
- Risch, H. A., et al. Population BRCA1 and BRCA2 mutation frequencies and cancer penetrances: a kin-cohort study in Ontario, Canada. J. Natl. Cancer Inst. 98 (23), 1694-1706 (2006).
- Slater, E. P., et al. PALB2 mutations in European familial pancreatic cancer families. Clin. Genet. 78, 490-494 (2010).
- Brennan, G. T., Relias, V., Saif, M. W.
