Summary
מוצג כאן היא שיטה פשוטה לניתוח cytometric הבידוד וזרימה של תאי דם היקפי mononuclear הסתננות-גליומה שמניב נתונים כמותיים זמן תלוי במעמד המספר והפעלת תאים חיסוניים הנכנסים למייקרו-סביבת גידול במוח מוקדם.
Abstract
המעבדה שלנו הוכיחה לאחרונה כי רוצח טבעי (NK) תאים מסוגלים לחסל GL26 עכבר מושתל orthotopically ועכברוש CNS-1 גליומות הממארת מייד לאחר קליטתם תוך גולגולתי אם תאי הסרטן ניתנים לקויים בביטוים של הקטינים galectin β-galactoside מחייב -1 (גל-1). עוד העבודה האחרונה החברה מראה כי אוכלוסייה של תאי מיאלואידית + / CD11b + Gr-1 היא קריטית להשפעה זו. כדי להבין טוב יותר את המנגנונים שבאמצעותם תאי NK ומיאלואידית לשתף פעולה כדי להעניק דחיית גידול גל-1-חסר פיתחנו פרוטוקול מקיף לבידוד והניתוח של תאים שחדרו-גליומה ההיקפיים mononuclear הדם (PBMC). השיטה הוכיחה כאן על ידי השוואת חדירת PBMC למייקרו-הסביבה של הגידול של גל-1-להביע GL26 גליומות עם אלה שניתנו גל-1-לקוי באמצעות מציאה shRNA. הפרוטוקול מתחיל בתיאור של איך תרבות ולהכין לסה"נ GL26LLS לחיסון לתוך מוח עכבר C57BL / 6J syngeneic. לאחר מכן הוא מסביר את השלבים כרוכים בניתוח cytometric בידוד וזרימה של PBMCs הסתננות-גליומה ממייקרו-סביבת גידול במוח מוקדם. השיטה ניתנת להתאמה למספר in vivo עיצובים הניסיוניים שבו נתונים זמניים על חדירת חיסון לתוך המוח נדרש. השיטה היא רגישה מאוד לשחזור, כפי שניתן לבודד מגידולים תוך-גולגולתי PBMCs הסתננות-גליומה בהקדם engraftment הודעה גידולי 24 שעות עם ספירת תאים דומה נצפתה מגידולי נקודת זמן המתאים בכל ניסויים בלתי תלויים. בניסויים בודדים יכולים לבצע את השיטה מקצירת המוח לזרום ניתוח cytometric של PBMCs הסתננות-גליומה בכ 4-6 שעות, תלוי במספר דגימות להיות מנותח. גם דגמי גליומה אלטרנטיביים ו / או נוגדני זיהוי תא ספציפי ניתן להשתמש בשיקול דעתם של experimentalists להעריך את החדירה של כמה immun האחרסוגי תאי דואר של עניין ללא צורך בשינויים בהליך הכולל.
Introduction
גליומות היא מחלקה של סרטן מוח neuroepithelial הנובע מגליה הפכה בתוך מערכת העצבים המרכזית (CNS). של כל גליומות, ארגון בריאות עולמי (WHO) גליומה IV כיתה, או גליובלסטומה (GBM), הוא נפוצה וקטלני ביותר 1. GBM הוא עקשן מאוד לטיפול הסטנדרטי של שוטף הכולל כריתת גידול ולאחריו קרינה בתוספת כימותרפיה במקביל ואדג'ובנט בטקסול 2 במידה האפשר. סוגי הסרטן קטלניים אלה נושאים פרוגנוזה עגומה של רק 15-18 חודשים של הישרדות מרגע אבחון ראשוני עם רק 5% מהחולים ששרדו את המחלה לאחר 5 שנים 3.
נוכחותו של מחסום דם המוח (BBB), חוסר בתא הצגת אנטיגן המקצועי (נגמ"שים), וקיום בלתי מזוהה בעבר מבני הלימפה בתום לב בתוך המוח 4 הובילו לרעיון של GBM חיסוני כחסוי. עם זאת, מחקרים רבים עכשיו sho w שסרטן המוח אלה אכן לעורר הגיוס של תאים חיסוניים היקפיים שהם בעיקר מיאלואידית במקור הכוללים מונוציטים, מקרופאגים, ותאי שמקורם מיאלואידית המדכאים (MDSCs) 5. GBM גם משפיע על הפעילות של מיקרוגליה מוח-התושב להפוך פרו-סרטני 6,7. תאי הלימפה כגון תאי CD8 + T 8 ותאים + רוצח טבעי CD56 9 נמצאים גם בתוך מייקרו-הסביבה של הגידול, אבל בהרבה פחות מספרים, למעשה חשבו להיות בשל תפקוד לדיכוי מערכת החיסון ביוזמת גורמים שמקורם בגליומה במקרופאגים גידול קשור ( שירות רפואי לנוער) 10. תאי CD4 + T נמצאים גם בGBM, אבל הרבה של אוכלוסייה זו מבטא גם CD25 וFoxP3, מקבלי של דיכוי המערכת החיסונית (T reg) רגולציה תאים T 11. המדינה מדכאות את מערכת החיסון הכוללת של GBM מגיע לשיאו בקידום בריחה החיסונית והתקדמות גידול 12.
= "Jove_content"> הבנה טובה יותר של המנגנונים של דיכוי חיסוני GBM היא קריטית לפיתוח אסטרטגיות טיפול חיסוניים יעילות שנועדו לעורר את המערכת החיסונית נגד הגידול. במהלך 15 השנים האחרונות במעבדה שלנו עבדה כדי להתגבר על המנגנונים של immunosuppresson גידול במוח על מנת לפתח immunotherapeutics אנטי GBM החדש היעיל 13-19. שיאו של עבודה זו הובילה כעת לניסוי קליני שנועד להעריך ציטוטוקסיות בשילוב וטיפולי חיסוני גירוי בחולים עם (מזהה ClinicalTrials.gov: NCT01811992) שאובחן לאחרונה GBM.
העבודה האחרונה שלנו מראה כי מערכת העצבים המרכזית-1 תאי GBM GL26 העכבר והחולדה לחסום מעקב חיסוני תא NK אנטי-סרטני על ידי ייצור כמויות גדולות של קטיני β-מחייב galactoside galectin-1 (גל-1) 20. זה הודגם על ידי דיכוי הביטוי של גל-1 בתאי גליומה באמצעות מציאה גן בתיווך shRNA. במבחנה experimenTS הראה כי תאי גליומה גל-1-חסר התרבו בדרך כלל בתרבות, עדיין עבר דחייה מהירה מייד לאחר קליטתם תוך גולגולת לתוך C57BL / 6J או RAG1 syngeneic - / - עכברים, וכך לבסס את עצמאותה של טי או B- תאים בצורה זו של דחיית גידול. immunodepletion תא NK עם אנטי-asialo GM 1 אנטי-סרום או נוגדנים חד שבטיים NK1.1 הובילו לשיקום צמיחת גליומה גל-1-לקויה תוך גולגולת השלם, הקמת התפקיד של תאי NK בגל-1-לקוי דחיית גליומה. אנו מציגים כעת immunodepletion שתאי מיאלואידית Gr-1 + / CD11b + מספיק כדי למנוע דחיית גליומה גל-1-לקוי למרות נוכחותם של תאי NK, ובכך חושף את תפקיד עזר הכרחי לתאי מיאלואידית שבמסייעת לגל של תיווך NK תמוגה -1 הלקויה גידול (נתונים שלא פורסמו). תוצאה בלתי צפויה זה הובילה אותנו לפתח פרוטוקול מקיף לבידוד והניתוח של תאי הדם היקפיים mononuclear (PBMCs) שלחדור מייקרו-סביבת גידול במוח מייד לאחר קליטתם תוך גולגולתי, כך שנוכל לאפיין טוב יותר את אירועי חדירה חיסוניים שלבסס דחיית גליומה גל-1-חסר.
השיטה הוכיחה כאן על ידי שימוש בתאי גליומה GL26 עכבר שחלבון mCitrine constitutively המפורש ניאון, נקרא GL26-Cit, המאפשרים הדמיה תאים סרטניים ישירה על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי 21. תאים אלה engrafted stereotactically לתוך המוח של עכברי C57BL / 6J syngeneic ומותרים לגדול במשך 24, 48, או 72 שעות לפני המתת חסד עכבר. אז PBMCs הסתננות-גליומה מבודדים וimmunolabeled באמצעות -CD45 אנטי, -Gr-1, -CD11b ו-NK1.1 נוגדנים פני תא יחד עם immunolabeling תאיים לgranzyme B (GzmB). השילוב הספציפי הזה של נוגדנים מאפשר זיהוי של Gr-1 + / CD11b + תאי מיאלואידית חדירת גידול וNK1.1 +, תאי NK, סוגי תאים יש לנו בeen מעורב בדחיית גידול גל-1-חסר. פרופיל החדירה החיסונית של גליומה GL26-Cit גל-1-חסר, המכונה כאן GL26-Cit-gal1i, לעומת אז לזה של גליומות להביע רמות נורמליות של בשם GL26-Cit-NT גל-1 המכילות אי מיקוד סיכת ראש shRNA שליטה. הפרוטוקול מתחיל בתיאור על איך תרבות תאי גליומה GL26-Cit במבחנה, ואחריו הסבר על איך נקלט orthotopically תאים אלה לסטריאטום של C57BL / 6J syngeneic. לאחר מכן הוא ממשיך למנות את השלבים כרוכים בבידוד וimmunolabeling של PBMCs הסתננות-גליומה לניתוח התזרים cytometric. הפרוטוקול מסתיים בהסבר של ניתוח נתונים סטנדרטי וייצוג גרפי.
ההפגנה מגלה כי שני Gr-1 + / CD11b + תאי מיאלואידית ותאי NK NK1.1 + מעדיפים לצבור בתוך מייקרו-סביבת גידול במוח גל-1-לקוי בתוך 48שעות של השתלת גידול, תוצאה אשר מסייעת להסביר מדוע גידולים אלה במהירות לעבור תמוגה גידול המלאה engraftment הודעה גידול-כ 1 שבוע 20. השיטה היא להתאמה בקלות למספר עיצובים ניסיוניים שונים בvivo שבו נתונים זמניים על חדירת חיסון לתוך המוח נדרש. בניסויים בודדים יכולים לבצע את הפרוטוקול מקצירת המוח לזרום ניתוח cytometric של PBMCs הסתננות-גליומה בכ 4-6 שעות, תלוי במספר דגימות להיות מנותח. השיטה גם עשויה להיות משולבת עם ניסויים שמטרה לאפיין את הפרופיל של מחזורי PBMCs בעכברי נושאי גידול להשוואה עם אלה שלחדור למוח כל כך לזהות פנוטיפים דיכוי חיסוני הנגרמים במיוחד על ידי מייקרו-הסביבה של הגידול. יישום של שיטות וזה דומה צריך להקל הבנה טובה יותר של הגורמים מעורבים בסחר בתאים חיסוניים ההיקפיים למייקרו-סביבת גידול במוח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: אנא בדוק את כל הפרוטוקול לפני ביצוע ניסויים. אישור לשימוש בבעלי חיים בעלי חוליות מהוועדה המוסדית המתאימה לשימוש ולרווחתם של בעלי חיים יש לקבל לפני ההליך.
1. הכנה של תאים סרטניים לתוך הגולגולת engraftment
- עבודה בארון בטיחות ביולוגית ברמה השנייה, להתחיל על ידי הכנת GL26-Cit-NT תקשורת תרבות תא / gal1i ידי השלמת בקבוק 500 מיליליטר של הנשר בינוני השתנה Dulbecco (DMEM) עם 10% בסרום שור עוברי חום מומת-מסונן סטרילי (FBS ), L- גלוטמין 2 מ"מ, 100 U / פניצילין מיליליטר, 100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין, 600 מיקרוגרם / מיליליטר סולפט G418 (לבחירה של וקטור ביטוי mCitrine) ו -3 מיקרוגרם / מיליליטר של dihydrochloride puromycin (לבחירה של אי מיקוד או shRNAs גל-1-ספציפי).
- (איור 1 א תרבות GL26-Cit-NT ו / או תאי GL26-Cit-gal1i ו1B 2 במשך 1-2 ימים לפני הליך קליטתם גידול או עד צלוחיות להגיע 50-80% confluency.
- ביום של ניתוח, להסיר את התקשורת ותרבות תא מתאי גליומה בעזרת פיפטה 10 מיליליטר סרולוגית ואקדח פיפטה וזורקים את התקשורת לתוך כוס פסולת.
- הפוך את הבקבוק העליון בצד למטה ולהוסיף 10 מיליליטר של DPBS ללמעלה מהבקבוק בעזרת פיפטה 10 מיליליטר סרולוגית. לאט לאט להפוך את הבקבוק כדי לכסות את התאים בDPBS, אז להטות את הבקבוק בצורה אנכית ולהסיר ולסלק DPBS לתוך כוס פסולת.
- להוסיף 3-4 מיליליטר של חלופה שאינה יונקים טריפסין בDPBS עם EDTA (ראה רשימת חומרים לפרטים נוספים) לכל בקבוק בתרבית רקמת T75 ולמקם בחזרה לארון תרבית הרקמה במשך 2-5 דקות. באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר, לבדוק שכל התאים התנתקו מהמשטח התחתון לפני שתמשיך.
- לעכב מעיל-הפרווהפעילות האנזימטית r על ידי דילול חלופי טריפסין עם 6 מיליליטר של DPBS. פיפטה למעלה ולמטה באמצעות פיפטה 10 מיליליטר סרולוגית כדי לשטוף את המשטח התחתון של הבקבוק וכדי לנתק באופן מכאני כל אגרגטים סלולריים. לשאוב את התאים ואת המקום ל -15 מיליליטר צינורות צנטריפוגה שכותרתו בהתאמה. ספין התאים למטה ב 550 XG (מקסימום RCF) במשך 5 דקות ב 4 ° C (איור 1 ג).
- הסר את supernatant ועדינות resuspend התאים עם 1 מיליליטר של DMEM-בתוספת של האו"ם. הקפד פיפטה התאים למעלה ולמטה ביסודיות עם micropipette P-1000 להשיג השעיה תא בודדת.
- הפוך דילול 1:10 של ההשעיה התא כתוצאה נוצרה ב1.6 על ידי הצבת 18 μl של DMEM-בתוספת של האו"ם לmicrotube פוליפרופילן 0.6 מיליליטר חרוטי ואחריו התוספת של 2 μl של ההשעיה התא הסרטני. פיפטה למעלה ולמטה באמצעות P-10 micropipette לhomogenize התאים ביסודיות.
- הוסף 10 μl ו# 160; של דילול תא 01:10 גידול שנוצר ב1.7 לmicrotube פוליפרופילן חרוטי 0.6 מיליליטר נפרד, ולאחר מכן להוסיף 10 μl של כתם הכחול Trypan לצינור. לערבב ביסודיות עם P-10 micropipette ולהוסיף 10 μl של / הפתרון הכחול התאים סרטניים כתוצאה Trypan תחת להחליק את מכסה זכוכית מונח על גבי hemocytometer נזהרת שלא להכניס בועות אוויר (איור 1D).
- ספירת התאים עם מיקרוסקופ שדה בהיר באמצעות מטרת 10X לפי הפרוטוקול הספציפי הקשורות לhemocytometer נתון. הקפד גורם בדילול פי 20 מהשעית תא גידול המקורית שנעשתה במהלך תקופת ההכנה של התאים להערכה מדויקת של תאים בaliquot 1 מיליליטר המקורי. השתמש בנוסחא הבאה כדי לחשב את המספר הכולל של תאים: תאים בסך הכל / מיליליטר = [((Σcells נספר לכל מ"ר) / # של ריבועים נספרו) x 20 (כלומר, גורם לדילול) x 10,000 תאים / מיליליטר].
- לאחר דetermining המספר הכולל של תאים לשורה תאים כל שימוש בניסוי נתון, ספין אותם ב 550 XG (מקסימום RCF) במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס. הסר את supernatant (ים) ו resuspend תאים עם נפח מתאים של DMEM-בתוספת של האו"ם כדי להשיג ריכוז יעד של 3 x 10 4 תאים לכל 1 μl עבור כל קו תא על פי הנוסחא הבאה: (# כולל של תאים / 30,000).
- הנח היקף שווה ערך של כל שורת תא לתוך צינורות שכותרתו בהתאמה 0.6 מיליליטר חרוטי פוליפרופילן ומניחים על קרח (איור 1E). הקפד לשמור כמה תאים להמשיך הפצת כל שורת תא אם T75s הנפרד לא נזרע בעבר.
2. נוהל לקליטתם של תאי stereotactic Glioma לסטריאטום של C57BL עכברים / 6J
- הכן עובד פתרונות של הרדמה כירורגית, שיכוך כאבים, והיפוך הרדמה לפני הניתוח כדלקמן:
- לקטמין / s dexmedetomidineההרדמה urgical: להסיר 1.4 מיליליטר מבקבוקון 10 מיליליטר של 0.9% NaCl הזרקת סטרילי ולהחליף עם 600 μl של 100 מ"ג / מיליליטר פתרון מניות של קטמין הידרוכלוריד 800 μl של 0.5 מ"ג / מיליליטר פתרון מניות של hydrochloride dexmedetomidine להניב פתרון עובד מעורב של קטמין הידרוכלוריד (6 מ"ג / מיליליטר) וhydrochloride dexmedetomidine (0.04 מ"ג / מיליליטר).
- לשיכוך כאבים עצירות: להסיר 1 מיליליטר מבקבוקון 10 מיליליטר של 0.9% NaCl הזרקת סטרילי ולהחליף עם כל נפח 1 מיליליטר של 0.3 מ"ג / ampul hydrochloride עצירות מניית מיליליטר יחיד להניב / מיליליטר פתרון עובד 0.03 מ"ג.
- להיפוך הרדמה כירורגית atipamezole: להסיר 1 מיליליטר מבקבוקון 10 מיליליטר של 0.9% NaCl הזרקת סטרילי ולהחליף עם 1 מיליליטר של 5 מ"ג / מיליליטר פתרון מניות של hydrochloride atipamezole להניב / מיליליטר פתרון עובד 0.5 מ"ג.
- עבודה במיקום שאושר להישרדות עכבר שלurgery, תתחיל בהגדרת מכשירי ניתוח autoclaved או חרוז מעוקר וחומרים כימיים אחרים, כפי שמוצג ב( איור 2 א), ואז לקבל מספיק C57BL / 6J נקבת 8-10 שבועות בן (syngeneic עם גליומה GL26) הנדרש למחקר; להבטיח גישה הרציפה למזון ולמים.
- להרדים את העכבר הראשון עם זריקת intraperitoneal יחיד (IP) של פתרון ההרדמה עובד על ידי מתן מינון של 75 מ"ג / קילוגרם קטמין ו 0.5 מ"ג / קילוגרם dexmedetomidine (כ -250 μl לעכבר 20 ז). בשלב הבא, לתת 5 מ"ג הזרקה / קילוגרם תת עורית (SC) של carprofen (כ -100 μl לעכבר 20 ז). ודא שהעכבר הוא לא מגיב לצובט הבוהן וזנב לפני שתמשיך.
- באמצעות קוצץ כירורגית, לגלח את הפרווה מהגולגולת. החל תמיסת חיטוי povidone- יוד לאזור המגולח, לשפשף עם 70% משטח הכנת אלכוהול איזופרופיל, אז להירשם מחדש תמיסת חיטוי povidone- יוד. לאחר מכן, למרוח כמות קטנה של Sterile וזלין משחת עיניים לכל עין כדי למנוע התייבשות.
- אבטח את הגולגולת במסגרת stereotactic לפי הפרוטוקול הבא:
- לפתוח בזהירות את הפה על ידי לכת בעם זוג מלקחיים מעוקלים לנתח למשוך בעדינות את הלשון ולעבור לצד אחד של הפה כדי למנוע חנק. לאפשר המלקחיים כדי לחזור בזמן בפה כדי להפיץ את הלסת פתוחה ולהנחות את שתי שיניים חותכות העליונה לחור המנעול של בר שן במסגרת stereotactic. Secure בר שן מציר אופקי או אנכי על ידי התאמת הברגים המתאימים. ודא שהגולגולת של העכבר היא רמה עם ראש הספסל.
- מניחים את הברים האוזן מאובטחת נגד עצמות postorbital של נזהרת שלא להחיל יותר מדי לחץ פנימה בגולגולת כדי למנוע ריסוק הגולגולת.
- הנח את סרגל האף מעל החוטם ובורג למטה עד נוח. בדוק שאין תנועה אנכית / לרוחב בראשו על ידי הפעלת לחץ עדיןעם אגודל ואצבע מורה. עכבר ממוקם כראוי למסגרת stereotactic מוצג ב( איור 2).
- באמצעות סכין אזמל, לעשות חתך קו האמצע סנטימטר 1 מעל הגולגולת מהעצם הקדמי לעצם העורפי. לחזור העור בחתך באמצעות מפשקי Colibri.
- מנמיכים את מזרק microliter מצויד במחט 33 G מחוברת לזרוע האנכית של מסגרת stereotactic ישירות מעל העמדה של גבחת (איור 2 ג). משם, להתאים את המיקום של AP מ"מ מחט 0.5, 2.5 מ"מ ML להגיע לאתר היעד להשתלת גידול. השתמש במזרק טוברקולין 1 מיליליטר מצויד במחט G 26 לציון מיקום זה בעדינות על ידי נוזף periosteum.
- לקדוח חור בגולגולת באתר היעד עד שמגיע למאטר הדורה הבסיסי באמצעות מקדח כוח הדיוק אלחוטי מצויד עם קצת 1/32 "(0.8 מ"מ). בעוד קידוח, להפעיל לחץ לסירוגין אחרי הסרת DRIll קצת מפני שטח של הגולגולת כדי למנוע חום גבוה וכוח שאחרת עשויה להוביל למקדח ניקוב רקמת המוח הבסיסית.
- לשטוף את מזרק microliter עם 0.9% NaCl בmicrotube פוליפרופילן חרוטי 1.7 מיליליטר, כדי להבטיח שהמחט אינה סתומה. בעדינות קפיצית microtube פוליפרופילן 0.6 מיליליטר חרוטי המכילים תאים הסרטניים מספר פעמים לresuspend התאים.
- צייר את 2 μl של תאים לתוך מזרק microliter להבטיח כי אין בועות אוויר הציגו לתוך המזרק. לוותר על 1 μl של התאים על 70% משטח הכנת אלכוהול איזופרופיל עוזב μl בדיוק 1 של תאים סרטניים שנותרו במזרק.
- להביא את המחט עד שהוא נוגע מאטר הדורה, אז להציג את המחט לתוך המוח -3.5 מ"מ ventrally ולחזור על ידי 0.5 מ"מ. לאט ובצורה חלקה לספק את התאים על ידי לחיצה על בוכנת המזרק במהלך 1-2 דקות.
- לאפשר לתאים settlדואר באתר ההזרקה במשך 5 דקות לפני נסיגת המחט לאט. נגב כל דם קרוש או עניין מוח מקצה המחט עם 70% משטח הכנת אלכוהול איזופרופיל נקי. יש לשטוף את המחט ומזרק ביסודיות עם 0.9% NaCl מצעד 2.6 כדי להבטיח שהמחט אינה סתומה לזריקה הבאה.
- הסר את מפשקי Colibri ותפרת את הקרקפת באמצעות שלושה תפרים 3-0 monofilament הניילון. הסר את העכבר מהמסגרת stereotactic ולנהל 0.1 מ"ג / קילוגרם של עצירות hydrochloride תת עורי (SC) (כ 67 μl של 0.03 מ"ג / מיליליטר הפתרון עובד לעכבר 20 ז) ואחריו 2.5 מ"ג / קילוגרם atipamezole hydrochloride שריר (IM) (כ 100 μl של 0.5 מ"ג פתרון / מיליליטר עובד לעכבר 20 ז) להקלה על כאב לאחר ניתוח והיפוך הרדמה. מניחים עכברים לאחר ניתוח חזרה לכלובים שלהם תחת מנורת חימום להתאושש.
3. העכבר Transcardial Perfusיון וקצירה של המוח
- הכן הפתרון של Tyrode heparinized לפי הפרוטוקול הבא:
- שים בר ערבוב מגנטי לתוך בקבוק אחסון הבורג מכסה זכוכית 1 ליטר ולמלא נפח עם מים ultrapure deionized. מניחים את הבקבוק על צלחת ערבוב.
- לשקול ולהוסיף הכימיקלים הבאים לבקבוק הזכוכית תוך ערבוב: נתרן כלורי 8 גרם (NaCl), סידן כלורי 0.264 גרם (CaCl 2 • 2H 2 O), monobasic פוספט נתרן 0.05 g (אא 2 4 • 2H 2 O PO), D-גלוקוז (C 6 H 12 O 6), ביקרבונט 1.0 גרם 1.0 גרם נתרן (NaHCO 3), 0.2 גר 'אשלגן כלורי (KCl). לאפשר מלחים לפזר, ולאחר מכן להוסיף 100 μl של פתרון מניות 1,000U / מיליליטר של נתרן הפרין לפתרון של Tyrode.
- הסר את המכל מצלחת ערבוב ולחלץ את בר ערבוב באמצעות שרביט מגנטי. אחסן פתרון heparinized של Tyrode ב 4מעלות צלזיוס.
- הכן פתרון עובד עבור הרדמה מסוף כדלקמן:
- להרדמת מסוף קטמין / xylazine: להסיר 1,360 μl מבקבוקון 10 מיליליטר של 0.9% NaCl הזרקת סטרילי ולהחליף עם 1,200 μl של 100 מ"ג / מיליליטר פתרון מניות של קטמין הידרוכלוריד ו -160 μl של 100 מ"ג / מיליליטר פתרון מניות של xylazine הידרוכלוריד להניב פתרון עובד מעורב של קטמין הידרוכלוריד (מ"ג 12 / מיליליטר) וhydrochloride xylazine (1.6 מ"ג / מיליליטר).
- הכן פתרון תמהיל תקשורת צנטריפוגה צפיפות על ידי הצבת 90 מיליליטר של 10x PBS לתוך 264 מיליליטר של המים ultrapure deionized (3.93x) במכל פלסטיק סטרילי. לכיל ל- pH 7.0-7.2 עם HCl ולסנן לעקר דרך פילטר 0.22 מיקרומטר. חנות ב 4 מעלות צלזיוס.
- הכן 70% תקשורת צנטריפוגה צפיפות על ידי שילוב של 18 מיליליטר של תמיסת תערובת תקשורת צנטריפוגה צפיפות עם 30 מיליליטר של תקשורת צנטריפוגה הצפיפות (ראה רשימת חומריםלפרטים נוספים) בצינור צנטריפוגות פוליפרופילן 50 מיליליטר. חנות ב 4 מעלות צלזיוס, אבל להביא לRT לפני השימוש.
- הכן 37% תקשורת צנטריפוגה צפיפות על ידי שילוב של 9.6 מיליליטר של DPBS עם 10.4 מיליליטר 70% תקשורת צנטריפוגה צפיפות בצינור צנטריפוגות 50 מיליליטר. חנות ב 4 מעלות צלזיוס, אבל להביא לRT לפני השימוש.
- הכן זרימת חיץ על ידי הצבת 500 μl של FBS לתוך 50 מיליליטר של DPBS (~ 1% FBS) בצינור צנטריפוגות 50 מיליליטר. אחסן בחנות על 4 מעלות צלזיוס
- מלא קרח פוליאוריטן דלי 4.5 L לקיבולת עם קוביות קרח.
- הפוך פתרון משולב של 1 מ"ג / מיליליטר collagenase ו1 מ"ג / מיליליטר DNase-אני בכמות מספקת ל1 מיליליטר לדגימה מוח במחקר על ידי דילול 10 מ"ג / מיליליטר פתרון DNase-אני מניית 01:10 ומ"ג 50 / פתרון מניות collagenase מיליליטר 1:50 DPBS סטרילי בצינור צנטריפוגות פוליפרופילן 15 מיליליטר אחד. לערבב בעדינות את הפתרון על ידי pipetting למעלה ולמטה עם micropipette P-1000. אחסן על קרח בpolyurethדלי Ane מצעד 3.7.
- להשיג שתי מטחנות רקמות Dounce זכוכית 7 מיליליטר. תווית אחת "NT" ואחר "gal1i". מניחים את מטחנות רקמות בדלי הקרח ולהוסיף 1 מיליליטר של DPBS לכל אחד.
- להשיג צינורות 15 מיליליטר צנטריפוגות מספיק כדי לאסוף חומר מוח מכל עכבר במחקר והמקום בדלי הקרח.
- מקום ~ 150 מיליליטר של DPBS בין שלושה צינורות 50 מיליליטר צנטריפוגות לתוך דלי הקרח.
- להשיג מנות מספיק משושה קלקר במשקל (קוטר הפנימי העליון (ID) 115 מ"מ, 85 מ"מ ID בסיס, 203 מיליליטר נפח) לכל עכבר במחקר. להגדיר המלא לנתיחה וטחינה דקה של מוח עכבר מוצג ב( איור 3 א)
- בנקודות זמן שנבחרו, להרדים את עכבר גידול נושאות הראשון במחקר באמצעות הזרקת IP יחידה של 150 מ"ג / קילוגרם של קטמין הידרוכלוריד ו -20 מ"ג / hydrochloride xylazine קילוגרם (כ -250 μl של מ"ג 12 / קטמין מיליליטר בשילוב / 1.6 מ 'g / מיליליטר xylazine עובד פתרון לעכבר 20 ז) כדי לגרום להרדמה עמוקה. ודא שהעכבר הוא לא תגובה לצובט הבוהן וזנב לפני שתמשיך.
- אחזר את הפתרון של Tyrode הכין בעבר ומניח לזרימה למינרית מוקדשת לניתוחים בבעלי החיים מסוף. מניחים צינור פולימרים בלתי חדיר גז המחובר למכל carbogen לפתרון של Tyrode. פתח את שסתום הטנק כדי לאפשר 95% 2/5% CO 2 O carbogen ברציפות בועה לפתרון.
- צרף מחט קהה 20 רכזת אלומיניום G לסוף צינור פולימרים בלתי חדיר גז נוסף המצורף למשאבת peristaltic. מניחים את הצינור בקצה השני של משאבת peristaltic לפתרון של Tyrode ולהפוך את המשאבה על מנת לאפשר לצינורות למלא עם הפתרון של Tyrode מחומצן וheparinized. הקים עבור זלוף transcardial העכבר מוצג ב( איור 3).
- באמצעות ארבעה 26 מחטי G, להצמידבצד העכבר הרדים הגחון על ידי החזית ורגליו אחוריות בגוש קצף פוליסטירן extruded המכוסה במגבת סופגת רשות בזרימה למינרית.
- לתפוס את העור מעל חלל הצפק באמצעות זוג המלקחיים נתיחה בוטים, ובעזרת זוג מספריים גדול לנתיחה לעשות חתך "Y" על ידי חדירה לקיר הבטן, חיתוך cephalically לנקב את הסרעפת, ואז מתפצל בחזה לסיים ב השחי ימין ועל השמאל.
- השתמש hemostat כדי לצבוט את עצם החזה ומשקפים את כלוב צלעות על הכתף השמאלית של העכבר. הסר את קרום הלב עם זוג מלקחיים לנתיחה בוטים.
- הפעל את משאבת peristaltic להתחיל לטפטף יציב של הפתרון של Tyrode מחומצן וheparinized (בערך 2.3-2.5 מיליליטר / דקה).
- הכנס את המחט הקהה לתוך החדר השמאלי של הלב. השתמש במספריים קטנים לנתיחה כדי לגזור אטריום הזכות לאפשר לexsanguination (איור3 ג).
- לאפשר הפתרון של Tyrode לינקב ביסודיות מערכת דם עכבר עד הכבד והריאות שהחווירו בשל חוסר הדם לגמרי. ודא שאין סכומי ברוטו של דם ימשיכו לצאת אטריום ימין לפני הסרת המחט קהה 20 רכזת אלומיניום G מהחדר השמאלי.
- להוציא סיכה העכבר מגוש קצף פוליסטירן extruded ולהנמיך את צד הגחון העכבר. בעזרת זוג מספריים גדול לנתיחה, להפריד את הראש משאר הגוף ברמה של הצוואר.
- באמצעות מספריים קטנים לנתיחה, לחתוך את הקרקפת בקו האמצע מתחיל בעצמות העורפיות עובדות קדימה לכיוון החרטום כדי לחשוף את הגולגולת.
- לחזור העור בשני הצדדים של הגולגולת באמצעות אגודל ואצבע והחזק את הגולגולת באופן מאובטח. השתמש זוג rongeurs העצם לפרוץ את הגולגולת מתחילה בעצמות העורפיות ולעבוד קדימה כדי לחשוף את הגב ורוחב לחלוטיןמשטחים של המוח. להיות זהיר כדי למזער את הנזק למוח.
- ברגע שעצמות הגולגולת הוסרו, להפוך את הראש של צד גחון העכבר ולהשתמש במספריים קטנים לנתיחה כדי לחתוך את עצבי גולגולת בבסיס המוח כדי לשחרר אותו מהגולגולת.
4. בידוד של PBMCs הסתננות-Glioma
- באמצעות סכין גילוח נקי להב אחד, לבודד את האזור במוח המכיל את הגידול על ידי ביצוע חתך sagittal את מרכז המוח ללחצות שתי ההמיספרות. הפעל הצד המדיאלי חצי כדור ipsilateral למטה ולעשות שני חתכי העטרה ברמות של המוח הקטן ונורת חוש הריח כדי לבודד את רקמת המטרה המכילה את שתל הגידול (איור 4 א). חלק מקביל של האונה הנגדית עשוי גם להיות מבודד ומשמש כביקורת שלילית.
- הנח את רקמת היעד למטחנת שכותרתו בהתאמה זכוכית Dounce רקמה המכילה 1 מיליליטר; של DPBS, לדחוף את הבוכנה כל הדרך למטה וטוויסט 7 פעמים בתחילה לשבש את הרקמה. הרם את הבוכנה כדי לאפשר לנוזלים להתיישב בחזרה לתחתית מטחנת הרקמה. חזור על פעולה זו שלוש פעמים; עם זאת רק לסובב את הבוכנה 4 פעמים במהלך שתי החזרות הבאות ו -3 פעמים במהלך חוזר האחרון, כדי למנוע מעל triturating הרקמה.
- באמצעות micropipette P-1000, ברצף ליישם שלושה כרכים 1 מיליליטר של DPBS קר כקרח (שהוכן ב3.11) בצדי הבוכנה לשטוף לתוך מטחנת הרקמה.
- Resuspend עניין המוח, נכתש על ידי pipetting למעלה ולמטה ומקום לתוך צינור 15 מיליליטר צנטריפוגות שכותרתו על קרח. יש לשטוף את הצדדים של מטחנת רקמת Dounce עם 1 מיליליטר נוסף של DPBS קר כקרח ולהוסיף לאותו צינור צנטריפוגות 15 מיליליטר. שמור את כל הצינורות המכילים חומר מוח, נכתש על קרח עד שכל הדגימות עובדו.
- חזור על שלבים 3.13-3.25 ו4.1-4.4 לכל עכבר במחקר.
- ברגע שכל חה הדגימותיש עובדו, ספין למטה עניין המוח, נכתש בצינורות 15 מיליליטר צנטריפוגות ב 740 XG (מקסימום RCF) במשך 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
- הסר את supernatant עם אקדח פיפטה ופיפטה 10 מיליליטר סרולוגית וresuspend עניין מוח pelleted ב 1 מיליליטר של collagenase / הכין בעבר DNase-אני אנזימי עיכול באמצעות P-1000. מניחים את 15 מיליליטר צינורות צנטריפוגה למדף מבחנה ומקום באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
- בעדינות להתסיס את הדגימות פעמיים לאורך כל תקופת הדגירה על ידי מצליף הצינורות כדי להקל disaggregation רקמה.
- הוסף 6 מיליליטר של DPBS קר כקרח בעזרת פיפטה 10 מיליליטר סרולוגית לכל צינור לדלל את אנזימי העיכול. פיפטה למעלה ולמטה כדי גלול, ולסנן את הנפח הכולל דרך מסנני רשת ניילון 70 מיקרומטר סטרילי לתוך צינורות 15 מיליליטר צנטריפוגות כותרת חדש על קרח.
- ספין ההשעיה תא המוח כלפי מטה ב740 XG (מקסימום RCF) במשך 20 דקות ב 4 ° C כדי להשיגגלולה תא בודדת (איור 4). לאחר הסרת 15 מיליליטר הצינורות מצנטריפוגות למקם אותם על קרח ולהגדיל את טמפרטורת ההגדרה בצנטריפוגה לכ -21 מעלות צלזיוס בהכנה לשלב הבא.
- באופן מלא להסיר את supernatant מצינור אחד המכיל תאי מוח ותחילה resuspend את כדורים ב 1 מיליליטר של 70% תקשורת צנטריפוגה צפיפות באמצעות micropipette P-1000. לאחר מכן להוסיף 4 מיליליטר נוסף של תקשורת צנטריפוגה צפיפות 70% לכל צינור בעזרת פיפטה 10 מיליליטר סרולוגית. לדפוק את הכובעים על אופן מאובטח וhomogenize ההשעיה התא בעדינות על ידי היפוך צינורות כמה פעמים.
- הסר את 15 מיליליטר צינורות צנטריפוגה המכילים תאי מוח resuspended ב -70% תקשורת צנטריפוגה צפיפות מקרח, ומקום במדף מבחנה ב RT. אחד בכל פעם, כיסוי בזהירות 2 מיליליטר של 37% פתרון תקשורת צנטריפוגה צפיפות על 5 מיליליטר של 70% תקשורת צנטריפוגה צפיפות עם micropipette P-1000 ליצירת ACממשק רזה בין שתי שכבות תקשורת צנטריפוגה הצפיפות (איור 4C).
- השתמש בסמן שקצהו קנס כדי לציין את המיקום של הממשק כך שהוא יכול להיות מזוהה בקלות לאחר צנטריפוגה, כאשר ההבחנה הופכת להיות פחות נראית לעין.
- ספין למטה 15 מיליליטר צינורות צנטריפוגות ב 740 XG (מקסימום RCF) במשך 20 דקות ב RT ללא הפסקה כדי למנוע שיבוש הממשק.
- לאחר צנטריפוגה, לאסוף את PBMCs שהצטבר בממשק שבין שתי שכבות תקשורת צנטריפוגה הצפיפות (איור 4D) על ידי החדרת micropipette P-200 לתוך הצינור לאורך הצד שלה, תוך עקיפת שכבת השומנים בזהירות.
- פעם אחת ברמה של להקת PBMC, לחלץ לאט 200 μl מפני שטח של 70% שכבת תקשורת צנטריפוגה הצפיפות ומקום לתוך צינור FACS פוליפרופילן שכותרתו בהתאמה על קרח. חזור פעם אחת להיקף כולל של 400 μl לדגימה.
- להוסיף 3 מיליליטר של חיץ זרימה לכל צינור FACS המכיל 400 μl של PBMCs לדלל מספיק תקשורת צנטריפוגה הצפיפות, אז לסובב את התאים מטה ב660 XG (מקסימום RCF) במשך 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
5. immunolabeling של PBMCs הסתננות-Glioma
- לפני ניתוח כל דגימות PBMC ניסיוניות, לבצע ניסוי בודד, עצמאי, תא שטח שליטת אלוטיפ להקים שערי בסיס להיות מזוהה עם קבוצה של מתח PMT קבוע בתוך תבנית ניתוח נתוני הזרימה cytometric המוקדשת להערכה של PBMCs הסתננות-פי גליומה לפרוטוקול הבא:
- נקלט עכבר / 6J C57BL אחד עם GL26-Cit-gal1i ועוד עם GL26-Cit-NT פי ההליך המתואר בסעיף 2. לאחר 72 שעות של צמיחת גידול, להרדים שני העכברים ולבודד את PBMCs חדירת הגידול בהתאם לנהלים התווה לאורך סעיפים 3 ו -4.
- לשלב את שתי דגימות PBMC (NTND gal1i) לכרך אחד (כלומר, 100 μl), ולאחר מכן עוד לחלק את המדגם באופן שווה בין שלושה צינורות FACS (כלומר, NK1 33.3 μl לכל צינור) שכותרתו "אלוטיפ CD45", "Gr-1 אלוטיפ / CD11b", ו". אלוטיפ 1 ". הוסף את הנוגדנים הבאים (כל אחד ב1: 100 דילול ובדילול להיקף כולל של 200 μl בזרימת חיץ) לצינורות FACS שכותרתו בהתאמה: "אלוטיפ CD45": עכברוש אלקסה פלואוריד 700 מצומדות- IgG2b, κ (שיבוט: RTK4530 ); "אלוטיפ Gr-1 / CD11b": אנטי העכבר CD45 (שיבוט עכברוש 700 מצומדות- אלקסה פלואוריד: 30-F11), החולדה PE-מצומדות IgG2b, κ (שיבוט: eB149 / 10H5), וPerCP / Cy5.5 IgG2b עכברוש -conjugated, κ (שיבוט: RTK4530); "אלוטיפ NK1.1": עכברוש 700 מצומדות- אלקסה פלואוריד אנטי העכבר CD45 (שיבוט: 30-F11), PE-מצומדות עכברוש אנטי עכבר Gr-1 (שיבוט: RB6-8C5), PerCP / עכברוש Cy5.5 מצומדות- אנטי העכבר CD11b (שיבוט: M1 / 70), וAPC-conjugated עכבר IgG2a, κ (שיבוט: eBM2a).
- לאפשר PBMCs לimmunolabel על קרח בחושך במשך 20 דקות. קפיצי צינורות פעם באמצע תקופת הדגירה לערבב בעדינות. לשטוף עם 1 מיליליטר של חיץ זרימה, ספין למטה ב660 XG (מקסימום RCF) במשך 10 דקות ב 4 ° C ו resuspend כל צינור FACS המכיל PBMCs עם 200 μl של זרימת חיץ.
- באמצעות cytometer זרימה מצויד בנחיר משולב 85 מיקרומטר, לנתח את הצינור "אלוטיפ CD45" ראשון להקמת שער מרווח בסיס CD45. לאחר מכן, להפעיל את הצינור "אלוטיפ Gr-1 / CD11b" להקים בסיס שער הרבע Gr-1 / CD11b רק באמצעות CD45 + תאים אמיתיים כקלט. לבסוף, להפעיל את הצינור "אלוטיפ NK1.1" להקים שער מרווח NK1.1 בסיס רק באמצעות CD45 האמיתי / Gr-1 + תאים נמוכים / CD11b +/- כקלט.
- השתמש בהליך הבא לכל הניסיון העתידיalysis:
- הפוך כמות מספקת של 1: נוגדני תא שטח 100 דילול בזרימת חיץ כדי להשיג 200 μl נפח לדגימה (בתוספת 1 לאלוטיפ GzmB): חולדה 700 מצומדות- אלקסה פלואוריד אנטי העכבר CD45 (שיבוט: 30-F11 ), חולדה PE מצומדות אנטי עכבר Gr-1 (שיבוט: RB6-8C5), החולדה PerCP / Cy5.5 מצומדות- אנטי העכבר CD11b (שיבוט: M1 / 70), אנטי עכבר NK1.1 עכבר APC-מצומדות (שיבוט: PK136).
- מוציא בזהירות את supernatant של PBMCs הסתחרר מטה מ4.15 עד המניסקוס הוא בדיוק מעל החלק התחתון של צינור אחד FACS (~ 50 μl) כדי להימנע מהפסדי תא. Resuspend PBMCs בצינור אחד FACS באמצעות זרימת חיץ השייר עם micropipette P-200 ולהסיר (1 / # של דגימות) בשווי של הנפח מכל צינור FACS ולשלב לתוך צינור FACS חדש שכותרתו "אלוטיפ נקווה".
- הוסף 200 μl של קוקטייל נוגדני תא השטח שהוכן ב5.2.1 לכל דגימת PBMC. לאפשר PBMCs לimmunolabel על קרח בחושך במשך 20 דקות. לא פליקהוא צינורות פעם באמצע תקופת הדגירה לערבב בעדינות.
- לשטוף עם 1 מיליליטר של חיץ זרימה; ספין למטה ב660 XG (מקסימום RCF) x 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
- Resuspend כל צינורות FACS המכילים PBMCs ב200 μl של מקבע מבוסס פורמלין זמין מסחרי (ראה רשימת חומרים לפרטים נוספים) במשך 15 דקות על קרח בחושך. קפיצי צינורות פעם באמצע תקופת הדגירה לערבב בעדינות.
- לשטוף עם 1 מיליליטר של חיץ 1x permeabilization / לשטוף זמין מסחרי (ראה רשימת חומרים לפרטים נוספים) וספין למטה ב660 XG (מקסימום RCF) במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
- בעוד PBMCs מסתובב למטה, להכין כמות מספקת של 1: של עכבר פסיפיק בלו-מצומדות אנטי עכבר GzmB 100 דילול (Clone: GB11) נוגדנים תוך-תאיים במאגר permeabilization / לשטוף 1x להשיג 200 μl לדגימה נפח.
- בצינור נפרד, להכין יחיד 200 μl נפח של 1: של פסיפיק בלו-קון 100 דילולjugated עכבר IgG1, κ (שיבוט: MOPC-21) נוגדני שליטת אלוטיפ.
- Resuspend כל אחת מהדגימות PBMC הניסיוניות עם 200 μl של 1: נוגדנים אנטי עכבר GzmB דילול 100 וresuspend צינור FACS היחיד שכותרתו "אלוטיפ נקווה" עם 200 μl הנפח של 1: נוגדני אלוטיפ דילול 100.
- אפשר את כל דגימות PBMC לimmunolabel על קרח בחושך במשך 20 דקות. קפיצי צינורות פעם באמצע תקופת הדגירה לערבב בעדינות.
- לשטוף עם 1 מיליליטר של חיץ זרימה; ספין למטה ב660 XG (מקסימום RCF) במשך 10 דקות ב 4 ° C PBMCs והגלול עם 200 μl של זרימת חיץ לניתוח.
- לזרום cytometrically לנתח PBMCs הסתננות-גליומה באמצעות זרבובית משולבת 85 מיקרומטר והשערים ומתח PMT הוקם בעבר בסעיף 5.1 22. הקפד להפעיל את כל הנפח של כל דגימה על cytometer הזרימה כדי להבטיח השוואה של המספר הכולל של גליומה-infilt הוגנתPBMCs דירוג בכל דגימה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
אסטרטגית gating הבאה משמשת לניסוי טיפוסי: FSC-מול SSC-→ SSC-H לעומת SSC-W → FSC-H לעומת FSC-W → CD45 לעומת ספירת → Gr-1 לעומת CD11b → NK1.1 לעומת ספירה. גייטס מונח על Gr-1 תאי מיאלואידית + / CD11b + ותאי NK NK1.1 + מכן מרובדת מבוססים על ביטוי GzmB (איור 5 א). Backgating אלה תאים זוהו כתאי NK1.1 + NK וGr-1 + / CD11b + תאי מיאלואידית בניסויים שלנו על FSC-מול SSC-מאשר את הגודל הקטן יותר הלימפה של תאי NK ואת הגודל גדול יחסית של תאי מיאלואידית ( איור 5). קבצי RAW נתונים (כלומר., קבצי FCS) מנותחים על ידי תוכנת ניתוח נתונים התזרים cytometric זמינה מסחרי כגון FlowJo.
סך של 18 C57BL / 6J שימש להפגין בשיטה זו. תשע (9) היו engrafted עם GL26-Cit-NT ו -9 היו engrafted עם GL26-Cit-gal1i באותו דאיי באמצעות מספר שווה של תאים (3x10 4). שלושה עכברים מכל קבוצה היו מורדמים ב 24, 48, וקליטתם לאחר גידול-72 שעות. הנתונים מראים כי קליטתם של תאי גליומה GL26-Cit-gal1i לתוך המוח של עכברי C57BL / 6J syngeneic במהירות גורמת גיוס של CD45 + PBMCs (איור 6 א). בהתבסס על קוקטייל נוגדנים הספציפי המשמש בהפגנה עוד ניתן לראות כי Gr-1 + / CD11b + תאי מיאלואידית ותאי NK NK1.1 + במיוחד להיכנס למייקרו-הסביבה של גידול גל-1-לקוי בתוך 48 שעות של engraftment גידול (איור 6B ו6C); עם זאת המספר הכולל של תאי מיאלואידית הסתננות-גליומה עולה בהרבה על זה של תאי NK.
איור 1: הכנת תאי GL26-Cit לתוך הגולגולת engraftment (.) בהיר שדה הנציג 10X וmicrographs epifluorescence של GL26-Cit-NT (תמונות משמאל) וGL26-Cit-gal1i (תמונות מימין) תאים שגודלו בתרבית. כתם מערבי של GL26-Cit-NT (נתיב שמאלי) וGL26-Cit-gal1i (נתיב ימני) lysate תא כולו (B). טובולין גמא (γ-אמבטיה.) מוצג כביקורת טעינה. GL26-Cit גלולה (C) תא מבקבוק תרבות רקמת T75 ומחוברות כ -50% לאחר צנטריפוגה ב 550 XG (מקסימום RCF) במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. מבט בהיר שדה של hemocytometer המכיל תאי GL26-Cit (נקודות לבנות) (ד) בדילול 1: 1 עם Trypan הכחול להעריך מספר תאים ואת כדאיות. תאים צריכים להיות> 90% קיימא על מנת להבטיח את צמיחת גידול לשחזור. הממוצע של ספירת התאים מהריבועים שהכותרת 1 עד 5 יש לנקוט כדי להגביר את הדיוק של הערכת ספירת תאים. תאים (E) GL26-Cit resuspended ב 3 x 10 4 תאים / μl בDMEM-בתוספת של האו"ם לimpla תוך גולגולתי ntation. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: stereotactic engraftment של תאי Glioma לסטריאטום של C57BL / 6J () פריסת חבילת כירורגי המציגה את מכשירי ניתוח הנדרשים וחומרים כימיים.. (ב) סגור את התצוגה של עכבר C57BL / 6J רתם במסגרת stereotactic עם מיקום מחט נכון ב0.5 מ"מ AP, 2.5 מ"מ ML, ו-3.0 DV מ"מ ביחס לגבחת. תצוגה (C) הגבי של גולגולת העכבר מראה את המיקום של גבחת ואתר היעד לקליטתם תאים סרטניים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
p-together.within עמודים = "תמיד"> 
איור 3:. עכבר Transcardial זלוף () ריאגנטים חובה לנתיחה, טחינה דקה, ועיכול אנזימטי של רקמת מוח עכבר. (ב) פריסה של המכשירים וחומרים כימיים הנדרשים לעכבר transcardial זלוף עם הפתרון של Tyrodes מחומצן וheparinized מוצגים בזרימה למינרית המוקדשת לניתוחי עכבר מסוף. ייצוג סכמטי של הלב מדגים מכשירים ומיקומים הנדרשים לזלוף transcardial נכונים (C). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: בידוד של Glioma-להסתנן לתוכםPBMCs. () אסטרטגיה לנתיחה של רקמת מוח עכבר המכילה שתלי גליומה orthotopic שלב מוקדם. הפנל העליון ממחיש את חציית sagittal של חצי הכדור ipsilateral מהאונה הנגדית. הפנל התחתון מדגים שני חתכי העטרה נוספים לפי הצורך כדי לבודד את רקמת המטרה המכילה את שתל הגידול (מסומן בצבע סגול). גלולה רקמת מוח תא בודד (ב) (חץ לבן) לאחר עיכול אנזימטי, סינון דרך רשת ניילון 70 מיקרומטר וצנטריפוגה. שיפוע תקשורת צנטריפוגה צפיפות שפך כראוי לפני צנטריפוגה (C). החץ הלבן מציין את הממשק הנקי שנוצר בין שכבות תקשורת צנטריפוגה שתי צפיפות. צפיפות שיפוע תקשורת צנטריפוגה צנטריפוגה לאחר מדגימה את שכבת שומנים המהווה בחלק העליון של החץ הלבן 37% שכבת תקשורת צנטריפוגה צפיפות) ולהקת PBMC (ד) (שתואר על ידי הקווים שחורים דואר מקווקו) בממשק שבין שתי השכבות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5: זרימת Cytometric gating אסטרטגיה המשמשת לזיהוי המסתנן-Glioma Gr-1 + / CD11b + תאי מיאלואידית ותאי NK () שלב 1:. תאי immunolabeled סה"כ המבודדים מהלהקה PBMC של שיפוע תקשורת צנטריפוגה צפיפות הם מגודרת ל להוציא פסולת הסלולר (FSC-פחות מ ~ 50 K). שלבים 2 ו -3: gating אפליית כפיל לסנן אגרגטים הסלולר. שלב 4: שער CD45 לזהות תאים חיסוניים המסתננת-גליומה. שליטת אלוטיפ מוצגת כצללית האפורה. שלב 5: CD45 + תאים מרובדת מבוסס על Gr-1 וCD11b. שליטת אלוטיפ לשני Gr-1 ו- CD 11b הוא מעולף על המגרש ומוקף מעגל הזהב. המעגל האדום מציין תאי מיאלואידית Gr-1 + / CD11b +. שלב 5 ': תאי מיאלואידית Gr-1 + / CD11b + ריבוד המבוסס על ביטוי GzmB. כמבוסס, תאים אלה אינם תווית עם נוגדנים נגד GzmB על שליטת אלוטיפ (צללית אפורה). שלב 6: GR-1 תאים נמוכים שהותוו על ידי המלבן השחור בשלב 5 מרובדת מבוסס על ביטוי NK1.1. שליטת אלוטיפ מוצגת כצללית האפורה. שלב 6 ': תאי NK1.1 גבוה ריבוד המבוסס על ביטוי GzmB. תאים אלה אכן תווית עם נוגדנים נגד GzmB מעל שליטת אלוטיפ (צללית אפורה). (ב) Backgating של Gr-1 תאי מיאלואידית + / CD11b + על FSC-מול SSC-הוכחה כי יש תאי NK גודל הלימפה קטן יותר בהשוואה לGR-1 + תאים בגודל הגדול יותר / CD11b + מיאלואידית."_blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 6: השוואה של PBMC הסתננות לתוך GL26-Cit-NT לעומת microenvironment גידול GL26-Cit-gal1i על שלושה הימים הראשון של גידול תוך גולגולת CD45 סה"כ (א) + תאים חיסוניים.. (ב) תאי מיאלואידית CD45 + / Gr-1 + / CD11b +. CD45 (C) + /NK1.1 + תאי NK. נקודות נתונים מPBMCs המבודדים מגליומות GL26-Cit-gal1i מחוברות על ידי קווים חלקים, whiles אלה מבודדים מגליומות GL26-Cit-NT מחוברים על ידי קווים מקווקווים. PBMCs הסתננות-גליומה משלושה עכברים נותח לסוג גידול בכל נקודת זמן. מספרים משויכים לכל נקודת נתונים על עקומות GL26-Cit-gal1i מייצגים מתקפל אינדוקציה מסוג PBMC שבפרט על GL26-CiT-NT בהשתלת הודעה גידול השעות שצוינו (HPI). הנתונים מייצגים את המספר הממוצע של תאים חיסוניים נספרו ± סטיית ההתקן של הממוצע (SEM). ניתוח סטטיסטי בוצע על ידי ניתוח 2-דרך של שונות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה מתאר שיטה חזקה ושחזור לניתוח הבידוד ותזרים cytometric של PBMCs שהסתנן למייקרו-סביבת גידול במוח העכבר המוקדם. השעיות תא גליומה נוצרות בריכוז שצוין על ידי בניסויים שengrafted stereotactically לסטריאטום של מוח העכבר. עכברים מורדמים אז בנקודות זמן קבועות מראש שצוינו על ידי עיצוב ניסיוני והמוח שלהם נקצרים ומעובד לבודד PBMCs הסתננות-גליומה אשר immunolabeled עם שילובים של נוגדנים ראשוניים fluorochrome- מצומדות; לאחר מכן תאי immunolabeled הם לכמת ידי cytometry זרימה. למרות ההפגנה שהוצגה כאן מתמקדת בנקודות זמן מוקדמות, ניתן להעריך PBMCs הסתננות-גליומה בכל פוסט-גידול engraftment עד נקודת זמן עד moribundity עכבר. השיטה היא מאוד מודולרית ככל מספר של שילובי נוגדן שונים ניתן להשתמש כדי לבחון תאים חיסוניים שלי ענייןncluding תאי T, תאי B, תאי NK, מונוציטים, ומקרופאגים. שים לב שהפרוטוקול כבר מותאם לשימוש עם C57BL / 6J נקבה 8-10 שבועות של גיל. עכברים מחוץ לטווח גילים זה אולי שינו אחוזי PBMCs במחזור, אשר עלול להוביל לספירת תאים בנקודות זמן מקבילה שאינם נציג של הנתונים שהוצגו כאן. ניסויי אפיון גם עשויים להידרש אם מודלים גידול חלופיים משמשים או אם עכברים אחרים מאלו על רקע B6 משמשים בשל העובדה שזנים שונים יכולים בפרופילים שלהם PBMC (Jaxpheno6; מסד העכבר Phenome; המעבדה ג'קסון). תנאי מגדר והסביבה יכולים להיות גם מקורות של פער בין תדרי PBMC ואחוזים.
שיטה זו הודגמה באמצעות שילוב של נוגדני משטח ארבעה תאים המאפשרים זיהוי של Gr-1 + / CD11b + תאי מיאלואידית ותאי NK NK1.1 +, סוגי תאים מעורבים בדחייה של gaL-1-חסר גליומה. ההכללה של נוגדני GzmB תאיים נוספת מאפשרת זיהוי של פוטנציאל רעיל לתאים בתת-הקבוצה של תאי NK. נציגי תוצאות ניתנות לחדירת תאים חיסונית לגליומות GL26-Cit המוקדם בC57BL עכברים / 6J syngeneic כי גם להביע את הרמות נורמליות של גל-1 או שצמצמו את הרמות עקב מציאה גן בתיווך shRNA. ההפגנה מפגינה רגישות ושחזור של הטכניקה על ידי מראה כי PBMCs הסתננות-גליומה יכול להיות מבודד reproducibly ולכמת בהקדם engraftment הודעה גידול-24 שעות. מלבד חשיפת אוכלוסייה של Gr-1 + תאי חדירת גידול גבוהים / CD11b מיאלואידית, ההפגנה גם מגלה אוכלוסייה של int Gr-1 / CD11b + תאים שזהותו אינו מוגדרת כיום.; ניסויים נוספים נחוצים כדי לפענח את דמותו של אוכלוסיית תא זה עוד יותר. אנחנו גם לציין כי אנו לא שומרים אוכלוסייה להבחין בקלות של CD45
אנטי-Gr-1 נוגדנים לזהות שני החלבונים פני תא Ly6G וLy6C ספציפיים לpolymorphonuclear ותאי מיאלואידית מונונוקלארים, בהתאמה 25. השימוש בתרופות אנטי-Gr-1 antibodies כך מונע הבחנה בין שתי אוכלוסיות תאים אלה. תוצאות ראשוניות במעבדה שלנו מתחילות עכשיו לשפוך אור על תיאור מדויק יותר של תאי Gr-1 + / CD11b + המוקדמים שלחדור מייקרו-סביבת גליומה גל-1-חסר. ניסויים בשילוב אנטי-Ly6G (שיבוט: 1A8) ואנטי-Ly6C (שיבוט: AL-21) נוגדנים יחד עם נוגדנים נגד CCR2 עכשיו מצביעים על כך שGR-1 CD11b + תאים / גבוהים הסתננות microenvironment גידול גל-1-חסר המוקדם עולה בקנה אחד עם מונוציטים דלקתיים גבוהים גבוה / CCR2 Ly6C, אם כי ניסויים נוספים נדרשים כדי לאשר את התוצאה הזאת (מידע לא מוצג).
בשל תא מאבד שעלול להתרחש במהלך שלבי צנטריפוגה החוזרת וresuspension המעורבים בבידוד PBMCs הסתננות-גליומה, סביר להניח שנצפה ספירת תאים הן למעשה נמוכה יותר, כי מה הם בעצם הווה במוח שלם. עם זאת, הבדלים בין הקבוצות xperimental צריכה להחזיק אם כרכים מקבילים של ממשק תקשורת צנטריפוגה 37/70 צפיפות מופקים ואם כל הנפח של כל דגימה מנותחת על ידי cytometer את הזרימה. כישלון לדבוק צעדים אלה יגרום להשוואות לא הוגנות בין דגימות וימנע ניתוח משוחד. חוסר היכולת לכמת את מספר PBMCs כניסה למייקרו-סביבת הגידול במוח המדויק אינה ספציפי הגבלה לפרוטוקול זה. שיטות אלטרנטיביות כגון אסטרטגיות ספירת תאי immunohistological כפופות גם לשגיאה בשל extrapolations של מספרים סלולריים כולל המבוססים על ספירת stereological והדרישה של thresholding תמונה שווה הערך בmicrographs סעיף רקמה, שעשויה להיות שונה ברמתם של מכתים רקע, שעלול לגרום לשקר אותות -שלילי או חיוביים שגויים. עם זאת, השוואה של ניתוח כמובן זמן בין שיטות אנליטיות שונות צריכה לחשוף עקומות חיסונית-זרם תלוי זמן עם צורה כללית דומה.חסרון נוסף לשיטות immunohistochemical הוא חוסר היכולת של נוגדנים מסוימים תוקף לcytometry זרימה להיקשר לאפיטופ אנטיגני שווה הערך בהקשר של סעיפי רקמות מוח קבוע פורמלין.
יש כמה שלבים עיקריים בפרוטוקול זה שעשוי לשמש למגבלות אלה לא מוכרים עם מתודולוגיה שלה. צעד אחד כזה הוא הקצירה של המוח מהגולגולת מבלי לפגוע בו. אנו ממליצים לתרגל כמה פעמים הטכניקה לפני הפעלת ניסויים נכונים. עם זאת, מאז מוח סופו של דבר, נכתש, נזק קל לשכבות השטחיות של המוח עשוי חסרי חשיבות לכימות מדויק של PBMCs הסתננות-גליומה. צעד שני שחוקרים מנוסים עשויים למצוא בתחילה קשים הוא מילוי שיפוע תקשורת צנטריפוגה הצפיפות. היכולת 'experimentalists כדי ליצור ממשק נקי ואילו שמעל 2 מיליליטר של תקשורת צנטריפוגה צפיפות 37% על גבישכבת 70% היא קריטית לבידוד לשחזור של PBMCs. למרות שצעד זה עשוי להוכיח תחילה מאתגר, זה הרבה מעשיר לPBMCs ומקטין באופן דרמטי את משך הזמן שיידרש אחרת לניתוח מדגם אם רקמת המוח כולו שבו להיות מנותחת זרימת cytometrically. העשרת PBMC גם מפחיתה את המספר הכולל של אירועים שנתפסו על ידי cytometer את הזרימה, ובכך להקטין גודל קובץ .fcs ועוזר לפתור אוכלוסיות תאים נדירות שחדר-מוח חיסונית. לקבלת התוצאות הטובות ביותר בהקמת ממשק צנטריפוגה הצפיפות נקייה אנו ממליצים לשפוך 37% תקשורת צנטריפוגה צפיפות באמצעות micropipette P-1000 עם פעולת בוכנה חלקה. זווית צינור צנטריפוגות 15 מיליליטר כ 20-30 מעלות מעל גבי הספסל. לנוח קצה micropipette בצד של סימוני מיליליטר צינור 3-5 מעל פני השטח של 70% שכבת תקשורת צנטריפוגה הצפיפות. יוצקים בהתמדה וכך לאט כדי למזער את מומנטום כלפי חוץ גלוי של 37% תקשורת צנטריפוגה הצפיפות כפי שextrudes מקצה micropipette כדי להימנע מלהפריע 70% תקשורת צנטריפוגה צפיפות שבבסיס. לבסוף, העובדה שארכיטקטורת רקמת המוח נהרסה בהכרח בתהליך של בידוד PBMCs הסתננות-גליומה אומרת שעכברים נוספים יידרשו לקבל נתונים היסטולוגית תאמו נקודת זמן.
דגמים חדשים יותר גליומה שנוצרו באמצעות ההזרקה של ה- DNA פלסמיד שעור לתוך המוח המכרסם הרגיל פותחו בשנים האחרונות 26-32. מודלים גידול אלה "אנדוגני" לעקוף חפצים פוטנציאליים שנגרמו על ידי stereotactically engrafting לשעבר תאי סרטן vivo ולחקות באופן הדוק יותר מסימני ההיכר היסטולוגית של גליומה הקלינית. השיטה המתוארת במסמך זה גם מתאים ללימוד אירועי חדירה חיסוניים המאפיינים יותר מבחינה קלינית רלוונטי מערכות מודל הבאות. מחקרים על זרם חיסוני בעכברים בילוד עשויים גם להתבצע באמצעות שיטה זו למרות הצפיפות של mous הילודמוח הדואר הוא פחות מזה של מבוגרים, אשר עשוי לדרוש אופטימיזציה של צעד עיכול אנזימטי כדי למנוע מעל העיכול של רקמת המוח. יישומים נוספים של הטכניקה כוללים חקירות בכיתות חלופיות של מחלת מוח דלקתית מלבד גידולים ממאירים כגון Encephalomyelitis הניסיוני אלרגי (EAE) ותגובות חיסוני לזיהום נגיפי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומי לבריאות / המכון לאומי להפרעות ושבץ (NIH / NINDS) מעניק R01-NS074387, R01-NS057711 וR21-NS091555 לMGC נוירולוגיות; NIH / NINDS מעניק R01-NS061107, R01-NS076991, R01-NS082311 וR21-NS084275 לPRL; מענקים מהלבבות השמחים של לאה, אוניברסיטת מרכז הסרטן המקיף מישיגן זכה לMGC וPRL; המחלקה לנוירוכירורגיה, אוניברסיטת מישיגן בית הספר לרפואה; מכון מישיגן לקליני ומחקר בריאות, נתמך על ידי מענק NIH 2UL1-TR000433; גרנט הדרכת ביולוגיה של אוניברסיטת מישיגן הסרטן נתמך על ידי NIH / T32-CA009676 המענק NCI (המכון הלאומי לסרטן); אוניברסיטת מישיגן ההדרכה במדעי המוח קליני והבסיסיים הנתמכות על ידי NIH / NINDS להעניק T32-NS007222; ואוניברסיטת מישיגן רפואית מדען תכנית אימונים נתמכה על ידי NIH / NIGMS (המכון הלאומי למדעי רפואה כלליים) להעניק T32-GM007863. המחבריםמחדש אסיר תודה על המנהיגות האקדמית ותמיכה שקיבלה מד"ר קארין Muraszko והמחלקה לנוירוכירורגיה; למ 'Dahlgren, ד Tomford, וס Napolitan לתמיכה ניהולית מעולה; למ 'Dzaman לקבלת סיוע טכני יוצא מן הכלל; ופיל פ ג'נקינס לתמיכה נדיבה כלפי רכישת Zeiss 3D מיקרוסקופ אלקטרוני סורק. אנחנו גם מכירים המעבדה Kuchroo בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת הרווארד שממנו הגרסה שונה של האסטרטגיה בתיווך תקשורת צנטריפוגה הצפיפות לבידוד של תאי mononuclear מוח נמשכת.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modification of Eagles Medium | Gibco | 12430-054 | with 4.5g/L D-glucose, L-glutamine, 25 mM HEPES and phenol red |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline | Gibco | 14190-144 | without calcium chloride or Magnesium chloride |
| Fetal bovine serum | Omega Scientific Inc. | FB-11 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 10,000 U/ml Penicillin; 10,000 μg/ml Streptomycin |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | 200 mM |
| G418 sulfate | Omega Scientific Inc. | GN-04 | |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P8833 | from Streptomyces alboniger |
| HyClone HyQTase non-mammalian trypsin alternative | Thermo Scientific | SV30030.01 | in DPBS with EDTA |
| Phase contrast hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | 0.1 mm deep |
| Trypan blue stain | Gibco | 15250-061 | |
| Sterile 0.9% NaCl injection, USP | Hospira | NDC: 0409-4888 | 10 ml vials |
| 0.6 ml conical polypropylenemi microtubes | Genesee Scientific | 22-272 | |
| Atipamezole hydrochloride injection | Orion Pharma | NDC: 52483-6298 | 5 mg/ml solution |
| Ketamine hydrochloride injection | Fort Dodge | NDC: 0409-2051 | 100 mg/ml solution |
| Dexmedetomidine hydrochloride injection | Zoetis | NDC: 54771-2805 | 0.5 mg/ml solution |
| Xylazine hydrochloride injection | Lloyd | NDC: 61311-481 | 100 mg/ml solution |
| Carprofen injection | Pfizer | NDC: 61106-8501 | 50 mg/ml solution |
| Buprenorphine hydrochloride injection | Reckitt Benckiser | NDC: 12496-0757 | 0.3 mg/ml ampuls |
| 1 ml tuberculin syringes | Covidien | 8881501400 | |
| 26G x ½ (0.45 mm x 13 mm) syringe needles | BD | 305111 | |
| Surgical clippers | 3M | 9661 | |
| Providone-iodine solution | Aplicare | 82-217 | NDC: 52380-1905 |
| Sterile petrolatum ophthalmic ointment | Dechra | NDC: 17033-211 | |
| 70% isopropyl alcohol prep pads | Kendall | 6818 | |
| Sterile gauze | Covidien | 8044 | non-woven, 4" x 4", 4-ply |
| 1.7 ml conical polypropylene microtubes | Genesee Scientific | 22-281 | |
| Mouse stereotactic frame | Stoelting | 51730 | |
| Surgical lamp | Philips Burton | CS316W | Coolspot II Variable Spotlight |
| Curved dissecting forceps | Ted Pella Inc. | 5431 | |
| Colibri retractors | FST | 17000-03 | |
| Cordless precision power drill | Dremel | 1100-01 | Stylus model; 7.2-Volt Lithium-Ion with Docking Station |
| Engraving Cutter | Dremel | 105 | 1/32" or 0.8 mm bit diameter |
| Microliter syringe | Hamilton | 75 | Hamilton Microliter Syringes 700 series; 5 μl volume |
| Microliter syringe needles | Hamilton | 7762-06 | 33 G, small hub RN NDL, 1.5 in, point style 3, 6/PK |
| Ethilon 3-0 black monofilament nylon sutures | Ethicon | 1663 | |
| Magnetic stir bar | VWR | 74950-296 | 7.9 mm diameter x 50 mm length (5/16" diameter x 2" length) |
| 1 L glass screw-cap storage bottle | Corning | 1395 | Type 1, Class A borosilicate glass |
| Heparin sodium | Sagent | NDC: 25021-400 | 1,000 U/ml solution |
| Peristaltic pump | Cole Parmer Instruments Group | 77200-60 | Master Flex Easy Load II console drive |
| compressed carbogen (95% O2 / 5% CO2) | available from local vendor | N/A | A-type, large cylinder |
| 20 G x 1 ½" aluminum hub blunt needles | Kendall | 8881202363 | 0.9 mm x 38.1 mm |
| Polyurethane ice bucket | Fisherbrand | 02-591-45 | Capacity: 0.152 oz. (4.5L) |
| Collagenase (Type I-S) | Sigma Aldrich | C1639 | from Clostridium histolyticum |
| Deoxyribonuclease I | Worthington Biochemical Corp. | LS002007 | >2,000 Kunitz units per mg dry weight |
| Antistatic polystyrene hexagonal weighing dishes | Ted Pella Inc. | 20157-3 | top I.D. 115 mm, base I.D. 85 mm, 203 ml volume |
| Stainless steel single edged razor blades | Garvey | 40475 | |
| Bone rongeurs | FST | 16001-15 | |
| Hemostat | FST | 13014-14 | |
| Large dissection scissors | Ted Pella Inc. | 1316 | |
| Small dissection scissors | FST | 14094-11 | |
| Blunt end forceps | Ted Pella Inc. | 13250 | |
| 7 ml glass Dounce tissue grinder | Kontes | KT885300-0007 | |
| Percoll Density Centrifugation Media | GE Healthcare | GE17-0891-01 | |
| 10 ml serological pipettes | Genesee Scientific | 12-104 | single use; sterile |
| 70 μm sterile nylon mesh cell strainers | Fisherbrand | 22363548 | |
| Alexa Fluor 700-conjugated rat anti-mouse CD45 (clone: 30-F11) | Biolegend | 103128 | |
| APC-conjugated mouse anti-mouse NK1.1 (clone: PK136) | eBiosciences | 17-5941-82 | |
| PE-conjugated rat anti-mouse Gr-1 (clone:RB6-8C5) | BD Pharmigen | 553128 | |
| PerCP/Cy5.5-conjugated rat anti-mouse CD11b (clone: M1/70) | Biolegend | 101228 | |
| Alexa Fluor 700-conjugated rat IgG2b, κ (clone: RTK4530) isotype control | Biolegend | 400628 | |
| APC-conjugated mouse IgG2a, κ (clone: eBM2a) isotype control | eBioscience | 17-4724 | |
| PE-conjugated rat IgG2b, κ (clone: eB149/10H5) isotype control | eBioscience | 12-4031-82 | |
| PerCP/Cy5.5-conjugated rat IgG2b, κ (clone: RTK4530) isotype control | Biolegend | 400632 | |
| Pacific Blue-conjugated mouse anti-mouse granzyme B (Clone: GB11) | Biolegend | 515403 | |
| Pacific Blue-conjugated mouse IgG1, κ (Clone: MOPC-21) isotype control | Biolegend | 400151 | |
| Cytofix/Cytoperm | BD | 554714 | |
| 15 ml polypropylene centrifuge tubes | Genesee Scientific | 21-103 | conical bottom |
| 50 ml polypropylene centrifuge tubes | Genesee Scientific | 21-108 | conical bottom |
| 12 mm x 75 mm round-bottom polypropylene FACS tubes | Fisherbrand | 14-956-1B | |
| FACSAria Special Order Research Product flow cytometer/cell sorter | BD | 650033 | |
| Class II Biological Safety Cabinet | The Baker Company | SG603 | model: SterilGARD III Advance |
References
- Bleeker, F. E., Molenaar, R. J., Leenstra, S. Recent advances in the molecular understanding of glioblastoma. J Neurooncol. 108, 11-27 (2012).
- Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N Engl J Med. 352, 987-996 (2005).
- Ostrom, Q. T., et al. CBTRUS statistical report: primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2007-2011. Neuro Oncol. 16, Suppl 4. iv1-63 (2014).
- Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523, 337-341 (2015).
- Kennedy, B. C., et al. Tumor-associated macrophages in glioma: friend or foe? J Oncol.. 2013, 486912 (2013).
- Markovic, D. S., Glass, R., Synowitz, M., Rooijen, N., Kettenmann, H. Microglia stimulate the invasiveness of glioma cells by increasing the activity of metalloprotease-2. J Neuropathol Exp Neurol. 64, 754-762 (2005).
- Zhai, H., Heppner, F. L., Tsirka, S. E.
- Kmiecik, J., et al. Elevated CD3+ and CD8+ tumor-infiltrating immune cells correlate with prolonged survival in glioblastoma patients despite integrated immunosuppressive mechanisms in the tumor microenvironment and at the systemic level. J Neuroimmunol. 264, 71-83 (2013).
- Yang, I., Han, S. J., Sughrue, M. E., Tihan, T., Parsa, A. T. Immune cell infiltrate differences in pilocytic astrocytoma and glioblastoma: evidence of distinct immunological microenvironments that reflect tumor biology. J Neurosurg. 115, 505-511 (2011).
- Wagner, S., et al. Microglial/macrophage expression of interleukin 10 in human glioblastomas. Int J Cancer. 82, 12-16 (1999).
- El Andaloussi, A., Lesniak, M. S. An increase in CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cells in tumor-infiltrating lymphocytes of human glioblastoma multiforme. Neuro Oncol. 8, 234-243 (2006).
- Kostianovsky, A. M., Maier, L. M., Anderson, R. C., Bruce, J. N., Anderson, D. E. Astrocytic regulation of human monocytic/microglial activation. J Immunol. 181, 5425-5432 (2008).
- Curtin, J. F., et al. HMGB1 mediates endogenous TLR2 activation and brain tumor regression. PLoS Med. 6, e10 (2009).
- Curtin, J. F., et al. Fms-like tyrosine kinase 3 ligand recruits plasmacytoid dendritic cells to the brain. J Immunol. 176, 3566-3577 (2006).
- Mineharu, Y., et al. Engineering the brain tumor microenvironment enhances the efficacy of dendritic cell vaccination: implications for clinical trial design. Clin Cancer Res. 17, 4705-4718 (2011).
- Larocque, D., et al. Exogenous fms-like tyrosine kinase 3 ligand overrides brain immune privilege and facilitates recognition of a neo-antigen without causing autoimmune neuropathology. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 14443-14448 (2010).
- Curtin, J. F., et al. Treg depletion inhibits efficacy of cancer immunotherapy: implications for clinical trials. PLoS One. 3, e1983 (2008).
- Ali, S., et al. Combined immunostimulation and conditional cytotoxic gene therapy provide long-term survival in a large glioma model. Cancer Res. 65, 7194-7204 (2005).
- Dewey, R. A., et al. Chronic brain inflammation and persistent herpes simplex virus 1 thymidine kinase expression in survivors of syngeneic glioma treated by adenovirus-mediated gene therapy: implications for clinical trials. Nat Med. 5, 1256-1263 (1999).
- Baker, G. J., et al. Natural killer cells eradicate galectin-1-deficient glioma in the absence of adaptive immunity. Cancer Res. 74, 5079-5090 (2014).
- Baker, G. J., et al. Mechanisms of glioma formation: iterative perivascular glioma growth and invasion leads to tumor progression, VEGF-independent vascularization, and resistance to antiangiogenic therapy. Neoplasia. 16, 543-561 (2014).
- Ormerod, M. G., Novo, D. Flow cytometry : a basic introduction. , (2008).
- Stirling, D. P., Yong, V. W. Dynamics of the inflammatory response after murine spinal cord injury revealed by flow cytometry. J Neurosci Res. 86, 1944-1958 (2008).
- Hirai, T., et al. The prevalence and phenotype of activated microglia/macrophages within the spinal cord of the hyperostotic mouse (twy/twy) changes in response to chronic progressive spinal cord compression: implications for human cervical compressive myelopathy. PLoS One. 8, e64528 (2013).
- Fleming, T. J., Fleming, M. L., Malek, T. R. Selective expression of Ly-6G on myeloid lineage cells in mouse bone marrow. RB6-8C5 mAb to granulocyte-differentiation antigen (Gr-1) detects members of the Ly-6 family. J Immunol. 151, 2399-2408 (1993).
- Wiesner, S. M., et al. De novo induction of genetically engineered brain tumors in mice using plasmid DNA. Cancer Res. 69, 431-439 (2009).
- Holland, E. C., et al. Combined activation of Ras and Akt in neural progenitors induces glioblastoma formation in mice. Nat Genet. 25, 55-57 (2000).
- Lynes, J., et al. Lentiviral-induced high-grade gliomas in rats: the effects of PDGFB, HRAS-G12V, AKT, and IDH1-R132H. Neurotherapeutics. 11, 623-635 (2014).
- de Vries, N. A., et al. Rapid and robust transgenic high-grade glioma mouse models for therapy intervention studies. Clin Cancer Res. 16, 3431-3441 (2010).
- Uhrbom, L., et al. Ink4a-Arf loss cooperates with KRas activation in astrocytes and neural progenitors to generate glioblastomas of various morphologies depending on activated Akt. Cancer Res. 62, 5551-5558 (2002).
- Marumoto, T., et al. Development of a novel mouse glioma model using lentiviral vectors. Nat Med. 15, 110-116 (2009).
- Assanah, M., et al. Glial progenitors in adult white matter are driven to form malignant gliomas by platelet-derived growth factor-expressing retroviruses. J Neurosci. 26, 6781-6790 (2006).
