Introduction
Os Gzms são uma família de serina-proteases altamente homólogas localizadas nos lisossomas especializados de CTL e as células NK 1. Os grânulos citotóxicos destas células assassinas, também contêm as proteínas de membrana de desregulação e PFN GNLY que são libertadas em simultâneo com as Gzms no reconhecimento de uma célula alvo destinado à eliminação 2,3. Existem cinco Gzms em seres humanos (GzmA, B, H, K e M), e 10 em ratos (Gzms GzmA - G, K, M e N). GzmA e GzmB são os mais abundantes e extensivamente estudados em humanos e ratos 1. No entanto, estudos mais recentes começaram a investigar os percursos de morte celular, bem como os efeitos biológicos adicionais mediadas pelos outros, os chamados Gzms órfãos na saúde e na doença 4.
A função mais conhecida das Gzms, em particular de GzmA e GzmB, é a indução de morte celular programada em células de mamífero quando entregue nas células alvo por PFN 5,6. Porém, Estudos mais recentes também demonstraram efeitos extracelulares dos Gzms com profundo impacto sobre a regulação imune e inflamação, independentemente da entrega cytosolic pela PFN 7,8. O espectro de células que são mortos de forma eficiente após a entrada cytosolic dos Gzms também foi recentemente alargado a partir de células de mamíferos para 9,10 bactérias e até mesmo certos parasitas 11. Estas descobertas recentes abriu um novo campo para pesquisadores GZM. Portanto, um, de alto rendimento do sistema de expressão de mamífero custo-eficiente irá facilitar significativamente o caminho para esses estudos futuros.
Humanos, ratos e de camundongos Gzms nativas foram purificados com sucesso a partir da fracção de grânulos de CTL e células NK linhas 12-14. No entanto, nas nossas mãos o rendimento de tais técnicas de purificação está na gama de menos do que 0,1 mg / L de cultura de células (observação não publicada e 12). Além disso, a resolução cromatograf ica de um único GZM sem contaminação por outrr Gzms e / ou proteínas que também estão presentes nos grânulos é um desafio (dados não publicados) e 12,14. Gzms recombinantes foram produzidas em bactérias, leveduras 15 16 17, células de insecto e em ainda em células de mamífero, tais como células HEK 293 18,19. Apenas os sistemas de expressão de mamífero suportar o potencial para produzir enzimas recombinantes com modificações pós-tradução idêntica à proteína nativa citotóxico. Modificações pós-tradução têm sido implicados com a captação especifica por endocitose e a localização intracelular da protease dentro das células alvo 20-22. Portanto, usando pHLsec 23 (um presente tipo de Radu Aricescu e Yvonne Jones, da Universidade de Oxford, Reino Unido) como a espinha dorsal do plasmídeo para a expressão GZM, foi estabelecido um sistema simples, tempo e custo-eficiente para a produção de proteínas de alto rendimento em HEK293T células. pHLsec combina um intensificador de CMV com um frango Β-actina promotor; juntos, esses elementos demonstrated a actividade do promotor mais forte em várias linhas de células 24. Além disso, o plasmídeo contém um intrão de coelho Β-globina, os sinais de secreção e de Kozak optimizada, um-6xHis-tag Lys e um sinal poli-A. As inserções podem ser convenientemente clonados entre o sinal de secreção e a-6xHis-tag Lys (Figura 1) assegurar a expressão óptima e eficiência de secreção para proteínas que não possuem domínios N-terminais adequados. Para a expressão das Gzms, que substituiu a sequência de sinal de secreção endógena com o sinal de secreção fornecida pelo vector, seguido por uma enteroquinase (EK) local (DDDDK), de modo que o tratamento EK activou a Gzms secretadas (Gzms activas começar com o N-terminal sequência de aminoácidos IIGG 25). Além disso, em favor deste método, as células HEK293T crescer rapidamente em baixa preço-médio, como meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), e são adequados para o método de transfecção com fosfato de cálcio eficiente em termos de custo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Produção do plasmídeo de expressão pHLsec-GZM
- Preparar ARN total a partir de células NK humanas (células primárias preparadas como no 26 ou a linha celular NK NK-92 expressando os cinco Gzms humanos) utilizando um método de isolamento de ARN adequada e transcrever reversa usando um kit de ADNc de primeira cadeia a sintetizar seguintes manufacturer` s recomendações. GZM amplificar ADNc utilizando PCR e o clone em pHLsec como descrito em 23 (presente tipo de Radu Aricescu e Yvonne Jones, Universidade de Oxford, Reino Unido) utilizando os locais AgeI e KpnI (Figura 1).
NOTA: Use os seguintes iniciadores indicados na Tabela 1. - Confirme inserções corretas por sequenciação. Expandir os plasmídeos de expressão em células DH5a e purifica-se utilizando um kit de isolamento de plasmídeo isento de endotoxinas e seguir as instruções do fabricante.
- Ressuspender os plasmídeos purificados em meio isento de endotoxina, água estéril a uma concentração de 2 mg / ml e armazenar a -20 ° C until uso.
2. Expressão de Gzms em células HEK293T
- Preparação de reagentes
- Prepare meio de cultura padrão. Para Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) contendo glucose elevada (25 mM), de GlutaMax (4 mM), piruvato de sódio (1 mM), adicionar 10% de padrão de soro de vitelo fetal (FCS), penicilina (100 unidades / ml), estreptomicina ( 100 ug / mL).
- Prepare meio de transfecção. Para meio de cultura sem penicilina-estreptomicina adicionar 25 ug / ml de cloroquina (adicionar fresco no dia da transfecção de 1000X existências em PBS, armazenado a -20 ° C).
- Prepare meio de cultura isento de soro: para meio isento de soro para células HEK293 adicionar glutamina (4 mM), penicilina (100 unidades / ml), estreptomicina (100 ug / ml), e 2,5 mg / L de anfotericina B.
- Preparar as soluções descritas na Tabela 2 e filtro com um filtro de 0,45 um antes da utilização:
- Expansão de células HEK293T
- Cultivar células HEK293T em 20 ml de cultoforma ure utilizando 150 x 25 mm pratos de cultura de tecidos.
- Dividir células a 80% de confluência (split-proporção de 1: 4, normalmente todos os dias 3ª). Células vagamente anexar, eles podem ser destacadas mecanicamente, sem tripsinização rigorosamente pipetando para cima e para baixo.
- Células da placa a noite antes da transfecção para dar 60-70% de confluência no dia da transfecção (densidade de sementeira de 2 x 10 ~ 5 células / mL). Um tamanho habitual de preparação consiste em 20 a 25 placas de cultura.
- Transfecção com fosfato de cálcio
- 1 h antes da transfecção, mudar o meio de cultura padrão de 20 ml de meio de transfecção. Perto do final deste passo de incubação 1 h, misturar 400 ug de ADN de plasmídeo com 10,95 ml DDH 2 0 e 1,55 ml de CaCl2 2M em tubos de 50 ml (um tubo / 5 pratos).
- 1-2 minutos antes da transfecção, adicionar 12,5 mL 2x HBS a 12,5 ml da solução de ADN-cálcio, misturar por inversão dos tubos e incubar durante 30 segundos a temperatura ambiente.
- Adicionar the mistura preparada em 2.3.2 directamente para as células (5 ml por placa), gota a gota para o meio. Polvilhe uniformemente sobre toda a área, transformando a forma de uma cor ligeiramente laranja.
- Incubar as placas de cultura de 7 a 11 horas numa incubadora de cultura de tecidos (37 ° C, 5% de CO 2 em ar humidificado). Após a incubação, um precipitado fino é visível. Remover o meio de transfecção, lavar cuidadosamente com PBS pré-aquecido e adicionar 20 ml de meio de cultura isento de soro preparado em 2.1.3. Incubar durante 72 h numa incubadora de cultura de tecidos.
- Analisar a eficiência de transfecção e expressão executando uma amostra (~ 20 ul) do sobrenadante das células em SDS-PAGE e coloração com Azul Brilhante de Coomassie para visualizar uma banda granzima.
- A purificação do Gzms do sobrenadante de cultura por níquel-IMAC
- Após a incubação, decanta-se os sobrenadantes de cultura de células em tubos de 250 ml por centrifugação e clara. Realizar uma primeira rotação (400 xg, 10 min, 4 °C) que irá limpar o meio de células isoladas. Transferir o sobrenadante em tubos frescos e 250 ml de centrifugação a 4000 xg, 30 min a 4 ° C para remover todos os restos de células remanescente.
- Adicionar 5 ml de NaCl 5 M, 6,25 mL de 2 M de Tris-Base (pH 8) e 1 ml de 0,25 M de NiSO4 por 250 ml de sobrenadante clarificado. Filtra-se o sobrenadante utilizando uma unidade de filtro de vácuo de 500 ml (0,45 mm).
- Equilibrar a coluna de Níquel-His-IMAC, com tampão de ligação A (10 volumes de coluna, CV), utilizando um sistema de FPLC adequado.
- Aplicar o sobrenadante clarificado para a coluna equilibrada a uma taxa de fluxo de 0,5 mL / min a 4 ° C.
- Depois o sobrenadante foi aplicado, lavagem da coluna com tampão A de ligação até que a absorvância de UV de linha de base é atingido (geralmente 10 CV).
- Eluir com uma Gzms linear 20 ml de gradiente (0 a 250 mM de imidazole), a uma taxa de fluxo de 0,5 ml / min durante a recolha de 2 ml-frações. Analisar as fracções de eluição por SDS-PAGE e coloração com Coomassie.
- Enteroquinase (EK)tratamento e limpeza final por cromatografia de permuta catiónica
- Piscina GZM contendo frações em um tubo de diálise com ≤10 MWCO. Armazenar uma pequena amostra a -20 ° C como controlo pré-EK.
- Adicionar EK a 0,02 unidades / 50 ml de sobrenadante inicial directamente para a fracção combinada no tubo de diálise e diálise O / N (pelo menos 16 horas) à temperatura ambiente em tampão de EK-(4 L, tampão de mudança, uma vez).
- No dia seguinte, analisar EK Gzms tratados em comparação com o pré-EK controlo por SDS-PAGE e coloração com Coomassie.
- Quando o processamento N-terminal está completa, a mudança de tampão de diálise S tampão A (4 L) e dializar durante mais 4 horas à temperatura ambiente. Filtrar dialisado (0,45 um).
- Equilibrar a coluna de S-S com tampão A. Colocar a amostra na coluna com a uma taxa de fluxo de 0,5 mL / min a 4 ° C.
- Após o carregamento da amostra, lava-se a coluna com tampão A até S absorvância de UV de linha de base é atingido (cerca de 10 CV). Eluir os Gzms com um gradiente linear de 30 ml (150 a 1000 mM de NaCl). GzmA ealaúdes em ~ 650 mM de NaCl, GzmB na ~ NaCl e GzmM mM 700 a ~ 750 mM de NaCl.
- Analisar as fracções de eluição por SDS-PAGE e ensaios colorimétricos (ver abaixo). Piscina fracções contendo Gzms e concentrado (cerca de 30 vezes, a uma concentração de cerca de 100 uM) em filtros de spin (15 ml, 10 MWCO). Alíquota os preparativos GZM concentrados e armazenar a -80 ° C.
3. Teste de atividade GZM
- Preparação de reagentes
- Preparar tampão de ensaio colorimétrico: 50 mM de base Tris, pH 7.
- Para a medição de GzmA, adicionar Na-CBZ-L-Lisina tiobenzilo éster (S-Bzl) (BLT) para o tampão de ensaio até uma concentração final de 0,2 mM e 5,5'-ditio-bis (ácido 2-nitrobenzóico) (DTNB) a uma concentração de 0,22 mM. Para GzmB, incluem 0,2 mM de Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl mM de DTNB (DAA) e 0,22. Para GzmM, incluem 0,2 mM Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-p-nitroanilida (pNA) (AAPL). Os péptidos sintéticos são adicionados a partir de soluções de reserva apropriadas (em DMSO, storEd a -20 ° C) para a memória intermédia de fresco antes do ensaio.
- Preparar tampão de ensaio de clivagem: 100 mM de NaCl, 50 mM de Tris-Base, pH 7,5
- Preparar tampão de ensaio colorimétrico: 50 mM de base Tris, pH 7.
- Ensaios colorimétricos
- Distribuir pequenas amostras GZM (<5 ul) de fracções de eluição ou de estoque concentradas nos 96 poços de fundo plano de placas. Incluir um controlo positivo (GZM preparações testadas em bruto ou lisados de células NK) e um controlo negativo (tampão apenas).
- Adicionar 100 ul de tampão de ensaio a cada poço (com uma pipeta multi-canal). Incubar durante 10 min a 37 ° C. Medir OD a 405 nm num leitor de microplacas.
- Ensaio de clivagem
- Para os ensaios de clivagem utilizando substratos purificados, co-incubação de um substrato proteico (nativo ou recombinante, 100-400 nM; alguns exemplos de substratos GZM eficientes são apresentados na secção de resultados e na nota no final desta secção) com diluições em série de um GZM (a partir de 400 nM) em tampão de ensaio para várias vezes.Analisar por SDS-PAGE e coloração com Coomassie ou prata; ou por western blotting utilizando anticorpos específicos.
- Para os ensaios de clivagem usando lisados de células, suspender as células HeLa 10 6 (ou qualquer linha de células de tumor disponível) em 1 ml de tampão de ensaio e lise por congelação em uma / banho de gelo seco e etanol descongelação a 37 ° C três vezes. Remover os detritos celulares por centrifugação (15.000 xg durante 10 min a 4 ° C).
- A co-incubação do ligado clarificado com Gzms a várias concentrações e tempos que anteriormente. A clivagem é detectada por imunotransf erência utilizando anticorpos apropriados.
NOTA: Alguns exemplos de substratos de boa fé para a qual anticorpos comerciais estão disponíveis: Licitação (BH3-interagindo agonista morte de domínio) e caspase 3 clivada por GzmB 27,28; vários ribonucleoproteínas nucleares heterogêneos (hnRNPA1, A2 e U) clivada por GzmA 29; citomegalovírus phosphoprotein 71 por GzmM 30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Na seção seguinte, vamos apresentar uma documentação completa de uma preparação GzmA para iluminar o método. Nós também purificado com sucesso GzmB e GzmM, produzindo resultados semelhantes em relação à eficiência e atividade purificação. No entanto, a partir dessas preparações posteriores só vamos mostrar algumas peças seleccionadas de dados. Preparações GzmB de células 293T seguintes actual protocolo foram utilizados em vários estudos publicados, com destaque para a sua actividade em vários sistemas de ensaio biológicos 9,29,31-34.
Uma purificação típica GzmA é mostrado na Figura 2A. A transfecção e expressão eficiente após 72 h foi indicada por uma banda GZM detectável num gel de SDS-PAGE corado com Coomassie sem posterior concentração do sobrenadante da cultura (~ 37 kDa para GzmB e GzmM sob condições redutoras; ~ 60/34 kDa para GzmA sob não redutor / condições redutoras). Após a purificação IMAC as amostras foram tratadas com enterokinase (EK). Uma mudança visível do EK tratada amostra (pós-EK) em comparação com o controlo pré-EK foi observada. A purificação final sobre o S-coluna resultou em preparações GZM altamente puros (GzmA na Figura 2A; GzmB GzmM e na Figura 2B) com uma aparência única banda de proteína em géis corados com Coomassie. As fracções combinadas foram concentradas até uma concentração final de ~ 100 pM. Tipicamente, obteve-se rendimentos de cerca de 0,5 a 1 mg Gzms por 100 ml de sobrenadante da cultura. Para demonstrar a glicosilação eficiente, algumas preparações iniciais foram tratadas com Endoglicosidase Iodeto de (endo) H, que remove oligossacáridos de manose elevados de glicoproteínas N-ligados. Nativo GzmA tem um local de glicosilação ligada a N em Asn-142, ao qual uma manose elevada oligossacárido está ligada 35. Tratamento com EndoH induzido um deslocamento evidente da mobilidade no GZM A, bem como GzmB, preparações de células HEK293T, mas não em bacterianamente gerado GzmA tal como analisado por SDS-PAGE e de Coomassiecoloração (Figura 2C).
Rotineiramente, cada lote GZM foi testado para a actividade enzimática em ensaios colorimétricos. Este teste rápido e fiável que demonstre actividade proteolítica das Gzms pela clivagem de pequenos péptidos sintéticos que é indicado espectrofotometricamente por uma mudança de cor do tampão de ensaio. Devido a diferentes preferências relativas aos resíduos de aminoácidos (posições P1), após o que estas proteases clivam, a escolha de um péptido específico varia entre os Gzms. GzmA tem actividade semelhante a tripsina, a clivagem após resíduos básicos arginina (Arg, R) e a lisina (Lys, K). Cleaves GzmB preferencialmente após resíduos de ácido aspártico (Asp, D), e se unirá GzmM após leucina (Leu, L) e metionina (Met, M) 1. A nossa escolha preferencial peptídeo é BLT-S-Bzl para medir a atividade GzmA, AAD-S-Bzl para GzmB e AAPL -PNA para GzmM.
A principal diferença entre o thiobsubstratos enzylester (DAA e BLT) e o substrato p-nitroanilida (AAPL) é a química específica, em que GZM medeia clivagem de substratos thiobenzylester liberta benzil-mercaptano, que só provoca uma reacção cromogénica, na sua reacção a jusante com o DTNB cromóforo. Portanto, nos tampões de reacção de thiobenzylester substratos DTNB tem que estar presentes, enquanto que a libertação GZM-mediada de p-nitroanilida é suficiente para a detecção colorimétrica. O método detalhado dos ensaios colorimétricos foi recentemente publicado 36. A Figura 3A mostra o BLT representativa e actividade de esterase AAPL nas fracções de eluição a partir do S-coluna de uma preparação GzmA e GzmM, respectivamente. Ensaio colorimétrico também foi utilizado para comparar a actividade do recombinante para preparações GzmB nativas. Tal como mostrado na Figura 3B, recombinante 293T GzmB clivado do substrato cromogénico com eficiência semelhante em comparação com GzmB nativa purificada a partir de um humano NK cell linha, como recentemente descrita 12.
Para testar mais especificamente a actividade GZM, são indicados GZM ensaios de clivagem usando substratos proteicos conhecidos. Estes ensaios de clivagem pode ser realizada com a proteína recombinante ou nativa purificada (se disponíveis), com lisados celulares ou mais fisiológico com células intactas. Se uma proteína substrato está disponível, a actividade proteolítica pode ser analisada em experiências de co-incubação simples com as preparações GZM como este é demonstrada com o GzmA bacteriana conhecida e GzmB substratos nuoCD nuoF e 9, bem como com o novo substrato mitocondrial humano GzmM NDUFAF3 (Figura 4A).
Lisados celulares representam outra fonte óbvia de vários substratos GZM. Anticorpos comerciais estão disponíveis contra muitos dos substratos. Um método rápido e simples para gerar lisados de células é através da aplicação de vários ciclos de congelação / descongelação, como anteriormente demonstrado 33. A utilização de detergentes is não é recomendado, pois pode interferir com a actividade GZM. Na Figura 4B, GzmA clivagem mediada de hnRNPA1 num lisado de células HeLa é demonstrada em imunotransferência utilizando um anticorpo anti-hnRNPA1, bem como um anticorpo anti-Β-actina como controlo de carga.
Para os ensaios de clivagem (ou ensaios de citotoxicidade em células intactas), a disponibilidade de uma molécula de entrega adicional é necessário (PFN ou Estreptolisina O, SLO, para células de mamífero; GNLY ou outros péptidos antimicrobianos para células procarióticas). Ensaios de clivagem em células intactas são mais difíceis quando a concentração das moléculas de entrega é crítica e precisa extensa ajuste fino. Apresentando estes protocolos complexos de ensaios de apoptose está além do escopo deste artigo. Aqui, nós só pode referir-se a vasta literatura, como exemplos 12,13.
<strong> Tabela 1: GZM Clonagem Primer Sequências.
As sequências dos iniciadores que foram utilizados para clonar GzmA, GzmB e GzmM são indicados. Iniciadores directos foram concebidos para introduzir um sítio de EK antes do N-terminal da protease activa (ver Figura 1)
Tabela 2: Soluções Stock e buffer composições.
Indicam-se as receitas das soluções de reserva mais importantes e tampões.
Figura 1. pHLsec Sequence Crítica para Construct Clonagem.
Na seqüência, alguns elementos do vetor sãorealçado que são importantes para a clonagem, a secreção, IMAC purificação e activação das proteases: As sequências de consenso de Kozak e de sinal de secreção, os sítios de restrição Kpnl e AgeI, bem como o Lys_6xHis etiqueta C-terminal. Nós exemplificado GzmA como a inserção que é N-terminalmente fundido com um sítio de enteroquinase (EK). Para o mapa completo do esqueleto completo do vetor, nos referimos à informações suplementares em 23.
Figura 2. Expressão, purificação e ativação de totalmente glicosilada Gzms Humanos de HEK 293 T Cells.
A) mostra uma série de corado com Coomassie, não redutor géis de SDS-PAGE demonstrando todo o processo de produção de GzmA sua secreção no sobrenadante a primeira purificação de níquel-IMAC, tratamento EK e fina l polimento por meio de cromatografia de permuta catiónica. O sobrenadante da cultura foi corrido em SDS-PAGE sob condições redutoras, não redutoras (não-vermelho) (vermelho) e. GzmA é um homodímero (ssGzmA) que é estabilizada por uma ligação de dissulfureto. O homodímero GzmA (~ 60 kDa) é executado perto de contaminar BSA (~ 66 kDa). Sob condições de redução do monômero GzmA (shGzmA) aparece como uma banda de ~ 34 kDa. Géis Para demonstrar a pureza do GzmB final e preparações GzmM, representante corados com Coomassie sob condições não redutoras são mostrados em B. bacterianamente (E. coli) gerado GzmA bem como GzmA e GzmB produzido em células HEK293T foram tratadas com EndoH e analisados por não redutor de SDS-PAGE e coloração com Coomassie. A glicosilação dos Gzms produzidos em células HEK293T é demonstrada por um desvio da mobilidade após o tratamento com EndoH, em comparação com GzmA não glicosilada produzida em bactérias (C).
ig3.jpg "/>
Figura 3. Recombinante Gzms Hydrolyze Peptídeos sintéticos.
A), de pequenas amostras das fracções de eluição a partir da coluna final S foram testados para a actividade GzmA e GzmM em ensaios cromogénicos utilizando BLT e AAPL, respectivamente, como substratos. Os gráficos mostram a clivagem do péptido que foi indicado como um aumento OD a 405 nm. As fracções de pico de actividade correlacionados com o pico de proteína na eluição como indicado na absorvência de UV e análise de SDS-PAGE (Figura 2A e B). B), 293T recombinante e nativa GzmB (preparada tal como descrito 12) nas concentrações indicadas foram incubadas na presença do substrato cromogénico DAA. GzmB actividade foi indicada como uma mudança de DO a 405 nm. O gráfico apresenta a média ± SEM dos nossos mais recentes preparações GZM que foram testados em triplicado.
52.911 / 52911fig4.jpg "/>
Figura 4. recombinante Gzms Cleave substratos proteicos.
A), proteínas bacterianas recombinantes GST-marcado da cadeia respiratória nuoCD e nuoF, bem como a proteína de mamífero respiratória cadeia NDUFAF3, foram tratados com a concentração indicada de Gzms indicadas durante 15 min a 37 ° C. Foram utilizados 1 ug de proteínas purificadas em 20 ul reacções. A clivagem foi analisada por SDS-PAGE e coloração com Coomassie. B) ligado de células HeLa (a uma concentração de proteína de ~ 1 mg / mL) foi incubado com as concentrações indicadas de GzmA recombinante durante 30 min e analisados por imunotransf erência utilizando anti hnRNPA1 e anticorpos Β-actina.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
O papel clássico e extensivamente estudada de GzmA e GzmB é a indução de apoptose em células de mamífero após a sua entrega por citosólico da proteína formadora de poros PFN 1. Recentemente, o espectro citotóxica dos Gzms foi alargado significativamente a partir de células de mamíferos para bactérias 9,10, bem como para certos parasitas 11. Além disso, as funções não clássicos, extracelulares de GzmA e GzmB, bem como a significância biológica dos vários Gzms órfãos ainda são obscuros. Portanto, um sistema de expressão e purificação tempo e custo-eficiente robusto dos Gzms, conforme previsto por este protocolo, será de grande ajuda para estes estudos futuros.
A força deste método é particularmente com base no vector de expressão, pHLsec 23, que é usado neste sistema. Este plasmídeo tem um número elevado de cópias em E. coli, permitindo assim a produção eficiente de ADN. Os seus elementos intensificador / promotor proporcionar oatividade mais forte em várias linhas de células 24. Ele contém um intrão dentro da unidade de transcrição. Os intrões foram encontradas para aumentar a expressão do gene em células de mamífero até 37 100 vezes. Além disso, o plasmídeo proporciona um consenso Kozak e um sinal de secreção optimizado, um-6xHis-tag Lys e um sinal poli-A (Figura 1). As inserções podem ser clonadas através da utilização dos locais AgeI e KpnI entre o sinal de secreção e a etiqueta Lys-6xHis. Usando AgeI e Xhol irá evitar a etiqueta poli-His. Para os Gzms, foi necessário inserir um sítio de enteroquinase na extremidade N-terminal das proteases que permitem a activação das proteases após expressão e purificação IMAC. Para a expressão de outras enzimas isso pode não ser necessário. O plasmídeo de expressão foi testada com sucesso em várias construções de vários comprimentos, estados de glicosilação, e do número de ligações dissulfureto, bem como para as proteínas que continham vários domínios com diferentes dobras 23.
38. Verificou-se que a eficiência de transfecção foi linearmente dependente da quantidade de DNA saturando-se apenas com cerca de 80 ug para um prato de 15 cm (observação não publicada). Portanto, recomendamos o uso de até 80 μ g de plasmídeo de DNA / prato neste protocolo para a máxima eficiência. Este deverá ascender a cerca de 2 mg de DNA por preparação (corresponding a 2 colunas Maxiprep). A eficiência de transfecção foi mais facilmente monitorizado através da execução de uma amostra de sobrenadante de cultura (cerca de 20 μ l) em SDS-PAGE após o período de incubação de 72 horas. Uma banda de proteína da protease secretada deverá ser visível por coloração de Coomassie. Se a banda GZM era fraca e as células não se separar e apareceu viável, as culturas foram incubadas durante mais 24 h antes de purificação IMAC.
Outra etapa mais importante foi o tratamento de enteroquinase (EK) que activa a enzima. EK actividade é dependente de cálcio e é inibida por concentrações elevadas de NaCl a 39 ou imidazole (observação não publicada). Por conseguinte, era essencial para dialisar o eluato da IMAC contra um volume suficiente (20 ml eluato por 2 L de tampão de diálise) de tampão de EK contendo cálcio suficiente e não mais do que 50 mM de NaCl a pH neutro. EK tratamento é recomendado durante 16 horas à temperatura ambiente e deve ser monitorizada por SDS-PAGE revelou que uma mudança de mobilidade óf a protease tratada se a clivagem estar completa. EK fresco foi adicionado e a incubação em tampão de diálise EK fresco foi continuada se o deslocamento foi incompleta. Só se a clivagem estava completa, a diálise contra tampão S A foi iniciado e purificação continuou. A cadeia leve catalítica de EK tem um valor de pi de 5,2, o que permite a separação completa de EK das Gzms no final de cromatografia de permuta catiónica.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596-026 | Total RNA isolation kit |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18064-014 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530L | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| EX-CELL 293 Serum-Free Medium for HEK 293 Cells | Sigma | 14571C | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco | 31966-021 | |
| SnakeSkin Dialysis Tubing, 10K MWCO | Thermo Scientific | 68100 | |
| Enterokinase from bovine intestine | Sigma | E4906 | recombinant, ≥20 units/mg protein |
| HisTrap Excel 5 ml column | GE Healthcare | 17-3712-06 | Nickel IMAC |
| HiTrap SP HP 5 ml column | GE Healthcare | 17-1152-01 | S column |
| N-α-Cbz-L-lysine thiobenzylester (BLT) | Sigma | C3647 | GzmA substrate |
| Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl (AAD) | MP Biomedicals | 2193608 _10mg | GzmB substrate |
| Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-p-nitroanilide (AAPL) | Bachem | GzmM substrate | |
| 5,5′-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) (DTNB) | Sigma | D8130 | Ellman`s reagent |
References
- Chowdhury, D., Lieberman, J. Death by a thousand cuts: granzyme pathways of programmed cell death. Annu Rev Immunol. 26, 389-420 (2008).
- Thiery, J., Lieberman, J. Perforin: a key pore-forming protein for immune control of viruses and cancer. Subcell Biochem. 80, 197-220 (2014).
- Krensky, A. M., Clayberger, C. Biology and clinical relevance of granulysin. Tissue Antigens. 73, 193-198 (2009).
- Bovenschen, N., Kummer, J. A. Orphan granzymes find a home. Immunol Rev. 235, 117-127 (2010).
- Lieberman, J. Granzyme A activates another way to die. Immunol Rev. 235, 93-104 (2010).
- Ewen, C. L., Kane, K. P., Bleackley, R. C.
- Hiebert, P. R., Granville, D. J. Granzyme B in injury, inflammation, and repair. Trends Mol Med. 18, 732-741 (2012).
- Afonina, I. S., Cullen, S. P., Martin, S. J. Cytotoxic and non-cytotoxic roles of the CTL/NK protease granzyme. B. Immunol Rev. 235, 105-116 (2010).
- Walch, M., et al. Cytotoxic cells kill intracellular bacteria through granulysin-mediated delivery of granzymes. Cell. 157, 1309-1323 (2014).
- Lee, W. Y., et al. Invariant natural killer T cells act as an extravascular cytotoxic barrier for joint-invading Lyme Borrelia. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2014).
- Kapelski, S., de Almeida, M., Fischer, R., Barth, S., Fendel, R. Antimalarial activity of granzyme B and its targeted delivery by a granzyme B-scFv fusion protein. Antimicrob Agents Chemother. , (2014).
- Thiery, J., Walch, M., Jensen, D. K., Martinvalet, D., Lieberman, J. Isolation of cytotoxic T cell and NK granules and purification of their effector proteins. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 3 (Unit3 37), (2010).
- Shi, L., Yang, X., Froelich, C. J., Greenberg, A. H. Purification and use of granzyme B. Methods Enzymol. 322, 125-143 (2000).
- Masson, D., Tschopp, J. A family of serine esterases in lytic granules of cytolytic T lymphocytes. Cell. 49, 679-685 (1987).
- Lorentsen, R. H., Fynbo, C. H., Thogersen, H. C., Etzerodt, M., Holtet, T. L. Expression, refolding, and purification of recombinant human granzyme B. Protein Expr Purif. 39, 18-26 (2005).
- Sun, J., et al. Expression and purification of recombinant human granzyme B from Pichia pastoris. Biochem Biophys Res Commun. 261, 251-255 (1999).
- Xia, Z., et al. Expression and purification of enzymatically active recombinant granzyme B in a baculovirus system. Biochem Biophys Res Commun. 243, 384-389 (1998).
- Stahnke, B., et al. Granzyme B-H22(scFv), a human immunotoxin targeting CD64 in acute myeloid leukemia of monocytic subtypes. Mol Cancer Ther. 7, 2924-2932 (2008).
- Gehrmann, M., et al. A novel expression and purification system for the production of enzymatic and biologically active human granzyme. B. J Immunol Methods. 371, 8-17 (2011).
- Metkar, S. S., et al. Cytotoxic cell granule-mediated apoptosis: perforin delivers granzyme B-serglycin complexes into target cells without plasma membrane pore formation. Immunity. 16, 417-428 (2002).
- Motyka, B., et al. Mannose 6-phosphate/insulin-like growth factor II receptor is a death receptor for granzyme B during cytotoxic T cell-induced apoptosis. Cell. 103, 491-500 (2000).
- Pinkoski, M. J., et al. Entry and trafficking of granzyme B in target cells during granzyme B-perforin-mediated apoptosis. Blood. 92, 1044-1054 (1998).
- Aricescu, A. R., Lu, W., Jones, E. Y. A time- and cost-efficient system for high-level protein production in mammalian cells. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62, 1243-1250 (2006).
- Fukuchi, K., et al. Activity assays of nine heterogeneous promoters in neural and other cultured cells. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 30 A, 300-305 (1994).
- Tran, T. V., Ellis, K. A., Kam, C. M., Hudig, D., Powers, J. C. Dipeptidyl peptidase I: importance of progranzyme activation sequences, other dipeptide sequences, and the N-terminal amino group of synthetic substrates for enzyme activity. Arch Biochem Biophys. 403, 160-170 (2002).
- Somanchi, S. S., Senyukov, V. V., Denman, C. J., Lee, D. A. Expansion, purification, and functional assessment of human peripheral blood NK cells. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
- Barry, M., et al. Granzyme B short-circuits the need for caspase 8 activity during granule-mediated cytotoxic T-lymphocyte killing by directly cleaving Bid. Mol Cell Biol. 20, 3781-3794 (2000).
- Darmon, A. J., Nicholson, D. W., Bleackley, R. C. Activation of the apoptotic protease CPP32 by cytotoxic T-cell-derived granzyme B. Nature. 377, 446-448 (1995).
- Rajani, D. K., Walch, M., Martinvalet, D., Thomas, M. P., Lieberman, J. Alterations in RNA processing during immune-mediated programmed cell death. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 8688-8693 (2012).
- Domselaar, R., et al. Noncytotoxic inhibition of cytomegalovirus replication through NK cell protease granzyme M-mediated cleavage of viral phosphoprotein 71. J Immunol. 185, 7605-7613 (2010).
- Thiery, J., et al. Perforin activates clathrin- and dynamin-dependent endocytosis, which is required for plasma membrane repair and delivery of granzyme B for granzyme-mediated apoptosis. Blood. 115, 1582-1593 (2010).
- Thiery, J., et al. Perforin pores in the endosomal membrane trigger the release of endocytosed granzyme B into the cytosol of target cells. Nat Immunol. 12, 770-777 (2011).
- Thomas, M. P., et al. Leukocyte protease binding to nucleic acids promotes nuclear localization and cleavage of nucleic acid binding proteins. J Immunol. 192, 5390-5397 (2014).
- Jacquemin, G., et al. Granzyme B-induced mitochondrial ROS are required for apoptosis. Cell death and differentiation. , (2014).
- Kummer, J. A., Kamp, A. M., Citarella, F., Horrevoets, A. J., Hack, C. E. Expression of human recombinant granzyme A zymogen and its activation by the cysteine proteinase cathepsin C. The Journal of biological chemistry. 271, 9281-9286 (1996).
- Hagn, M., Sutton, V. R., Trapani, J. A. A colorimetric assay that specifically measures Granzyme B proteolytic activity: hydrolysis of Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl. Journal of visualized experiments : JoVE. , e52419 (2014).
- Huang, M. T., Gorman, C. M. Intervening sequences increase efficiency of RNA 3' processing and accumulation of cytoplasmic RNA. Nucleic Acids Res. 18, 937-947 (1990).
- Luthman, H., Magnusson, G. High efficiency polyoma DNA transfection of chloroquine treated cells. Nucleic Acids Res. 11, 1295-1308 (1983).
- Magee, A. I., Grant, D. A., Hermon-Taylor, J., Offord, R. E. Specific one-stage method for assay of enterokinase activity by release of radiolabelled activation peptides from alpha-N-[3H]acetyl-trypsinogen and the effect of calcium ions on the enzyme activity. Biochem J. 197, 239-244 (1981).
