Introduction
Die Gzms sind eine Familie von hoch homologen Serinproteasen in spezialisierten Lysosomen von CTL und NK-Zellen 1 lokalisiert. Die zytotoxischen Granula dieser Killerzellen enthalten auch die Membran-störenden Proteinen PFN und GNLY, die gleichzeitig mit den Gzms bei Erkennung einer Zielzelle für die Eliminierung 2,3 bestimmt werden freigegeben. Es gibt fünf Gzms beim Menschen (GZMA, B, H, K und M) und 10 Gzms in Mäusen (GZMA - G, K, M und N). GZMA und GzmB sind die häufigsten und umfassend in Menschen und Mäusen 1 untersucht. Allerdings haben neuere Studien begonnen, die Zelltod Wege sowie die zusätzlichen biologischen Wirkungen von den anderen, so genannten Orphan-Gzms in Gesundheit und Krankheit 4 vermittelt zu untersuchen.
Das am besten bekannte Funktion der Gzms, insbesondere GZMA und GzmB, ist die Induktion von programmiertem Zelltod in Säugerzellen, wenn sie von PFN 5,6 in die Zielzellen geliefert. JedochZeigten neuere Studien auch extrazelluläre Effekte der Gzms mit tiefgreifenden Auswirkungen auf die Immunregulation und Entzündungen, unabhängig von zytosolischen Lieferung durch PFN 7,8. Das Spektrum von Zellen, die effizient nach cytosolischen Eingabe der Gzms getötet wurde vor kurzem auch aus Säugerzellen, Bakterien 9,10 und sogar bestimmte Parasiten 11 verbreitert. Diese jüngsten Entdeckungen auf ein ganz neues Feld für GZM Forscher eröffnet. Daher wird eine kostengünstige, High-Yield-Säugetier-Expressionssystem deutlich den Weg für die künftige Studien erleichtern.
Nativen menschlichen, Maus und Ratte Gzms wurden erfolgreich aus der Kornfraktion von CTL und NK-Zellen Linien 12-14 gereinigt. Jedoch in unseren Händen die Ausbeute solcher Reinigungsverfahren ist in dem Bereich von weniger als 0,1 mg / l Zellkultur (unveröffentlichte Beobachtung und 12). Darüber hinaus die chromatographische Auflösung eines einzelnen GZM ohne Verunreinigung durch other Gzms und / oder Proteine, die ebenfalls vorhanden sind, in den Granulaten ist eine Herausforderung (unveröffentlichte Daten und 12,14). Rekombinante Gzms wurden Bakterien 15, Hefe 16, Insektenzellen 17 und auch in Säugerzellen, wie HEK 293 18,19 hergestellt. Nur die Säugetier-Expressionssysteme tragen das Potenzial, rekombinanten Enzyme mit posttranslationalen Modifikationen identisch mit dem nativen zytotoxischen Protein zu produzieren. Posttranslationale Modifikationen der spezifischen Aufnahme durch Endozytose und die intrazelluläre Lokalisation der Protease in Zielzellen 20-22 gebracht. Daher kann unter Verwendung pHLsec 23 (ein freundliches Geschenk von Radu Aricescu und Yvonne Jones, University of Oxford, UK) als Plasmidrückgrat für GZM Ausdruck haben wir ein einfaches, zeit- und kosteneffizientes System für High-Yield-Proteinproduktion in HEK293T-Zellen. pHLsec kombiniert eine CMV-Enhancer mit einem Huhn Β-Actin-Promotor; Zusammen bilden diese Elemente Demonstrationented der stärkste Promotor-Aktivität in verschiedenen Zelllinien 24. Zusätzlich enthält das Plasmid ein Kaninchen Β-Globin-Intron, optimierte Kozak und Sekretionssignalen, einen Lys-6xHis-Tag und einem Poly-A-Signal. Inserts können bequem zwischen dem Sekretionssignal und dem Lys-6xHis-tag (Abbildung 1) eine optimale Expression und Sekretion Effizienz für Proteine fehlen geeignete N-terminalen Domänen geklont werden. Für die Expression der Gzms, die endogene Sekretionssignal-Sequenz mit dem Sekretionssignal von dem Vektor, gefolgt von einer Enterokinase (EK) Website (DDDDK) versehen ist, so dass wir ersetzt EK Behandlung aktiviert die sezernierten Gzms (aktiv Gzms beginnen mit dem N-terminalen Aminosäuresequenz IIGG 25). Zusätzlich zugunsten für dieses Verfahren, HEK293T Zellen schnell wachsen in günstiges Medium, wie Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) und sind für eine kosteneffiziente Calciumphosphat-Transfektionsverfahren gut geeignet.
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Protocol
1. Herstellung des Expressionsplasmids pHLsec-GZM
- Bereiten Gesamt-RNA aus menschlichen NK-Zellen (Primärzellen, wie in 26 oder der NK-Zelllinie NK-92 exprimieren, alle fünf menschlichen Gzms hergestellt) mit einer geeigneten RNA-Isolierungsverfahren und Umkehr transcribe unter Verwendung eines ersten cDNA synthetisieren Satz, nach dem manufacturer` s Empfehlungen. Verstärken GZM cDNA mittels PCR und Klon in pHLsec wie in 23 (Art Geschenk der Radu Aricescu und Yvonne Jones, University of Oxford, UK) beschrieben mit den AgeI und KpnI-Stellen (Abbildung 1).
HINWEIS: Verwenden Sie die folgenden in Tabelle 1 angegebenen Primer. - Bestätigen richtigen Inserts durch Sequenzierung. Erweitern Sie die Expressionsplasmide in DH5a-Zellen und zu reinigen mit einem Endotoxin-freiem Plasmidisolierung Satz und befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers.
- Resuspendieren der gereinigten Plasmide in Endotoxin-freiem, sterilem Wasser bei einer Konzentration von 2 mg / ml und bei -20 ° C until Einsatz.
2. Expression von Gzms in HEK293T-Zellen
- Zubereitung von Reagenzien
- Bereiten Standardkulturmedium. In Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) mit hohem Glucosegehalt (25 mM), Glutamax (4 mM), Natriumpyruvat (1 mM) in 10% der Standard fötalem Kälberserum (FCS), Penicillin (100 Einheiten / ml), Streptomycin ( 100 ug / ml).
- Bereiten Transfektionsmedium. Um Kulturmedium ohne Penicillin-Streptomycin hinzufügen 25 ug / ml Chloroquin (Add frisch am Tag der Transfektion von 1,000x Aktien in PBS, bei -20 ° C gelagert).
- Vorbereitung serumfreien Kulturmedium: Zu einem serumfreien Medium für HEK293 Zellen hinzuzufügen Glutamin (4 mM), Penicillin (100 Einheiten / ml), Streptomycin (100 ug / ml) und 2,5 mg / l Amphotericin B.
- Herzustellen, die in Tabelle 2 und der Filter mit einem 0,45 um Filter vor der Verwendung beschriebenen Lösungen:
- Ausbau HEK293T-Zellen
- Wachsen HEK293T-Zellen in 20 ml Kulture Medium unter Verwendung von 150 x 25 mm-Gewebekulturschalen.
- Split-Zellen bei 80% Konfluenz (Split-Verhältnis von 1: 4, in der Regel jeden 3. Tag). Zellen lose befestigen, sie mechanisch ohne Trypsinierung abgelöst werden kann durch eine konsequente Auf- und Abpipettieren.
- Plattenzellen in der Nacht vor der Transfektion auf 60-70% Konfluenz am Tag der Transfektion (Aussaatdichte ~ 2 x 10 5 Zellen / ml) zu ergeben. Eine übliche Vorbereitung Größe besteht aus 20 bis 25 Kulturschalen.
- Calciumphosphat-Transfektion
- 1 Stunde vor der Transfektion, ändern Sie die Standard-Kulturmedium auf 20 ml Transfektionsmedium. Kurz vor dem Ende dieser 1 h Inkubationsschritt mischen 400 ug Plasmid-DNA mit 10,95 ml ddH 2 0 und 1,55 ml 2 M CaCl 2 in 50-ml-Röhrchen (1 Röhrchen / 5 Gerichte).
- 1 bis 2 min vor der Transfektion wurden anschließend 12,5 ml 2x HBS bis 12,5 ml der DNA-Calcium-Lösung, Mischung durch Umdrehen der Röhrchen und Inkubation für 30 s bei RT.
- In the-Gemisch in 2.3.2 direkt auf die Zellen (5 ml pro Schale), tropfenweise in das Medium. Streuen gleichmäßig über die gesamte Fläche, Drehen des Mediums auf eine leicht orange Farbe.
- Die Kulturschalen inkubieren 7-11 h in einem Brutschrank (37 ° C, 5% CO 2 in angefeuchteter Luft). Nach der Inkubation ist ein feiner Niederschlag sichtbar. Entfernen Sie das Transfektionsmedium gründlich vorsichtig mit vorgewärmten PBS und 20 ml Serum-freiem Kulturmedium in 2.1.3 vorbereitet. Inkubiere für 72 h in einem Brutschrank.
- Analyse der Transfektion und Expressionseffizienz, indem eine Probe (~ 20 & mgr; l) der Zellüberstand auf SDS-PAGE und Färbung mit Coomassie Brilliant Blue, ein Granzym Band visualisieren.
- Reinigung von Gzms aus Kulturüberstand von Nickel-IMAC
- Nach der Inkubation dekantieren die Zellkulturüberstände in 250-ml-Röhrchen und klar durch Zentrifugation. Führen Sie eine erste Spin (400 g, 10 min, 4 °C), die das Medium von abgelösten Zellen löschen wird. Den Überstand in frische 250 ml-Röhrchen und Schleudern bei 4000 xg, 30 min bei 4 ° C, um alle verbleibenden Zelltrümmer zu entfernen.
- 5 ml 5 M NaCl, 6,25 ml 2 M Tris-Base (pH 8) und 1 ml von 0,25 M NiSO 4 pro 250 ml der geklärten Überstand. Den Überstand unter Verwendung eines 500 ml Vakuum-Filtereinheit (0,45 mm).
- Äquilibrieren eine Nickel-IMAC-Säule mit His-Bindungspuffer A (10 Säulenvolumen, CV) mit einem geeigneten FPLC-System.
- Gelten die geklärte Überstand auf die äquilibrierte Säule mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml / min bei 4 ° C.
- Nachdem der Überstand aufgebracht wurde, Waschsäule mit His-Bindungspuffer, bis die UV-Absorption Basislinie erreicht ist (normalerweise 10 CV).
- Eluieren Gzms mit einem linearen 20 ml-Gradienten (0 bis 250 mM Imidazol) bei einer Flussrate von 0,5 ml / min, während das Sammeln 2 ml-Fraktionen. Analyse der Elutionsfraktionen durch SDS-PAGE und Coomassie-Färbung.
- Enterokinase (EK)Behandlung und Endreinigung durch Kationenaustauschchromatographie
- Pool GZM haltigen Fraktionen in einem Dialyseschlauch mit ≤10 MWCO. Bewahren Sie eine kleine Probe bei -20 ° C als Pre-EK Kontrolle.
- In EK bei 0,02 Einheiten / 50 ml anfänglichen Überstand direkt auf die vereinigte Fraktion im Dialyseschlauch dialysiert und O / N (mindestens 16 h) bei RT in EK-Puffer (4 L, ändern Puffer einmal).
- Am nächsten Tag analysiert EK behandelt Gzms im Vergleich zur vorge EK Kontrolle durch SDS-PAGE und Coomassie-Färbung.
- Wenn N-terminale Verarbeitung abgeschlossen ist, ändern Dialysepuffer auf S Puffer A (4 l) dialysiert und für weitere 4 h bei RT. Filter Dialysat (0,45 um).
- Äquilibrieren eine S-S-Säule mit Puffer A. Laden der Probe auf die Säule mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml / min bei 4 ° C.
- Nach der Probenbeladung, waschen Sie die Säule mit S-Puffer A, bis die UV-Absorption Basislinie erreicht ist (ca. 10 CV). Eluieren die Gzms mit einer 30 ml linearen Gradienten (150 bis 1000 mM NaCl). GZMA eLauten bei ~ 650 mM NaCl, GzmB bei ~ 700 mM NaCl und GzmM bei ~ 750 mM NaCl.
- Analysieren Elutionsfraktionen durch SDS-PAGE und kolorimetrische Assays (siehe unten). Pool enthaltenden Fraktionen Gzms und Konzentrat (etwa 30-fach, auf eine Konzentration von etwa 100 uM) in Spinfilter (15 ml, 10 MWCO). Aliquot der konzentrierten GZM Vorbereitungen und bei -80 ° C.
3. Prüfung GZM Aktivität
- Zubereitung von Reagenzien
- Vorbereitung kolorimetrischen Assay-Puffer: 50 mM Tris-Base, pH 7.
- Für die Messung der GZMA fügen Na-CBZ-L-Lysin thiobenzyl ester (S-Bzl) (BLT) mit dem Assay-Puffer auf eine Endkonzentration von 0,2 mM und 5,5'-Dithio-bis (2-nitrobenzoesäure) (DTNB) in einer Konzentration von 0,22 mM. Für GzmB umfassen 0,2 mM Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl (AAD) und 0,22 mM DTNB. Für GzmM umfassen 0,2 mM Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-p-Nitroanilid (pNA) (AAPL). Synthetische Peptide werden von entsprechenden Stammlösungen in DMSO (, stored bei -20 ° C) zu dem Puffer frisch vor dem Assay.
- Vorbereitung Spaltungstestpuffer: 100 mM NaCl, 50 mM Tris-Base, pH 7,5
- Vorbereitung kolorimetrischen Assay-Puffer: 50 mM Tris-Base, pH 7.
- Kolorimetrische Assays
- Verteilen Sie kleine GZM Proben (<5 & mgr; l) von Elutionsfraktionen oder konzentrierte Aktien in den 96-Loch-Flachbodenplatten. Fügen Sie eine positive Kontrolle (getestet GZM Zubereitungen oder rohe NK Zell-Lysate) und eine Negativkontrolle (nur Puffer).
- Füge 100 & mgr; l Assay-Puffer in jede Vertiefung (unter Verwendung einer Mehrkanalpipette). Inkubieren für 10 min bei 37 ° C. Messen der OD bei 405 nm in einem Mikroplatten-Lesegerät.
- Spaltungsassay
- Für Spaltungs-Assays unter Verwendung von gereinigten Substrate, Co-Inkubation ein Protein-Substrat (native oder rekombinante, 100-400 nM; einige Beispiele für effiziente GZM Substrate werden in der Ergebnisbereich und in dem Hinweis am Ende dieses Abschnitts dargestellt) mit seriellen Verdünnungen einer GZM (beginnend bei 400 nM) in Assay-Puffer für verschiedene Zeiten.Analyse durch SDS-PAGE und Silberfärbung oder Coomassie; oder durch Western-Blot unter Verwendung spezifischer Antikörper.
- Zur Abspaltung Assays unter Verwendung Zelllysaten auszusetzen 10 6 HeLa-Zellen (oder einen beliebigen verfügbaren Tumorzelllinie) in 1 ml Testpuffer und Lyse durch Einfrieren in einem Ethanol / Trockeneis-Bad und Auftauen bei 37 ° C dreimal. Entfernen von Zelltrümmern durch Zentrifugation (15.000 × g für 10 min bei 4 ° C).
- Co-Inkubation mit dem geklärten Lysat Gzms in verschiedenen Konzentrationen und Zeiten wie oben. Spaltung wird durch Immunoblotting unter Verwendung von geeigneten Antikörpern nachgewiesen.
HINWEIS: Einige Beispiele für Bona-fide-Substrate, für die kommerzielle Antikörper verfügbar sind: Bid (BH3-Domäne interagieren Tod Agonist) und Caspase 3 durch GzmB 27,28 gespalten; mehrere heterogene Kern Ribonukleoproteine (hnRNPA1, A2 und U) durch GZMA 29 gespalten wird; Cytomegalovirus Phosphoprotein 71 durch GzmM 30.
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Representative Results
Im folgenden Abschnitt werden wir eine vollständige Dokumentation eines GZMA Vorbereitung zu präsentieren, um die Methode zu beleuchten. Wir haben auch erfolgreich gereinigt GzmB und GzmM, die ähnliche Ergebnisse in Bezug auf Reinigungsleistung und Aktivität. Doch von diesen später Vorbereitungen werden wir nur zeigen einige ausgewählte Stücke von Daten. Wurden GzmB Präparate aus 293T-Zellen nach dem aktuellen Protokoll in mehreren veröffentlichten Studien verwendet, Hervorhebung ihrer Tätigkeit in verschiedenen biologischen Testsystemen 9,29,31-34.
Eine typische GZMA Reinigung ist in 2A gezeigt. Effiziente Transfektion und Expression nach 72 h wurde durch eine nachweisbare GZM Bande auf einem Coomassie-gefärbten SDS-PAGE Gel ohne weitere Konzentrierung des Kulturüberstands (~ 37 kDa für GzmB und GzmM unter reduzierenden Bedingungen gekennzeichnet; ~ 60/34 kDa für GZMA unter nicht-reduzierenden / reduzierenden Bedingungen). Nach der IMAC Reinigung wurden die Proben mit eingeben behandeltokinase (EK). Eine sichtbare Verschiebung des EK-behandelte Probe (post-EK) im Vergleich zur vorge EK Kontrolle beobachtet wurde. Die abschließende Reinigung der S-Säule führte in hochreiner GZM Zubereitungen (GZMA in 2A; GzmB und GzmM in 2B) mit einem einzigen Band Auftritt auf Coomassie-gefärbten Proteingelen. Die vereinigten Fraktionen wurden auf eine Endkonzentration von ~ 100 & mgr; M konzentriert. Typischerweise erhielten wir Ausbeuten von etwa 0,5 bis 1 mg pro 100 Gzms ml Kulturüberstand. Um eine effiziente Glykosylierung zu demonstrieren, wurden ein paar Ausgangspräparate mit Endoglycosidase (Endo) H, die Hochmannose-Oligosaccharide von N-gebundenen Glykoproteinen entfernt behandelt. Mutter GZMA hat eine N-gebundene Glykosylierungsstelle an Asn-142, dem ein Hochmannose-Oligosaccharid gebunden ist 35. EndoH Behandlung induzierte eine deutliche Verschiebung in der Mobilität GZM A sowie GzmB, Zubereitungen aus HEK293T-Zellen, aber nicht in bakteriell erzeugten GZMA wie durch SDS-PAGE und CoomassieFärbung (Abbildung 2C).
Routinemäßig wurde jeder GZM Charge für die enzymatische Aktivität in kolorimetrische Assays getestet. Diese schnelle und zuverlässige Test zeigt die proteolytische Aktivität der Gzms durch die Spaltung von kleinen synthetischen Peptiden, die spektrophotometrisch durch eine Farbänderung des Testpuffer angedeutet ist. Unterschiedlichen Präferenzen in Bezug auf die Aminosäurereste (P1-Position), nach der diese Proteasen spalten, ist in den einzelnen Gzms die Wahl eines speziellen Peptids. GZMA hat Trypsin-ähnliche Aktivität spaltet, nachdem die basischen Reste Arginin (Arg, R) und Lysin (Lys, K). GzmB spaltet bevorzugt nach Asparaginsäurereste (Asp, D) und GzmM schneidet nach Leucin (Leu, L) und Methionin (Met, M) 1. Unsere bevorzugte Peptid Wahl ist BLT -S-Bzl zu GZMA Aktivität zu messen, AAD -S-Bzl für GzmB und AAPL -pNA für GzmM.
Der Hauptunterschied zwischen der thiobenzylester Substrate (AAD und BLT) und der p-Nitroanilid-Substrates (AAPL) ist die spezifische Chemie, dadurch GZM vermittelt Spaltung thiobenzylester Substrate frei benzyl-Mercaptan, die nur löst eine chromogene Reaktion in seinem stromabwärtigen Reaktion mit dem Chromophor DTNB. Daher wird in den Reaktionspuffern thiobenzylester Substrate DTNB vorhanden sein muss, während die GZM-vermittelten Freisetzung von p-Nitroanilid ist ausreichend für den kolorimetrischen Nachweis. Das detaillierte Verfahren der kolorimetrischen Assays wurde kürzlich veröffentlicht 36. 3A zeigt die repräsentativen BLT und AAPL Esterase-Aktivität in den Elutionsfraktionen der S-Säule eines GZMA und GzmM Herstellung sind. Kolorimetrischen Assay wurde auch verwendet, um die Aktivität des rekombinanten nativen GzmB Präparationen zu vergleichen. Wie in 3B gezeigt ist, gespalten rekombinanten 293T GzmB das chromogene Substrat mit ähnlicher Effizienz im Vergleich zu nativem GzmB aus einer menschlichen NK cel gereinigtl Leitung, wie kürzlich beschrieben 12.
Um genauer zu testen GZM Aktivität werden GZM Spaltungs-Assays unter Verwendung bekannter Proteinsubstraten angezeigt. Diese Spaltungsassays mit gereinigten rekombinanten oder nativen Proteins oder durchgeführt werden (falls vorhanden), mit Zelllysaten meisten physiologischen mit intakten Zellen. Wenn ein Protein-Substrat verfügbar ist, können proteolytische Aktivität in einfachen Co-Inkubation Experimente mit den GZM Zubereitungen als dies mit der bekannten bakteriellen GZMA demonstriert und GzmB Substrate nuoCD und nuof 9 sowie mit dem neuen menschlichen mitochondrialen GzmM Substrat NDUFAF3 analysiert werden (4A).
Zelllysate stellen eine weitere offensichtliche Quelle von mehreren GZM Substraten. Handelsübliche Antikörper sind gegen viele der Substrate. Eine schnelle und einfache Methode, um Zelllysate erzeugen, indem mehrere Frost / Tau-Zyklen, wie zuvor gezeigt 33. Die Verwendung von Detergentien is nicht empfohlen, da sie mit GZM Aktivität beeinträchtigen können. In 4B GZMA vermittelte Spaltung hnRNPA1 in einer HeLa-Zell-Lysat in einem Immunoblot unter Verwendung eines Anti-hnRNPA1 Antikörper sowie einen Anti-Β-Actin-Antikörper als Beladungskontrolle gezeigt.
Für Spaltungs-Assays (oder Zytotoxizitätsassays) in intakten Zellen, ist die Verfügbarkeit von Nachlieferung Molekül notwendig (PFN oder Streptolysin O, SLO, für Säugetierzellen; GNLY oder andere antimikrobielle Peptide für prokaryotische Zellen). Spaltungs-Assays an intakten Zellen schwierigsten, wenn die Konzentration der Liefer Moleküle ist kritisch und muss umfassende Feinabstimmung. Einführung dieser komplexen Protokollen Apoptoseassays geht über den Rahmen dieses Dokuments. Hier können wir nur für die große Menge an Literatur beziehen, als Beispiele 12,13.
<strong> Tabelle 1: GZM Cloning Primer-Sequenzen.
Die Primer-Sequenzen, die verwendet wurden, um GZMA, GzmB und GzmM klonieren sind angegeben. Vorwärts-Primer wurden entworfen, um eine EK Website vor dem N-Terminus der aktiven Protease einzuführen (siehe 1)
Tabelle 2: Stammlösungen und Pufferzusammensetzungen.
Die Rezepte der wichtigsten Stammlösungen und Puffer angegeben.
Abbildung 1. pHLsec Sequence Critical für Baukonstruktion Cloning.
In der Reihenfolge, in der einige Elemente des Vektors sindmarkiert, die für die Klonierung, Sekretion IMAC Reinigung und Aktivierung der Proteasen sind: die Kozak-Konsensus und Sekretion Signalsequenzen, die AgeI und KpnI-Restriktionsstellen, als auch die C-terminalen Lys_6xHis tag. Wir veranschau GZMA wie der Einsatz, die N-terminal zu einer Enterokinase (EK) Website verschmolzen ist. Für die volle Karte der komplette Vektorgerüst, verweisen wir auf die ergänzenden Informationen in 23.
Abbildung 2. Expression, Reinigung und Aktivierung der Voll glykosylierte humane Gzms von HEK 293 T-Zellen.
A) zeigt eine Reihe von mit Coomassie gefärbten, nicht-reduzierenden SDS-PAGE-Gelen, welche die gesamte GZMA Produktionsprozesses von seiner Sekretion in den Überstand auf ersten Nickel-IMAC Reinigung EK Behandlung und FINA l Polier über Kationenaustausch-Chromatographie. Der Kulturüberstand wurde auf SDS-PAGE unter reduzierenden (rot) und nicht-reduzierenden (nicht-red) Bedingungen laufen gelassen. GZMA ein Homodimer (ssGzmA), die durch eine Disulfidbindung stabilisiert wird. Die GZMA Homodimer (~ 60 kDa) verläuft in der Nähe gefährdend BSA (~ 66 kDa). Unter reduzierenden Bedingungen wird das GZMA Monomer (shGzmA) als ein ~ 34 kDa-Bande. Um die Reinheit des Endprodukts GzmB und GzmM Zubereitungen zeigen repräsentative Coomassie-gefärbten Gelen unter nicht reduzierenden Bedingungen werden in B. Bakteriell (E. coli) gezeigt erzeugt GZMA sowie GZMA und GzmB in HEK293T-Zellen produziert wurden mit EndoH behandelt und analysiert, durch nicht-reduzierende SDS-PAGE und Coomassie-Färbung. Glykosylierung der in HEK293T-Zellen produziert Gzms durch eine Mobilitätsverschiebung nach EndoH Behandlung im Vergleich zu nicht-glycosylierte GZMA in Bakterien (C) hergestellt demonstriert.
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Figur 3. Rekombinante Gzms Hydrolyze synthetischen Peptiden.
A) wurden kleine Proben der Elutionsfraktionen von der letzten S-Säule für GZMA und GzmM Aktivität in chromogenen Assays unter Verwendung von BLT und AAPL jeweils als Substrate getestet. Diagramme zeigen Peptidspaltung, die als OD bei 405 nm angegeben wurde. Die Aktivitätspeakfraktionen mit dem Protein-Peak bei der Elution, wie in UV-Absorption und SDS-PAGE-Analyse (2A und B) angegeben korreliert. B), rekombinante und native 293T GzmB (wie beschrieben 12 hergestellt) in den angegebenen Konzentrationen in Gegenwart des chromogenen Substrats AAD inkubiert. GzmB Aktivität wurde als OD bei 405 nm angegeben. Graph zeigt den Mittelwert ± SEM von unserem jüngsten GZM Zubereitungen, die in dreifacher Ausführung getestet.
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Abbildung 4. Rekombinante Gzms Cleave Proteinsubstraten.
A) Das rekombinante GST-tagged, bakterielle Zellatmung Proteine nuoCD und nuof sowie die Säugeratmungskette Protein NDUFAF3 wurden mit der angegebenen Konzentration angegeben Gzms für 15 min bei 37 ° C behandelt. 1 ug gereinigte Proteine in 20 & mgr; l-Reaktionen verwendet wurden. Spaltung wurde durch SDS-PAGE und Coomassie-Färbung analysiert. B) HeLa-Zelllysat (bei einer Proteinkonzentration von ca. 1 mg / ml) wurden mit den angegebenen Konzentrationen von rekombinantem GZMA für 30 min durch Immunoblotting mit Anti hnRNPA1 und Β-Actin-Antikörpern inkubiert und analysiert.
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Discussion
Die klassische und ausgiebig untersucht Rolle GZMA und GzmB ist die Induktion von Apoptose in Säugetierzellen nach ihrer zytosolischen Lieferung durch den porenbildendes Protein PFN 1. Kürzlich wurde die zytotoxische Spektrum der Gzms signifikant von Säugetierzellen, Bakterien 9,10 sowie bestimmte Parasiten 11 verbreitert. Darüber hinaus sind die nicht-klassischen, extrazelluläre Funktionen GZMA und GzmB sowie die biologische Bedeutung der verschiedenen Waisen Gzms noch unklar. Daher ist eine robuste zeit- und kosteneffiziente Expression und Reinigung System der Gzms, durch dieses Protokoll vorgesehen ist, wird eine große Hilfe für diese künftigen Studien.
Die Stärke dieser Methode beruht vor allem auf dem Expressionsvektor, pHLsec 23, die in diesem System eingesetzt wird. Dieses Plasmid hat eine hohe Kopienzahl in E. coli, so dass eine effiziente DNA-Produktion. Seine Enhancer / Promotor-Elemente bieten diestärkste Aktivität in verschiedenen Zelllinien 24. Es enthält ein Intron innerhalb der Transkriptionseinheit. Introns wurden gefunden, um die Genexpression in Säugerzellen bis zu verbessern 100fach 37. Zusätzlich stellt das Plasmid eine Kozak-Konsens und eine optimierte Sekretionssignal, einen Lys-6xHis-Tag und einem Poly-A-Signal (Figur 1). Inserts können mit den AgeI und KpnI-Stellen zwischen dem Sekretionssignal und dem Lys-6xHis-Tag kloniert werden. Verwendung AgeI und XhoI vermeiden die polyHis Tag. Für die Gzms, war es notwendig, eine Enterokinase-Stelle am N-Terminus der Proteasen ermöglicht die Aktivierung der Proteasen nach Expression und Reinigung IMAC einzufügen. Für die Expression von anderen Enzymen, könnte dies nicht notwendig sein. Das Expressionsplasmid wurde erfolgreich für die Mehrfachkonstrukte in verschiedenen Längen, Glycosylierung Zustände, und die Anzahl der Disulfidbindungen, sowie Proteine, die mehrere Domänen mit unterschiedlichen Faltungen 23 enthaltenen getestet.
38. Wir fanden, dass die Transfektionseffizienz war linear abhängig von der DNA-Menge zu sättigen nur bei etwa 80 & mgr; g für einen 15-cm-Spiegel (unveröffentlichte Beobachtung). Daher empfehlen wir die Verwendung von bis zu 80 μ g von Plasmid-DNA / Schale in diesem Protokoll für maximale Effizienz. Dies wird etwa 2 mg DNA pro Zubereitung betragen (corresponding bis 2 Maxiprep Spalten). Die Transfektionseffizienz wurde am leichtesten nach der 72 Stunden Inkubationszeit läuft eine Probe des Kulturüberstand (etwa 20 μ l) auf SDS-PAGE überwacht. Eine Proteinbande des sezernierten Protease sollte durch Coomassie-Färbung sichtbar. Wenn der GZM Band war schwach, und die Zellen nicht abzulösen und erschien tragfähige wurden die Kulturen für weitere 24 h vor IMAC Reinigung inkubiert.
Weiteres wichtigste Schritt war der Enterokinase (EK) Behandlung, die das Enzym aktiviert. EK Aktivität ist calciumabhängig und wird durch hohe Konzentrationen von NaCl 39 oder Imidazol (unveröffentlichte Beobachtung) gehemmt. Daher war es von entscheidender Bedeutung, um das Eluat von dem IMAC gegen einen ausreichenden Menge (20 ml Eluat pro 2 l Dialysepuffer) des EK-Puffer, der ausreichend Kalzium und nicht mehr als 50 mM NaCl bei neutralem pH dialysieren. EK Behandlung wird für 16 Stunden bei Raumtemperatur empfohlen und sollten durch SDS-PAGE, die eine Mobilitätsverschiebung o ergab überwacht werdenf behandelten Protease wenn die Spaltung war vollständig. Frisch EK wurde zugegeben und die Inkubation in frischem EK Dialysepuffer wurde fortgesetzt, wenn die Verschiebung unvollständig war. Nur dann, wenn die Spaltung vollständig war, wurde einer Dialyse gegen Puffer A S gestartet und die Reinigung fortgesetzt. Die katalytische leichten Kette des EK weist einen pI-Wert von 5,2, so dass die vollständige Trennung des EK aus den Gzms im endgültigen Kationenaustauschchromatographie.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596-026 | Total RNA isolation kit |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18064-014 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530L | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| EX-CELL 293 Serum-Free Medium for HEK 293 Cells | Sigma | 14571C | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco | 31966-021 | |
| SnakeSkin Dialysis Tubing, 10K MWCO | Thermo Scientific | 68100 | |
| Enterokinase from bovine intestine | Sigma | E4906 | recombinant, ≥20 units/mg protein |
| HisTrap Excel 5 ml column | GE Healthcare | 17-3712-06 | Nickel IMAC |
| HiTrap SP HP 5 ml column | GE Healthcare | 17-1152-01 | S column |
| N-α-Cbz-L-lysine thiobenzylester (BLT) | Sigma | C3647 | GzmA substrate |
| Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl (AAD) | MP Biomedicals | 2193608 _10mg | GzmB substrate |
| Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-p-nitroanilide (AAPL) | Bachem | GzmM substrate | |
| 5,5′-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) (DTNB) | Sigma | D8130 | Ellman`s reagent |
References
- Chowdhury, D., Lieberman, J. Death by a thousand cuts: granzyme pathways of programmed cell death. Annu Rev Immunol. 26, 389-420 (2008).
- Thiery, J., Lieberman, J. Perforin: a key pore-forming protein for immune control of viruses and cancer. Subcell Biochem. 80, 197-220 (2014).
- Krensky, A. M., Clayberger, C. Biology and clinical relevance of granulysin. Tissue Antigens. 73, 193-198 (2009).
- Bovenschen, N., Kummer, J. A. Orphan granzymes find a home. Immunol Rev. 235, 117-127 (2010).
- Lieberman, J. Granzyme A activates another way to die. Immunol Rev. 235, 93-104 (2010).
- Ewen, C. L., Kane, K. P., Bleackley, R. C.
- Hiebert, P. R., Granville, D. J. Granzyme B in injury, inflammation, and repair. Trends Mol Med. 18, 732-741 (2012).
- Afonina, I. S., Cullen, S. P., Martin, S. J. Cytotoxic and non-cytotoxic roles of the CTL/NK protease granzyme. B. Immunol Rev. 235, 105-116 (2010).
- Walch, M., et al. Cytotoxic cells kill intracellular bacteria through granulysin-mediated delivery of granzymes. Cell. 157, 1309-1323 (2014).
- Lee, W. Y., et al. Invariant natural killer T cells act as an extravascular cytotoxic barrier for joint-invading Lyme Borrelia. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2014).
- Kapelski, S., de Almeida, M., Fischer, R., Barth, S., Fendel, R. Antimalarial activity of granzyme B and its targeted delivery by a granzyme B-scFv fusion protein. Antimicrob Agents Chemother. , (2014).
- Thiery, J., Walch, M., Jensen, D. K., Martinvalet, D., Lieberman, J. Isolation of cytotoxic T cell and NK granules and purification of their effector proteins. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 3 (Unit3 37), (2010).
- Shi, L., Yang, X., Froelich, C. J., Greenberg, A. H. Purification and use of granzyme B. Methods Enzymol. 322, 125-143 (2000).
- Masson, D., Tschopp, J. A family of serine esterases in lytic granules of cytolytic T lymphocytes. Cell. 49, 679-685 (1987).
- Lorentsen, R. H., Fynbo, C. H., Thogersen, H. C., Etzerodt, M., Holtet, T. L. Expression, refolding, and purification of recombinant human granzyme B. Protein Expr Purif. 39, 18-26 (2005).
- Sun, J., et al. Expression and purification of recombinant human granzyme B from Pichia pastoris. Biochem Biophys Res Commun. 261, 251-255 (1999).
- Xia, Z., et al. Expression and purification of enzymatically active recombinant granzyme B in a baculovirus system. Biochem Biophys Res Commun. 243, 384-389 (1998).
- Stahnke, B., et al. Granzyme B-H22(scFv), a human immunotoxin targeting CD64 in acute myeloid leukemia of monocytic subtypes. Mol Cancer Ther. 7, 2924-2932 (2008).
- Gehrmann, M., et al. A novel expression and purification system for the production of enzymatic and biologically active human granzyme. B. J Immunol Methods. 371, 8-17 (2011).
- Metkar, S. S., et al. Cytotoxic cell granule-mediated apoptosis: perforin delivers granzyme B-serglycin complexes into target cells without plasma membrane pore formation. Immunity. 16, 417-428 (2002).
- Motyka, B., et al. Mannose 6-phosphate/insulin-like growth factor II receptor is a death receptor for granzyme B during cytotoxic T cell-induced apoptosis. Cell. 103, 491-500 (2000).
- Pinkoski, M. J., et al. Entry and trafficking of granzyme B in target cells during granzyme B-perforin-mediated apoptosis. Blood. 92, 1044-1054 (1998).
- Aricescu, A. R., Lu, W., Jones, E. Y. A time- and cost-efficient system for high-level protein production in mammalian cells. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62, 1243-1250 (2006).
- Fukuchi, K., et al. Activity assays of nine heterogeneous promoters in neural and other cultured cells. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 30 A, 300-305 (1994).
- Tran, T. V., Ellis, K. A., Kam, C. M., Hudig, D., Powers, J. C. Dipeptidyl peptidase I: importance of progranzyme activation sequences, other dipeptide sequences, and the N-terminal amino group of synthetic substrates for enzyme activity. Arch Biochem Biophys. 403, 160-170 (2002).
- Somanchi, S. S., Senyukov, V. V., Denman, C. J., Lee, D. A. Expansion, purification, and functional assessment of human peripheral blood NK cells. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
- Barry, M., et al. Granzyme B short-circuits the need for caspase 8 activity during granule-mediated cytotoxic T-lymphocyte killing by directly cleaving Bid. Mol Cell Biol. 20, 3781-3794 (2000).
- Darmon, A. J., Nicholson, D. W., Bleackley, R. C. Activation of the apoptotic protease CPP32 by cytotoxic T-cell-derived granzyme B. Nature. 377, 446-448 (1995).
- Rajani, D. K., Walch, M., Martinvalet, D., Thomas, M. P., Lieberman, J. Alterations in RNA processing during immune-mediated programmed cell death. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 8688-8693 (2012).
- Domselaar, R., et al. Noncytotoxic inhibition of cytomegalovirus replication through NK cell protease granzyme M-mediated cleavage of viral phosphoprotein 71. J Immunol. 185, 7605-7613 (2010).
- Thiery, J., et al. Perforin activates clathrin- and dynamin-dependent endocytosis, which is required for plasma membrane repair and delivery of granzyme B for granzyme-mediated apoptosis. Blood. 115, 1582-1593 (2010).
- Thiery, J., et al. Perforin pores in the endosomal membrane trigger the release of endocytosed granzyme B into the cytosol of target cells. Nat Immunol. 12, 770-777 (2011).
- Thomas, M. P., et al. Leukocyte protease binding to nucleic acids promotes nuclear localization and cleavage of nucleic acid binding proteins. J Immunol. 192, 5390-5397 (2014).
- Jacquemin, G., et al. Granzyme B-induced mitochondrial ROS are required for apoptosis. Cell death and differentiation. , (2014).
- Kummer, J. A., Kamp, A. M., Citarella, F., Horrevoets, A. J., Hack, C. E. Expression of human recombinant granzyme A zymogen and its activation by the cysteine proteinase cathepsin C. The Journal of biological chemistry. 271, 9281-9286 (1996).
- Hagn, M., Sutton, V. R., Trapani, J. A. A colorimetric assay that specifically measures Granzyme B proteolytic activity: hydrolysis of Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl. Journal of visualized experiments : JoVE. , e52419 (2014).
- Huang, M. T., Gorman, C. M. Intervening sequences increase efficiency of RNA 3' processing and accumulation of cytoplasmic RNA. Nucleic Acids Res. 18, 937-947 (1990).
- Luthman, H., Magnusson, G. High efficiency polyoma DNA transfection of chloroquine treated cells. Nucleic Acids Res. 11, 1295-1308 (1983).
- Magee, A. I., Grant, D. A., Hermon-Taylor, J., Offord, R. E. Specific one-stage method for assay of enterokinase activity by release of radiolabelled activation peptides from alpha-N-[3H]acetyl-trypsinogen and the effect of calcium ions on the enzyme activity. Biochem J. 197, 239-244 (1981).
