Abstract
Den utbredda användningen av nästa generations sekvensering har öppnat nya vägar för cancerforskning och diagnos. NGS kommer att ge enorma mängder nya data om cancer, och särskilt cancergenetik. Nuvarande kunskap och framtida upptäckter kommer att göra det nödvändigt att studera ett stort antal gener som kan vara inblandade i en genetisk predisposition för cancer. I detta avseende har vi utvecklat ett NextEra design för att studera 11 kompletta gener involverade i DNA-skador reparation. Detta protokoll har utvecklats för att på ett säkert sätt studera 11 gener (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAD80 och TP53) från promotor till 3'-UTR i 24 patienter samtidigt. Detta protokoll, som bygger på transposas teknik och gDNA anrikning, ger en stor fördel när det gäller tiden för genetisk diagnostik tack till prov multiplexering. Detta protokoll kan användas säkert med blod gDNA.
Introduction
Under 2010 nästan 1,5 miljoner människor (främst kvinnor) utvecklade bröstcancer över hela världen. Man uppskattar att 5 till 10% av dessa fall var ärftlig. Nästan 20 år sedan, var BRCA1 och BRCA2 identifierats som inblandade i ärftlig bröst-och äggstockscancer 1. Sedan cirka 15 år sedan, har BRCA1 och BRCA2 kodande regioner sekvenserats för att fastställa den genetiska anlag för bröstcancer och äggstockscancer. Förändringar i BRCA1 och BRCA2 påvisas i 10 till 20% av utvalda familjer 2 tyder på att analysen av dessa regioner inte är tillräckligt för effektiv screening. Nyligen analys av icke-kodande sekvenser (promotor, introner, 3-'UTR) av BRCA1 och BRCA2 betonat att nya mutationer / varianter kunde kopplas till en högre risk för bröstcancer 3-6.
BRCA1 och BRCA2-proteiner är inblandade i homolog rekombination Repair (HHR), vilket kompletteras med ett flertal partners 7. Även förändringar i BRCA1 eller BRCA2 inducerar defekter i DNA-reparation kan övriga parter också påverkar risken för bröstcancer. Denna hypotes verkar ha validerats sedan BRIP1 8 och PALB2 9 har en bevisad effekt på livmoderhalscancer och bröstcancer, respektive. Dessutom kan två andra "måttlig risk" bröstcancerresistensgener, ATM och CHEK2, också studeras rutinmässigt 10.
Uppföljning av dessa studier, beslutade vi att ta fram ett protokoll för att analysera 11 gener (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAP80 och TP53) hos 24 patienter samtidigt med hjälp av en mycket enkel och relativt snabb protokoll baserat på transposase teknik, med anrikning och sekvensering på ett medium genomströmning enhet. Tackdenna teknik, sekvens vi kompletta gener från början av promotorn till slutet av 3'-UTR, utom RAP80, för vilken en intronregion 2500 bp inte omfattades (Chr5: 176,381,588-176,390,180). Detta motsvarar totalt cirka 1.000.300 bp studeras med 2734 sonder. Vanligtvis är BRCA1 och BRCA2 exonic sekvenser analyseras av Sanger-sekvensering, som behöver 1,5 månader för mindre än 20 patienter. Med det nuvarande protokollet (Figur 1), på samma tid, 11 kompletta gener för mer än 75 patienter kunde analyseras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Bedömning av gDNA (iskt DNA) Utbyte
- Kvantifiera nyligen extraherade gDNA före framställningen av biblioteket. Använd fluorometriska metoden bedömnings avkastning att kvantifiera intakt gDNA (undvika att använda en spektrofotometer för gDNA avkastningsbedömning). Mät (260/280 nm) förhållande och se till att den är mellan 1,8 och 2 OBS: 50 ng gDNA krävs för experimentet.
2 gDNA Anrikning: Dag 1, morgon
- Innan du börjar
- Från DNA anrikningssats (se tabell för material / utrustning), tina DNA buffert (TD) och DNA-enzym (TDE1) lösningar på is. Minst 30 minuter före användning, ta med renings magnetiska pärlor och stoppa mål (ST) buffert till rumstemperatur (RT). Lägg 20 pl av gDNA provet vid 2-2,5 ng / | il direkt in i en 96-brunnsplatta, en väl per prov. VIKTIGT: Använd en positiv kontroll för att validera det protokoll (prov med känd sekvensvariation).
- Tagmentation
- Mix alla reagenser grundligt genom att vända 5x och spinn ner en kort stund. Vid RT, tillsätt 25 pl av TD-buffert till varje brunn innehållande 50 ng (20 ^ il) av gDNA, och därefter 5 ^ il TDE1 buffert. Ställ pipett till 50 ^, försiktigt pipettera hela volymen upp och ner 10 gånger.
- Täck plattan med en limfilm och centrifugera under 1 min vid 280 x g vid 20 ° C. Sedan placera plattan i en termocykler (omslag vid 100 ° C) och kör följande program: 55 ° C i 5 min och 10 ° C för obegränsad tid.
- Under denna inkubation, förbereda provarket med Experiment Manager för att definiera de index som kommer att användas.
- Tagmentation Rening
OBS: Detta steg är avgörande. Var mycket försiktig.- Kontrollera om frånvaron av fällningen i renings magnetiska pärlor och ST-buffert. Om fällningar före, värma upp lösningar i händerna. Tina resuspensionsbuffert (RSB) på is.
- På RT, virvel ST lösning och till15 ^ till varje brunn innehållande prov. Ställ pipett till 65 pl, försiktigt pipettera hela volymen upp och ner 10 gånger. Inkubera under 5 min vid RT. Täck plattan och centrifugera under 1 min vid 280 x g vid 20 ° C.
- Lägg 52 l av tidigare blandade renings magnetiska kulor i varje brunn. Ställ pipett till 117 l, försiktigt pipettera hela volymen upp och ner 10 gånger. Inkubera under 10 min vid RT. Täck plattan och centrifugera under 1 min vid 280 x g vid 20 ° C.
- Ta bort klisterfilmen. Placera 96-brunnar på en magnetisk ställ för 2 min vid RT. Se till att den överstående verkar helt klart.
- Bered en färsk 80% etanollösning (för 24 prover, tillsätt 2 ml destillerat vatten till 8 ml etanol). Avlägsna och kassera supernatanten till att inte störa pärlorna.
- Medan hålla plattan på magnetiskt stativ, tillsätt 200 pl av nyframställd 80% etanol till varje brunn utan att störa pärlorna och inkubera plattan under åtminstone 30 sekvid rumstemperatur. Kasta bort supernatanten och upprepa tvätta en andra gång. Se till att etanolen har tagits bort. Låt torka i rumstemperatur i 10 min eller tills fullständig avdunstning av etanol.
- Avlägsna plattan från den magnetiska monter och tillsätt 22,5 l av RSB buffert. Ställ pipetten till 22,5 pl, försiktigt pipettera hela volymen upp och ner 10 gånger. Placera 96-brunnar på den magnetiska stå och inkubera under 2 min. Se till att den överstående verkar helt klart. Överföra försiktigt 20 ul av supernatanten i en ny 96-brunnars platta.
OBS: Eventuellt bestämma storleken på de tagmented prover genom att använda ett fragment analysatorn. I stället för de åtgärder som nämns ovan, använd högupplösta akrylamidgelelektrofores. Fragment bör vara mellan 150 bp och 1000 bp.
- 1 st PCR-amplifiering
- Tina PCR Master Mix innehåller polymeras (LP-PMM), index 1 primer och index 2 primerlösningar på is. Matcha kombinationen of index med Experiment chef provarket. För multiplexering, förbereda olika i7 från index 1 (i7, N7xx) för varje prov.
- I varje brunn, tillsätt 20 ìl av LP-PMM, 5 l av index 1 och 5 l av index 2 Ställ pipetten till 50 ^, försiktigt pipettera hela volymen upp och ner 10 gånger. Täck plattan med en självhäftande microseal film. Centrifugera under 1 min vid 280 x g vid 20 ° C.
- Placera plattan i en termocykler (locket värmdes vid 100 ° C) och kör program 1 (tabell 1).
OBS: proceduren kan stoppas vid denna punkt och reaktionerna förvaras över natten i termo eller 2 dagar mellan 2 och 8 ° C.
3 gDNA Anrikning: Dag 1, eftermiddag
- Innan du börjar
- Tina oligos (CSO), fånga målet buffert 1 (NCT1) och RSB lösningar på is. Minst 30 minuter före användning, ta med renings magnetiska kulor till RT.
- PCR Purification
- Centrifugera plattan från steg 2,4, under 1 min vid 280 x g vid 20 ° C.
- På RT, tillsätt 45 l av blandade renings magnetiska kulor i varje brunn. Ställ pipetten till 95 pl, försiktigt pipettera hela volymen upp och ner 10 gånger. Inkubera under 10 min vid RT. Placera 96-brunnar på en magnetisk ställ för 2 minuter vid RT.
- Se till att den överstående verkar helt klart. Bered en färsk 80% etanollösning (för 24 prover, tillsätt 2 ml destillerat vatten till 8 ml etanol). Kasta bort supernatanten till att inte störa pelleten.
- Medan hålla plattan på magnetiskt stativ, tillsätt 200 pl av nyframställd 80% etanol till varje brunn utan att störa pärlorna och inkubera plattan i 30 sek vid rumstemperatur. Kasta bort supernatanten och upprepa tvätta en andra gång. Se till att etanolen har tagits bort. Låt torka i rumstemperatur i 15 minuter.
- Avlägsna plattan från den magnetiska monter och tillsätt 40 pl RSB buffert. Ställ rörettte till 40 pl, försiktigt pipettera hela volymen upp och ner 10 gånger.
- Placera 96-brunnar på den magnetiska stå och inkubera under 2 min. Den överstående bör visas helt klar. Överföra försiktigt 38 pl av supernatanten till en ny 96-brunnars platta.
- Bestäm avkastningen av varje prov genom ett fluorimetrisk metod. Denna första del av protokollet kommer att valideras, om de bedömda avkastningen är mellan 30 och 50 ng / l.
- 1 st hybridisering
- Pool upp till 12 prover per pool i detta skede genom att blanda 500 ng av varje prov i en ny 96-brunnar. Se till att den slutliga volymen av varje pool inte överstiger 40 | il.
OBS: Om det behövs, minska volymen av pooler med hjälp av en vakuum koncentrator anordning vid RT (Varning: koncentrationen av DNA kan inte ändras genom upphettning, även vid 30 ° C för uppvärmning orsakar DNA nedbrytning). Anpassa den slutliga volymen till 40 pl genom att lägga RSB lösning. - BlandaNCT1 lösning. För varje brunn innehållande 40 pl poolade DNA-prover, tillsätt 50 pl NCT1 och 10 ul CSO. Ställ pipetten till 100 l, försiktigt pipettera hela volymen upp och ner 10 gånger. Förslut plattan och centrifugera under 1 min vid 280 x g vid 20 ° C.
- Placera plattan i en termocykler (locket värmdes vid 100 ° C) och kör program 2 (tabell 1).
- Pool upp till 12 prover per pool i detta skede genom att blanda 500 ng av varje prov i en ny 96-brunnar. Se till att den slutliga volymen av varje pool inte överstiger 40 | il.
4. gDNA Anrikning: Dag 2, Morgon
- Innan du börjar
- Från DNA anrikningssats (se tabell för material / Utrustning) tö 2 N NaOH (HP3), mål elueringsbufferten 1 (ET1), rikta elueringsbuffert 1 ET2, streptavidin magnetiska kulor (SMB), tvättlösning 1 (WS1), tvätt lösning 2 (WS2), tvättlösning 3 (WS3), CSO och NCT1 lösningar vid RT.
- 1 st Hybridisering Wash
- Avlägsna 96-brunnar från termocykler och centrifugera 1 min vid 280 x g vid 20 ° C. Ta bort klisterkåpan mycket carefully.
- Överför 100 | il reaktionsblandning från plattan i ett annat MIDI 96-brunnar och tillsätt 250 | il väl virvlades SMB lösning. Ställ pipetten till 350 l, försiktigt pipettera hela volymen upp och ner 10 gånger. Förslut plattan och inkubera vid RT i 30 min.
- Centrifugera under 1 min vid 280 x g vid 20 ° C, ta bort det vidhäftande tätningen och placera plattan på den magnetiska stativ för 2 min. Se till att den överstående verkar helt klart. Kasta bort supernatanten och ta bort plattan från den magnetiska monter.
- Tillsätt 200 l av väl blandat WS1 lösning i brunnen innehåller pärlorna. Ställ pipetten till 200 l och försiktigt pipettera hela volymen upp och ner 15x undvika bildandet av bubblor / skum.
- Placera plattan på den magnetiska stativ för 2 min. Se till att den överstående verkar helt klart. Kasta bort supernatanten och ta bort plattan från den magnetiska monter.
- Tillsätt 200 l av väl blandat WS2 lösningen i brunnar containing pärlor. Ställ pipetten till 200 l och försiktigt pipettera hela volymen upp och ner 15x undvika bildning av bubblor / skum.
- Placera plattan på den magnetiska stativ för 2 min. Se till att den överstående verkar helt klart. Kasta bort supernatanten och ta bort plattan från den magnetiska monter.
- Tillsätt 200 l av väl blandat WS2 lösningen i brunnar innehållande kulor. Ställ pipetten till 200 l och försiktigt pipettera hela volymen upp och ner 15x.
- Överför hela volymen i en ny 96-brunnars platta. Förslut plattan och placera plattan i en termocykler (locket värmdes vid 100 ° C). Starta termocykler vid 42 ° C under 30 min.
- Imediately placera plattan på den magnetiska stativ för 2 min. Se till att den överstående verkar helt klart. Ta bort förseglingen och kassera omedelbart alla supernatanten. Ta sedan bort plattan från den magnetiska monter.
- Tillsätt 200 l av WS2 i brunnar innehållande kulor. Ställ pipetten till 200l och försiktigt pipettera hela volymen upp och ner 15x undvika bildning av bubblor / skum. Förslut plattan och placera plattan i en termocykler (locket värmdes vid 100 ° C). Starta termocykler vid 42 ° C under 30 min.
- Placera omedelbart plattan på den magnetiska stativ för 2 min. Se till att den överstående verkar helt klart. Ta bort förseglingen och kassera omedelbart alla supernatanten. Ta sedan bort plattan från den magnetiska monter.
- Tillsätt 200 l av väl blandat WS3 lösningen i brunnar innehållande kulor. Ställ pipetten till 200 l och försiktigt pipettera hela volymen upp och ner 15x.
- Placera plattan på den magnetiska stativ för 2 min. Se till att den överstående verkar helt klart. Släng alla supernatanten och ta bort plattan från den magnetiska monter.
- Upprepa WS3 tvätta en andra gång.
- Efter att supernatanten, täta plattan och kort centrifug för att dra ner restvätskan. Placera plattan pådet magnetiska stativ för 2 min. Kassera den återstående supernatanten.
- I ett 0,2 ml rör, blanda 28,5 l av ET1 och 1,5 l av HP3 lösningar. Denna mix är för 1 pool, om fler pooler är beredda, multiplicera dessa volymer med antalet pooler förberedda.
- Avlägsna plattan från den magnetiska monter. Lägg 23 | il av den ovan framställda blandningen. Ställ pipetten till 23 l och försiktigt pipettera hela volymen upp och ner 15x. Förslut plattan och låt stå i 5 min vid RT. Centrifugera under 1 min vid 280 x g vid 20 ° C.
- Placera plattan på den magnetiska stativ för 2 min. Se till att den överstående verkar helt klart. Avlägsna den adhesiva filmen och överför 21 | il av supernatanten till ett nytt 96-brunnar.
- Tillsätt 4 l av ET2-lösning till varje brunn. Ställ pipetten till 25 l och försiktigt pipettera hela volymen upp och ner 10 gånger och försegla plattan.
OBS: proceduren kan stoppas vid denna punkt och reaktionerna lagras i upp till 7 dagar vid -15 ° C. Om plattan är frusen, helt tina innan 2: a hybridisering.
- 2 nd Hybridisering
- Centrifugera plattan under 1 min vid 280 x g vid 20 ° C. Avlägsna den adhesiva filmen och lägga 50 ul av NCT1, 10 pl av CSO, och 15 | il av PCR-kvalitet vatten till 25 | il av biblioteket. Ställ pipetten till 100 l och försiktigt pipettera hela volymen upp och ner 10 gånger.
- Förslut plattan och centrifugera under 1 min vid 280 x g vid 20 ° C.
- Placera plattan i en termocykler (locket värmdes vid 100 ° C) och kör program 2 (tabell 1).
5. gDNA Anrikning: Dag 2, eftermiddag
- Innan du börjar
- Tina ET1, ET2, SMB, WS1, WS2, WS3 och HP3 lösningar vid RT för hybridisering tvätt. Från DNA anrikning kit, tina PCR Master Mix innehåller polymeras (TC-PMM), PCR-primer cocktail (PPC) och RSB lösningar på is för PCR-förstärkning.
- 2: a hybridisering Wash
- Följ exakt samma protokoll som för 4,2-1 st hybridisering tvätt.
- PCR-amplifiering
- I en ny 96-brunnars platta, blanda 20 | il av eluering från steg 5,2, 25 pl av TC-PMM och 5 pl av PPC. Ställ pipetten till 50 l och försiktigt pipettera hela volymen upp och ner 10 gånger. Förslut plattan och centrifugera under 1 min vid 280 x g vid 20 ° C.
- Placera plattan i en termocykler (locket värmdes vid 100 ° C) och kör program 3 (tabell 1).
6. gDNA Anrikning: Dag 3
- Innan du börjar
- Thaw RSB lösningen på is. Minst 30 minuter före användning, ta med renings magnetiska kulor till RT.
- PCR Purification
- Centrifugera plattan från steg 5,3 för 1 min vid 280 x g vid 20 ° C och avlägsna bindemedlets täckskikt.
- Vid RT, tillsätt 90 | il previously blandade renings magnetiska kulor i varje brunn. Ställ pipetten till 140 l, försiktigt pipettera hela volymen upp och ner 10 gånger. Inkubera under 15 min vid RT. Placera 96-brunnar på en magnetisk ställ för 5 min vid RT. Se till att den överstående verkar helt klart.
- Bered en färsk 80% etanollösning (under 2 prover, tillsätt 200 | il destillerat vatten till 800 ^ il etanol). Kasta bort supernatanten till att inte störa pelleten.
- Medan hålla plattan på magnetiskt stativ, tillsätt 200 pl av nyframställd 80% etanol till varje brunn utan att störa pärlorna och inkubera plattan i 30 sek vid RT. Kasta bort supernatanten och upprepa tvätta en gång till. Se till att etanolen har tagits bort. Låt torka vid rumstemperatur i 15 min eller tills fullständig avdunstning av etanol medan plattan är på magnetstativ.
- Avlägsna plattan från den magnetiska monter och tillsätt 30 pl RSB buffert. Ställ pipetten till 30 l, och försiktigt pipettera than hela volymen upp och ner 10 gånger. Inkubera plattan under 2 min vid rumstemperatur.
- Placera 96-brunnar på den magnetiska stå och inkubera i 5 minuter eller tills supernatanten visas helt klar. Överför försiktigt 28 ìl av supernatanten i en ny 96-brunnar (typskylt: TCY).
OBS: Proceduren kan stoppas på detta stadium och reaktionerna förvaras vid -15 ° C i upp till 7 dagar.
- Bibliotek Validering och kvantifiering
- Bestämma kvaliteten av biblioteket genom användning av ett fragment analysatorn. Högupplöst akrylamidgelelektrofores skulle kunna användas för att ersätta de steg som nämnts ovan, men rekommenderas inte. Fragment bör vara mellan 150 bp och 1000 bp.
OBS: Rekommenderas: Kvantifiera biblioteket genom qPCR att få bästa antalet kluster under sekvensering. - Som referens, använd en validerad bibliotek (2 nM). Om det första biblioteket förbereds, använder fag PhiX DNA (10 nM) föreskrivs kalibrering av sequencing anordningen.
- Förbered spädningar av positiva kontrollen för att få 7 poäng på 20, 16, 8, 6, 4, 2, och 1:00 i EBT (EB elutionsbuffert + 0,1% Tween 20). Späd bibliotek av intresse på 1/1000 och 1/2000. Varje punkt måste analyseras i tre exemplar.
- Förbered följande blandning (multiplicera volymer med antalet brunnar som används): 1 väl, tillsätt 10 ìl av SYBR Green innehåller qPCR Master Mix (2x), 0,2 l av framåt primer (10 ^ M, AATGATACGGCGACCACCGAGAT), 0,2 l av omvänd primer (10 ^ M, CAAGCAGAAGACGGCATACGA), och 7,6 pl PCR grade vatten.
- Efter blandning, avsätta i en 96-brunnsplatta, 18 ul av blandningen till varje brunn och 2 | il av den positiva kontrollen och biblioteks utspädningar. Förslut plattan och centrifugera under 1 min vid 280 x g vid 20 ° C. Sedan placera plattan i en kvantitativ PCR termo och kör program 4 (Tabell 1).
- Analysera resultaten som konventionell absolut kvantifiering för att erhålla avkastningen av varje library. Fördelen med qPCR är att den kvantifierar endast DNA som kommer att samverka med flödescellen.
OBS: Använd inte fluorimetrisk kvantifiering av DNA på grund av närvaron av DNA-mimetiska molekyler i en av reagenser. Denna kvantifiering metod skulle överskatta biblioteket avkastningen och därmed underskatta klustring poäng.
- Bestämma kvaliteten av biblioteket genom användning av ett fragment analysatorn. Högupplöst akrylamidgelelektrofores skulle kunna användas för att ersätta de steg som nämnts ovan, men rekommenderas inte. Fragment bör vara mellan 150 bp och 1000 bp.
- Sekvense Införing
- Späd varje bibliotek vid 4 nM i en slutlig volym på 30 pl elueringsbuffert (EB), och samla alla bibliotek och blanda väl.
- Bered en färsk 0,2 N NaOH-lösning i EB-buffert och blanda 10 ul av denna NaOH-lösning med 10 l av poolade biblioteken. Blanda väl och inkubera exakt 5 min vid RT.
- Efter 5 minuter, omedelbart lägga 980 l av hybridisering buffert (från sekvensepatron) och blanda väl. Därefter blanda 400 | il av denna blandning med 600 pl av hybridiseringsbuffert. Blanda väl och överför 600 pl i en 300 cykelkassett (2 x 150) för en injektion av 8PM. Starta sekvensering.
7. Data Analysis
- När enheten har bearbetat data, överföra .bam och .vcf-filer till en ny dator.
OBS: transposas fragmentering innehåller fotspår. Följaktligen trimmar programvaran automatiskt dessa uppgifter. - Samla genetiska variationer som erhållits med analysen av enheten.
- Analysera exporterade filer (.bam, .vcf) med en annan programvara (Alamut) genom att följa tillverkarens instruktioner. Därefter jämför de genetiska variationer som erhålles med båda analyserna. Endast variationer detekterade två gånger anses närvarande.
Tabell 1. PCR-betingelser
| Program | Temperatur | Tid | Num. upprepningar | |||
| 1 | 72 ° C | 3 min | 1 | 98 ° C | 30 sek | 1 |
| 98 ° C | 10 sek | 10 | ||||
| 60 ° C | 30 sek | |||||
| 72 ° C | 30 sek | |||||
| 72 ° C | 5 min | 1 | ||||
| 10 ° C | obegränsad | |||||
| 2 | 95 ° C | 10 minuter | 1 | |||
| 93 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 91 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 89 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 87 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 85 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 83 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 81 ° C 1 min | 1 | |||||
| 79 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 77 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 75 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 71 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 69 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 67 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 65 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 63 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 61 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 59 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 58 ° C | 1 min | 16-18 tim | ||||
| 3 | 98 ° C | 30 sek | 1 | |||
| 98 ° C | 10 sek | 10 | ||||
| 60 ° C | 30 sek | |||||
| 72 ° C | 30 sek | |||||
| 72 ° C | 5 min | 1 | ||||
| 10 ° C | obegränsad | |||||
| 4 | 95 ° C | 10 minuter | 1 | |||
| 95 ° C | 15 sek | 40 | ||||
| 60 ° C | 1 min | |||||
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Prov QC-resultat
Förmågan hos denna metod för att bestämma sekvenserna av målgener är baserat på kvaliteten på den gDNA (figur 2A) och kvaliteten på den tagmentation steget. Om tagmentation inte är tillräckligt (figur 2B, övre panel), kommer sekvensering inte vara tillfredsställande. Såsom nämnts ovan, efter det tagmentation rening, den gDNA bör tagmented i fragment från 150 bp till 1000 bp med en majoritet av fragmenten omkring 300 bp (figur 2B, lägre panelen).
I slutet av biblioteks beredning, biblioteks kvalitet kontrolleras med en Bioanalyser. Profilen som erhålls bör vara ungefär densamma som efter tagmentation men med ett högre antal fragment (figur 2C). Om biblioteket kvalitet är inte identisk med figur 1C, bör sekvense inte utföras.
När sekvense lanseras påsekvensanordningen är klustring poäng tillgänglig efter 9 cykler och bör vara mellan 800.000 och 1.100.000 kluster / mm (figur 3A). Om detta antal är lägre, kommer sekvense inte är tillfredsställande, särskilt i djupet av läsning. Om den är högre, kommer bilderna bli suddiga (Figur 3B), och ingen analys kommer att göras på grund av att det är omöjligt att skilja kluster.
Vid slutet av körningen, är det viktigt att kontrollera kvaliteten poäng. Genom att följa det protokoll som beskrivits i detalj ovan, kommer kvalitetspoäng av körningen motsvarar fig 4. Kvaliteten på sekvensering representeras av en Q-poäng (Q-30). För att validera experimentet, åtminstone omkring 75% av sekvenserna (kluster) bör ha en Q-poäng överlägsen eller lika med 30.
Sekvenseringsresultat
Detta experiment utformades för att studera konstitutionella genetiska abnormiteter. I det här fallet är den genetiska defekter prESENT vid 50% i genomet. På grund av detta, är den sekvense djup inte mycket viktigt. Häri vi förberett och sekvens samtidigt 2 bibliotek av 12 patienter under 11 kompletta gener. För att få hög sekvense djup, har antalet multiplexerade patienter som ska minskas. Som gDNA anrikning är baserad på avskiljning av prober, är berikande inte homogena (Figur 5). Med våra protokoll, genererade vi cirka 6 Gb läser, inducerar en genomsnittlig täckning på 150 läsningar för varje bas, med minst 20 och högst 330 läsningar. Dessa lästa djup är förenliga med användning av NGS i klinisk praxis 11. Trots heterogenitet lästa djup, troligen på grund av gDNA anrikning av fånga, och inte den stora omflyttning av gener, är det viktigt att notera att Q-poäng var alltid överlägsen 30 (figur 5), vilket stärker sekvensering.
Icke desto mindre är det viktigt att validera tekniken genom jämförelse av resultatS erhållen med de som erhållits med Sanger-sekvensering. I de 17 patienter sekvense av både Sanger-sekvensering (kodande sekvenser av BRCA1 och BRCA2) och transposaset baserad teknik, upptäckte vi samma 330 genetiska variationer (SNP och mutationer). Som ett exempel har en punktmutation i BRCA1-genen (figur 6 till vänster) och en deletion av fyra baser i BRCA2-genen (Figur 6 höger) detekteras av både Sånger och transposas-baserade metoder. Som BRCA1 är på den omvända strängen av kromosom 13, är det viktigt att notera att det är nödvändigt att komplettera (men inte invertera) sekvensen erhållits, medan för BRCA2 (på den främre strängen), betyder den erhållna sekvensen behöver inte kompletteras . Såsom indikeras i figur 5, ger NGS teknik uppskattad frekvens av genetisk variation, medan Sangermetoden inte. Dessutom, speciellt för INDEL variationer är lättare med NG tolkningenS-teknik. Som visas i figur 6 rätt, INDEL variationssekvenser visas som en kodad elektroferogram som behöver framåt och bakåt sekvense att dechiffrera infogas eller tas bort sekvensen. Med NGS analys är den infogas eller tas bort sekvensen bestäms direkt, vilket minskar risken för feltolkningar. Slutligen transposaset baserad teknik tillät oss att analysera ett större antal mål gener, och vi hittade många nya genetiska variation sekvenser som inte omfattades av Sanger-sekvensering. Dessa resultat kommer att publiceras på annat håll.
Figur 1 Schematisk arbetsflödet av förfarandet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Kvalitetskontroller före och efter biblioteks förberedelser. A. Spektrofotometrisk profil gDNA som säkert kan användas för tagmentation. Den DNA-utbytet måste vara högre än 5 ng / ul, måste 260/280 och 260/230-förhållanden vara överlägsen 1,8 och 2, respektive. B. Fragment analyzer profiler av tagmented gDNA. Övre panel representerar otillräckligt tagmented gDNA. Nedre panelen visar ett perfekt tagmented prov. C. Fragment analysator profil beredd biblioteket strax före sekvense lansering. Fragment storlek är samma som tagmented gDNA (B, nedre fältet) men med en förstärkt belopp. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
> 
Figur 3 Kontroll kluster generation. A. Skärmdump av sekvensanordningen under körningen. Klustertätheten bör vara mellan 800 och 1000 K / mm. B. Olika bilder motsvarar låg densitet (övre panelen), hög densitet (nedre panelen) och perfekt densitet (mittpanelen). Klicka här för att se en större version av denna siffra .
Figur 4 Kontroll av Q-poäng. Vid slutet av körningen, ska valideras sekvense ha minst 75% av genererade kluster med en Q-poäng överlägsen 30.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 representerar data täckning och deras motsvarande Q-poäng. Inläsnings djupet är heterogen längs den täckta genen. Ändå är Q-poäng täckta områden alltid överlägsen Q-30. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. Representativa resultat som erhållits med Sanger-sekvensering och med transposas-baserad teknik. Samtliga genetiska variationer som observerats med Sanger-sekvensering var detected med transposaset baserad teknik. Med beaktande av följande punktmutationer är lätta att tolka, INDEL förändringar är ibland ganska svåra att studera med Sangermetoden. Med transposas-baserad teknik i samband med ett medium genomströmning enhet INDEL förändringar är enkla att upptäcka. Trots detta är det viktigt att notera att det är nödvändigt att komplettera (men inte invertera) sekvenser som erhålls när målet genen ligger på minussträngen (här BRCA1-genen). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den utbredda användningen av NGS-enheter och tekniker har gett nya möjligheter i studiet av cancer och genetiska sjukdomar. Förutom hela genom sekvensering eller RNA-sekvensering, analys av en stor mängd utvalda gDNA sekvenser i många patienter ger samtidigt stora möjligheter i diagnos. Här utvecklade vi en specifik design (tillgänglig på begäran) med NextEra teknik för att studera 11 kompletta gener hos 24 patienter samtidigt med ett medium genomströmning sekvenseanordning (Table of Materials / utrustning). Detta protokoll möjliggör snabb fram uppgifter som gör att en snabb respons på patienternas oro med låg risk för fel. Såsom illustreras i fig 6, var alla genetiska variationer detekterade med Sanger-sekvensering också detekteras med hjälp av transposas baserade förberedelse kit. Denna metod är tillförlitlig och lätt att tolka, särskilt för komplexa INDEL förändringar som analyseras direkt. Icke desto mindre är det viktigtatt notera att för gener belägna i minussträngen, är det nödvändigt att komplettera (utan backning) nukleotider. Den nuvarande arbetet har utförts med en design för analys av 11 kompletta gener, men protokollet är samma oavsett vilken utformning som väljs. Transposas-baserad teknik kan även användas för biblioteks beredning från långväga PCR-produkter 12. Faktum är att algoritmen (utvecklad av tillverkaren) som används för konstruktion (tillverkarens hemsida verktyg, se tabell för material / utrustning) är särskilt avsedda för detta protokoll. Förutom transposaset-baserad teknik, två andra mekanismer för DNA-fragmentering innan biblioteket förberedelser finns också tillgängliga: mekanisk fragmentering och enzymatisk fragmentering. Mekanisk DNA-fragmentering är reproducerbar men behöver en ultraljud och förberedelse biblioteket är dyrare och mer tidskrävande. Enzymatisk DNA-fragmentering inducerar ofta problem för DNA capture grund restriktionsenzym platser, vilket resulterari avsaknad av målsekvens täckning. Ändå varje strategi för DNA-fragmentering har fördelar och nackdelar, men tycks ge ganska likartade resultat, åtminstone för lång räckvidd PCR-produkt fragmentering 13. Användningen av en ny enzymcocktail tycktes ge samma resultat som de som erhölls med mekanisk DNA-fragmentering 14. Transposas-baserad teknik kräver högkvalitativa DNA (inte för DNA extraherat från FFPE vävnader). Dessutom aktiviteten av transposaset behöver fragment av mer än 300 bp, vilket tyder på att fragment av intresse måste vara längre än denna längd. Denna specificitet förklarar behovet av hög kvalitet, un-fragmenterat DNA.
Hittills har genetiska varianter av generna BRCA1 och BRCA2 studerats i familjär bröst-och äggstockscancer. Men medverkan av BRCA-generna, och särskilt BRCA2, nu misstänks i andra cancerformer, särskilt i bukspottkörteln 15, prostata16, och testikelcancer 17. Den genetiska förändringen av PALB2, en partner i BRCA-generna, är också associerat med pankreascancer 18. Dessutom nyligen visade det sig att patienter som hyser BRCA-mutationer, och i en mindre utsträckning PALB2 mutationer, visade ett bättre svar på deras bukspottskörtelcancer till PARP-hämmare 19. Som BRCA1, BRCA2, och PALB2 är förknippade med en familjär risk för cancer, och eventuellt i samband med känslighet för specifika behandlingar, förefaller det viktigt att utforska BRCA1 och BRCA2 partners i screening för familjär cancerrisk och screening för cancer behandlingssvar.
Från dessa data tycks analysen av DNA break reparation relaterade gener är viktiga inte bara för screening av känslighet, men också för en förmodad indikator på behandlingssvar. Vidare kunde den fullständiga genen analys föreslås med detta protokoll covER alla ändringar som kan vara medfödd närvarande (och som finns i cancerceller), såsom mutationer i promotorn, splitsplatser eller reglerande splits anläggningar i introner. Hittills har förändringar i icke-kodande sekvenser av gener inte studerats på djupet, men utvecklingen av genomet hela associationsstudier skulle kunna belysa viktiga funktioner i dessa sekvenser.
Sammanfattningsvis är transposaset baserad design som utvecklats i detta dokument ett intressant sätt att utforska genetiska avvikelser i cancerkänslighets gener involverade i DNA-skador reparation. Möjligheten att sekvensera 11 kompletta gener för 24 patienter samtidigt är en viktig fördel jämfört med Sanger sekvenseringsmetoden, vilket är en ganska svår teknik för screening.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MiSeq | Illumina | SY-410-1001 | Sequencing/medium throughput device |
| Nextera Enrichment kit | Illumina | FC-123-1208 | Transposase based technology |
| 300 cycle cartridge | Illumina | 15033624 | |
| AMPure beads | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic purification beads |
| Magnetic stand | Alpaqua | A32782 | |
| 96-well Plates | Life Technologies | 4306737 | |
| MIDI 96-well plates | Biorad | AB0859 | |
| Microseal A | Biorad | MSA-5001 | This seal is necessary only for PCR amplification. Other standard seals can be used throughout the experiment |
| MiSeq | Illumina | Provided with the sequencing device Experiment Manager software Internet adress: http://designstudio.illumina.com/NexteraRc/project/new Manufacturer website tool |
References
- Cornelisse, C. J., Cornelis, R. S., Devilee, P. Genes responsible for familial breast cancer. Pathol. Res. Pract. 192 (7), 684-693 (1996).
- Culver, J., Lowstuter, K., Bowling, L. Assessing breast cancer risk and BRCA1/2 carrier probability. Breast Dis. 27, 5-20 (2007).
- Cox, D. G., et al. Common variants of the BRCA1 wild-type allele modify the risk of breast cancer in BRCA1 mutation carriers. Hum. Mol. Genet. 20 (23), 4732-4747 (2011).
- Maia, A. T., et al. Effects of BRCA2 cis-regulation in normal breast and cancer risk amongst BRCA2 mutation carriers. Breast Cancer Res. 14 (2), 63 (2012).
- Anczuków, O., et al. BRCA2 deep intronic mutation causing activation of a cryptic exon: opening toward a new preventive therapeutic strategy. Clin. Cancer Res. 18 (18), 4903-4909 (2012).
- Brewster, B. L., et al. Identification of fifteen novel germline variants in the BRCA1 3'UTR reveals a variant in a breast cancer case that introduces a functional miR-103 target site. Hum. Mutat. 33 (12), 1665-1675 (2012).
- Roy, R., Chun, J., Powell, S. N. BRCA1 and BRCA2: different roles in a common pathway of genome protection. Nat Rev Cancer. 12 (1), 68-78 (2012).
- Ma, X. D., et al. First evidence for the contribution of the genetic variations of BRCA1-interacting protein 1 (BRIP1) to the genetic susceptibility of cervical cancer. Gene. 524 (2), 208-213 (2013).
- Haanpää, M., Pylkäs, K., Moilanen, J. S., Winqvist, R. Evaluation of the need for routine clinical testing of PALB2 c.1592delT mutation in BRCA negative Northern Finnish breast cancer families. BMC Med. Genet. 14, 82 (2013).
- Southey, M. C., Teo, Z. L., Winship, I. PALB2 and breast cancer: ready for clinical translation. Appl. Clin. Genet. 6, 43-52 (2013).
- Ulahannan, D., Kovac, M. B., Mulholland, P. J., Cazier, J. B., Tomlinson, I. Technical and implementation issues in using next-generation sequencing of cancers in clinical practice. Br. J. Cancer. 109, 827-835 (2013).
- Hernan, I., Borràs, E., de Sousa Dias, M., Gamundi, M. J., Mañé, B., Llort, G., Agúndez, J. A., Blanca, M., Carballo, M. Detection of genomic variations in BRCA1 and BRCA2 genes by long-range PCR and next-generation sequencing. J. Mol. Diagn. 14, 286-293 (2012).
- Knierim, E., Lucke, B., Schwarz, J. M., Schuelke, M., Seelow, D. Systematic comparison of three methods for fragmentation of long-range PCR products for next generation sequencing. Plos One. 6, e28240 (2011).
- de Sousa Dias, M., Hernan, I., Pascual, B., Borràs, E., Mañé, B., Gamundi, M. J., Carballo, M. Detection of novel mutations that cause autosomal dominant retinitis pigmentosa in candidate genes by long-range PCR amplification and next-generation sequencing. Mol. Vis. 19, 654-664 (2013).
- The Breast Cancer Linkage Consortium. Cancer Risks in BRCA2 Mutation Carriers. J. Natl. Cancer Inst. 91, 1310-1316 (1999).
- Levy-Lahad, E., Friedman, E. Cancer risks among BRCA1 and BRCA2 mutation carriers. Br. J. Cancer. 96 (1), 11-15 (2007).
- Risch, H. A., et al. Population BRCA1 and BRCA2 mutation frequencies and cancer penetrances: a kin-cohort study in Ontario, Canada. J. Natl. Cancer Inst. 98 (23), 1694-1706 (2006).
- Slater, E. P., et al. PALB2 mutations in European familial pancreatic cancer families. Clin. Genet. 78, 490-494 (2010).
- Brennan, G. T., Relias, V., Saif, M. W.
