Introduction
Yüksek verimli sütçü sığırlarda erken embriyonik kayıp süt endüstrisi 1, 2 ana zorluklardan biridir. Sığır nedeniyle benzer gelişimsel süreç 3, 4 insan preimplantasyon embriyo gelişimini incelemek için ilginç bir model haline gelmiştir. Ancak, daha fazla araştırma sığır erken embriyonik gelişiminde rol oynayan genler hakkında daha iyi bir anlayış olması gerekir.
İlk mikrodizi teknolojisi bu yana yirmi yıl 1995 5 geliştirilen sonra daha sofistike prob üretim teknolojisi azaltılmış baskı hataları içinde ve farklı mikroarray platformları 6 arasında dizi yongalarının değişkenlik gelişimi. Geliştirilmiş mikrodizi teknolojisi erken embriyo q, son zamanlarda klinik araştırmalar 7 ve bu teknolojinin yaygın bir uygulama ile sonuçlanmıştıruality değerlendirmesi 8.
mikroarray teknolojisi için gerekli malzeme büyük miktarda mikroarray teknolojisi başlangıçta böyle erken embriyonik gelişme olarak araştırma alanları bir dizi giremedi ana nedeni olduğunu. Daha yakın zamanda, RNA amplifikasyon yöntemleri doğrusal RNA Başlangıç Maddesi 9 alt nanogram arasında mikrogram seviyesine kadar RNA amplifikasyonu için geliştirilmiştir. Piyasada bulunan birçok ticari RNA amplifikasyon kitleri vardır; Ancak, daha popüler iyi gelişmiş kitleri Ribo-Tek Primer İzotermal Amplification 10 ile ilgili ve T7 organizatörü 11 yöntemleri sürülür. En popüler antisens RNA amplifikasyonu 5 'ucunda 12 bir T7 promotörü bağlantılı bir oligo dT primeri ile in vitro transkripsiyonu ile kullanır. Bu teknoloji doğrusal amplifikasyon f sonra temsili bir anti-duyu transkript en muhafaza veriyorveya diziler melezleme 13. Bu yöntem, sığır embriyo 8 ekstrakte edilen toplam RNA pikogram seviyesini yükseltmek için adapte edilmiştir.
Evrensel Bağlantı Sistemi (ULS) doğrudan guanin 14 N7 pozisyonunda bir koordinatif bağ oluşturarak, platin bağlı flüoresan boya ya siyanin 547 veya cyanine 647 ile DNA veya RNA güçlendirilmiş içeren etiketleme yöntemidir. Bu yöntem, Arna enzimatik yöntem 15 tarafından üretilen tadil edilmiş aminoallyl göre değişiklik olmadan Arna amplifiye daha stabil oluşturmak için embriyolar araştırma uyarlanmıştır. Tek boya ve iki boyalar etiketleme Her iki yöntem mikroarray Evrensel Bağlantı Sistemi kullanılarak adapte edilmiştir. Büyük bir mikroarray karşılaştırmaları çalışma tek ve iki renkli dizisi platformları 6 arasındaki veri kalitesi iyi bir korelasyon olduğunu oldu.
Son zamanlarda, hem T7 yükseltici sürücün, antisens RNA amplifikasyonu ve uls etiketleme yöntemleri mikrodizi hibridizasyon 8, 16 için Arna malzeme etiketli yüksek kalitede yeterli miktarda üretmek için daha güvenilir bir protokol sağlamaktır geliştirilmiştir. Bu nedenle, bu çalışmada örnek olarak 7. Gün sığır embriyoları kullanılarak iki renkli mikroarray yer alan veri analizi RNA ekstraksiyon önemli adımlardan bazıları göstermek için bir protokol sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışmanın hayvan parçası Alberta Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi Üniversitesi tarafından tüm hayvan deney prosedürleri onaylı (Protokol # AUP00000131) ile, Alberta, Edmonton, Kanada Üniversitesi Metabolik Araştırma Birimi'nde yürütülen ve hayvanlar göre bakım için Hayvan Bakımı yönergelere Kanada Konseyi (1993).
1. Embriyo Üretim, Toplam RNA ve DNaz Tedavi İzolasyonu
- Hayvan deneysel protokollerin ve embriyo toplama önceki yayınlarda 17, 18'de başvurun.
- Havuz ve sıvı azot içinde her ineğin benzer sahne embriyoların dondurularak ek ve daha sonra RNA ekstraksiyonu kadar -80 ° C tutun.
- (Kit bilgisi Malzeme Listesinde mevcut) piko ölçekli örneklerinden RNA ayıklamak sağlayan bir sütun tabanlı RNA ekstraksiyon kiti sayesinde toplam RNA ayıklayın.
NOT: Tavsiye edilen kit içerir: Klima Buffer, Ekstraksiyon tamponfer,% 70 Etanol, yıkama tampon çözeltisi 1, Yıkama Tamponu 2, elüsyon tamponu, toplama tüpleri ve mikrosantrifüj tüpleri RNA saflaştırma sütunlar. - Tüp içeren embriyo 10 ul ekstraksiyon tampon ekleyin ve 42 ° C'de 30 dakika inkübe edilir. 2 dakika boyunca 800 xg'de santrifüj tüpü mikrosantrifüj tüp içine hücre ekstresi toplamak için.
- arıtma sütun filtresi zar üzerine 250 ul Klima Buffer Pipet. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca Tertibatı Tamponu ile RNA saflaştırma sütunu inkübe edin. 1 dakika boyunca 16,000 x g'de toplama tüpü arıtma sütun santrifüjleyin.
- Pipet RNA ekstraksiyon tampon maddesinin ve embriyo karışımına% 70 Etanol 10 uL. Yukarı ve aşağı pipetleme iyice karıştırın. şartlandırılarak arıtma sütuna Pipet karışımı.
- 100 x g'de 2 dakika süre ile RNA, santrifüj saflaştırma kolona bağlanacağı hemen akışı çıkarmak için 30 saniye süreyle 16,000 xg'de santrifüj uygulayın.
- pipet 10081; 8000 x g, 1 dakika için arıtma kolonu ve santrifüj içine yıkama tampon çözeltisi 1 L.
NOT: DNaz tedavi RNA izolasyonu sonrası ters transkripsiyon veya çoğaltım işlemi ise tavsiye edilir. - Sağ adım 1.8 sonra genomik DNA sindiremez.
NOT: Önerilen DNaz kiti Malzeme Listesinde mevcuttur. Önerilen kit içerir: DNaz I stok solüsyonu ve Buffer. - 35 ul tampon, 5 uL DNaz I stok solüsyonu karıştırılarak DNaz inkübasyon karışım hazırlayın. yavaşça ters çevirerek karıştırın.
- saflaştırma kolonudur zarı içine, doğrudan 40 uL DNase inkübasyon karışımı pipetle. 15 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
- Pipet 40 mcL Yıkama arıtma sütun zarı içine Tampon 1 ve daha sonra 15 saniye süreyle 8,000 xg'de santrifüj.
- 8,000 x g'de 1 dakika için arıtma kolonu ve santrifüj içine pipetle 100 uL yıkama tampon çözeltisi 2.
- saflaştırma kolonudur ve santrifüj içine bir 100 uL yıkama tamponu 2 Pipet16,000 x g'de 2 dakika süre ile.
- Yeni bir 0.5 mL mikrosantrifüj tüpüne saflaştırma sütunu aktarın. doğrudan arıtma sütunun zar üzerine Seyreltme Tampon Pipet 11 mcL. elüsyon tamponu dağıtım sırasında membran içine, Seyreltme Tampon maddesi maksimum absorpsiyonu garantilemek üzere, hafifçe membran yüzeyine pipet ucu dokunun.
- Oda sıcaklığında 1 dakika boyunca sütun inkübe edin. sütununda, Seyreltme Tampon maddesi dağıtma 1000 xg'de 1 dakika için sütun santrifüj ve ardından RNA elüte etmek için 16,000 x g'de 1 dakika boyunca dönerler.
- RNA kalitesini ve miktarını 19 değerlendirmek için üreticinin talimatlarına göre Bioanalyzer alet kullanın.
- kullanılana kadar -80 ° C'de RNA numunesi saklayın.
2. Mikroarray Analizi RNA Amplifikasyon ve Etiketleme
NOT: RNA amplifikasyonu ve etiketleme işlemleri ile çalışan ilk kez kullanıcı için, RNA alo başak-beş ng kullanımıGerçek Arna örnekleri ile ng RNA amplifikasyonu ve melezleşme kalite kontrol ölçümü izlemek için. Başak RNA karışımı önceden belirlenen oranlarda on nitro sentezlendi, poliadenile transkript içerir. Prosedür düzgün yapıldığında, etiketli transkript özellikle dizilerde tamamlayıcı kontrol sondaları sadece melezleşme ve veri asgari öz- veya çapraz melezleşme ile kalite kontrol güvencesi izlemek için taranabilir. Dizi ve veri analizi taradıktan sonra, kontrol şiddetleri içinde-çivili ve normalizasyon prosedürü ile ilgili daha fazla detay açıklama önceki yayınlarda 20, 21 bölümüne bakınız. Aşağıdaki yordam rutin mikroarray kullanıcılara verilir.
- 11 uL - 10 toplam hacmi 100 pg kaliteli RNA örnek (RNA Bütünlük sayısı (RIN) değeri en az> 7.0) hazırlayın.
- amplifikasyon kiti edememek RNA örnekleri artırın(Küçük pg 100 gibi), piko ölçekli örnekleri ile çalışır.
NOT: Tavsiye edilen amplifikasyon kiti bilgisi Malzeme Listesinde mevcuttur ve herhangi bir değişiklik yapılmadan üreticinin talimatlarına uyar. - amplifiye Arna büyüklüğü aralığındaki profilini değerlendirmek için bir floresan bazlı kantitatif kullanın.
- amplifiye Arna konsantrasyonunu ölçmek için (260 ve 280 nm 'de absorbans göre) spektrofotometre cihazı kullanın.
- Etiketleme için hazır olana kadar -80 ° C 'de büyütülmüş ARNA saklayın.
- ULS Arna etiketleme kiti kullanım kılavuzuna göre floresan etiketleme için güçlendirilmiş RNA 2 ug kullanın.
Not: 647 boya kolayca ozon tarafından parçalanır foto-degradasyon ve Siyanin 647 boya duyarlı siyanin 547 ve siyanin için, etiketleme prosedürü ışık az miktarda ve bir ozon içermeyen ortamda gerçekleşir. - Ozon seviyesi kadar ozon kutusuna (Şekil 1A) açın 0.001 ppm.
- İyice karıştırın ve 15 dakika boyunca 85 ° C 'de bir PCR inkübe edin. en az 1 dakika boyunca buz üzerinde Örnekleri. Cy-boya etiketli güçlendirilmiş RNA temizlemek için, (1,9 ila 1.11) DNaz tedavi ile ilgili adımlar dışında, RNA ekstraksiyon kiti ile devam etmeden önce tüplerin içeriğini toplamak için aşağı doğru döndürün.
- ölçülmesi ve etiketli büyütülmüş RNA'nın konsantrasyonu belirlemek ve kullanımdan önce 3 gün -80 ° C'de en fazla etiketli ARNA tutmak için spektrofotometre cihazı kullanın.
3. Mikroarray Hibridizasyon ve yıkama
Not: Aşağıdaki önemli adımlar İki renkli Microarray- tabanlı Gen İfadesi Analizi Protokolüne göre adapte edilir (versiyon6.5, Mayıs 2010).
- Her cyanine 547- ve Siyanin 647 etiketli Arna ng 825 eşit miktarda ekleyin ve 25x parçalanma ve 10x engelleme tampon ile karıştırın.
- 15 dakika boyunca 60 ° C'de ısıtın ve 1 dakika boyunca buz üzerinde soğutulur.
- 2x hibridizasyon tamponu eşit miktarda ekleyin ve iyice karıştırın.
- 13.000 rpm'de santrifüj, sonra karışım hibridizasyon için hazır hale gelir.
- Dizi slayt üzerine karışımdan 100 uL yüklemek ve melezleme odasının içine slayt mühür.
- Fırında 10 rpm'de dönen 65 ° C'de 17 saat melezleme fırını içine monte bölmeyi yükleyin.
- stabilizasyon daldırma ve 30 saniye için çözüm kurutulmasıyla ozon koruma tedavisi ile protokole göre diziler yıkayın.
- toz parçacıkları ile çözümünden diziler çıkarın ve dizi yüzeyi kuru olduğundan emin olun
4. Tarama Mikroarray slayt
- karanlık bir yerde diziler tutun ve TARAMAn açmaker (15 dk bekleme süresi) kullanmak için hazır olana kadar.
- tarayıcıya, sol dizi barkod yükleyin ve taramaya başlayın. yazılım kullanım kılavuzuna göre nokta analiz yapmak ve (GPR) dosya biçimi olarak verileri kaydetmek.
5. İstatistiksel Analiz
- FlexArray yazılımı http://genomequebec.mcgill.ca/FlexArray/license.php "ithal ham veri" üzerine tıklayın ve FlexArray içine GPR dosyaları yüklemek indirin.
- Gerekirse talimat takip ederek normalleşme ve istatistiksel analiz. Not: Daha önce 22 açıklandığı gibi bu çalışmada olumlu nokta seçimi için eşik hesaplayın.
- tüm melezleştirilmiş noktalar ve arka plan sinyalleri görüntülemek için FlexArray arsa izleyiciden kılavuzda açılır seçin. Not: mikrodizi hibridizasyon sonrası kontrol çivili benzer bir görüntü önceki çalışmada 8'de görülebilir.
- seçinFlexArray gelen diziler normalleşme süreci arasında bir persantil aşağıdaki dizinin içinde lös normalleşme buna kılavuzu açılır.
- Bir Excel içine FlexArray tüm normalleştirilmiş verileri dışa daha fazla kullanım için dosya.
6. Biyoinformatik Analizi
Sığır embriyo özgü transkriptleri prob dizilerinin orijinal açıklama (BESTv1) mikrotertip önce 8 tarif edilmiştir. Bu çalışmada, 20.403 benzersiz Gen Semboller (GS) (elde edildi Dosya1 Supplement EmbryoGENE Laboratuar Bilgi Yönetim Sistemi (LIMS) ELMA (http://elma.embryo-gene.ca) yoluyla). 6765 benzersiz genlerin (listesi file2 Ek ) seçilmiş ve mikroarray normalleşme sürecinden sonra tüm olumlu sinyaller (Adım 5 tekabül oldu0,5) sığır Günlük 7 embriyolar gen ifadesi profilinden. Olumlu bir sinyal eşik A değerinin sinyal yoğunluğu gelen geçirgen yayında 16 üzerinden hesaplanmıştır.
- Sınıflandırma Sistemi 23, 24 (Evrimsel ilişkiler yoluyla protein analizi) PANTHER fonksiyonel analizi gerçekleştirmek için aşağıdaki linki (http://www.pantherdb.org/about.jsp) açın.
- İstatistiksel overrepresentation testi kullanılarak embriyonik gelişim sırasında belirli biyolojik süreci tanımlamak ve referans listesine 25 olarak Bos taurus varsayılan ayarı (veritabanındaki tüm genler) kullanmak için 6765 embriyo özgü GS listesini yükleyin.
Not: Bu istatistiksel olarak fazla veya az ifade edilen bir binom testi kullanılarak olan GO açısından gelişimsel ilgili süreçlerin belirlenmesini sağlar. - Yazılım varsayılan olarak <0.05 Set P-değeri eşik. Veriler indirilebilir ve expo olabilirDaha fazla seçim 16 Excel dosyasına rted.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
7. Gün sığır embriyolarının toplam RNA ve amplifiye Arna temsili bir sonuç Şekil 3'te gösterilen ve Tablo 1 'de özetlenmiştir.
RNA bütünlüğü ve profil RNA ekstraksiyonu sonrasında değerlendirilebilir. RNA kalitesinin değerlendirilmesi Bioanalyzer cihazı (Şekil 3A) ve daha yüksek 7.0 amplifikasyonu (Tablo 1) için kullanılacak nitelikli RIN değeri yalnızca örnekleri tarafından yapılabilir.
Kalite ve amplifiye RNA miktarı amplifikasyonundan sonra değerlendirilmelidir. Güçlendirilmiş RNA profili ve uygun boyut aralığındaki benzerlik kalite kontrol (Şekil 3B) ana faktörlerdir. İki hafta büyütmeden sonra, amplifiye edilmiş RNA fragmanları bp 200 ila 800 (Şekil 3b) arasında değişen, boyut olarak çok benzerdir veBenzer boyut aralığındaki tüm ARNAS daha floresan etiketlemesi için seçilir. Ayrıca, orijinal toplam RNA başarılı amplifikasyon Arna (Tablo 1), en azından daha az bin katlık bir artışa verecektir.
Flüoresan işaretleme verimi işaretleme oranı derecesine göre hesaplanabilir. Formül ULS Arna etiketleme kiti kullanım kılavuzunda mevcuttur. belirten% 3.6 olduğu 1 ortalama - - kullanım kılavuzu etiketleme oranı derecesi 1.0 olması gerektiğini göstermektedir 100 nükleotid başına 3.6 ULS molekülleri.
melezleme ve tarama sonrası görüntü dosyaları FlexArray izlenebilir. Mikrodizi hibridizasyon ve yıkama sonrasında iyi bir kalitede taranan görüntü Şekil 4A'da gösterilmiştir. etiketli malzeme bu aralıktan daha düşük veya daha yüksek ise, sinyalleri tespit etmek için ya da yüksek arka plan seviyeleri scanni sonra tespit edilecek çok düşük olacaktırng (Şekil 4B).
Bu çalışmada, olumlu bir sinyal eşik 7.6 (7.6 veya arka <pozitif olarak kabul 7.6 daha yüksek sonda sinyali) olarak belirlenmiştir. Yaklaşık 20826 pozitif noktalara temsil prob setleri% 46 sığır 7. günde embriyolar (Şekil 5) kırmızı renkte gösterilir. Açıklama içermeyen ve yinelenen gen sembolleri ayrılmasından sonra, sadece 6.765 özgü gen sembolleri PANTHER analizi için bırakılır.
Bu 6.765 genler Gün 7 Günlük Sığır Blastosistlerinin ifade özgü RNA transkriptlerini temsil etmektedir. Sığır Blastosistlerinin özgü biyolojik süreci bulmak için Panther overrepresentation test gerçekleştirilir. En yüksek kat zenginleştirme indeksi ile ilk 10 Gen Ontoloji (GO) vadeli kimlikleri (Şekil 6) seçilir. Genel olarak, bu özel GO şartları büyük ölçüde aktif hücresel bölünme sürecini bu tür mitosi olarak temsils ve kromozom ayrımı, hücre döngüsü ve sitoplazmik ve mitokondriyal çevirinin başlatılması düzenlenmesi.
Şekil 1: Ozon serbest Kutusu (A) ve Dizi Etiketleme Reaksiyonu (B). A) Ozon Free Box havayı geri dönüştürür ve ozon ve mikroarray performansı sırasında kutunun içinde ozon seviyesini izlemek için son derece hassas ozon sensörü yok eden bir katalitik konvertör ünitesinden oluşur. B) Etiketleme prosedürü ve dizi melezleme ozon tarafından floresan Siyanin 647 boya bozulmasını önlemek için kutunun içine gerçekleştirin. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: PANTHER Gen Listesi Analizi. Kırmızı oklar alan doldurulması gerekir göstermektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: Toplam RNA nın bir Örnek Bioanalyzer elektroferogramları (A) ve amplifiye RNA (B) Jel görünümü. A) RIN değeri, RNA konsantrasyonu ve rRNA oranı genel sonuç gösteriliyor. B) iki turlu amplifikasyon sonrası güçlendirilmiş RNA profili. Amplifiye RNA fragmanları 200 ve 800 bp arasında bir aralıkta olması beklenir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4: Dizi Yoğunluğu Haritası görüntü. (A) yeşil ve kırmızı kanal (mavi, yeşil renk ile sol üzerinde gösterilen) yüksek nokta yoğunluğu ve düşük arka plan ile tarama yaptıktan sonra 547 ve Siyanin 647 sinyallerini cyanine karşılık gösteren bir dizi slayt iyi bir görüntü (koyu mavi ile sağda gösterilen renk). (B) kırmızı kanaldan çok yüksek bir arka plan görüntüsü gösteren bir dizi slayt kötü bir görüntü (Siyanin 647 nokta yoğunluğu görüntüden benzer mavi-yeşil renk ile üst panelden belirtilmiştir). Renk şeması farklı renklerde karşılık gelen sayısal değerleri ile sinyalin şiddetini gösterir. sinyal yoğunluğu değeri koyu mavi renk aralığında en düşük düzeydedir. Büyük görmek için buraya tıklayınızBu rakamın r sürümü.
Şekil 5: Günlük 7 Sığır Embriyo Gen İfadesi Profil için MA Plot. 20826 kırmızı lekeler arka plan sinyalleri üzerinde olumlu sinyaller temsil etti. Arka plan noktalar siyah renkte vurgulanır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 6: En Fold Zenginleştirme İndeksi ile Top 10 Gen Ontoloji (GO) Dönem kimlikleri. Bu özel GO şartları büyük ölçüde böyle bir mitoz ve kromozom ayrımı, hücre döngüsünün düzenlenmesi ve başlatılması gibi aktif hücresel bölünme sürecini temsil eden sitoplazmik ve trans mitokondrialyon. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| Numune | Embriyo sayısı | tip | Embriyo morfolojik kalite | RNA konsantrasyonu (pg / ml) | RIN | Amplifikasyonu için el total RNA (pg) | Amplifiye RNA konsantrasyonu (ng / ml) | ||||||||
| S1 | 4 | blastosist | Grade 1 ve 2 | 101 | 8.6 | 858,5 | 3498,4 | ||||||||
| S2 | 1 | blastosist | 2. sınıf | 142 | 7.4 | 1207 | 1682,4 | S3 | 2 | blastosist | 1. derece | 135 | 8.8 | 1147,5 | 3185,3 |
| S4 | 3 | blastosist | 1. derece | 177 | 9 | 1504,5 | 2906,4 | ||||||||
| S5 | 5 | blastosist | 1. derece | 636 | 8.3 | 5406 | 3437,5 | ||||||||
| S6 | 3 | blastosist | Grade 1 ve 2 | 159 | 9.1 | 1351,5 | 1689,8 | ||||||||
| S7 | 3 | blastosist | 1. derece | 154 | 9 | 1309 | 4507,1 | ||||||||
| S8 | 4 | blastosist | 1. derece | 304 | 8.5 | 2584 | 3089,3 | ||||||||
| S9 | 5 | blastosist | 1. derece | 282 | 9.1 | 2397 | 3917,8 | ||||||||
| S10 | 6 | blastosist | Grade 1 ve 2 | 374 | 9.4 | 3179 | 2979 | ||||||||
| S11 | 5 | blastosist | 1. derece | 272 | 9.3 | 2312 | 2576 | ||||||||
| S12 | 3 | blastosist | 1. derece | 206 | 9 | 1751 | 2567,9 |
Tablo 1: Numune ve RNA bilgileri. RNA konsantrasyonu ve kalitesi, ekstraksiyondan sonra değerlendirilmelidir. RNA bütünlüğü ve konsantrasyonu, bir Bioanalyzer ile değerlendirilebilir. RNA bütünlüğü numarası fazla 7.0 olması gerekir. RNA konsantrasyonu amplifikasyonu sonra spektrofotometre cihazı ile muayene edilmelidir. Embryo kalite Uluslararası Embriyo Transferi Derneği Kılavuzuna göre değerlendirildi (3. ed., The Savoy, IL).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
İlk sorun gen ifadesinin çalışmak için yüksek kaliteli RNA yeterli miktarda almıyor Günlük 7 sığır embriyolarının kullanarak mikroarray analizi gerçekleştirmek için. Geleneksel fenol / kloroform RNA ekstraksiyonu ve etanol çökeltme yöntemi, düşük verim ve RNA amplifikasyon reaksiyonu inhibe olası artık fenol elde Gün 7 embriyo için uygun değildir. Bunun yerine, standart sütun tabanlı bir yöntem, toplam RNA izole etmek ve daha sonra konsantrasyonunu arttırmak için en az elüsyon tamponuyla RNA elüt edilmesi için daha iyidir. Embriyo başına toplam RNA 780 ug bir ortalama aynı metodoloji 26 ve şu anda kullanılan aynı RNA özütleme kiti 27, 28 kullanan diğer raporlar ile karşılaştırılabilir bu çalışmada elde edilir. RNA ekstraksiyonu için, ekstraksiyon tamponu önce tekrar çözünmesi için iyice karıştırılarak kullanımı veya ekstraksiyon tamponu flakon sıcak önce çökeltiyi eritmek için tavsiye edilirkullanmak. Ayrıca, inkübasyon süresi de çıkarma aşamasında RNA verimi için önemlidir. 42 ° C de tam 30 dakika daha az İnkübasyon süresi RNA verimi azalır.
sütun üzerinde DNaz sindirim total RNA saflaştırılması sırasında genomik DNA kontaminasyonu gidermek için gereklidir. DNaz enzim vorteks ve santrifüj karşı çok hassastır. Bu nedenle, DNaz ve tampon hafifçe üst edilerek karıştırılır.
RNA kalitesini 7 hibridizasyon için düşünülmemelidir daha düşük bir RIN olan mikro-dizi analizi ve örneklerde çok önemlidir. Bu çalışmada, Bioanalyzer ile elde edilen toplam RNA, profil sığır blastosistlerinin 26, 27 ile ilgili çalışmalarda, daha önce gözlenen benzer. Bu, embriyonik geçiş maternal önce oosit ve embriyoların hazırlanan özellikle RNA öncesi taranmış embriyoları kullanırken dikkat edilmelidir değer, RIN değeri genellikle 7 daha düşük karşılaştırıldığındaToplam Gün 7 embriyolar RNA ve bu nedeniyle 28S / 18S rRNA oranı 27 bir varyasyon etmektir.
sığır embriyolarının çıkarılan RNA miktarı platformu hibridizasyon için yeterli değildir, bu nedenle, RNA amplifikasyonu gereklidir. PCR gibi RNA amplifikasyonu için çok sayıda yöntem vardır, in vitro transkripsiyon (IVT) ve ribo-Spia (tek astar izotermal amplifikasyon). İkinci yöntem daha hızlıdır ve bir günde diziler için yeterli malzeme sağlar rağmen, malzemesi 29 başlangıç olarak ng en az 5 gereklidir. Bu nedenle, biz (küçük olarak 100 pg gibi) düşük başlangıç maddeleri 12 ile çalışabilen IVT yöntemini seçti. Ayrıca, daha önce sığır embriyo başarıyla 29 ekstrakte edilen toplam RNA amplifikasyonu için test edilmiştir. Bu çalışmada, bizim amplifikasyon yöntemi embriyo başına 598 pg toplam RNA embriyo başına ~ 28 ug amplifiye RNA üretilir. additioson olarak, iki turlu yükseltilmesinden sonra, bizim numuneler önceki çalışmalarda 13, 15 ile uyum içindedir (200 ve 800 bp arasında) benzer bir profil ve uygun boyut aralığı gösterdi.
Bu protokol, biz bir non-enzimatik etiketleme protokolü, platin bağlı cyanine (siyanin 547 ve siyanin 647) boyalar kullanılır. Bu yöntem, güçlendirilmiş veya non-güçlendirilmiş RNA etiketleme sağlar. önce etiketleme zorunda amplifikasyon adım yanlılığı azaltmak ve enzimatik yönteme kıyasla daha uzun parçaları üretmek, doğal nükleotidler kullanılarak RNA güçlendirilmiş yüksek verim yol sağlar. Siyanin 547 ve Siyanin 647 boyalar floresan boyalar iki renkli dizisi için tavsiye yaygındır. Bununla birlikte, Siyanin 647 boya, ozon bozulmaya karşı duyarlıdır. El düzenlenen ozon monitör 2 ppb altında ozon emin seviyesini sağlamak için kullanılmalıdır. Buna ek olarak, tozsuz bir ortam melezleme çözeltisi içine veya durin düşen toz parçacıklarını önlemek için gereklig tarama.
Mikrodizi deneyi bir veya iki renkli bir yaklaşımla tasarlanabilir. Her deneysel yaklaşım bazı avantajları ve dezavantajları vardır. iki renkli tasarımlar kullanılarak, değişkenlik ve arka plan gürültüsünü azaltan doğrudan karşılaştırma için izin verir ve döngü için ortak bir referans örneği tanımlanması ile tasarlıyor. Deneyler iki renkli tasarımlar kullanılarak gerçekleştirildiğinde boya özgü önyargılar büyük ölçüde sonuçlarını etkileyebilir rağmen, bu önyargıları boya swapları yaparak azaltılabilir. Böyle teknik çoğaltma deneysel maliyetleri ekler, ancak diferansiyel ifadesi 31 ölçme doğruluğunu ve hassasiyetini hem artırabilirsiniz.
(Örneğin bir goril gibi) diğer biyoinformatik yazılımı PANTHER referans olarak Bos taurus genomu ile dataset karşılaştırarak izin verir karşılaştırın. Bizim sonuçlarımız Günlük 7 büyükbaş embriyonik gelişim sırasında biyolojik bileşenlerin takip ve işlevleri söz konusu olduğunu göstermektedir: metafaz / ANAP düzenlemehücre döngüsünün hase geçiş, mitotik metafaz / anafaz geçiş düzenlenmesi, kromozom ayrımı düzenlenmesi, mitokondriyal çeviri, protein K48 bağlı ubikitinasyon ER vezikül aracılı taşıma, nükleer transkripsiyonu mRNA katabolik süreci, çeviri başlatmanın, mitoz kardeş kromatid ayrımı Golgi için mitoz bölünme nükleer.
Dizilerin tarama güçlendirilmiş RNA floresan etiketleme bu makalede sunulan protokoller, yüksek kaliteli veri korumak için yukarıdaki çevresel faktörlerin ekstra bilinci ile yürütülmelidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | KIT0204 | |
| RNase-Free DNase Set (50) | Qiagen | 79254 | |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| Arcturus RiboAmp HS PLUS Kit | Applied Biosystems | KIT0505 | |
| 2100 Bioanalyzer Instruments | Agilent Technologies | G2940CA | |
| RNA Screen Tape | Agilent Technologies | 5067-5576 | |
| ULS Fluorescent Labeling Kit | Kreatech Diagnostics | EA-021 | |
| Custom Gene Expression Microarrays | Agilent Technologies | G2514F | |
| Agilent Gene Expression wash buffer 1 | Agilent Technologies | Part #5188-5325 | |
| Agilent Gene Expression wash buffer 2 | Agilent Technologies | Part #5188-5326 | |
| 2x Hi-RPM Hybridization buffer | Agilent Technologies | Part #5190-0403 | |
| 25x Fragment buffer | Agilent Technologies | Part #5185-5974 | |
| 10x GE Blocking Agent | Agilent Technologies | Part #5188-5281 | |
| Stabilization and drying solution | Agilent Technologies | Part #5185-5979 | |
| Gasket slides enabled by Agilent SureHyb techonolgy | Agilent Technologies | G2524-60012 | Pack of 20 gasket slides, 4 microarrays/slide |
| Two-Color RNA Spike-In Kit | Agilent Technologies | Cat# 5188-5279 | |
| GenePix 4000B array scanner | Molecular Devices | GENEPIX 4000B-U | |
| Ozone Free Box | BioTray | OFB_100x200 | |
| GAL file | Agilent Technologies | - |
References
- Royal, M. D., Smith, R. F., Friggens, N. C. Fertility in dairy cows: bridging the gaps. Animal. 2 (08), 1101-1103 (2008).
- Diskin, M. G., Murphy, J. J., Sreenan, J. M. Embryo survival in dairy cows managed under pastoral conditions. Anim. Reprod. Sci. 96 (3-4), 297-311 (2006).
- Wrenzycki, C., et al. Effects of culture system and protein supplementation on mRNA expression in pre-implantation bovine embryos. Hum. Reprod. 16 (5), 893-901 (2001).
- Menezo, Y. J., Herubel, F. Mouse and bovine models for human IVF. Reprod. Biomed. Online. 4 (2), 170-175 (2002).
- Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science. 270 (5235), 467-470 (1995).
- Patterson, T. A., et al. Performance comparison of one-color and two-color platforms within the MicroArray Quality Control (MAQC) project. Nat. Biotechnol. 24 (9), 1140-1150 (2006).
- Rhodes, D. R., Chinnaiyan, A. M.
- Robert, C., et al. Combining resources to obtain a comprehensive survey of the bovine embryo transcriptome through deep sequencing and microarrays. Mol. Reprod. Dev. 78 (9), 651-664 (2011).
- Nygaard, V., Hovig, E. Options available for profiling small samples: a review of sample amplification technology when combined with microarray profiling. Nucleic Acids Res. 34 (3), 996-1014 (2006).
- Kurn, N., Chen, P., Heath, J. D., Kopf-Sill, A., Stephens, K. M., Wang, S. Novel isothermal, linear nucleic acid amplification systems for highly multiplexed applications. Clin Chem. 51 (10), 1973-1981 (2005).
- Van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., Yool, A., Dement, W. C., Barchas, J. D., Eberwine, J. H. Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA. Proc. Natl. Acad. Sci. 87 (5), 1663-1667 (1990).
- Phillips, J., Eberwine, J. H. Antisense RNA Amplification: A linear amplification method for analyzing the mRNA population from single living cells. Methods. 10 (3), 283-288 (1996).
- Gilbert, I., Scantland, S., Dufort, I., Gordynska, O., Labbe, A., Sirard, M. A., Robert, C. Real-time monitoring of aRNA production during T7 amplification to prevent the loss of sample representation during microarray hybridization sample preparation. Nucleic Acids Res. 37 (8), 65 (2009).
- Gijlswijk, R. P., Talman, E. G., Jansse, P. J., Snoeijers, S. S., Killian, J., Tanke, H. J., Heetebrij, R. J. Universal Linkage System: versatile nucleic acid labeling technique. Expert Re. Mol. Diagn. 1 (1), 81-91 (2001).
- Gilbert, I., Scantland, S., Sylvestre, E. L., Dufort, I., Sirard, M. A., Robert, C. Providing a stable methodological basis for comparing transcript abundance of developing embryos using microarrays. Mol. Hum. Reprod. 16 (8), 601-616 (2010).
- Tsoi, S., et al. Development of a porcine (Sus scofa) embryo-specific microarray: array annotation and validation. BMC Genomics. 13, 370 (2012).
- Salehi, R., et al. Superovulatory response and embryo production in Holstein cows fed diets enriched in oleic, linoleic or α-linolenic acid. Reprod. Fertil. Dev. 26 (1), 218-218 (2013).
- Thangavelu, G., Colazo, M. G., Ambrose, D. J., Oba, M., Okine, E. K., Dyck, M. K. Diets enriched in unsaturated fatty acids enhance early embryonic development in lactating Holstein cows. Theriogenology. 68 (7), 949-957 (2007).
- Agilent 2100 Bioanalyzer User's Guide. , Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2946-90004_Vespucci_UG_eBook_(NoSecPack).pdf (2016).
- Kerr, K. F. Extended analysis of benchmark datasets for Agilent two-color microarray. BMC Bioinformatics. 8, 371 (2007).
- Zhu, Q., Miecznikowski, J. C., Halfon, M. S. A wholly defined Agilent microarray spike-in dataset. Bioinformatics. 27 (9), 1284-1289 (2011).
- Vallee, M., Gravel, C., Palin, M. F., Reghenas, H., Stothard, P., Wishart, D. S., Sirard, M. A. Identification of novel and known oocyte-specific genes using complementary DNA subtraction and microarray analysis in three different species. Biol. Reprod. 73 (1), 63-71 (2005).
- Thomas, P. D., et al. PANTHER: a library of protein families and subfamilies indexed by function. Genome Res. 13 (9), 2129-2141 (2003).
- Mi, H., et al. The PANTHER database of protein families, subfamilies, functions and pathways. Nucleic Acids Res. 33, 284-288 (2005).
- Mi, H., Muruganujan, A., Casagrande, J. T., Thomas, P. D. Large-scale gene function analysis with the PANTHER classification system. Nat. Protoc. 8, 1551-1566 (2013).
- Ross, P. J., Wang, K., Kocabas, A., Cibelli, J. B. Housekeeping gene transcript abundance in bovine fertilized and cloned embryos. Cell Reprogram. 12 (6), 709-717 (2010).
- Gilbert, I., et al. The dynamics of gene products fluctuation during bovine pre-hatching development. Mol. Reprod. Dev. 76, 762-772 (2009).
- Vallee, M., et al. Revealing the bovine embryo transcript profiles during early in vivo embryonic development. Reproduction. 138 (1), 95-105 (2009).
- Dafforn, A., et al. Linear mRNA amplification from as little as 5 ng total RNA for global gene expression analysis. Biotechniques. 37 (5), 854-857 (2004).
- Beaujean, N., Jammes, H., Jouneau, A. Nuclear Reprogramming. Studying Bovine Early Embryo Transcriptome by Microarray. Dufort, I., Rovert, C., Sirard, M. A. , Humana Press, Springer. NY. Chapter 15 (2015).
- Patterson, T. A., et al. Performance comparison of one-color and two-color platforms within the MicroArray Quality Control (MAQC) project. Nat. Biotechnol. 24 (9), 1140-1150 (2006).
