Introduction
Ранняя эмбриональная потеря в высокопродуктивных молочных коров является одной из основных проблем в молочной промышленности 1, 2. Бычий стала интересной моделью для изучения развития предимплантационной эмбрионов человека из - за их подобного процесса развития 3, 4. Тем не менее, требуются дальнейшие исследования, чтобы иметь лучшее представление о генах, участвующих в коровьем раннего эмбрионального развития.
Через двадцать лет после первой технологии микрочипов разработан в 1995 году 5, разработка более совершенных технологий изготовления зонда уменьшенных ошибок и изменчивости чипов массива внутри , так и между различными микрочипов платформ 6 печати. Усовершенствованная технология микрочипов привело к широко применения этой технологии в области клинических исследований 7 и совсем недавно, в начале эмбриона дОценка uality 8.
Большое количество необходимого материала для микрочипов технологии является основной причиной, почему технология микрочипов изначально не удалось ввести ряд научно-исследовательских областях, таких, как раннее эмбриональное развитие. Совсем недавно, методы амплификации РНК были улучшены линейно усиливать РНК до уровня микрограммов из суб-нанограмм исходного материала РНК 9. Есть несколько коммерческих наборов РНК амплификации на рынке; Тем не менее, более популярные хорошо разработанные комплекты связаны с Рибо-Single Праймер изотермическом Amplification 10 и T7 промотор приводом 11 методов. Самой популярной антисмысловых РНК амплификации использует в пробирке транскрипции с олиго - дТ праймера , соединяющего с Т7 промотора на 5 'конце 12. Эта технология позволяет поддерживать наиболее представительных антисмысловых транскриптов после линейного усиления Fили массивы гибридизация 13. Этот метод был адаптирован для усиления пикограммов уровня тотальной РНК , выделенной из бычьего эмбриона 8.
Универсальная система Рычажный (ULS) является метод маркировки , который непосредственно включает ДНК или РНК , амплифицированной с платиной-сшитый флуоресцентного красителя либо цианиновыми 547 или цианиновыми 647, путем формирования координационную связь на N7 положении гуанина 14. Этот метод был адаптирован в исследовании эмбрионов для создания более стабильной усиливается Арна без изменений по сравнению с aminoallyl модифицированным Арна , порожденного ферментативным способом 15. Оба одного красителя и маркировки два красители методы были адаптированы с помощью универсальной системы Linkage в микрочипе. Большое исследование микрочипов сравнения в том , что существует хорошая корреляция качества данных между одно- и двухцветных массива платформ 6.
В последнее время, как Т7 промотор приводаN антисмысловой РНК амплификации и мечения ULS методы были разработаны , чтобы обеспечить более надежный протокол для создания достаточного количества высококачественных меченый ARNA материалов для микрочипов гибридизации 8, 16. Таким образом, данное исследование обеспечивает протокол, чтобы продемонстрировать некоторые из важных этапов от экстракции РНК к анализу данных, участвующих в двухцветной микрочипов с использованием 7-й день эмбрионы крупного рогатого скота в качестве примера.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Животное часть этого исследования была проведена на исследовательское подразделение Метаболический Университета Альберты, Эдмонтон, Канада, со всеми экспериментальными процедурами животных утвержден (Протокол № AUP00000131) Университета Альберты уходу и использованию животных комитета, и животные заботятся в соответствии в канадский совет руководящих принципов по уходу за животными (1993).
1. Эмбрион Производство, Выделение тотальной РНК и ДНКазы лечения
- Для экспериментальных протоколов животных и сбора эмбрионов см в наших предыдущих публикациях 17, 18.
- Бассейн и оснастке замораживать подобные эмбрионы стадии от каждой коровы в жидком азоте, а затем хранить при -80 ° C до экстракции РНК.
- Экстракт тотальной РНК с помощью набора для экстракции РНК колонке на основе , которая позволяет извлекать РНК из пико масштаба образцов (комплект информационных материалов доступен в список материалов).
Примечание: Рекомендуемый набор содержит: Кондиционер Буфер, извлечение BufFER, 70% этилового спирта, промывочный буфер 1, промывочного буфера 2, буфера для элюции, колонны очистки РНК со сбором трубок и микропробирок. - Добавьте 10 мкл буфера для экстракции в пробирку, содержащую эмбрионов и инкубировали в течение 30 мин при 42 ° С. Центрифуга трубки при 800 мкг в течение 2 мин для сбора клеточного экстракта в микроцентрифужных трубки.
- Пипетировать 250 мкл буфера для кондиционирования на мембрану Очистка на колонке фильтра. Выдержите колонны очистки РНК с Conditioning буферным раствором в течение 5 мин при комнатной температуре. Центрифуга колонны очистки в пробирку при 16000 мкг в течение 1 мин.
- Пипетка по 10 мкл 70% этанола в смесь РНК-экстракционном буфере и эмбрионов. Хорошо перемешать с помощью пипетки вверх и вниз. Пипетка смесь в переобусловленного колонне очистки.
- Для связывания РНК, Центрифуга колонны очистки в течение 2 мин при 100 х г и следуют непосредственно за центрифугированием при 16000 х г в течение 30 с, чтобы удалить поток через.
- Пипетка 10081, L промывочного буфера 1 в колонну очистки и центрифугировать в течение 1 мин при 8000 х г.
Примечание: ДНКазы лечение рекомендуется при проведении обратной транскрипции или амплификации после выделения РНК. - Дайджест геномную ДНК сразу после шага 1.8.
Примечание: Рекомендуется ДНКазы комплект доступен в списке материалов. Рекомендуемый комплект содержит: маточный раствор ДНКазы I и буфера. - Подготовка ДНКазную инкубационный смеси путем смешивания 5 мкл ДНКазы I исходного раствора с 35 мкл буфера. Смешайте аккуратно переворачивая.
- Внесите мкл ДНКазы инкубационную смесь 40 непосредственно в мембрану колонны очистки. Инкубируют при комнатной температуре в течение 15 мин.
- Пипетка 40 мкл промывочного буфера 1 в мембрану колонку очистки, а затем центрифуге при 8000 мкг в течение 15 сек.
- Пипетка 100 мкл промывочного буфера 2 в колонну очистки и центрифугировать в течение 1 мин при 8000 х г.
- Пипетировать еще 100 мкл моющего буфера 2 в колонну очистки и центрифугев течение 2-х минут при 16000 х г.
- Перенести колонны очистки на новый 0,5 мл микроцентрифужных трубки. Пипетка 11 мкл буфера для элюции непосредственно на мембрану колонны очистки. Для того, чтобы обеспечить максимальное поглощение Буфера для элюции в мембрану, осторожно потрогать кончик пипетки к поверхности мембраны, в то время дозирования элюирующего буфера.
- Инкубируйте колонку в течение 1 мин при комнатной температуре. Центрифуга колонку в течение 1 мин при 1000 х г распределить буфера для элюции в колонке, а затем вращаться в течение 1 мин при 16000 х г для элюции РНК.
- Используйте Bioanalyzer прибор в соответствии с инструкциями изготовителя , чтобы оценить качество и количество РНК 19.
- Хранить образцы РНК при температуре -80 ° С до использования.
2. РНК и амплификация Этикетировочное для Microarray анализа
Примечание: Для первого пользователя время работы с процедурами амплификации РНК и маркировки, используют пять нг шип-РНК в АОТнг с фактическими образцами Арна для мониторинга измерения контроля качества РНК-амплификации и гибридизации. Шип-РНК в смеси содержит десять в пробирке синтезированные, Полиаденилированная транскриптов в заранее определенном соотношении. Когда процедура выполняется должным образом, меченые транскрипты специфически гибридизоваться только с комплементарными зондами управления в массивах, и данные могут быть отсканированы для отслеживания обеспечения качества управления с минимальным само- или перекрестной гибридизации. Подробнее описание относительно пичковый в интенсивности контроля и нормализации процедуры после сканирования массива и анализа данных является ссылаться на предыдущие публикации 20, 21. Следующая процедура дается рутинных пользователей микрочипов.
- Приготовьте (значение числа РНК Целостность (РИН) по крайней мере> 7,0) высокое качество 100 пг образец РНК в общем объеме 10 - 11 мкл.
- Amplify образцы РНК с помощью комплекта усиления возможностиработать с пико масштаба образцов (всего лишь 100 пг).
Примечание: Рекомендуемый комплект информационных усиления доступен в списке материалов и следует инструкциям изготовителя без каких-либо изменений. - С помощью флуоресцентного на основе количественного для оценки профиля диапазона размера амплифицированного АРНА.
- С помощью спектрофотометра инструмент (на основании оптической плотности при 260 и 280 нм) для измерения концентрации усиливаемого АРНА.
- Хранить усиленную ARNA при -80 ° С до готовности к маркировке.
- Используйте 2 мкг амплифицированной РНК для флуоресцентной маркировки в соответствии с ULS Арна комплект маркировки инструкция пользователя.
Примечание: Так как цианиновыми 547 и 647 цианиновыми краситель чувствительны к фото-деградации и цианиновыми 647 краситель легко разрушается озоном, процедура маркировки происходит в минимальном количестве света и под озоновой свободной среды. - Включите поле озона (рис 1А) , пока уровень озона составляет 0,001 частей на миллион.
- Осторожно перемешать и инкубировать пробирки в амплификатор при 85 ° С в течение 15 мин. Место образцы на льду в течение не менее 1 мин. Спин вниз собрать содержимое пробирки перед продолжением набора для экстракции РНК, за исключением шагов, связанных с лечением ДНКазы (от 1.9 до 1.11), для очистки Cy-краситель-меченого амплифицированной РНК.
- С помощью спектрофотометра прибор для измерения и определения концентрации меченого амплифицированной РНК и держать меченый ARNA при -80 ° C максимум в течение 3-х дней перед использованием.
3. Microarray гибридизацию и промывку
Примечание: Следующие важные шаги адаптированы в соответствии с Двухцветный микрочипов на основе анализа экспрессии генов протокола (версия6.5, май 2010 г.).
- Добавить равное количество 825 нг каждого из цианиновыми 547- и цианиновыми 647-меченого Арна и смешать с 25х и 10х фрагментации блокировки буферов.
- Нагревают смесь при 60 ° С в течение 15 мин и охладили на льду в течение 1 мин.
- Добавить равное количество 2х буфера гибридизации и хорошо перемешать.
- Центрифуга при 13000 оборотов в минуту, после чего смесь готова к гибридизации.
- Нагрузка 100 мкл из смеси на слайде массива и запечатать слайд внутри камеры гибридизации.
- Загрузите в собранном виде камеры в печи гибридизации в течение 17 ч при температуре 65 ° C вращается со скоростью 10 оборотов в минуту в печи.
- Вымойте массивы в соответствии с протоколом с обработкой защиты озонового слоя путем погружения в стабилизации и высушивания раствора в течение 30 сек.
- Удалите массивы из раствора и убедитесь, что поверхность массива сухой, без каких-либо частиц пыли
4. Сканирование микрочипов слайдов
- Держите массивы в темном месте и включите scannэр, пока он не будет готов к использованию (15 мин время ожидания).
- Загрузите штрих-код массива на левой стороне, в сканер и запустите процесс сканирования. Сделайте анализ пятна в соответствии с руководством пользователя программного обеспечения и сохранить данные в виде (GPR) формат файла.
5. Статистический анализ
- Загрузите программное обеспечение FlexArray http://genomequebec.mcgill.ca/FlexArray/license.php~~HEAD=dobj Нажмите на кнопку "импорта необработанных данных" и загружать файлы GPR в FlexArray.
- Выполните нормализацию и статистический анализ, если это необходимо, следуя инструкциям. Примечание: Вычислить порог для положительного отбора спот в данном исследовании , как это было описано ранее 22.
- Выберите выпадающий руководстве от зрителя сюжету FlexArray, чтобы просмотреть все гибридизированных пятна и фоновые сигналы. Примечание: Аналогичная картина колосовых в контрольной группе после гибридизации с микрочипом можно увидеть в предыдущем исследовании , 8.
- ВыберитеЛёссовое нормализация внутри массива последующим квантиль между процессом нормализации массивов из FlexArray выпадающий руководство соответствующим образом.
- Экспортировать все нормированные данные из FlexArray в Excel файл для дальнейшего использования.
6. Биоинформатика анализ
Оригинальный аннотирование зонда последовательностей из бычьих эмбрион конкретных транскриптов (BESTv1) микрочипов было описано ранее 8. В настоящем исследовании, были получены 20,403 уникальные символы генов (GS) ( Дополнение File1 ) через Систему EmbryoGENE Laboratory Information Management (LIMS) ELMA (http://elma.embryo-gene.ca). Список 6765 уникальных генов ( Дополнение File2 ) был выбран и соответствовал всем положительных сигналов после процесса нормализации микрочипов (шаг 50,5) из бычьей День 7 гена эмбрионы профиля экспрессии. Порог Положительный сигнал был рассчитан на основе проницаемым публикации 16 от интенсивности сигнала значением A.
- Для проведения функционального анализа с PANTHER (Protein анализу на основе эволюционные отношения) система классификации 23, 24, откройте следующую ссылку (http://www.pantherdb.org/about.jsp~~HEAD=dobj).
- Загрузить список 6765 эмбрионов конкретных GS для идентификации конкретного биологического процесса во время эмбрионального развития с использованием статистического теста доминированию и использовать настройки по умолчанию парнокопытных (все гены в базе данных) в виде списка ссылок 25.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это позволяет идентифицировать связанные с развитием процессов с точки зрения ГО, которые статистически завышения или занижения выражается с помощью биномиального теста. - Порог Установите P-значение в <0,05 в качестве программного обеспечения по умолчанию. Данные могут быть загружены и экспоrted в файл Excel для последующего выбора 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Репрезентативный результат тотальной РНК и усиливаемого Арна из 7 -й день эмбрионов крупного рогатого скота показана на рисунке 3 и в таблице 1.
целостности и профиль РНК может быть оценена после экстракции РНК. Оценка качества РНК может быть сделано с помощью Bioanalyzer инструмента (фиг.3А) , и только те образцы с значением RIN выше 7,0 имеют право быть использованы для амплификации (таблица 1).
Качество и количество амплифицированной РНК должна быть оценена после амплификации. Сходство усиливаемого профиля РНК и соответствующего диапазона размеров являются основными факторами для контроля качества (рис 3B). После двух круглых амплификации амплифицированные фрагменты РНК очень похожи по размеру, в пределах от 200 до 800 пар оснований (рис 3B) ивсе ARNAS подобного диапазона размеров выбираются для дальнейшей маркировки флуоресценции. Кроме того , успешное усиление исходной тотальной РНК даст по крайней мере , более чем в тысячу раз увеличение Арна (таблица 1).
Эффективность маркировки флуоресценция может быть рассчитана в соответствии со степенью соотношения маркировки. Формулу расчета можно получить в комплекте этикетирование инструкция пользователя ULS Арна. Руководство пользователя предполагает степень соотношения маркировки должна составлять 1,0 - 3,6%, что свидетельствует о том, что в среднем 1 - 3,6 молекул ULS на 100 нуклеотидов.
Файлы изображений после гибридизации и сканирования можно рассматривать с FlexArray. Хорошее качество отсканированного изображения после микрочипов гибридизации и промывки показан на рисунке 4A. Если меченые материалы выше или ниже этого диапазона, сигналы будут слишком низкими, чтобы обнаружить или высокий уровень фона будет обнаружен после того, как scanniнг (Рисунок 4B).
В текущем исследовании, положительный порог сигнала был установлен на уровне 7,6 (зонда сигнала выше, чем 7,6 или фона <7,6 считается положительным). Примерно 46% из наборов зондов , представляющих 20826 положительные пятна обозначены красным цветом в коровьем День 7 эмбрионов (Рисунок 5). После удаления символов Неаннотированный и дубликат гена, только 6765 уникальных символов генов остается для анализа Panther.
Эти гены 6765 представляют собой уникальные РНК-транскриптов, выраженные в бычьей бластоцисты День 7. Для того чтобы найти биологический процесс, специфичные для крупного рогатого скота бластоцисты, ПАНТЕРА перепредставленности Тест выполняется. Лучшие 10 Джин Онтология (ГО) термин идентификаторы с самым высоким индексом обогащения складка выбран (рисунок 6). В общем случае, эти специфические термины GO в основном представляют собой активный процесс клеточного деления, такие как mitosis и сегрегации хромосом, регуляция клеточного цикла и начало цитоплазматической и митохондриальной трансляции.
Рисунок 1: Озон свободной коробки (А) и массив Этикетировочное реакции (В). A) Озон Свободная ячейка состоит из каталитического блока преобразователя , который перерабатывает воздух и разрушает озон и высокочувствительный датчик озона для мониторинга уровня озона внутри коробки во время исполнения микрочипов. Б) Процедура маркировки и гибридизацию массива выполняют внутри коробки , чтобы избежать флуоресцентного цианиновыми 647 деградации красителя по озону. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Представитель Bioanalyzer Electropherogram тотальной РНК (А) , и гель изображение усиленных РНК (В). A) Отображение общего результата со значением Рин, концентрации РНК и соотношение рРНК. Б) Профиль амплифицированной РНК после того, как два тура амплификации. Амплифицированные фрагменты РНК, как ожидается, будет в диапазоне от 200 до 800 пар оснований. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4: Изображение Массив Intensity Map. (A) Хороший образ слайд массива , показывающий зеленый и красный канал соответствуют цианиновыми 547 и цианиновыми 647 сигналов после сканирования с высокой интенсивностью пятна (указанного слева с синим зеленым цветом) и низким уровнем фона (отображается справа с темно - синий цвет). (Б) Неудачный образ слайд массива показывает очень высокое фоновое изображение из красного канала (указывается из верхней панели с аналогичным синим зеленого цвета с изображением цианиновыми 647 интенсивности пятна). Диаграмма цвета указывает интенсивность сигнала с числовыми значениями, соответствующими различным цветам. Значение интенсивности сигнала является самым низким в диапазоне от темно-синего цвета. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть большоег версии этой фигуры.
Рисунок 5: MA Участок для 7 -й день бычьего Эмбрион Gene Expression Profile. 20.826 красные пятна представлены положительные сигналы выше фоновых сигналов. Фон пятна выделены черным цветом. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 6: Идентификаторы Срочные Top 10 Генная Онтология (ГО) с самым высоким вислоухая индекс по обогащению урана. Эти специфические термины GO в основном представляют собой активный процесс клеточного деления, такие как митоза и сегрегации хромосом, регуляции клеточного цикла и начало цитоплазматический и митохондриальный транстаже. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
| Образец | Количество эмбрионов | Тип | Эмбрион морфологическое качество | Концентрация РНК (пг / мкл) | РИН | Б общей РНК для амплификации (пг) | Концентрация Усиленный РНК (нг / мкл) | ||||||||
| S1 | 4 | бластоциста | Оценка 1 & 2 | 101 | 8.6 | 858,5 | 3498,4 | ||||||||
| S2 | 1 | бластоциста | 2-й класс | 142 | 7.4 | 1207 | 1682,4 | S3 | 2 | бластоциста | 1-й класс | 135 | 8,8 | 1147,5 | 3185,3 |
| S4 | 3 | бластоциста | 1-й класс | 177 | 9 | 1504,5 | 2906,4 | ||||||||
| S5 | 5 | бластоциста | 1-й класс | 636 | 8.3 | 5406 | 3437,5 | ||||||||
| S6 | 3 | бластоциста | Оценка 1 & 2 | 159 | 9.1 | 1351,5 | 1689,8 | ||||||||
| S7 | 3 | бластоциста | 1-й класс | 154 | 9 | 1309 | 4507,1 | ||||||||
| S8 | 4 | бластоциста | 1-й класс | 304 | 8.5 | 2584 | 3089,3 | ||||||||
| S9 | 5 | бластоциста | 1-й класс | 282 | 9.1 | 2397 | 3917,8 | ||||||||
| S10 | 6 | бластоциста | Оценка 1 & 2 | 374 | 9.4 | 3179 | 2979 | ||||||||
| S11 | 5 | бластоциста | 1-й класс | 272 | 9.3 | 2312 | 2576 | ||||||||
| S12 | 3 | бластоциста | 1-й класс | 206 | 9 | 1751 | 2567,9 |
Таблица 1: Образец и информации РНК. Концентрация и качество РНК должна быть оценена после экстракции. Целостность РНК и концентрация может быть оценена с помощью любого Bioanalyzer. номер целостности РНК должна быть больше, чем 7,0. Концентрация РНК должна быть рассмотрена спектрофотометра прибора после усиления. ЭмбриКачество O оценивали в соответствии с Руководством Международного общества переноса эмбрионов (3 - е изд., Savoy, IL).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Первая проблема, для выполнения анализа микрочипов с использованием 7-й день эмбрионы крупного рогатого скота не получает достаточного количества РНК высокой качества для изучения экспрессии генов. Выделение РНК Традиционная фенол / хлороформ и способ осаждения этанолом не рекомендуется для 7-й день эмбрионов, что приводит к низкой урожайности и возможной остаточному фенола, ингибирующих реакции амплификации РНК. Вместо этого стандартный метод на основе столбца лучше изолировать общую РНК, а затем элюировать РНК с минимальным элюирующего буфера для увеличения концентрации. В среднем 780 мкг общей РНК на эмбрион , полученный в текущем исследовании , которое сопоставимо с другими отчетами с использованием идентичной методологии 26 и набора для экстракции РНК же 27, 28 , используемый в настоящее время . Для экстракции РНК, рекомендуется для растворения осадка перед использованием тщательно перемешивая или нагреть флакон буфера для экстракции повторно растворить экстракционный буфер передиспользовать. Кроме того, время инкубации также имеет важное значение для урожая РНК на стадии экстракции. Время инкубации меньше, чем полный 30 мин при 42 ° С снижается выход РНК.
В колонке ДНКазы пищеварение необходимо для удаления загрязнения геномной ДНК во время полной очистки РНК. ДНКазы фермент очень чувствителен к вихревым и центрифугой. Поэтому, ДНКазы и буфер должен быть смешан аккуратно переворачивая.
Качество РНК очень важно при анализе микрочипов и образцы с RIN ниже 7 не следует рассматривать для гибридизации. В настоящем исследовании, суммарные профили РНК , полученные с помощью Bioanalyzer аналогичны тем , которые наблюдались ранее в исследованиях из бычьих бластоцист 26, 27. Стоит отметить, что при использовании предварительно вылупились эмбрионов, особенно РНК, полученной из ооцитов и эмбрионов перед материнскими эмбриональным перехода, значение Рин часто ниже, чем 7 по сравнениюк тотальной РНК из эмбрионов 7 -й день и это связано с изменением в соотношении 28S / 18S рРНК 27.
Количество извлеченного РНК из эмбрионов коров не является достаточным для платформы гибридизации, следовательно, требуется РНК амплификации. Есть несколько методов , доступных для амплификации РНК , такие как ПЦР, в пробирке транскрипции (ИВТ) и рибо-SPIA (один праймер изотермические амплификации). Хотя последний способ быстрее и в один день , обеспечивает достаточное количество материала для массивов, то требуется , по меньшей мере 5 нг в качестве исходного материала 29. Таким образом, мы выбрали метод IVT , который способен работать при низких исходных материалов 12 ( всего лишь 100 пг). Более того, она уже была испытана для амплификации общей РНК , выделенной из бычьего эмбриона успешно 29. В настоящем исследовании, наш метод усиления производства ~ 28 мкг амплифицированной РНК на эмбрион от 598 пг общей РНК в зародыше. сложения инаконец, после двух круглых усиления, наши образцы показали аналогичный профиль и соответствующий диапазон размеров (от 200 до 800 б.п.) , которые находятся в согласии с предыдущими исследованиями , 13, 15.
В этом протоколе, мы использовали неферментативного протокола маркировки, платины связаны цианиновыми (цианиновыми 547 и цианиновыми 647) красители. Этот метод позволяет маркировать или усиливаемого неамплифицированный РНК. Имея стадию амплификации до маркировки позволяет использовать природные нуклеотиды, что приводит к повышению урожайности амплифицированных РНК, уменьшают смещение и генерировать более длинные фрагменты по сравнению с ферментативным способом. Цианинового 547 и 647 цианиновыми красители являются общими флуоресцентные красители рекомендуют для двухцветного массива. Тем не менее, цианиновыми 647 краситель является чувствительным к деградации озона. Ручной монитор озона следует использовать, чтобы убедиться, что уровень озона ниже 2 частей на миллиард. Кроме того, без пыли окружающей среды необходимо, чтобы избежать частиц пыли попадания в растворе для гибридизации или Дуринг сканирования.
Microarray эксперимент может быть выполнен в одно- или двухцветной подхода. Каждый экспериментальный подход имеет некоторые преимущества и недостатки. Использование двухцветных конструкций снижает изменчивость и фоновый шум, позволяет для прямого сравнения и цикл конструкций с определением общего эталонного образца. Хотя краситель конкретных уклоны могут существенно повлиять на результаты, когда эксперименты выполняются с помощью двухцветных конструкций, эти уклоны могут быть смягчены путем выполнения красителях свопы. Такая техническая репликация добавляет к экспериментальным затрат, но может повысить как точность и чувствительность при измерении дифференциальной экспрессии 31.
Сравните с другими биоинформатики программного обеспечения (например, Gorilla) PANTHER позволяет сравнивать набор данных с парнокопытных геном в качестве ссылки. Наши результаты указывают на то, что во время 7-й день эмбрионального развития крупного рогатого скота следующие биологические компоненты и функции участвуют: регулирование метафазы / ANAPHase переход клеточного цикла, регулирование перехода митотической метафаза / анафазы, регулирование сегрегации хромосом, митохондриальный перевод, белок K48-сшитый убиквитинирование, ER к Golgi везикул-опосредованной транспорт, катаболический процесс ядерного транскрипции мРНК, инициации трансляции, митотический сестра хроматид сегрегации , митотический ядерного деления.
Протоколы, представленные в данной работе, от флуоресцентной маркировки усиливаемого РНК к сканированию массивов должны быть выполнены с дополнительным осознанием вышеуказанных факторов внешней среды для поддержания данных высокого качества.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | KIT0204 | |
| RNase-Free DNase Set (50) | Qiagen | 79254 | |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| Arcturus RiboAmp HS PLUS Kit | Applied Biosystems | KIT0505 | |
| 2100 Bioanalyzer Instruments | Agilent Technologies | G2940CA | |
| RNA Screen Tape | Agilent Technologies | 5067-5576 | |
| ULS Fluorescent Labeling Kit | Kreatech Diagnostics | EA-021 | |
| Custom Gene Expression Microarrays | Agilent Technologies | G2514F | |
| Agilent Gene Expression wash buffer 1 | Agilent Technologies | Part #5188-5325 | |
| Agilent Gene Expression wash buffer 2 | Agilent Technologies | Part #5188-5326 | |
| 2x Hi-RPM Hybridization buffer | Agilent Technologies | Part #5190-0403 | |
| 25x Fragment buffer | Agilent Technologies | Part #5185-5974 | |
| 10x GE Blocking Agent | Agilent Technologies | Part #5188-5281 | |
| Stabilization and drying solution | Agilent Technologies | Part #5185-5979 | |
| Gasket slides enabled by Agilent SureHyb techonolgy | Agilent Technologies | G2524-60012 | Pack of 20 gasket slides, 4 microarrays/slide |
| Two-Color RNA Spike-In Kit | Agilent Technologies | Cat# 5188-5279 | |
| GenePix 4000B array scanner | Molecular Devices | GENEPIX 4000B-U | |
| Ozone Free Box | BioTray | OFB_100x200 | |
| GAL file | Agilent Technologies | - |
References
- Royal, M. D., Smith, R. F., Friggens, N. C. Fertility in dairy cows: bridging the gaps. Animal. 2 (08), 1101-1103 (2008).
- Diskin, M. G., Murphy, J. J., Sreenan, J. M. Embryo survival in dairy cows managed under pastoral conditions. Anim. Reprod. Sci. 96 (3-4), 297-311 (2006).
- Wrenzycki, C., et al. Effects of culture system and protein supplementation on mRNA expression in pre-implantation bovine embryos. Hum. Reprod. 16 (5), 893-901 (2001).
- Menezo, Y. J., Herubel, F. Mouse and bovine models for human IVF. Reprod. Biomed. Online. 4 (2), 170-175 (2002).
- Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science. 270 (5235), 467-470 (1995).
- Patterson, T. A., et al. Performance comparison of one-color and two-color platforms within the MicroArray Quality Control (MAQC) project. Nat. Biotechnol. 24 (9), 1140-1150 (2006).
- Rhodes, D. R., Chinnaiyan, A. M.
- Robert, C., et al. Combining resources to obtain a comprehensive survey of the bovine embryo transcriptome through deep sequencing and microarrays. Mol. Reprod. Dev. 78 (9), 651-664 (2011).
- Nygaard, V., Hovig, E. Options available for profiling small samples: a review of sample amplification technology when combined with microarray profiling. Nucleic Acids Res. 34 (3), 996-1014 (2006).
- Kurn, N., Chen, P., Heath, J. D., Kopf-Sill, A., Stephens, K. M., Wang, S. Novel isothermal, linear nucleic acid amplification systems for highly multiplexed applications. Clin Chem. 51 (10), 1973-1981 (2005).
- Van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., Yool, A., Dement, W. C., Barchas, J. D., Eberwine, J. H. Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA. Proc. Natl. Acad. Sci. 87 (5), 1663-1667 (1990).
- Phillips, J., Eberwine, J. H. Antisense RNA Amplification: A linear amplification method for analyzing the mRNA population from single living cells. Methods. 10 (3), 283-288 (1996).
- Gilbert, I., Scantland, S., Dufort, I., Gordynska, O., Labbe, A., Sirard, M. A., Robert, C. Real-time monitoring of aRNA production during T7 amplification to prevent the loss of sample representation during microarray hybridization sample preparation. Nucleic Acids Res. 37 (8), 65 (2009).
- Gijlswijk, R. P., Talman, E. G., Jansse, P. J., Snoeijers, S. S., Killian, J., Tanke, H. J., Heetebrij, R. J. Universal Linkage System: versatile nucleic acid labeling technique. Expert Re. Mol. Diagn. 1 (1), 81-91 (2001).
- Gilbert, I., Scantland, S., Sylvestre, E. L., Dufort, I., Sirard, M. A., Robert, C. Providing a stable methodological basis for comparing transcript abundance of developing embryos using microarrays. Mol. Hum. Reprod. 16 (8), 601-616 (2010).
- Tsoi, S., et al. Development of a porcine (Sus scofa) embryo-specific microarray: array annotation and validation. BMC Genomics. 13, 370 (2012).
- Salehi, R., et al. Superovulatory response and embryo production in Holstein cows fed diets enriched in oleic, linoleic or α-linolenic acid. Reprod. Fertil. Dev. 26 (1), 218-218 (2013).
- Thangavelu, G., Colazo, M. G., Ambrose, D. J., Oba, M., Okine, E. K., Dyck, M. K. Diets enriched in unsaturated fatty acids enhance early embryonic development in lactating Holstein cows. Theriogenology. 68 (7), 949-957 (2007).
- Agilent 2100 Bioanalyzer User's Guide. , Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2946-90004_Vespucci_UG_eBook_(NoSecPack).pdf (2016).
- Kerr, K. F. Extended analysis of benchmark datasets for Agilent two-color microarray. BMC Bioinformatics. 8, 371 (2007).
- Zhu, Q., Miecznikowski, J. C., Halfon, M. S. A wholly defined Agilent microarray spike-in dataset. Bioinformatics. 27 (9), 1284-1289 (2011).
- Vallee, M., Gravel, C., Palin, M. F., Reghenas, H., Stothard, P., Wishart, D. S., Sirard, M. A. Identification of novel and known oocyte-specific genes using complementary DNA subtraction and microarray analysis in three different species. Biol. Reprod. 73 (1), 63-71 (2005).
- Thomas, P. D., et al. PANTHER: a library of protein families and subfamilies indexed by function. Genome Res. 13 (9), 2129-2141 (2003).
- Mi, H., et al. The PANTHER database of protein families, subfamilies, functions and pathways. Nucleic Acids Res. 33, 284-288 (2005).
- Mi, H., Muruganujan, A., Casagrande, J. T., Thomas, P. D. Large-scale gene function analysis with the PANTHER classification system. Nat. Protoc. 8, 1551-1566 (2013).
- Ross, P. J., Wang, K., Kocabas, A., Cibelli, J. B. Housekeeping gene transcript abundance in bovine fertilized and cloned embryos. Cell Reprogram. 12 (6), 709-717 (2010).
- Gilbert, I., et al. The dynamics of gene products fluctuation during bovine pre-hatching development. Mol. Reprod. Dev. 76, 762-772 (2009).
- Vallee, M., et al. Revealing the bovine embryo transcript profiles during early in vivo embryonic development. Reproduction. 138 (1), 95-105 (2009).
- Dafforn, A., et al. Linear mRNA amplification from as little as 5 ng total RNA for global gene expression analysis. Biotechniques. 37 (5), 854-857 (2004).
- Beaujean, N., Jammes, H., Jouneau, A. Nuclear Reprogramming. Studying Bovine Early Embryo Transcriptome by Microarray. Dufort, I., Rovert, C., Sirard, M. A. , Humana Press, Springer. NY. Chapter 15 (2015).
- Patterson, T. A., et al. Performance comparison of one-color and two-color platforms within the MicroArray Quality Control (MAQC) project. Nat. Biotechnol. 24 (9), 1140-1150 (2006).
