Summary
Presenteres her er en grei metode for isolering og strømningscytometrisk analyse av glioma-infiltrerende perifere mononukleære blodceller som gir tidsavhengige kvantitative data om antallet og aktivering status av immunceller som kommer inn i begynnelsen av hjernesvulst mikromiljøet.
Abstract
Vårt laboratorium har nylig vist at naturlige dreperceller (NK) celler som er i stand til å utrydde orthotopically implanterte mus GL26 og rotte CNS-1 maligne gliomer kort tid etter intrakran innpoding hvis kreftceller er gjengitt mangelfulle i sin ekspresjon av β-galaktosid-bindende lektin galectin -1 (gal-1). Nyere arbeid viser nå at en befolkning på Gr-1 + / CD11b + myeloide celler er kritisk til denne effekten. For bedre å forstå de mekanismer som NK og myeloide celler samarbeider til å gi gal-1-manglende tumor avvisning har vi utviklet en omfattende protokoll for isolering og analyse av glioma-infiltrerende perifere mononukleære blodceller (PBMC). Metoden demonstreres her ved å sammenligne PBMC infiltrasjon inn i tumoren mikromiljøet av gal-1-uttrykkende GL26 gliomer med de som er gjengitt gal-1-manglende via shRNA knockdown. Protokollen begynner med en beskrivelse av hvordan kultur og forberede GL26 cells for inokulering inn i syngenisk C57BL / 6J mus hjernen. Det forklarer deretter trinnene involvert i isolasjon og flowcytometrisk analyse av glioma-infiltrere PBMC fra tidlig hjernesvulst mikromiljøet. Metoden er anvendbar for en rekke in vivo eksperimentelle design i hvilket tidsmessige data vedrørende immun infiltrering inn i hjernen er nødvendig. Metoden er følsom og meget reproduserbar, som glioma-infiltrerende PBMC kan isoleres fra intrakraniale svulster så raskt som 24 timer etter tumor-innpoding med tilsvarende celletall observert fra tid punkt avstemt tumorer gjennom uavhengige eksperimenter. En enkelt experimentalist kan utføre fremgangsmåten fra hjernen til høstingen flowcytometrisk analyse av glioma-infiltrerende PBMC i omtrent 4-6 timer, avhengig av antallet prøver som skal analyseres. Alternative glioma modeller og / eller celle-spesifikke gjenkjennings antistoffer kan også anvendes ved experimentalists skjønn for å vurdere infiltrasjon av flere andre Immune celletyper av interesse uten behov for endringer i den generelle prosedyre.
Introduction
Hjernesvulst er en klasse av neuroepithelial hjernen kreft som skyldes transformert gliaceller i sentralnervesystemet (CNS). Av alle gliomer, World Health Organization (WHO) karakter IV gliomer, eller glioblastom (GBM), er den vanligste og dødelig en. GBM er svært ildfast til dagens standard-of-care som består av tumor reseksjon i størst mulig grad etterfulgt av stråling pluss samtidig og adjuvant kjemoterapi med temozolomid to. Disse dødelige kreft bære en forferdelig kamp prognose på bare 15-18 måneder for overlevelse fra tidspunktet for første diagnosen med bare 5% av pasientene som overlever sykdommen etter 5 år 3.
Tilstedeværelsen av blod-hjerne barrieren (BBB), mangel på profesjonelle antigenpresenterende celler (APC), og den tidligere uidentifiserte eksistensen av bona fide lymfatiske strukturer i hjernen 4 har ført til oppfatningen av GBM som immune privilegert. Men mange studier nå show at disse hjernen kreft faktisk skape rekruttering av perifere immunceller som er overveiende myeloid opprinnelse som inkluderer monocytter, makrofager, og myeloide-avledet suppressorceller (MDSCs) 5. GBM også påvirker aktiviteten til hjerne bosatt mikroglia å bli pro-tumorigent 6,7. Lymfoide celler slik som CD8 + T-celler 8 og CD56 + naturlige drepeceller 9 er også til stede i tumoren mikromiljøet, men i mye mindre antall, til en faktisk tenkt å være på grunn av immunundertrykkende funksjon konstruert av glioma-avledede faktorer på tumorassosierte makrofager ( TAM), 10. CD4 + T-celler er også til stede i GBM, men mye av denne befolkningen uttrykker også CD25 og foxp3, skaperne av immundempende T regulatorisk (T reg) celler 11. Den generelle immundempende delstaten GBM kulminerer i markedsføringen av immunologisk flukt og tumorprogresjon 12.
13-19. Kulminasjonen av dette arbeidet har nå ført til en klinisk studie designet for å evaluere en kombinert cytotoksiske og immun-stimulerende terapeutisk for pasienter med nylig diagnostisert GBM (ClinicalTrials.gov Identifier: NCT01811992).
Vår siste arbeid viser at mus og rotte GL26 CNS-1-GBM-celler blokkerer anti-tumor NK-celleimmunovervåkning ved å produsere store mengder av den β-galaktosid-bindende lektin galectin-1 (gal-1) 20. Dette ble demonstrert ved å undertrykke uttrykket av gal-en i gliomceller hjelp shRNA-mediert genet knockdown. In vitro experiments viste at gal-en-mangel gliomceller proliferated normalt i kultur, men gjennomgikk raske avvisning snart etter intrakranielle engraftment inn syngenisk C57BL / 6J eller RAG1 - / - mus, og dermed etablere uavhengighet T- eller B-celler på denne formen for svulst avvisning. NK celle immunodepletion med anti-asialo GM en anti-serum eller monoklonale NK1.1 antistoffer førte til fullstendig restaurering av intrakranielle gal-en-mangel glioma vekst, etablering rollen som NK-celler i gal-en-mangel glioma avvisning. Vi viser nå at immunodepletion av Gr-1 + / CD11b + myeloide celler er tilstrekkelig til å hindre gal-1-manglende glioma avvisning tross for tilstedeværelsen av NK-celler, og dermed avsløre et uunnværlig hjelperolle for myeloide celler i assistanse til NK-mediert gal -1-mangel tumor lysis (upubliserte data). Dette uventede resultatet har ført oss til å utvikle en omfattende protokoll for isolering og analyse av perifert blod mononukleære celler (PBMC) sominfiltrere hjernesvulst mikromiljøet snart etter intrakranielle engraftment slik at vi kan bedre karakterisere immuninfiltrasjons hendelser som predikat gal-en-mangel glioma avvisning.
Metoden er demonstrert her ved hjelp av mus GL26 gliomceller som konstitutivt uttrykte mCitrine fluorescerende protein, kalt GL26-Cit, som tillater direkte tumorcelle visualisering av fluorescens mikros 21. Disse cellene er stereotaktisk podet inn i hjernen av syngene C57BL / 6J mus og får lov til å vokse i 24, 48 eller 72 timer før avlivning mus. Glioma-infiltrerende PBMCer er så isolert og immunolabeled bruker anti -CD45, -Gr-en, -CD11b og -NK1.1 celleoverflaten antistoffer sammen med intracellulære immunolabeling for granzyme B (GzmB). Denne spesifikke kombinasjonen av antistoffer gir mulighet for identifisering av tumor-infiltrerende Gr-1 / + CD11b + celler, og myeloide NK1.1 +, NK-celler, celletyper har vi been innblandet i gal-en-mangelfull svulst avvisning. Immun infiltrasjon profil gal-1-manglende GL26-Cit glioma, referert til her som GL26-Cit-gal1i, blir så sammenlignet med den i gliomas uttrykker normale nivåer av gal-1 kalt GL26-Cit-NT som inneholder en ikke- målretting kontroll shRNA hårnål. Protokollen begynner med en beskrivelse av hvordan kultur GL26-Cit gliomceller in vitro, som er etterfulgt av en forklaring på hvordan du orthotopically innpode disse cellene inn i striatum av syngeniske C57BL / 6J mus. Den fortsetter deretter å nummerere trinnene involvert i isolasjon og immunolabeling av glioma-infiltrerende PBMCer for flowcytometrisk analyse. Protokollen avsluttes med en forklaring av standard dataanalyse og grafisk representasjon.
Demonstrasjonen avslører at både Gr-1 + / CD11b + myeloide celler og NK1.1 + NK-celler fortrinnsvis akkumuleres i gal-en-mangel hjernesvulst mikromiljø innen 48hr av tumorimplantering, et resultat som bidrar til å forklare hvorfor disse svulstene raskt gjennomgå komplett tumorlyse ca 1 uke etter svulst engraftment 20. Fremgangsmåten er lett tilpasses til en rekke forskjellige in vivo eksperimentelle design i hvilket tidsmessige data vedrørende immun infiltrering inn i hjernen er nødvendig. En enkelt experimentalist kan utføre protokollen fra hjernen til høstingen flowcytometrisk analyse av glioma-infiltrerende PBMC i omtrent 4-6 timer, avhengig av antallet prøver som skal analyseres. Fremgangsmåten kan også kombineres med forsøk tok sikte på å karakterisere profilen av sirkulerende PBMC i tumorbærende mus i sammenlikning med dem som infiltrerer hjernen så å identifisere immunsuppresjonsteknikker fenotyper spesifikt indusert av svulsten mikromiljøet. Bruk av denne og lignende metoder bør legge til rette for en bedre forståelse av hvilke faktorer som er involvert i smugling av perifere immunceller i hjernen svulsten mikromiljøet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: Les hele protokollen før du utfører eksperimenter. Det må innhentes godkjenning for bruk av virveldyr fra den aktuelle institusjonelle komiteen på bruk og velferd for dyr før du fortsetter.
1. Utarbeidelse av tumorceller intrakranielle engraftment
- Å arbeide i en klasse II biologisk trygghetskabinett, starte med å fremstille GL26-Cit-NT / gal1i cellekulturmedier ved å supplere en 500 ml flaske med Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) med 10% sterilfiltrert varmeinaktivert føtalt bovint serum (FBS ), 2 mM L-glutamin, 100 U / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin, 600 ug / ml G418 sulfat (for valg av mCitrine ekspresjonsvektoren) og 3 ug / ml puromycin-dihydroklorid (for valg av den ikke- målretting eller gal-en-spesifikke shRNAs).
- Kultur GL26-Cit-NT og / eller GL26-Cit-gal1i celler (figur 1A og 1B 5% CO2 i 1-2 dager før tumor engraftment prosedyre eller inntil flaskene når 50-80% konfluens.
- På operasjonsdagen, fjerne cellekultur medier fra gliomceller bruker en 10 ml serologisk pipette og en pipette pistol og kast media i en avfalls beger.
- Snu flasken top-side-ned og legge til 10 ml DPBS til oversiden av kolben ved hjelp av en 10 ml serologisk pipette. Sakte snu kolben for å dekke cellene i DPBS, deretter tips kolben vertikalt og fjern og kast DPBS i en avfalls beger.
- Legg 3-4 ml av ikke-pattedyr trypsin alternativ i DPBS med EDTA (se liste materialer for detaljer) til hver T75 vevskulturkolbe og sette tilbake i vevskultur skap i 2-5 min. Ved hjelp av en lys-feltet mikroskop, sjekk at alle cellene har løsnet fra bunnen overflaten før du fortsetter.
- Hemme further enzymatisk aktivitet ved fortynning av trypsin alternativt med 6 ml DPBS. Pipetter opp og ned ved hjelp av en 10 ml serologisk pipette for å skylle bunnflaten av kolben og for mekanisk å dissosiere noen cellulære aggregater. Aspirer cellene og legg inn henholdsvis merket 15 ml sentrifugerør. Spinn cellene ned ved 550 xg (maks RCF) i 5 min ved 4 ° C (figur 1C).
- Fjern supernatanten og resuspender cellene forsiktig med 1 ml av un-supplert DMEM. Sørg for å pipettere cellene opp og ned grundig med en P-1000 mikropipette å oppnå en enkelt celle suspensjon.
- Foreta en 1:10 fortynning av den resulterende cellesuspensjonen ble generert på 1,6 ved å plassere 18 ul un-supplert DMEM inn i et 0,6 ml polypropylen mikrorør konisk, etterfulgt av tilsetning av 2 ul av tumorcellesuspensjon. Pipetter opp og ned ved hjelp av en P-10 mikropipette å homogen cellene grundig.
- Legg til 10 mL &# 160; på 01:10 tumorcelle fortynning generert på 1,7 i et separat 0,6 ml polypropylen mikrorør konisk, og deretter tilsettes 10 ul av Trypan blå flekken til røret. Bland med en P-10 mikropipette og tilsett 10 ul av den resulterende tumor celle / Trypan blå løsning under et glass dekkglass plassert på toppen av et hemocytometer være forsiktig med å innføre luftbobler (figur 1D).
- Telle celler med en lys-feltet mikroskop bruker en 10X objektiv i henhold til bestemte protokollen assosiert med den gitte hemocytometer. Vær sikker på å faktor i den 20-gangers fortynning av den opprinnelige tumorcellesuspensjonen gjort under fremstillingen av cellene for nøyaktig estimering celle i den opprinnelige 1 ml aliquot. Bruk følgende formel for å beregne det totale antall celler: total celler / ml = [((Σcells telles per kvadrat) / antall firkanter telles) x 20 (dvs. fortynningsfaktoren) x 10.000 celler / ml].
- Etter determining det totale antall celler for hver cellelinje som brukes i en gitt eksperiment, spinne dem ned ved 550 xg (maks RCF) i 5 min ved 4 ° C. Fjern supernatanten (e) og resuspender cellene med et passende volum av un-supplert DMEM for å oppnå et mål konsentrasjon på 3 x 10 4 celler pr 1 ul for hver cellelinje i henhold til følgende formel: (totalt antall av celler / 30.000).
- Plassere et tilsvarende volum av hver cellelinje inn i henholdsvis merket med 0,6 ml koniske polypropylenrør og sted på is (figur 1E). Sørg for å spare noen celler til å fortsette å spre hver cellelinje hvis separate T75s tidligere ikke var sådd.
2. Fremgangsmåte for stereotaktisk innpoding av gliomceller i striatum fra C57BL / 6J mus
- Forbered arbeider løsninger av kirurgisk anestesi, analgesi og anestesi reversering før operasjonen som følger:
- For ketamin / dexmedetomidin surgical anestesi: fjerne 1,4 ml fra en 10 ml ampulle med steril 0,9% NaCl-injeksjon og erstatt med 600 ul av en 100 mg / ml stamløsning av ketamin-hydroklorid og 800 pl av en 0,5 mg / ml stamløsning av dexmedetomidin-hydroklorid for å gi et blandede arbeidsløsning av ketamin-hydroklorid (6 mg / ml) og dexmedetomidin hydroklorid (0,04 mg / ml).
- For buprenorfin analgesi: fjerne 1 ml fra en 10 ml ampulle med steril 0,9% NaCl-injeksjon og erstatte med hele 1 ml volum av en enkel 0,3 mg / ml stam buprenorfinhydroklorid ampul for å gi en 0,03 mg / ml arbeidsløsning.
- For atipamezol kirurgisk anestesi reversering: fjerne 1 ml fra en 10 ml ampulle med steril 0,9% NaCl-injeksjon og erstatte med 1 ml av en 5 mg / ml stamløsning av atipamezol-hydroklorid for å gi en 0,5 mg / ml arbeidsløsning.
- Jobbe i et godkjent sted for mus overlevelse surgery, begynner ved å sette opp autoklaveres eller steriliseres kule kirurgiske instrumenter og andre reagenser som vist i (figur 2A), og deretter oppnå nok til 8-10 uker gamle C57BL / 6J hunn mus (syngen med GL26 glioma) som er nødvendig for undersøkelsen; sikre deres kontinuerlig tilgang til mat og vann.
- Bedøve første mus med en enkel intraperitoneal (ip) injeksjon av arbeids anestesi løsningen ved å levere en dose på 75 mg / kg ketamin og 0,5 mg / kg deksmedetomidin (ca. 250 ul av en 20 g mus). Deretter gir en 5 mg / kg subkutant (sc) injeksjon av karprofen (omtrent 100 ul på en 20 g mus). Sørg for at musen er non-respondere på tå og hale klyper før du fortsetter.
- Ved hjelp av kirurgiske clippers, barbere pelsen fra kraniet. Påfør povidonjodid antiseptisk løsning på barberte området, skrubb med en 70% isopropylalkohol prep pad, deretter søke povidonjodid antiseptisk løsning. Deretter gjelder en liten mengde klorle petrolatum oftalmisk salve til hvert øye for å hindre uttørking.
- Fest hodeskalle i stereotaktisk ramme i henhold til følgende protokoll:
- Åpne munnen forsiktig ved å nå på med et par buede dissecting pinsett til å dra forsiktig ut tungen og flytte til den ene siden av munnen for å hindre choking. Tillat pinsett til å trekke mens i munnen for å spre kjeven åpen og veilede de to øverste fortennene inn i nøkkelhullet på tann bar på stereotaktisk ramme. Sikre tannen bar fra å svinge horisontalt eller vertikalt ved å justere de respektive skruer. Sørg for at musens kraniet er på nivå med benken toppen.
- Plasser øret barer sikkert mot postorbital beina i kraniet være forsiktig med å bruke for mye innover press på skallen for å hindre knusing.
- Plasser nesen bar over snuten og skru ned til den sitter. Sjekk at det ikke er vertikal / sideveis bevegelse i hodet ved å trykke lettmed en tommel og pekefinger. En mus riktig plassert i en stereotaktisk ramme er vist i (figur 2B).
- Ved hjelp av en skalpell blad, lage en 1 cm midtlinjen snitt over kraniet fra pannebeinet til nakkeknøl. Trekke huden på snittet hjelp Colibri haker.
- Senk mikroliter sprøyte utstyrt med en 33 G nål festet til den vertikale arm av stereotaktisk ramme direkte over posisjonen til bregma (figur 2C). Derfra justere plasseringen av nålen 0,5 mm AP, 2,5 mm ML for å nå målet stedet for tumorimplantering. Bruk en 1 ml tuberkulinsprøyte utstyrt med en 26 G nål for å markere dette stedet ved å forsiktig etsende periosteum.
- Bor et hull i kraniet på målområde til n underliggende dura mater du bruker en trådløs presisjon elektrisk drill utstyrt med en 1/32 "(0,8 mm) bit. Under boring, gjelder periodisk trykk etterfulgt av fjerning av drill bit fra overflaten av kraniet for å unngå overdreven varme og kraft som ellers kan føre til borkronen punktering av liggende hjernevev.
- Skyll mikroliter sprøyte med 0,9% NaCl i en 1,7 ml konisk polypropylen microtube for å sikre at nålen ikke er tett. Knips forsiktig på 0,6 ml konisk polypropylen mikrorør inneholder kreftceller flere ganger for å resuspendere cellene.
- Utarbeide 2 ul av celler inn i mikroliter sprøyte som sikrer at ingen luftbobler blir ført inn i sprøyten. Dispensere 1 mL av cellene på en 70% isopropylalkohol prep puten forlater nøyaktig 1 mL av tumorceller som er igjen i sprøyten.
- Ta nålen ned til den berører dura mater, deretter innføre nålen inn i hjernen -3.5 mm ventralt og trekke fra 0,5 mm. Sakte og jevnt levere cellene ved nedtrykking av sprøytestemplet i løpet av 1-2 min.
- La cellene til settle på i 5 minutter forut for sakte å trekke tilbake nålen på injeksjonsstedet. Tørk koagulert blod eller hjernemasse fra spissen av nålen med en ren 70% isopropylalkohol prep pad. Skyll nålen og sprøyten grundig med 0,9% NaCl fra trinn 2.6 for å sikre at nålen ikke er tett for neste injeksjon.
- Fjern de Colibri haker og sy hodebunnen med tre 3-0 nylon monofilament sting. Fjern musen fra stereotaktisk ramme og administrere 0,1 mg / kg av buprenorfin-hydroklorid subkutant (sc) (ca. 67 pl av 0,03 mg / ml arbeidsløsning for en 20 g mus) etterfulgt av 2,5 mg / kg atipamezol hydroklorid intramuskulært (im) (omtrent 100 ul av 0,5 mg / ml arbeidsløsning for en 20 g mus) for postoperativ smertelindring og bedøvelse reversering. Plasser post-kirurgiske mus tilbake til sine merdene under en varmelampe for å gjenopprette.
3. Mouse Transcardial Perfusion og Høsting av Brain
- Forbered heparinisert Tyrodes løsning i henhold til den følgende protokoll:
- Sette en magnetisk rørestav i en 1 l glass med skrukork lagringsflaske og fyll opp til volum med avionisert ultrarent vann. Plasser flasken på en røreplate.
- Vei og tilsett følgende kjemikalier til glassflaske under omrøring: 8 g natriumklorid (NaCl), 0,264 g kalsiumklorid (CaCl 2 • 2 H 2 O), 0,05 g Natriumfosfat, monobasisk (NaH 2PO 4 • 2 H 2 O), 1,0 g D-glukose (C 6 H 12 O 6), 1,0 g natriumbikarbonat (NaHCO3), 0,2 g kaliumklorid (KCl). Tillat saltene for å løses opp, og deretter tilsett 100 ul av en 1,000U / ml stamløsning av heparin natrium i Tyrodes løsning.
- Fjern beholderen fra røreplaten og trekke ut røre bar ved hjelp av en magnetisk tryllestav. Lagre heparinisert Tyrodes løsning ved 4° C.
- Forbered en fungerende løsning for terminal anestesi som følger:
- For ketamin / xylazin terminal anestesi: fjerne 1,360 mL av en 10 ml ampulle med steril 0,9% NaCl-injeksjon og erstatte med 1200 pl av en 100 mg / ml stamløsning av ketamin-hydroklorid og 160 pl av en 100 mg / ml stamløsning av xylazin hydroklorid til å gi et blandet arbeidsløsning av ketamin-hydroklorid (12 mg / ml) og xylazin-hydroklorid (1,6 mg / ml).
- Klargjør densitetssentrifugering media blanding oppløsning ved å plassere 90 ml 10 x PBS til 264 ml ultrarent vann deionisert (3.93x) i en steril plastbeholder. Titrering til pH 7,0-7,2 med HCl og sterilisere filtrere gjennom et 0,22 um filter. Oppbevar ved 4 ° C.
- Forbered 70% tetthetssentrifugering materiale ved å blande 18 ml av tetthetssentrifugeringsmateriale blanding oppløsningen med 30 ml av densitetssentrifugering medier (se listen materialerfor detaljer) i et 50 ml polypropylen sentrifugerør. Oppbevar ved 4 ° C, men bringe til romtemperatur før bruk.
- Forbered 37% tetthetssentrifugering media ved å kombinere 9,6 ml DPBS med 10,4 ml 70% tetthetssentrifugering media i et 50 ml sentrifugerør. Oppbevar ved 4 ° C, men bringe til romtemperatur før bruk.
- Forbered strømnings buffer ved å plassere 500 pl av FBS i 50 ml DPBS (~ 1% FBS) i et 50 ml sentrifugerør. Lagre på butikken ved 4 ° C
- Fyll en 4,5 L polyuretan isen bøtte til kapasitet med is chips.
- Lage en kombinert oppløsning på 1 mg / ml kollagenase og 1 mg / ml DNase-I i tilstrekkelig mengde til 1 ml per hjerneprøve i studien ved fortynning av en 10 mg / ml DNase-I stamløsning 01:10 og 50 mg / ml kollagenase stamløsning 1:50 med sterilt DPBS i et enkelt 15 ml polypropylen sentrifugerør. Bland forsiktig løsningen ved å pipettere opp og ned med en P-1000 mikropipette. Lagre på isen i polyuretanane bøtte fra trinn 3.7.
- Få to 7 ml glass Dounce vev kverner. Merk av et "NT" og den andre "gal1i". Plasser vev kverner i isen bøtte og tilsett 1 ml DPBS til hver.
- Skaffe nok 15 ml sentrifugerør å samle hjernen saken fra hver mus i studien og plasser i isen bøtte.
- Plasser ~ 150 ml DPBS blant tre 50 ml sentrifugerør i isen bøtte.
- Skaffe nok polystyren sekskantede veier retter (top indre diameter (ID) 115 mm, basen ID 85 mm, 203 ml volum) for hver mus i studien. Den komplette sett opp for disseksjon og utgnidning muse hjerner er vist i (figur 3A)
- Ved valgte tidspunkter, bedøve første tumorbærende mus i studien ved bruk av en enkelt intraperitoneal injeksjon av 150 mg / kg ketamin-hydroklorid og 20 mg / kg xylazin-hydroklorid (ca. 250 ul av det kombinerte 12 mg / ml ketamin / 1,6 mg / ml xylazin arbeidsoppløsning for en 20 g mus) for å indusere dyp anestesi. Sørg for at musen er non-respons på tå og hale klyper før du fortsetter.
- Hente den tidligere utarbeidet Tyrode løsning og plasser i en laminær hette dedikert til terminal dyre kirurgiske prosedyrer. Plasser gass-ugjennomtrengelig polymer-rør festet til en carbogen tanken inn i Tyrodes løsning. Åpne tankventil, slik at 95% O 2/5% CO2 carbogen for kontinuerlig å boble inn i oppløsningen.
- Fest en 20 G aluminiumsnavet butt nål til enden av ytterligere gass-ugjennomtrengelig polymer-rør festet til en peristaltisk pumpe. Plasser røret ved den andre enden av den peristaltiske pumpe inn i Tyrodes løsning og slå på pumpen for å tillate røret å fylle med oksygenrikt og heparinisert Tyrodes løsning. Den er satt opp for mus transcardial perfusjon er vist i (figur 3B).
- Ved hjelp av fire 26 G nåler, pin nedbedøvet mus ventral side opp ved fronten og bakpoter på en ekstrudert polystyren skum blokk dekket med en disposisjon absorberende håndkle i laminær hette.
- Ta tak i huden over bukhulen ved hjelp av et par av sløv disseksjon tang, og ved hjelp av en stor par av disseksjon saks lage en "Y" innsnitt ved å trenge inn i peritoneal veggen, skjæring cephalically for å punktere membranen, deretter bifurcating ved sternum å si at venstre og høyre axillae.
- Bruk en hemostat å klemme sternum og reflektere brystkassen over muse venstre skulder. Fjern hjerteposen med paret av stump disseksjon tang.
- Slå på den peristaltiske pumpe for å begynne en jevn strøm av oksygenerte og heparinisert Tyrodes løsning (omtrent 2,3-2,5 ml / min).
- Sett butt nål inn i den venstre ventrikkel av hjertet. Bruk en liten par disseksjon saks for å avklipt høyre forkammer å tillate blodtapping (Figur3C).
- Tillat Tyrodes løsning grundig perfuse musesirkulasjonssystemet til lever og lunger har helt forvellet på grunn av mangel på blod. Sørg for at ingen brutto mengder blod fortsette å gå ut av høyre atrium før du tar ut 20 G aluminium hub butt nål fra venstre ventrikkel.
- Løsne musen fra polysturenskum blokk og slå musen ventral side ned. Ved hjelp av en stor par av disseksjon saks, skiller hodet fra resten av kroppen på nivå med halsen.
- Ved hjelp av en liten par disseksjon saks, klippe hodebunnen ved midtlinjen som begynner på nakkeknøl jobbe frem mot snuten for å avdekke kraniet.
- Trekk tilbake huden på begge sider av kraniet ved hjelp av en tommel og pekefinger og hold skallen sikkert. Bruk et par bein Rongeurs å bryte gjennom kraniet begynner på nakkeknøl og jobbe frem til helt eksponere rygg- og sideveisoverflatene av hjernen. Vær nøye med å minimere skader på hjernen.
- Når kraniale bein er fjernet, slår lederen for mus ventral side opp og bruke en liten par disseksjon saks for å klippe hjernenerver i bunnen av hjernen for å frigjøre den fra skallen.
4. Isolering av gliom-infiltrerende PBMCer
- Ved hjelp av en ren enkelt edged barberblad, isolere området av hjernen som inneholder svulsten ved å gjøre en sagittal kutt i midten av hjernen til å halvere de to halvkuler. Snu ipsilaterale halvkule mediale side ned og lage to koronale kutt på nivåene av lillehjernen og luktelappen for å isolere målet vev som inneholder svulsten implantatet (Figur 4A). En tilsvarende del av den kontralaterale hemisfære kan også isoleres og brukes som en negativ kontroll.
- Plasser målvevet inn i henholdsvis merket glass Dounce vevsmaler inneholdende 1 ml; av DPBS, skyve stempelet helt ned og vri 7 ganger til utgangspunktet forstyrre vev. Løfte stempelet for å tillate væsken å slå tilbake til bunnen av vevsmaler. Gjenta dette trinnet tre ganger; men bare vri stempelet 4 ganger i løpet av de neste to repetisjoner og 3 ganger i løpet av den siste repeat for å unngå over triturating vevet.
- Ved hjelp av en P-1000 mikropipette, sekvensielt anvende tre 1 ml volumer av iskald DPBS (fremstilt i 3,11) langs sidene av stempelet for å skylle ned i vevsmaler.
- Resuspender triturert hjernemassen ved å pipettere opp og ned og legge det i en merket 15 ml sentrifugerør på is. Skyll sidene av Dounce vevsmaler med 1 ekstra ml iskald DPBS og legge til den samme 15 ml sentrifugerør. Hold alle rør som inneholder gnidd hjernen saken på is inntil alle prøvene har blitt behandlet.
- Gjenta trinn 03.13 til 03.25 og 04.01 til 04.04 for hver mus i studien.
- Når alle prøvene hahar blitt behandlet, spinne ned triturert hjernemasse i de 15 ml sentrifugerør ved 740 xg (maks RCF) i 20 minutter ved 4 ° C.
- Fjern supernatanten med en 10 ml serologisk pipette og pipette pistol og resuspender pelletert hjernemasse i 1 ml av den tidligere fremstilte collagenase / DNase-I digestive enzymer ved anvendelse av en P-1000. Plasser 15 ml sentrifugerør i et testrør stativ og plasser i et 37 ° C vannbad i 15 min.
- Beveg lett prøvene to ganger i løpet av inkubasjonstiden ved å dra rørene for å lette vev dekomponering.
- Tilsett 6 ml iskald DPBS ved hjelp av en 10 ml serologisk pipette til hvert rør for å fortynne fordøyelsesenzymer. Pipette opp og ned til resuspender, og filtrere det totale volum gjennom sterile 70 mikrometer nylon mesh filtre inn i nye merket 15 ml sentrifugerør på is.
- Spinn hjernecellesuspensjonen seg ved 740 xg (maks RCF) i 20 minutter ved 4 ° C for å oppnå enenkelt celle pellet (figur 4B). Etter fjerning av 15 ml rør fra sentrifugen plassere dem på is og øke temperaturen på sentrifugen til ca. 21 ° C i forberedelse for neste trinn.
- Fullstendig fjerne supernatanten fra hvert rør inneholdende hjerneceller og først resuspender pelleten i 1 ml 70% tetthetssentrifugering medier ved bruk av en P-1000 mikropipette. Deretter legger 4 ekstra milliliter 70% densitetssentrifugering media til hvert rør ved hjelp av en 10 ml serologisk pipette. Skru caps på sikkert og homogencellesuspensjonen ved å forsiktig snu til rør flere ganger.
- Fjern de 15 ml sentrifugerør inneholder hjerneceller resuspendert i 70% densitetssentrifugering medier fra isen, og plasser i et reagensrør stativ ved RT. En av gangen, omhyggelig overlappe 2 ml 37% tetthetssentrifugering media oppløsningen på 5 ml av 70% tetthetssentrifugering media med en P-1000 mikropipette for å danne aclean grensesnittet mellom de to tetthetssentrifugering av mediesjikt (figur 4C).
- Bruke en tynn markør for å indikere posisjonen av grenseflaten slik at det lett kan identifiseres etter sentrifugering, når forskjellen blir mindre tydelig.
- Spinne ned de 15 ml sentrifugerør ved 740 xg (maks RCF) i 20 minutter ved romtemperatur uten noen pause for å unngå å forstyrre grensesnittet.
- Etter sentrifugering samle PBMC som har samlet seg i grenseflaten mellom de to tetthetssentrifugering av mediesjikt (figur 4D) ved innføring av en P-200 mikropipette inn i røret langs dets side, forsiktig utenom lipidlaget.
- Når på nivået av PBMC band, langsomt trekke ut 200 ul fra overflaten av 70% tetthetssentrifuge lag medier og plasser det i et respektivt merket polypropylen FACS rør på is. Gjenta gang for et totalvolum på 400 mL per prøve.
- Tilsett 3 ml av strømningsbuffer til hver FACS rør inneholdende 400 ul av PBMC å fortynne tilstrekkelig tetthet sentrifuge media, så spinne ned cellene ved 660 x g (maks RCF) i 20 minutter ved 4 ° C.
5. Immunolabeling av gliom-infiltrerende PBMCer
- Før analyse av eventuelle eksperimentelle PBMC-prøver, utføre et enkelt, uavhengig, celleoverflaten isotype kontrollforsøk for å etablere basislinje porter for å være assosiert med et sett av faste PMT-spenninger i en strømningscytometrisk analyse av data mal dedikert til vurdering av glioma-infiltrerende PBMC ifølge til følgende protokoll:
- Innpode en C57BL / 6J-mus med GL26-Cit-gal1i og en annen med GL26-Cit-NT henhold til fremgangsmåten beskrevet i avsnitt 2. Etter 72 timer med tumorvekst, avlive både mus og isolerer tumor-infiltrerende PBMC i henhold til prosedyrene skissert gjennom §§ 3 og 4.
- Kombinere de to PBMC prøver (NT ennd gal1i) i ett volum (dvs. 100 ul), og deretter videre dele prøven jevnt mellom tre FACS rør (dvs. 33,3 mL per rør) merket "CD45 isotype", "Gr-1 / CD11b isotype", og "NK1. 1 isotypen ". Legg til følgende antistoffer (hver ved en 1: 100 fortynning, og fortynnet til et totalt volum på 200 ul i strømningsbuffer) til de respektive merkede FACS rør: "CD45 isotype": Alexa Fluor 700-konjugert rotte IgG2b, κ (klon: RTK4530 ); "Gr-1 / CD11b isotypen": Alexa Fluor 700-konjugert rotte anti-mus CD45 (klon: 30-F11), PE-konjugert rotte IgG2b, κ (klone: eB149 / 10H5), og PerCP / Cy5.5 -konjugert rotte IgG2b, κ (klone: RTK4530); "NK1.1 isotypen": Alexa Fluor 700-konjugert rotte anti-mus CD45 (klon: 30-F11), PE-konjugert rotte anti-mus Gr-1 (klone: RB6-8C5), PerCP / Cy5.5-konjugert rotte anti-mus CD11b (klone: M1 / 70), og APC-conjugated mus IgG2a, κ (klone: eBM2a).
- Tillat PBMC til immunolabel på isen i mørket i 20 min. Flick rørene en gang halvveis i inkubasjonstiden til forsiktig blande. Vask med 1 ml buffer strømning, spinne ned ved 660 xg (maks RCF) i 10 minutter ved 4 ° C og resuspendere FACS hvert rør inneholdende PBMC med 200 ul av strømnings buffer.
- Ved hjelp av en flowcytometer utstyrt med en 85 mikrometer integrert dyse, analysere "CD45 isotypen" tube første til å etablere en baseline CD45 intervall gate. Deretter kjør "Gr-1 / CD11b isotypen" tube å etablere en baseline Gr-1 / CD11b kvadranten gate med kun sanne CD45 + celler som input. Til slutt, kjør "NK1.1 isotypen" tube å etablere en baseline NK1.1 intervall gate bruker eneste sanne CD45 + / Gr-1 lave / CD11b +/- celler som input.
- Bruk følgende fremgangsmåte for all fremtid eksperimentell enalysis:
- Stille en tilstrekkelig mengde av en 1: 100 fortynning av celleoverflate-antistoff i strømnings buffer for å oppnå et 200 ul volum per prøve (pluss en for GzmB isotype): Alexa Fluor 700-konjugert rotte-anti-mus CD45 (klon: 30-F11 ), PE-konjugert rotte-anti-muse-Gr-1 (klon: RB6-8C5), PerCP / Cy5.5-konjugert rotte-anti-mus CD11b (klon: M1 / 70), APC-konjugert mus-anti-muse NK1.1 (klone: PK136).
- Fjern forsiktig supernatanten av de spunnede ned PBMC fra 4,15 til menisken er like over bunnen av hvert rør FACS (~ 50 mL) for å unngå celle tap. Suspender PBMCer i hvert FACS rør ved hjelp av reststrømmen buffer med en P-200 mikropipette og fjerne (1 / antall prøver) verdt av volumet fra hver FACS rør og kombinere inn i en ny FACS tube merket "sammenslått isotypen".
- Tilsett 200 ul av celleoverflate-antistoff cocktail fremstilt 5.2.1 hver PBMC prøve. Tillat PBMC til immunolabel på isen i mørket i 20 min. Flick tHan rør en gang halvveis i inkubasjonstiden til forsiktig blande.
- Vask med 1 ml flyt buffer; spinne ned ved 660 xg (maks RCF) x 10 minutter ved 4 ° C.
- Resuspender alle FACS-rør inneholdende PBMC i 200 ul av en kommersielt tilgjengelig, formalin-baserte bindemiddel (se listen materialer for detaljer) i 15 minutter på is i mørket. Flick rørene en gang halvveis i inkubasjonstiden til forsiktig blande.
- Vask med 1 ml av en kommersielt tilgjengelig 1x permeabilization / vaskebuffer (se listen materialer for detaljer) og spinne ned ved 660 xg (maks RCF) i 10 minutter ved 4 ° C.
- Mens PBMC blir spinne ned, fremstille en tilstrekkelig mengde av en 1: 100 fortynning av Pacific Blue-konjugert mus-anti-mus GzmB (klon: GB11) intracellulære antistoffer i 1x permeabilization / vaskebuffer for å oppnå et 200 ul volum per prøve.
- I et separat rør, fremstille en enkelt 200 ul volum av en 1: 100 fortynning av Pacific Blue-conkonjugerte mus lgG1, κ (klon: MOPC-21) isotype kontroll-antistoff.
- Resuspender hver av forsøksprøvene PBMC med 200 ul av 1: 100 fortynning av anti-mus-antistoffer GzmB og resuspender enkelt FACS røret merket "sammenslåtte isotype" med 200 ul volum av 1: 100 fortynning av isotype antistoffer.
- Tillat alle PBMC prøver å immunolabel på isen i mørket i 20 min. Flick rørene en gang halvveis i inkubasjonstiden til forsiktig blande.
- Vask med 1 ml flyt buffer; spinne ned ved 660 xg (maks RCF) i 10 minutter ved 4 ° C og resuspender PBMC med 200 ul strømnings buffer for analyse.
- Flyte cytometrically analysere glioma-infiltrerende PBMCer ved hjelp av en 85 mikrometer integrert dyse og portene og PMT-spenninger tidligere etablert i § 5.1 22. Sørg for å kjøre hele volumet av hver prøve på strømningscytometeret for å sikre en rettferdig sammenligning av det totale antall gliom-infiltvurdering PBMCer i hver prøve.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Følgende gating strategien brukes for et typisk eksperiment: FSC-A vs. SSC-A → SSC-H vs. SSC-W → FSC-H vs. FSC-W → CD45 vs. telle → Gr-1 vs CD11b → NK1.1 vs. teller. Porter plassert på Gr-1 + / CD11b + myeloide celler og NK1.1 + NK-celler blir deretter stratifisert basert på GzmB uttrykket (figur 5A). Backgating de celler som er identifisert som NK1.1 + NK-celler og Gr-1 + / CD11b + myeloide celler i våre eksperimenter bort på FSC-A vs. SSC-A bekrefter den mindre størrelsen av lymfoide celler og NK den relativt store størrelsen av myeloide celler ( Figur 5B). Rådatafiler (ie. FCS-filer) blir analysert av kommersielt tilgjengelige strømningscytometrisk dataanalyse programvare som FlowJo.
En total på 18 C57BL / 6J mus ble brukt for å demonstrere denne metoden. Ni (9) ble innpodet med GL26-Cit-NT og 9 ble innpodet med GL26-Cit-gal1i på samme day ved hjelp av tilsvarende antall celler (3x10 4). Tre mus fra hver gruppe ble avlivet ved 24, 48 og 72 timer etter tumor-innpoding. Dataene viser at innpoding av GL26-Cit-gal1i gliomceller inn i hjernen av syngene C57BL / 6J-mus induserer hurtig rekrutteringen av CD45 + PBMC (figur 6A). Basert på det spesifikke antistoff som brukes cocktail i demonstrasjonen det kan videre vises at Gr-1 + / CD11b + myeloide celler og NK1.1 + NK-celler spesifikt går inn i gal-1-manglende tumor mikromiljøet i 48 timer av tumor innpoding (figur 6B og 6C); men det totale antall glioma-infiltrerende myeloide celler langt oppveier det av NK-celler.
Figur 1: Utarbeidelse av GL26-Cit Cells intrakranielle engraftment (A.) Representant 10X lyse-feltet og epifluorescence mikrografer av GL26-Cit-NT (venstre bilde) og GL26-Cit-gal1i (høyre bilde) celler dyrket i kultur. (B) Western blot av GL26-Cit-NT (venstre felt) og GL26-Cit-gal1i (høyre felt) hele cellelysat. Gamma tubulin (γ-tub.) Vises som en lasting kontroll. (C) GL26-Cit Cellepelleten fra en tilnærmet 50% konfluent T75 vevskulturkolbe etter sentrifugering ved 550 x g (maks RCF) i 5 min ved 4 ° C. (D) Bright-feltet visning av en hemocytometer inneholder GL26-Cit celler (hvite prikker) fortynnet 1: 1 med trypanblått å vurdere celle nummer og levedyktighet. Cellene bør være> 90% levedyktig for å sikre reproduserbar tumorvekst. Gjennomsnittet av de celletellinger fra rutene som er merket 1 til 5 bør tas for å øke nøyaktigheten av celletallet estimering. (E) GL26-Cit cellene resuspendert på 3 x 10 4 celler / mikroliter i un-supplert DMEM for intrakraniell implantation. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: stereotaktisk innpoding av gliomceller i striatum fra C57BL / 6J mus (A) Kirurgisk pulter som viser de nødvendige kirurgiske instrumenter og reagenser.. (B) Nærbilde av en C57BL / 6J mus utnyttet i en stereotaktisk ramme med riktig nål plassering på 0,5 mm AP, 2,5 mm ML, og -3,0 mm DV forhold til bregma. (C) Dorsal utsikt over muse skallen som viser plasseringen av bregma og målområde for svulst celle engraftment. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3:. Mouse Transcardial Perfusjons (A) Nødvendige reagenser for disseksjon, finmaling, og enzymatisk fordøyelse av mus hjernevev. (B) Layout av instrumenter og reagenser som kreves for mus transcardial perfusjon med oksygenrikt og heparinisert Tyrodes løsning vist i en laminær hette dedikert til terminal muse kirurgiske prosedyrer. (C) Skjematisk fremstilling av hjertet demonstrere riktige instrumenter og plasseringer som kreves for transcardial perfusjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Isolering av Glioma-infiltrerendePBMC. (A) Strategi for disseksjon av musen hjernevev inneholder tidlig stadium orthotopic glioma implantater. Toppanelet demonstrerer sagittal bisection av ipsilaterale halvkule bort fra motsatt halvkule. Det nederste panel viser de to ekstra korona kutt som er nødvendige for å isolere målvevet som inneholder tumorimplantering (uthevet i purpur). (B) Enkelt celle hjernevev pellet (hvit pil) etter enzymatisk fordøyelse, filtrering gjennom en 70 mikrometer nylon mesh og sentrifugering. (C) Riktig hellet tetthetssentrifugeringsmedier gradient før sentrifugering. Den hvite pilen angir ren grenseflate mellom de to tetthetssentrifugering av mediesjikt. (D) densitetssentrifugering media gradient etter sentrifugering som viser lipidlaget som dannes på toppen av 37% tetthetssentrifuge lag medier hvite pilen) og PBMC båndet (beskrevet av the stiplede svarte linjer) ved grenseflaten mellom de to lagene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Flowcytometriske gating Strategy brukes til å identifisere Glioma-infiltrerende Gr-1 + / CD11b + myeloide celler og NK-celler (A) Trinn 1:. Totalt immunolabeled celler isolert fra PBMC band av en densitetssentrifugering media gradient er inngjerdet på å utelukke cellerester (FSC-A mindre enn ~ 50 K). Trinn 2 og 3: Doublet diskriminering gating å filtrere ut cellulære aggregater. Trinn 4: CD45 gate å identifisere glioma-infiltrerende immunceller. Isotypekontroll er vist som grå silhuett. Trinn 5: CD45 + celler stratifisert basert på Gr-1 og CD11b. Isotype kontroll av både Gr-1 og CD 11b er kledde på tomten og omsluttet av gull sirkel. Den røde sirkelen indikerer Gr-1 + / CD11b + myeloide celler. Trinn 5 ': Gr-1 + / CD11b + myeloide celler stratifisert basert på GzmB uttrykk. Som betinget, disse cellene ikke merke med anti-GzmB antistoffer enn isotypekontroll (grå silhuett). Trinn 6: Gr-1 lave celler skissert av den svarte firkanten i trinn 5 stratifisert basert på NK1.1 uttrykk. Isotypekontroll er vist som grå silhuett. Trinn 6 ': NK1.1 høy celler stratifisert basert på GzmB uttrykk. Disse cellene faktisk merke med anti-GzmB antistoffer ovenfor isotypekontroll (grå silhuett). (B) Backgating av Gr-1 + / CD11b + myeloide celler på FSC-A vs. SSC-A demonstrere at NK-celler har en mindre lymfoid størrelse i forhold til de større størrelse Gr-1 + / CD11b + myeloide celler."_blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: Sammenligning av PBMC Infiltrasjon inn i GL26-Cit-NT vs. GL26-Cit-gal1i svulstens mikromiljø i løpet av de tre første dagene av Intrakraniell tumorvekst (A) Totalt CD45 + immunceller.. (B) CD45 + / Gr-1 + / CD11b + myeloide celler. (C) CD45 + /NK1.1 + NK-celler. Datapunkter fra PBMC isolert fra GL26-Cit-gal1i gliomer er koblet sammen med glatte linjer, whiles de isolert fra GL26-Cit-NT gliomer er koblet sammen med stiplede linjer. Glioma-infiltrerende PBMC fra tre mus ble analysert pr tumortype ved hvert tidspunkt. Nummer knyttet til hvert datapunkt på GL26-Cit-gal1i kurvene representerer fold-induksjon av den aktuelle PBMC typen løpet GL26-Cit-NT på den angitte time etter tumorimplantering (HPI). Data representerer gjennomsnittsantallet av immunceller telles ± standardavvik av gjennomsnittet (SEM). Statistisk analyse ble utført av to-veis variansanalyse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen beskriver en robust og reproduserbar metode for isolering og strømningscytometrisk analyse av PBMC som har infiltrert den tidlige musehjernetumor mikromiljøet. Glioma cellesuspensjoner blir generert ved en konsentrasjon som er angitt av experimentalist som er stereotaktisk podet inn i striatum i musehjerne. Mus blir deretter avlives på forhåndsbestemte tidspunkter angitt av eksperimentell design og deres hjerner er høstet og behandlet for å isolere glioma-infiltrerende PBMC som er immunolabeled med kombinasjoner av fluorokromkonjugerte konjugert primære antistoffer; immunolabeled cellene blir deretter kvantifisert ved hjelp av strømningscytometri. Selv om demonstrasjonen presenteres her fokuserer på tidlig tidspunkt, kan glioma-infiltrerende PBMCer vurderes som helst punkt post-tumor engraftment inntil mus moribundity. Metoden er svært modul som hvilket som helst antall forskjellige antistoffkombinasjoner kan brukes for å undersøke immunceller av interesse including T-celler, B-celler, NK-celler, monocytter og makrofager. Legg merke til at protokollen er optimalisert for bruk med kvinnelige C57BL / 6J mus 8-10 ukers alder. Mus utenfor denne aldersgruppen kan ha endret prosenter av sirkulerende PBMC, som kan føre til celletall på tilsvarende tidspunkter som ikke er representative for de data som presenteres her. Karakterisering eksperimenter kan også være nødvendig dersom andre tumormodeller anvendes eller når andre enn de på bakgrunn B6 mus brukes på grunn av det faktum at stammene kan variere i sine PBMC-profiler (Jaxpheno6; mus Phenome Database, Jackson Laboratory). Kjønn og miljøforhold kan også være kilder til ulikhet blant PBMC frekvenser og prosenter.
Denne metoden har blitt demonstrert ved anvendelse av en kombinasjon av fire celleoverflate-antistoffer som muliggjør påvisning av Gr-1 + / CD11b + myeloide celler og NK1.1 + NK-celler, celletyper involvert i avvisning av gal-1-manglende glioma. Inkludering av intracellulære GzmB antistoffer muliggjør ytterligere påvisning av cytotoksisk potensial i NK-celleundersett. Representative resultatene er gitt for immuncelleinfiltrasjon i tidlig GL26-Cit gliomer i syngeniske C57BL / 6J mus som enten uttrykker normale nivåer av gal-1 eller som har redusert nivåer på grunn av shRNA-mediert genet knockdown. Demonstrasjonen oppviser følsomhet og reproduserbarhet av teknikken ved å vise at glioma-infiltrerende PBMC kan reproduserbart isolert og kvantifiseres så raskt som 24 timer etter tumor-innpoding. Bortsett fra å avsløre en befolkning på tumor infiltrere GR-1 høy / CD11b + myeloide celler, demonstrasjonen avslører også en befolkning på Gr-en int / CD11b + celler hvis identitet er foreløpig udefinert.; ytterligere forsøk er nødvendige for ytterligere å dechiffrere karakteren av denne cellepopulasjon. Vi merker oss også at vi ikke observerer en lett gjenkjennelig befolkning på CD45
Anti-Gr-1-antistoffer gjenkjenner både Ly6G og Ly6C celleoverflateproteiner som er spesifikke for polymorfonukleære og mononukleære myeloide celler, henholdsvis 25. Anvendelse av anti-Gr-1 antibodkaper utelukker dermed skillet mellom disse to cellepopulasjoner. Foreløpige resultater i vår lab begynner nå å belyse en mer nøyaktig beskrivelse av de tidlige Gr-1 + / CD11b + celler som infiltrerer gal-en-mangel glioma mikromiljøet. Eksperimenter som omfatter anti-Ly6G (klone: 1A8) og anti-Ly6C (klone: AL-21) antistoffer sammen med anti-CCR2 antistoffer nå tyder på at GR-1 høy / CD11b + celler infiltrere tidlig gal-1-mangel svulstens mikromiljø er i samsvar med Ly6C høy / CCR2 høye inflammatoriske monocytter, men ytterligere forsøk er nødvendig for å bekrefte dette resultatet (data ikke vist).
På grunn av celle taper som kan oppstå i løpet av repetisjonssentrifugering og resuspensjon trinnene involvert i å isolere glioma-infiltrerende PBMC, er det sannsynlig at det observert celletall er nemlig lavere enn det som faktisk er tilstede i den intakte hjerne. Imidlertid forskjeller mellom experimental grupper bør holde hvis ekvivalente volumer av 37/70 tetthetssentrifugeringsmedier grensesnitt ekstraheres, og hvis hele volumet av hver prøve analysert ved strømningscytometer. Unnlatelse av å følge disse trinnene vil føre til urettferdige sammenligninger mellom prøvene, og vil være til hinder for objektiv analyse. Manglende evne til å tallfeste nøyaktig antall PBMC inn i hjernesvulst mikromiljøet er ikke en begrensning som er spesifikk for denne protokollen. Alternative metoder som immunohistologiske celle telling strategier er også gjenstand for feil på grunn av fremskrivninger av total celle tall basert på stereological teller og kravet om tilsvarende bilde thresholding på vev seksjonsmikrobilder, som kan variere i deres nivå av bakgrunnsfarging, som potensielt fører til falske -negativ eller falske positive signaler. Likevel bør en sammenligning av tidsforløpet analyse mellom ulike analysemetoder avsløre tidsavhengige immun-tilstrømningen kurver med lignende generelle formen. Enytterligere ulempe ved immunhistokjemiske metoder er den manglende evne av visse antistoffer godkjent for flowcytometri å binde seg til det tilsvarende antigen epitop innenfor rammen av formalin-fikserte vevssnitt hjernen.
Det er noen viktige skritt i denne protokollen som kan tjene som begrensninger for de som ikke kjenner sin metodikk. Et slikt skritt er høsting av hjernen fra kraniet uten å skade den. Vi foreslår å praktisere teknikken flere ganger før du kjører riktig eksperimenter. Imidlertid, siden hjernen til slutt vil bli findelt, mindre skade på overfladiske lag av hjernen er sannsynligvis uviktige for nøyaktig kvantifisering av glioma-infiltrerende PBMC. Et annet skritt som uerfarne etterforskere kan i utgangspunktet synes vanskelig er det å helle av densitetssentrifugering media gradient. De experimentalists evne til å danne et rent grensesnitt mens liggende 2 ml av 37% densitetssentrifugering media på toppen av70% laget er avgjørende for reproduserbar isolering av PBMC. Selv om dette trinn kan i utgangspunktet være utfordrende, er det vesentlig beriker for PBMC og dramatisk reduserer den tid ellers kreves for analyse av prøver hvis hele hjernevev, hvor strømningen som skal analyseres cytometrically. PBMC berikelse reduserer også det totale antall hendelser fanges opp av flowcytometer, og dermed redusere .fcs filstørrelser og bidra til å løse sjeldne hjerne infiltrere immuncellepopulasjoner. For best resultat i å etablere et rent densitetssentrifugering grensesnitt vi anbefaler å helle 37% tetthet sentrifugering medier med en P-1000 mikropipette med glatt stempelet handling. Vinkle 15 ml sentrifugerør ca 20-30 ° over benken toppen. Hviler spissen av mikropipette på siden av røret 3-5 ml tegninger over overflaten av det 70% tetthet sentrifuge lag medier. Hell jevnt og sakte så å minimere overt utover fremdriften av 37% densitetssentrifugering media som det fram og tilbades fra mikropipette tips for å unngå å forstyrre den underliggende 70% densitetssentrifugering media. Til slutt, det faktum at hjernevev arkitekturen er nødvendigvis ødelagt i prosessen med å isolere gliom-infiltrerende PBMC betyr at ytterligere mus vil være nødvendig for å oppnå tidspunkt passet histologiske data.
Nyere glioma modeller generert ved injeksjon av onkogen plasmid DNA i den normale gnagere hjernen har blitt utviklet i de senere år 26-32. Disse "endogene" tumormodeller omgå potensielle gjenstander forårsaket av stereotaktisk engrafting ex vivo kreftceller og nærmere etterligne de histologiske kjennetegn på klinisk glioma. Metoden er beskrevet her er godt egnet til å studere immuninfiltrasjons hendelser som preger disse mer klinisk relevant modellsystemer. Studier av immun tilstrømning i neonatale mus, kan også utføres ved hjelp av denne fremgangsmåten, selv om tettheten av neonatal mouse hjerne er mindre enn den for voksne, noe som kan kreve en optimering av den enzymatiske fordøyelse skritt for å hindre over fordøyelse av hjernevev. Andre anvendelser av teknikken inkluderer undersøkelser på alternative klasser av inflammatorisk hjernesykdom bortsett fra ondartede svulster som eksperimentell allergisk encefalomyelitt (EAE) og immunresponser mot virusinfeksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health / National Institute of nevrologiske lidelser og hjerneslag (NIH / ninds) innvilger R01-NS074387, R01-NS057711 og R21-NS091555 å MGC; NIH / ninds tilskudd R01-NS061107, R01-NS076991, R01-NS082311 og R21-NS084275 til PRL; tilskudd fra Leah Happy Hearts, University of Michigan Comprehensive Cancer Center tildelt MGC og PRL; Institutt for nevrokirurgi, University of Michigan School of Medicine; Michigan Institute for Clinical and Health Research, støttet av NIH stipend 2UL1-TR000433; University of Michigan Cancer Biology Training Grant støttet av NIH / NCI (National Cancer Institute) stipend T32-CA009676; University of Michigan Opplæring i klinisk og grunnleggende nevrovitenskap støttet av NIH / ninds innvilge T32-NS007222; og University of Michigan Medical Scientist Training Program støttes av NIH / NIGMS (National Institute of General Medicine Sciences) innvilge T32-GM007863. Forfatterne enre takknemlig for den faglige ledelsen og mottatt støtte fra Dr. Karin Muraszko og Nevrokirurgisk avdeling; M. Dahlgren, D. Tomford, og S. Napolitan for suveren administrativ støtte; M. Dzaman for fremragende teknisk assistanse; og til Phil F. Jenkins for generøs støtte mot kjøp av en Zeiss 3D Scanning Electron Microscope. Vi erkjenner også Kuchroo laboratorium ved Harvard Medical School, hvorfra en modifisert versjon av tetthetssentrifugerings media-mediert strategi for isolering av mononukleære celler i hjernen ble trukket.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modification of Eagles Medium | Gibco | 12430-054 | with 4.5g/L D-glucose, L-glutamine, 25 mM HEPES and phenol red |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline | Gibco | 14190-144 | without calcium chloride or Magnesium chloride |
| Fetal bovine serum | Omega Scientific Inc. | FB-11 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 10,000 U/ml Penicillin; 10,000 μg/ml Streptomycin |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | 200 mM |
| G418 sulfate | Omega Scientific Inc. | GN-04 | |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P8833 | from Streptomyces alboniger |
| HyClone HyQTase non-mammalian trypsin alternative | Thermo Scientific | SV30030.01 | in DPBS with EDTA |
| Phase contrast hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | 0.1 mm deep |
| Trypan blue stain | Gibco | 15250-061 | |
| Sterile 0.9% NaCl injection, USP | Hospira | NDC: 0409-4888 | 10 ml vials |
| 0.6 ml conical polypropylenemi microtubes | Genesee Scientific | 22-272 | |
| Atipamezole hydrochloride injection | Orion Pharma | NDC: 52483-6298 | 5 mg/ml solution |
| Ketamine hydrochloride injection | Fort Dodge | NDC: 0409-2051 | 100 mg/ml solution |
| Dexmedetomidine hydrochloride injection | Zoetis | NDC: 54771-2805 | 0.5 mg/ml solution |
| Xylazine hydrochloride injection | Lloyd | NDC: 61311-481 | 100 mg/ml solution |
| Carprofen injection | Pfizer | NDC: 61106-8501 | 50 mg/ml solution |
| Buprenorphine hydrochloride injection | Reckitt Benckiser | NDC: 12496-0757 | 0.3 mg/ml ampuls |
| 1 ml tuberculin syringes | Covidien | 8881501400 | |
| 26G x ½ (0.45 mm x 13 mm) syringe needles | BD | 305111 | |
| Surgical clippers | 3M | 9661 | |
| Providone-iodine solution | Aplicare | 82-217 | NDC: 52380-1905 |
| Sterile petrolatum ophthalmic ointment | Dechra | NDC: 17033-211 | |
| 70% isopropyl alcohol prep pads | Kendall | 6818 | |
| Sterile gauze | Covidien | 8044 | non-woven, 4" x 4", 4-ply |
| 1.7 ml conical polypropylene microtubes | Genesee Scientific | 22-281 | |
| Mouse stereotactic frame | Stoelting | 51730 | |
| Surgical lamp | Philips Burton | CS316W | Coolspot II Variable Spotlight |
| Curved dissecting forceps | Ted Pella Inc. | 5431 | |
| Colibri retractors | FST | 17000-03 | |
| Cordless precision power drill | Dremel | 1100-01 | Stylus model; 7.2-Volt Lithium-Ion with Docking Station |
| Engraving Cutter | Dremel | 105 | 1/32" or 0.8 mm bit diameter |
| Microliter syringe | Hamilton | 75 | Hamilton Microliter Syringes 700 series; 5 μl volume |
| Microliter syringe needles | Hamilton | 7762-06 | 33 G, small hub RN NDL, 1.5 in, point style 3, 6/PK |
| Ethilon 3-0 black monofilament nylon sutures | Ethicon | 1663 | |
| Magnetic stir bar | VWR | 74950-296 | 7.9 mm diameter x 50 mm length (5/16" diameter x 2" length) |
| 1 L glass screw-cap storage bottle | Corning | 1395 | Type 1, Class A borosilicate glass |
| Heparin sodium | Sagent | NDC: 25021-400 | 1,000 U/ml solution |
| Peristaltic pump | Cole Parmer Instruments Group | 77200-60 | Master Flex Easy Load II console drive |
| compressed carbogen (95% O2 / 5% CO2) | available from local vendor | N/A | A-type, large cylinder |
| 20 G x 1 ½" aluminum hub blunt needles | Kendall | 8881202363 | 0.9 mm x 38.1 mm |
| Polyurethane ice bucket | Fisherbrand | 02-591-45 | Capacity: 0.152 oz. (4.5L) |
| Collagenase (Type I-S) | Sigma Aldrich | C1639 | from Clostridium histolyticum |
| Deoxyribonuclease I | Worthington Biochemical Corp. | LS002007 | >2,000 Kunitz units per mg dry weight |
| Antistatic polystyrene hexagonal weighing dishes | Ted Pella Inc. | 20157-3 | top I.D. 115 mm, base I.D. 85 mm, 203 ml volume |
| Stainless steel single edged razor blades | Garvey | 40475 | |
| Bone rongeurs | FST | 16001-15 | |
| Hemostat | FST | 13014-14 | |
| Large dissection scissors | Ted Pella Inc. | 1316 | |
| Small dissection scissors | FST | 14094-11 | |
| Blunt end forceps | Ted Pella Inc. | 13250 | |
| 7 ml glass Dounce tissue grinder | Kontes | KT885300-0007 | |
| Percoll Density Centrifugation Media | GE Healthcare | GE17-0891-01 | |
| 10 ml serological pipettes | Genesee Scientific | 12-104 | single use; sterile |
| 70 μm sterile nylon mesh cell strainers | Fisherbrand | 22363548 | |
| Alexa Fluor 700-conjugated rat anti-mouse CD45 (clone: 30-F11) | Biolegend | 103128 | |
| APC-conjugated mouse anti-mouse NK1.1 (clone: PK136) | eBiosciences | 17-5941-82 | |
| PE-conjugated rat anti-mouse Gr-1 (clone:RB6-8C5) | BD Pharmigen | 553128 | |
| PerCP/Cy5.5-conjugated rat anti-mouse CD11b (clone: M1/70) | Biolegend | 101228 | |
| Alexa Fluor 700-conjugated rat IgG2b, κ (clone: RTK4530) isotype control | Biolegend | 400628 | |
| APC-conjugated mouse IgG2a, κ (clone: eBM2a) isotype control | eBioscience | 17-4724 | |
| PE-conjugated rat IgG2b, κ (clone: eB149/10H5) isotype control | eBioscience | 12-4031-82 | |
| PerCP/Cy5.5-conjugated rat IgG2b, κ (clone: RTK4530) isotype control | Biolegend | 400632 | |
| Pacific Blue-conjugated mouse anti-mouse granzyme B (Clone: GB11) | Biolegend | 515403 | |
| Pacific Blue-conjugated mouse IgG1, κ (Clone: MOPC-21) isotype control | Biolegend | 400151 | |
| Cytofix/Cytoperm | BD | 554714 | |
| 15 ml polypropylene centrifuge tubes | Genesee Scientific | 21-103 | conical bottom |
| 50 ml polypropylene centrifuge tubes | Genesee Scientific | 21-108 | conical bottom |
| 12 mm x 75 mm round-bottom polypropylene FACS tubes | Fisherbrand | 14-956-1B | |
| FACSAria Special Order Research Product flow cytometer/cell sorter | BD | 650033 | |
| Class II Biological Safety Cabinet | The Baker Company | SG603 | model: SterilGARD III Advance |
References
- Bleeker, F. E., Molenaar, R. J., Leenstra, S. Recent advances in the molecular understanding of glioblastoma. J Neurooncol. 108, 11-27 (2012).
- Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N Engl J Med. 352, 987-996 (2005).
- Ostrom, Q. T., et al. CBTRUS statistical report: primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2007-2011. Neuro Oncol. 16, Suppl 4. iv1-63 (2014).
- Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523, 337-341 (2015).
- Kennedy, B. C., et al. Tumor-associated macrophages in glioma: friend or foe? J Oncol.. 2013, 486912 (2013).
- Markovic, D. S., Glass, R., Synowitz, M., Rooijen, N., Kettenmann, H. Microglia stimulate the invasiveness of glioma cells by increasing the activity of metalloprotease-2. J Neuropathol Exp Neurol. 64, 754-762 (2005).
- Zhai, H., Heppner, F. L., Tsirka, S. E.
- Kmiecik, J., et al. Elevated CD3+ and CD8+ tumor-infiltrating immune cells correlate with prolonged survival in glioblastoma patients despite integrated immunosuppressive mechanisms in the tumor microenvironment and at the systemic level. J Neuroimmunol. 264, 71-83 (2013).
- Yang, I., Han, S. J., Sughrue, M. E., Tihan, T., Parsa, A. T. Immune cell infiltrate differences in pilocytic astrocytoma and glioblastoma: evidence of distinct immunological microenvironments that reflect tumor biology. J Neurosurg. 115, 505-511 (2011).
- Wagner, S., et al. Microglial/macrophage expression of interleukin 10 in human glioblastomas. Int J Cancer. 82, 12-16 (1999).
- El Andaloussi, A., Lesniak, M. S. An increase in CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cells in tumor-infiltrating lymphocytes of human glioblastoma multiforme. Neuro Oncol. 8, 234-243 (2006).
- Kostianovsky, A. M., Maier, L. M., Anderson, R. C., Bruce, J. N., Anderson, D. E. Astrocytic regulation of human monocytic/microglial activation. J Immunol. 181, 5425-5432 (2008).
- Curtin, J. F., et al. HMGB1 mediates endogenous TLR2 activation and brain tumor regression. PLoS Med. 6, e10 (2009).
- Curtin, J. F., et al. Fms-like tyrosine kinase 3 ligand recruits plasmacytoid dendritic cells to the brain. J Immunol. 176, 3566-3577 (2006).
- Mineharu, Y., et al. Engineering the brain tumor microenvironment enhances the efficacy of dendritic cell vaccination: implications for clinical trial design. Clin Cancer Res. 17, 4705-4718 (2011).
- Larocque, D., et al. Exogenous fms-like tyrosine kinase 3 ligand overrides brain immune privilege and facilitates recognition of a neo-antigen without causing autoimmune neuropathology. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 14443-14448 (2010).
- Curtin, J. F., et al. Treg depletion inhibits efficacy of cancer immunotherapy: implications for clinical trials. PLoS One. 3, e1983 (2008).
- Ali, S., et al. Combined immunostimulation and conditional cytotoxic gene therapy provide long-term survival in a large glioma model. Cancer Res. 65, 7194-7204 (2005).
- Dewey, R. A., et al. Chronic brain inflammation and persistent herpes simplex virus 1 thymidine kinase expression in survivors of syngeneic glioma treated by adenovirus-mediated gene therapy: implications for clinical trials. Nat Med. 5, 1256-1263 (1999).
- Baker, G. J., et al. Natural killer cells eradicate galectin-1-deficient glioma in the absence of adaptive immunity. Cancer Res. 74, 5079-5090 (2014).
- Baker, G. J., et al. Mechanisms of glioma formation: iterative perivascular glioma growth and invasion leads to tumor progression, VEGF-independent vascularization, and resistance to antiangiogenic therapy. Neoplasia. 16, 543-561 (2014).
- Ormerod, M. G., Novo, D. Flow cytometry : a basic introduction. , (2008).
- Stirling, D. P., Yong, V. W. Dynamics of the inflammatory response after murine spinal cord injury revealed by flow cytometry. J Neurosci Res. 86, 1944-1958 (2008).
- Hirai, T., et al. The prevalence and phenotype of activated microglia/macrophages within the spinal cord of the hyperostotic mouse (twy/twy) changes in response to chronic progressive spinal cord compression: implications for human cervical compressive myelopathy. PLoS One. 8, e64528 (2013).
- Fleming, T. J., Fleming, M. L., Malek, T. R. Selective expression of Ly-6G on myeloid lineage cells in mouse bone marrow. RB6-8C5 mAb to granulocyte-differentiation antigen (Gr-1) detects members of the Ly-6 family. J Immunol. 151, 2399-2408 (1993).
- Wiesner, S. M., et al. De novo induction of genetically engineered brain tumors in mice using plasmid DNA. Cancer Res. 69, 431-439 (2009).
- Holland, E. C., et al. Combined activation of Ras and Akt in neural progenitors induces glioblastoma formation in mice. Nat Genet. 25, 55-57 (2000).
- Lynes, J., et al. Lentiviral-induced high-grade gliomas in rats: the effects of PDGFB, HRAS-G12V, AKT, and IDH1-R132H. Neurotherapeutics. 11, 623-635 (2014).
- de Vries, N. A., et al. Rapid and robust transgenic high-grade glioma mouse models for therapy intervention studies. Clin Cancer Res. 16, 3431-3441 (2010).
- Uhrbom, L., et al. Ink4a-Arf loss cooperates with KRas activation in astrocytes and neural progenitors to generate glioblastomas of various morphologies depending on activated Akt. Cancer Res. 62, 5551-5558 (2002).
- Marumoto, T., et al. Development of a novel mouse glioma model using lentiviral vectors. Nat Med. 15, 110-116 (2009).
- Assanah, M., et al. Glial progenitors in adult white matter are driven to form malignant gliomas by platelet-derived growth factor-expressing retroviruses. J Neurosci. 26, 6781-6790 (2006).
