Introduction
Gzms 전문 CTL의 리소좀과 NK 세포 1 지역화 높은 상동 세린 프로테아제의 가족입니다. 이러한 킬러 세포의 세포 독성 과립은 제거 2,3 향하는 표적 세포의 인식에 Gzms와 동시에 출시되는 막 방해 단백질 PFN 및 GNLY가 포함되어 있습니다. (- G, K, M과 N GzmA) 인간 (GzmA, B, H, K와 M)에서 다섯 Gzms 및 마우스에서 10 Gzms이 있습니다. GzmA과 GzmB이 가장 풍부하고 광범위하게 인간과 생쥐 한 연구이다. 그러나, 최근의 연구들은 세포 사멸 경로뿐만 아니라 건강과 질환 4 다른, 소위 고아 Gzms에 의해 매개되는 생물학적 효과를 추가로 조사하기 시작했다.
5,6- PFN에 의해 표적 세포 내로 전달 된 경우 Gzms의 가장 잘 알려진 함수와 GzmA GzmB의 특히 포유 동물 세포에서 프로그래밍 된 세포 사멸을 유도한다. 그러나더 최근의 연구는 또한 PFN 7,8 독립적으로 세포질 전달, 면역 조절 및 염증에 깊은 영향을 Gzms의 세포 외 효과를 보여 주었다. Gzms의 세포질 기입 한 후 효율적으로 살해 세포의 스펙트럼은 최근 박테리아 9, 10, 심지어 특정 기생충 (11) 포유 동물 세포에서 확대되었다. 이러한 최근의 발견은 GZM 연구원에 대한 완전히 새로운 분야를 열었다. 따라서, 비용 효율적인, 고 수율 포유 동물 발현 시스템은 크게 그 미래 연구에 대한 방법을 완화합니다.
네이티브 인간, 마우스 및 래트 Gzms 성공적 CTL 및 NK 세포 라인 12-14의 과립 분획으로부터 정제 하였다. 그러나, 우리의 손에 이러한 정제 기술의 수율은 0.1 ㎎ / ℓ, 세포 배양 (미공개 관측 및 12)의 범위이다. 또한, 인접하여 오염이없는 단일의 GZM 크로마토 해상도R Gzms 및 / 또는 과립 형태로도 존재하는 단백질 (게시되지 않은 데이터와 12, 14)에 도전하고있다. 재조합 Gzms 심지어 이러한 HEK 293 18,19 같은 포유 동물 세포에서 세균 15, 16, 효모, 곤충 세포 및 17에서 제조 하였다. 만 포유류 발현 시스템은 원시 세포 독성 단백질과 동일한 번역 후 변형으로 재조합 효소를 생산할 수있는 가능성을 부담. 번역 후 변형은 엔도 사이토 시스에 의해 특정 흡수 및 표적 세포 20-22 내의 단백질 분해 효소의 세포 내 현지화에 연루되어있다. 따라서, pHLsec (23)를 사용하여 GZM 발현 플라스미드 백본 (라두 Aricescu과 이본 존스, 옥스포드, 영국의 대학의 일종 선물), 우리는 높은 수율 단백질 생산을위한 간단하고, 시간과 비용 효율적인 시스템을 구축 HEK293T 세포. pHLsec는 닭 Β-액틴 프로모터와 CMV 증강을 결합; 함께, 이러한 요소는 demonstra테드 다양한 세포 라인 (24)에서 가장 강력한 프로모터 활성. 또한, 플라스미드는 토끼 Β-글로빈 인트론, 최적화 된 코작과 분비 신호리스 - 6xHis 태그 및 폴리 신호가 포함되어 있습니다. 삽입이 분비 신호와 적절한 N- 말단 도메인을 부족한 단백질에 대한 최적의 발현과 분비 효율을 보장리스 - 6xHis 태그 (그림 1) 사이에 편리하게 복제 할 수 있습니다. Gzms의 발현을 위해, 우리는되도록 EK 치료 분비 Gzms는 (활성 Gzms는 N - 말단으로 시작 활성화 된 엔테로 키나제 (EK) 사이트 (DDDDK) 뒤에 벡터에 의해 제공 분비 신호 내인성 분비 신호 서열로 대체 아미노산 서열 IIGG 25). 또한이 방법에 대한 찬성, HEK293T 세포는 둘 베코의 수정 이글의 중간 (DMEM)로, 저가의 매체에 빠른 속도로 성장하고, 비용 효율적인 칼슘 포스페이트 형질 전환 방법에 적합하다.
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Protocol
발현 플라스미드 pHLsec-GZM 1. 생산
- 인간 NK 세포로부터 manufacturer` 다음 적합한 RNA 분리 방법을 이용하여 첫 번째 가닥의 cDNA를 합성 키트를 사용하여 스크립트 작성 역방향 (26 또는 다섯 인간 Gzms 발현 NK 세포주 NK-92에서와 같이 제조 차 전지), 총 RNA를 준비 의 권장 사항. 23 (라두 Aricescu과 이본 존스, 옥스포드, 영국의 대학 종류의 선물)에 설명 된대로 GZM cDNA를 AgeI과 KpnI으로 절단 부위 (그림 1)를 사용하여 pHLsec으로 PCR 및 복제를 사용하여 증폭.
참고 : 표 1의 다음 프라이머를 사용합니다. - 순서에 의해 올바른 삽입을 확인합니다. DH5α 세포에서 발현 플라스미드를 확장하고 독소가없는 플라스미드 분리 키트를 사용하여 정화하고 제조업체의 지침을 따르십시오.
- 된 unti -20 ° C에서 2 ㎎ / ㎖ 저장의 농도로 내 독소가없는 멸균 수에 정제 된 플라스미드를 재현 탁L 사용.
HEK293T 세포에서 Gzms 2. 표현
- 시약의 조제
- 표준 배지를 준비합니다. 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM)를 함유하는 고 글루코스 (25 mM)을 루타 (4 mM)을 위해, 피루브산 나트륨 (1 mM)을 (표준 소 태아 혈청 (FCS), 페니실린 (100 단위 / ml), 스트렙토 마이신의 10 %를 추가 100 μg의 / ㎖).
- 형질 매체를 준비합니다. 페니실린 - 스트렙토 마이신이없는 배지에 25 μg의 / ㎖ 클로로퀸 (-20 ℃에서 보관 PBS에서 1000 배 주식에서 형질의 날에 갓 추가)를 추가합니다.
- 무 혈청 배지를 준비 : 무 혈청 배지에 HEK293 세포 글루타민 (4 mM)을, 페니실린 (100 단위 / ml), 스트렙토 마이신 (100 μg의 / ㎖) 및 2.5 ㎎ / L의 암포 테리 B. 추가하세요
- 사용하기 전에 0.45 μm의 필터를 표 2와 필터에 설명 된 솔루션을 준비합니다 :
- HEK293T 세포 확대
- 20 ㎖ 숭배에 HEK293T 세포를 성장150 X 25mm 조직 배양 접시를 사용하여 URE 매체.
- 80 %의 포화 상태에서 분할 세포 (1 분할 비율 : 4, 일반적으로 매 3 일째). 세포는 느슨하게 그들은 기계적으로 엄격로 pipetting 아래로 트립신하지 않고 분리 할 수 있습니다 연결합니다.
- 플레이트 세포 형질 감염 전날은 형질 감염 (시딩 밀도 ~ 2 × 105 세포 / ml)의 날 60~70%의 생장을 얻었다. 평소 준비 크기는 20-25 배양 접시로 구성되어 있습니다.
- 칼슘 - 포스페이트 형질
- 형질 감염 전에, 1 시간에 20 ml의 형질 감염 배지로 표준 배지를 변경. 이 1 시간 배양 단계의 끝 부분, 10.95 ML의 DDH 2 0 50 ml의 튜브 2M 염화칼슘 2의 1.55 ㎖ (1 관 / 5 요리)와 플라스미드 DNA의 400 μg의 혼합.
- (1) 형질 전환 이전에 최소 2, DNA-칼슘 용액 12.5 ml의 12.5 ml의 2 배 HBS를 추가 튜브의 반전에 의해 혼합하고 실온에서 30 초 동안 품어.
- 일 추가E 혼합물을 직접 세포 (접시 당 5 ㎖)에 적가 매체에 2.3.2에서 제조. 약간 오렌지 색상으로 매체를 회전, 전체 영역에 걸쳐 고르게 뿌린다.
- 조직 문화 인큐베이터에서 7-11 시간 (37 ℃, 5 % 가습 공기 중 CO 2)의 배양 접시를 품어. 배양 후, 미세한 침전물을 볼 수 있습니다. 미리 예열 PBS로 조심스럽게 씻어, 형질 매체를 제거하고 2.1.3에서 제조 된 20 ml의 무 혈청 배지를 추가합니다. 조직 문화 인큐베이터에서 72 시간 동안 품어.
- SDS-PAGE에 세포 상층 액의 샘플 (~ 20 μL)를 실행하고, 그랜 자임 밴드를 시각화 쿠마 브릴리언트 블루로 염색하여 형질 전환 및 발현 효율을 분석 할 수 있습니다.
- 니켈 IMAC에 의해 배양 상층 액에서 Gzms의 정제
- 배양 후, 250 ml의 튜브에 세포 배양 상층 액을 가만히 따르다 및 원심 분리하여 취소합니다. 첫 번째 스핀을 수행 (400 XG, 10 분, 4 °분리 된 세포에서 매체를 취소합니다 C). 남아있는 세포 파편을 제거하기 위해 4 ° C에서 4,000 XG, 30 분에서 신선한 250 ml의 튜브와 스핀에 뜨는을 전송합니다.
- 5 M NaCl을 5 ㎖, 삭제 상층 액 250 ml의 당 0.25 M 니소 (4) 6.25 2 M 트리스 자료 (PH 8) ml의 1 ML을 추가합니다. 500㎖의 진공 필터 유닛 (0.45 mm)를 사용하여 상청액을 필터.
- 적절한 FPLC 시스템을 사용하여 그분의 결합 버퍼를 (10 열 볼륨, CV)와 니켈 - 아이맥 열 평형.
- 4 ℃에서 0.5 ㎖ / 분의 유속으로 칼럼을 평형화 클리어 상등액을 적용한다.
- 상등액을 도포 한 후 UV 흡광도가 기준선 (통상 10 CV)에 도달 할 때까지, 그의 결합 완충액으로 칼럼을 세척 하였다.
- 용출 Gzms 0.5 ml의 유속으로 20 ㎖의 선형 구배 (0 ~ 250 mM의 이미 다졸)로 / 분 ML-2 분획을 수집한다. SDS-PAGE 및 쿠마시 염색으로 용출 분획을 분석한다.
- 엔테로 키나제 (EK)치료 및 양이온 교환 크로마토 그래피에 의한 최종 정리
- ≤10와 MWCO 투석 튜브 함유 분획을 풀 GZM. 사전 EK 제어와 같은 -20 ° C에서 작은 샘플을 저장합니다.
- 투석 튜브에서 직접 풀링 부분에 0.02 단위 / 초기 상층 액 50 ㎖에 EK을 추가하고 O / N EK-버퍼에 실온에서 (최소 16 시간) (4 L, 한 번 변화 버퍼를) 투석.
- 다음날, EK는 SDS-PAGE 및 쿠마시 염색으로 사전 EK 제어에 비해 Gzms 처리 분석.
- N 말단 처리가 완료되면 (4 L)를 버퍼 S 투석 완충액을 변경하고 다른 RT에서 4 시간 동안 투석. 필터 투석액 (0.45 μm의).
- 4 ℃에서 0.5 ㎖ / 분의 유속으로 칼럼에 샘플을로드 S 버퍼 A. 가진 S-열 평형.
- UV 흡광도 기준 (약 10 이력서)에 도달 할 때까지 샘플로드 한 후, S 버퍼와 열을 씻는다. 30 ml의 선형 구배 (150 mM의 NaCl을 1000)와 Gzms을 용출. GzmA 전자~ 750 mM의 염화나트륨에서 ~ 700 mM의 염화나트륨과 GzmM에서 ~ 650 mM의 NaCl을, GzmB에서 류트.
- SDS-PAGE 및 비색 분석 (아래 참조)에 의한 용출 분수를 분석합니다. Gzms과 농축액을 함유하는 분획을 풀 (약 30 배 이상, 약 100 μM의 농도로)에서의 스핀 필터 (15 ㎖, 10 MWCO). -80 ° C에서 집중 GZM 준비 및 저장 나누어지는.
3. 테스트 GZM 활동
- 시약의 조제
- 50 mM 트리스 - 자료, pH가 7 : 비색 분석 버퍼를 준비합니다.
- GzmA의 측정을 위해, 0.2 mM 내지 5,5'- 디티 오 - 비스 (2- 니트로 벤조산)의 최종 농도로 검정 완충액에 나트륨-CBZ-L- 라이신을 thiobenzyl 에스테르 (S-BZL) (BLT)를 추가 0.22 mm의 농도 (DTNB). GzmB를 들어, 0.2 mM의 BOC-알라 - 알라 -의 ASP-S-BZL (AAD) 및 0.22 mM의 DTNB을 포함한다. GzmM 들어, 0.2 mM의 SUC 닐 -Ala-Ala-Pro-의 Leu-35㎕를 PNA () (AAPL)를 포함한다. 합성 펩티드는 DMSO에 (적절한 재고 솔루션에서 추가, STOR에드 갓 분석하기 전에 버퍼에 -20 ℃)에서.
- 절단 분석 완충액 준비 : 100 mM의 염화나트륨, 50 mM 트리스 - 자료, pH가 7.5
- 50 mM 트리스 - 자료, pH가 7 : 비색 분석 버퍼를 준비합니다.
- 비색 분석
- 96 웰 평면 바닥 판에서 용출 분수에서 작은 GZM 샘플 (<5 μL) 또는 집중 주식을 배포합니다. 양성 대조군 (GZM 시험 제제 또는 조질 NK 세포 용 해물) 및 음성 대조군 (전용의 버퍼)를 포함한다.
- (멀티 채널 피펫을 사용하여) 각 웰에 분석 완충액 100 μl를 추가합니다. 37 ℃에서 10 분 동안 품어. 마이크로 플레이트 리더에서 405 nm에서 OD를 측정한다.
- 분열 분석
- 희석액과 - 정제 된 기판을 사용하여 절단 분석법 (효율적인 GZM 기판의 몇 가지 예는이 섹션의 끝에 결과 섹션과 주에 제시 400 nM의 네이티브 또는 재조합, 100)을 단백질 기질을 공동 배양 GZM의 다양한 시간에 대한 분석 버퍼 (400 nm에서 시작).SDS-PAGE 및 쿠마 또는 실버 염색으로 분석; 또는 웨스턴하여 특정 항체를 사용하여 블 롯팅.
- 세포 용 해물을 사용하여 절단 분석법, 37 ° C 세번에서 에탄올 / 드라이 아이스 배스 융해에서 동결 세이 버퍼를 Lyse 1 ㎖에서 106 HeLa 세포 (또는 가능한 종양 세포주)를 일시. (4 ° C에서 10 분 동안 15,000 XG)을 원심 분리하여 세포 파편을 제거합니다.
- 위와 같이 다양한 농도와 시간에 Gzms와 클리어 해물을 공동-품어. 쪼개짐은 적절한 항체를 사용하여 면역 블에 의해 검출된다.
참고 : 선의의 기판의 몇 가지 예하는 상업 항체가 사용할 수 있습니다 입찰 (BH3-상호 작용 도메인 죽음 작용제)와 GzmB 27,28에 의해 절단 카스파 제 3; GzmA (29)에 의해 절단 여러 이기종 핵 리보 (hnRNPA1, A2 및 U); GzmM (30)에 의해 거대 세포 바이러스 인 단백질 (71).
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Representative Results
다음 섹션에서 우리는 방법을 조명 GzmA 준비의 전체 문서를 발표 할 예정이다. 또한 성공적으로 정화 효율 및 작동에 대해서는 유사한 결과를 생성하고 GzmB GzmM 정제. 그러나, 그 후 준비에서 우리는 데이터의 몇 선택한 조각을 보여줍니다. 현재 프로토콜 다음 293T 세포로부터 GzmB 제제는 다양한 생물학적 분석 시스템 9,29,31-34 그들의 활동을 강조 여러 발표 된 연구에 사용 하였다.
전형적인 GzmA 정화는 그림 2A에 표시됩니다. ~ GzmA에 대한 34분의 60 kDa의를 아래에 72 시간은 환원 조건 하에서 배양 상청 GzmB 및 GzmM에 대한 (~ 37 kDa의 더 농도없이 쿠마 묻은 SDS-PAGE 젤에 감지 GZM 밴드로 표시하고 효율적인 형질 전환 및 발현 후 ) 환원 조건 / 비 환원성. 아이맥 정화 후 샘플을 입력 처리 하였다okinase (EK). EK의 눈에 보이는 변화는 샘플 (POST-EK) 사전 EK 제어에 비해이 관찰되었다 처리. 쿠마 묻은 단백질 젤의 단일 밴드 외관, S-열에 최종 정화는 고순도의 GZM 준비 (그림 2B에서 GzmB과 GzmM 그림 2A에 GzmA) 결과. 풀링 분획 ~ 100 μM의 최종 농도로 농축 하였다. 일반적으로, 우리는 100 ml의 배양액 당 약 0.5 내지 1 밀리그램 Gzms의 수율을 획득. 효율적인 당화를 설명하기 위해 몇 가지 초기 준비는 N- 결합 된 당 단백질에서 높은 만노스 올리고당을 제거 엔도 글리코시다 제 (엔도) (H)로 처리 하였다. 네이티브 GzmA는 높은 만노스 올리고당 35 바운드되는 ASN-142 N - 결합 글리코 실화 부위를 갖는다. EndoH 치료 명백한 이동성 GZM에서 시프트뿐만 아니라 GzmB, HEK293T 세포로부터 준비를 유도하지만 SDS-PAGE로 분석하고 쿠마시로 세균 GzmA 생성에염색 (그림 2C).
정기적으로, 모든 GZM 배치는 비색 분석에서 효소 활성을 시험 하였다. 이것은 신속하고 신뢰성 시험 분석 완충액의 색상 변화에 의해 표시되는 분광 작은 합성 펩티드의 분열에 의해 Gzms의 단백질 분해 활성을 나타낸다. 때문에 이들 프로테아제 절단 후 아미노산 잔기 (P1 위치)에 관한 다른 환경으로, 특정 펩티드의 선택은 Gzms 중에서 변한다. 기본 잔류 물 (의 Arg, R)과 라이신 (리스, K)를 아르기닌 후 GzmA는 절단, 트립신 등의 활동이있다. 우선적으로 아스파르트 산 잔기 (ASP, D) 후 GzmB의 절단 및 GzmM의 절단 류신 (레우, L)과 메티오닌 (메트로, M) 후 1. 우리의 우선 펩타이드 선택 GzmA 활동을 측정하기 위해 샌드위치 -S-BZL이다, GzmM에 대한 GzmB 및 AAPL -pNA에 대한 AAD -S-BZL.
thiob의 주요 차이점그 GZM가 thiobenzylester 기판 절단 만 발색단 DTNB와 하류 반응 발색 반응을 유발 벤질 메르 캅탄, 해제 매개로 enzylester 기판 (AAD 및 BLT) 및 35㎕를 기판 (AAPL)는 특정 화학이다. 35㎕를 GZM의 매개 방출이 비색 검출 충분하지만 따라서 thiobenzylester 기판의 반응에 DTNB 버퍼가 존재한다. 비색 분석의 상세한 방법은 최근에 출판되었다 (36). 그림 3a는 각각 GzmA 및 GzmM 준비의 S-열에서 용출 분획을 대표하는 샌드위치와 AAPL 에스 테라 제 활성을 보여줍니다. 비색 분석은 네이티브 GzmB 제제로 재조합의 활성을 비교하기 위해 사용 하였다. 도 3b에 도시 된 바와 같이, 재조합 GzmB 293T 인간 NK CEL로부터 정제 된 천연 GzmB에 비해 유사한 효율 발색 기질을 절단하여L 라인은 최근 인 12을 설명했다.
보다 구체적 GZM 활성을 테스트하기 위해, 공지 된 단백질 기질을 사용 GZM 절단 분석은 표시된다. 이러한 분열 분석은 세포 용 해물과, (가능한 경우) 정제 된 재조합 또는 천연 단백질과 수행 또는 손상 세포와 가장 생리적 할 수 있습니다. 단백질 기질을 사용할 수있는 경우, 단백질 가수 분해 활성이이 공지 세균 GzmA으로 증명하고 GzmB뿐만 아니라 신규 한 인간 미토콘드리아 GzmM 기판 NDUFAF3와 nuoCD 및 nuoF 9의 기판대로 GZM 제제 간단한 공동 배양 실험에서 분석 될 수있다 (그림 4A).
세포 용 해물은 다수 GZM 기판의 다른 명백한 소스들을 나타낸다. 상업 항체는 기판의 많은에 사용할 수 있습니다. 세포 용 해물을 생성하는 빠르고 간단한 방법은 이전에 33 있듯이 여러 냉동 / 해동 사이클을 적용하는 것이다. 세제 I의 사용그들은 GZM 활동을 방해 할 수 있습니다 추천 아니다. 도 4b에, GzmA 항 hnRNPA1 항체뿐 아니라 로딩 대조군으로서 항 - Β 액틴 항체를 사용하여 면역 블롯에서 입증된다 헬라 세포 용 해물에 hnRNPA1 개열을 매개.
그대로 세포 분열 분석 (또는 세포 독성 분석)의 경우, 추가의 전달 분자의 가용성이 필요한 (PFN 또는 포유류 세포에 대한 Streptolysin O, SLO; GNLY 또는 원핵 세포 다른 항균 펩타이드). 전달 분자의 농도가 중요하며, 광범위한 미세 조정을 필요로 그대로 세포 분열 분석은 가장 도전이다. 세포 사멸 분석의 이러한 복잡한 프로토콜을 소개하는 것은이 글의 범위를 벗어납니다. 여기, 우리는 예제 12, 13로, 문학의 거대한 몸을 참조 할 수 있습니다.
<강한> 표 1 : GZM 복제 프라이머 시퀀스.
GzmA, GzmB 및 GzmM를 복제하는 데 사용 된 프라이머 서열은 표시됩니다. 정방향 프라이머는 활성 프로테아제의 N 말단 전에 EK 사이트를 소개하도록 설계되었다 (도 1 참조)
표 2 : 주식 솔루션 및 버퍼 조성물.
가장 중요한 재고 솔루션 및 버퍼의 조리법이 표시됩니다.
그림 1. 구인 복제에 대해 긴급 pHLsec 순서.
순서, 벡터에 몇 요소는프로테아제의 클로닝, 분비, IMAC 정제 및 활성화를 위해 중요하다는 것을 강조 : Kozak 보존 및 분비 신호 서열, 및 AgeI를 KpnI 제한 부위뿐만 아니라 C 말단 Lys_6xHis 태그. 우리는 N 말단 엔테로 키나제 (EK) 사이트로 융합 삽입으로 GzmA을 예시. 전체 벡터 백본의 전체지도를 위해, 우리는 23에서 추가 정보를 참조하십시오.
그림 2. HEK 293 T 세포에서 발현, 정제 및 완전 당화 인간 Gzms의 활성화.
A)의 시리즈를 도시 쿠마시 염색, 비 환원성 제 니켈 IMAC 정제, EK 처리 및 FINA에 상청액의 분비로부터 GzmA 전체 제조 공정을 보여주는 SDS-PAGE 젤 양이온 교환 크로마토 그래피를 통해 L을 연마합니다. 배양 상등액 (적색) 및 비 환원 (비 - 적색) 환원 조건 하에서 SDS-PAGE에서 실행 하였다. GzmA는 이황화 결합에 의해 안정화된다 호모 다이머 (ssGzmA)이다. GzmA 호모 다이머 (~ 60 kDa의)는 BSA (~ 66 kDa의)를 오염에 가까운 실행됩니다. 환원 조건에서 GzmA 모노머 (shGzmA가) ~ 34 kDa의 밴드로 나타납니다. 비 환원 조건 하에서 최종 GzmB 및 GzmM 제제의 순도를 입증하기 위해, 대표 쿠마 묻은 젤이 B. 세균 (대장균)에 나타낸다는 GzmA뿐만 GzmA 및 GzmB가 HEK293T 세포에서 생성 등 EndoH로 처리하고 분석 하였다 생성 SDS-PAGE 및 쿠마시 염색을 감소시킴으로써 비. 박테리아 (C)에서 생성 된 비 당화 GzmA에 비해 HEK293T 세포에서 생성 Gzms의 글리코 실화는 EndoH 처리 후에 이동성 변화에 의해 증명된다.
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그림 3. 재조합 Gzms 가수 분해 합성 펩티드.
A), 최종 S 칼럼으로부터 용출 분획의 작은 샘플을 기판으로서, 각각 BLT 및 AAPL을 이용하여 발색 분석법 GzmA 및 GzmM 활성에 대해 시험 하였다. 그래프는 405 nm에서 OD 증가로 표시 한 펩타이드 절단을 보여줍니다. UV 흡광도 및 SDS-PAGE 분석 (도 2A와 B)에 나타낸 바와 같이 용출 된 단백질에 피크 활성과 상관 피크 분획. 표시된 농도에서) 설명한 바와 같이 제조 12 B), 재조합 293T 네이티브 GzmB는 (AAD 발색 기질의 존재하에 배양 하였다. GzmB 활동은 405 nm에서 OD 변화로 표시되었다. 그래프는 3 회 반복 시험 한 가장 최근 GZM 준비의 SEM ± 평균을 보여줍니다.
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4. 재조합 Gzms 베기 단백질 기질 그림.
A) 재조합 GST 태그 된 세균성 호흡 쇄 단백질 및 nuoCD nuoF뿐만 아니라 포유류의 호흡 쇄 단백질 NDUFAF3은 37 ° C에서 15 분 동안 지시 Gzms의 표시된 농도로 처리 하였다. 20 μL 반응에서 정제 된 단백질의 1 μg의 사용 하였다. 쪼개짐은 SDS-PAGE 및 쿠마시 염색으로 분석 하였다. B) ~ 1 ㎎ / ㎖의 단백질 농도에서 헬라 세포 용 해물 ()는 안티 hnRNPA1 및 Β 액틴 항체를 사용하여 면역 블에 의해 30 분 동안 재조합 GzmA의 표시된 농도로 배양하여 분석 하였다.
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Discussion
GzmA 및 GzmB의 고전과 광범위하게 연구 역할은 기공 형성 단백질 PFN 1로 그들의 세포질 배달 후 포유 동물 세포에서 세포 사멸의 유도이다. 최근 Gzms의 세포 독성 스펙트럼 세균 9,10뿐만 아니라 특정 기생충 (11)에 포유류 세포에서 현저하게 확대시켰다. 또한, GzmA 및 GzmB의 비 고전적, 세포 외 기능뿐만 아니라 다양한 고아 Gzms의 생물학적 중요성은 여전히 불분명하다. 이 프로토콜에 의해 제공 따라서, Gzms의 강력한 시간과 비용 효율적인 표현과 정화 시스템은 이러한 미래 연구에 큰 도움이 될 것입니다.
이 방법의 강도는 특히 이러한 시스템에서 사용되는 발현 벡터 pHLsec 23에 기초한다. 이 플라스미드는 E.의 높은 사본 번호가 콜라이, 따라서 효율적인 DNA 생산을 가능하게한다. 그 인핸서 / 프로모터 요소를 제공다양한 세포 라인 (24)에 강한 활동. 그것은 전사 단위 내 인트론이 포함되어 있습니다. 인트론은 최대 포유 동물 세포에서 유전자 발현을 강화하는 것으로 밝혀졌다 (37)를 100 배. 또한, 플라스미드는 Kozak 보존 및 최적화 된 분비 신호리스-6xHis 태그 및 폴리 신호 (도 1)를 제공한다. 인서트 분비 신호 및 라이신 - 6xHis 태그 사이 AgeI 및 KpnI로 절단 부위를 사용하여 클로닝 할 수있다. AgeI 및 XhoI에 사용 polyHis 태그를 피할 것이다. Gzms 들어, 발현 및 정제 후 IMAC 프로테아제의 활성을 활성화 프로테아제의 N 말단에 엔테로 키나제 부위를 삽입 할 필요가 있었다. 다른 효소의 발현을 위해이 필요하지 않을 수도 있습니다. 발현 플라스미드를 성공적으로 여러 다양한 길이, 당화 상태 및 이황화 결합의 수의 구조뿐만 아니라 다른 주름 (23) 여러 도메인을 포함하는 단백질에 대한 검사를했다.
38 배지 (즉, DNA 라이 소좀의 분해를 억제한다). 우리는 형질 전환 효율이 15 cm 접시 (게시되지 않은 관찰) 약 80 μg의에서 만 포화의 DNA 양의 선형 적으로 의존하는 것으로 나타났습니다. 따라서, 우리는 최대한의 효율성을 위해이 프로토콜에 플라스미드 DNA / 접시의 80 μ G까지 사용하는 것이 좋습니다. 이 준비 당 DNA의 약 2 mg의 (correspondin을 금액합니다2 MaxiPrep 열을 G). 형질 전환 효율은 가장 쉽게 72 시간의 잠복기 후 SDS-PAGE에 배양 상층 액 (약 20 μ L)의 샘플을 실행하여 모니터링 하였다. 분비 된 단백질 분해 효소의 단백질 밴드 쿠마 염색으로 볼 수 있어야합니다. GZM 밴드가 약이고 세포가 생존을 분리하고 등장하지 않은 경우, 문화 IMAC 정화 전에 또 다른 24 시간 동안 배양 하였다.
또 다른 가장 중요한 단계는 효소를 활성화하는 엔테로 키나제 (EK) 처리했다. EK 활성 칼슘 의존적이며, 염화나트륨 (39) 또는 이미 다졸 (미공개 관찰)의 높은 농도에 의해 억제된다. 따라서, 충분한 칼슘 및 중성 pH에서의 NaCl 이상을 함유하는 50 mM의 EK 버퍼의 충분한 양 (투석 완충액 20 ㎖마다 용출액을 2 L)에 대한 IMAC로부터 용출액을 투석에 매우 중요했다. EK 처리 실온에서 16 시간 동안 추천 및 이동성 시프트 O를 밝혀 SDS-PAGE에 의해 모니터링해야처리 된 단백질 분해 효소 f를 절단이 완료합니다. 신선한 EK 가하고 시프트가 불완전 인 경우 EK 신선한 투석 버퍼 인큐베이션을 계속 하였다. 절단이 완료 한 경우에만, S 버퍼에 대한 투석을 시작하고 정화 계속했다. EK의 촉매 경쇄 최종 양이온 교환 크로마토 그래피에 EK Gzms에서의 완전한 분리를 허용 5.2의 PI 값을 갖는다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596-026 | Total RNA isolation kit |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18064-014 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530L | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| EX-CELL 293 Serum-Free Medium for HEK 293 Cells | Sigma | 14571C | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco | 31966-021 | |
| SnakeSkin Dialysis Tubing, 10K MWCO | Thermo Scientific | 68100 | |
| Enterokinase from bovine intestine | Sigma | E4906 | recombinant, ≥20 units/mg protein |
| HisTrap Excel 5 ml column | GE Healthcare | 17-3712-06 | Nickel IMAC |
| HiTrap SP HP 5 ml column | GE Healthcare | 17-1152-01 | S column |
| N-α-Cbz-L-lysine thiobenzylester (BLT) | Sigma | C3647 | GzmA substrate |
| Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl (AAD) | MP Biomedicals | 2193608 _10mg | GzmB substrate |
| Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-p-nitroanilide (AAPL) | Bachem | GzmM substrate | |
| 5,5′-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) (DTNB) | Sigma | D8130 | Ellman`s reagent |
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