Summary
Den elektrofysiologisk teknik af intracellulær optagelse påvises og anvendes til bestemmelse spektrale følsomheder af enkelte fotoreceptorceller i forbindelsen øjet af en sommerfugl.
Abstract
Intracellulær optagelse er en kraftfuld teknik anvendes til at bestemme, hvordan en enkelt celle kan reagere på en given stimulus. I vision forskning har intracellulær optagelse historisk set været en udbredt teknik til at studere følsomhed individuelle fotoreceptorceller til forskellige lys stimuli, som stadig bliver brugt i dag. Der er dog stadig en ringe detaljeret metode i litteraturen for forskere, der ønsker at kopiere intracellulære optagelse eksperimenter i øjet. Her præsenterer vi insektet som model for behandlingen af øjet fysiologi mere generelt. Insektceller fotoreceptorceller er placeret nær overfladen af øjet og er derfor let at nå, og mange af de involverede i et syn mekanismer er konserveret på tværs dyrerækker. Vi beskriver den grundlæggende fremgangsmåde til in vivo intracellulær optagelse af fotoreceptorceller i øjet af en sommerfugl, med målet om at gøre denne teknik mere tilgængelig for forskere med lidt forudgående erfaring i electrophysiology. Vi introducerer den grundlæggende nødvendige udstyr, hvordan man forbereder en levende sommerfugl til optagelse, hvordan du indsætter et glas mikroelektrode i en enkelt celle, og endelig proceduren optagelse selv. Vi forklarer også den grundlæggende analyse af rå respons data til bestemmelse spektral følsomhed enkelte celletyper. Selvom vores protokol fokuserer på fastlæggelse spektral følsomhed, andre stimuli (f.eks polariseret lys) og variationer af metoden kan anvendes på denne opsætning.
Introduction
De elektriske egenskaber af celler, såsom neuroner observeres ved at måle ion flow over cellemembraner som en ændring i spænding eller strøm. En række elektrofysiologiske teknikker er blevet udviklet til at måle bioelektriske begivenheder i celler. Neuroner fundet i øjnene af dyr er tilgængelige og deres kredsløb er ofte mindre kompleks end i hjernen, hvilket gør disse celler gode kandidater til elektrofysiologisk undersøgelse. Almindelige anvendelser af elektrofysiologi i øjet, omfatter elektroretinografi (ERG) 1,2 og mikroelektrode intracellulær optagelse. ERG indebærer at placere en elektrode i eller på et dyrs øje, anvende en lys-stimulering, og måle ændringen i spænding som en sum af svarene fra alle nærliggende celler 3-6. Hvis man er specielt interesseret i at karakterisere spektrale følsomhed individuelle fotoreceptorceller, ofte flere celletyper samtidigt reagerer på forskellige styrker til en given stimulus; således detkan være vanskeligt at fastlægge følsomheden af specifikke celletyper fra ERG-data, især hvis der er flere forskellige typer af spektralt-lignende fotoreceptorceller i øjet. En mulig løsning er at skabe transgene Drosophila med fotoreceptoren (opsin) genet af interesse udtrykkes i flertallet R1-6 celler i øjet og derefter udføre ERG'er 7. Potentielle ulemper ved denne metode omfatter nej til lav ekspression af fotoreceptor protein 8, og den lange tidshorisont for generering og screening af transgene dyr. For øjnene med færre slags spektralt adskilte fotoreceptorer, kan tilpasning af øjet med farvede filtre hjælpe med at sænke bidraget fra nogle celletyper til ERG, derved tillader estimering af spektral følsomhed maxima 9.
Intracellulær optagelse er en anden teknik, hvor et fint elektrode spidder en celle og en stimulus påføres. De elektrode optegnelser kun at individual celle respons, så optagelse fra og analysere flere individuelle celler kan give specifikke følsomhed fysiologisk forskellige celletyper 10-14. Selvom vores protokol fokuserer på analyse af spektrale følsomhed, de grundlæggende principper for intracellulær optagelse med skarpe elektroder er modificerbare til andre formål. Brug af en anden forberedelse af en prøve, for eksempel, og ved hjælp skarpe kvarts elektroder, kan man optage fra dybere i den optiske lap eller andre regioner i hjernen, afhængigt af spørgsmålet bliver stillet. For eksempel, svartider enkelte fotoreceptorceller 15, celle aktivitet i optikken lapper 16 (lamina, medulla eller lobula 17), hjerne 18 eller anden ganglier 19 kan også registreres med lignende teknikker, eller farve stimuli kunne erstattes med polarisering 20 -22 eller bevægelse stimuli 23,24.
Fototransduktion, den proces, hvor lysenergi absorberes og omdannes til et elektrokemisk signal, er en gammel træk fælles for næsten alle i dag dyrerækker 25. Den visuelle pigment fundet i fotoreceptorceller og ansvarlig for at iværksætte visuel fototransduktion er rhodopsin. Rhodopsiner i alle dyr består af et opsin protein, et medlem af 7 transmembrane G-protein-koblet receptor familie, og en tilhørende kromofor som er afledt af retinal eller et lignende molekyle 26,27. Opsin aminosyresekvens og kromofor struktur påvirker absorbansen for rhodopsin til forskellige bølgelængder af lys. Når en foton bliver absorberet af kromoforen rhodopsin bliver aktiveret, initiere et G-protein kaskade i den celle, i sidste ende fører til åbningen af membranbundne ionkanaler 28. Modsætning til de fleste neuroner, fotoreceptorer undergår graduerede potentielle ændringer, der kan måles som en relativ ændring i responsamplituden med skiftende lys stimulus. Typisk en givenfotoreceptor typen kun udtrykker én opsin gen (om der findes undtagelser 8,10,29-31). Sofistikeret farvesyn, af den art, der findes i mange hvirveldyr og arthropoder, opnås med en kompleks øje hundredvis eller tusindvis af fotoreceptorceller hver udtrykker en eller nogle gange mere rhodopsin typer. Visuel information indfanges ved at sammenligne reaktioner over fotoreceptor mosaik via kompleks nedstrøms neurale signalering i øjet og hjernen, hvilket resulterer i opfattelsen af et billede komplet med farve og bevægelse.
Efter måling af de rå responser af en fotoreceptor celle til forskellige bølgelængder af lys via intracellulær optagelse, er det muligt at beregne sin spektrale følsomhed. Beregningen er baseret på princippet om Univariance, hvori det hedder, at en fotoreceptor celle respons er afhængig af antallet af fotoner det absorberer, men ikke af de særlige egenskaber af fotoner det absorberer 32. Enhver foton der er absorbed af rhodopsin vil inducere den samme reaktion. Dette betyder i praksis, at en celles rå responsamplituden vil stige på grund af enten en stigning i lysintensitet (flere fotoner til at absorbere), eller til et skift i bølgelængde mod sit højdepunkt følsomhed (højere sandsynlighed for rhodopsin absorbere denne bølgelængde). Vi gør brug af dette princip i forbindelse cellulære reaktioner på kendte intensitet og bølgelængde til reaktioner ved forskellige bølgelængder, og den samme intensitet, men ukendte relative følsomhed. Cell typer er ofte identificeret af bølgelængden, hvor deres følsomhed toppe.
Her viser vi en metode til intracellulær registrering og analyse af spektrale følsomhed fotoreceptorer i øjet af en sommerfugl, med fokus på at gøre denne metode mere tilgængelig for den bredere forskersamfund. Selvom intracellulær optagelse forbliver almindelige i litteraturen, især med hensyn til farvesyn i insekter, har vi fundet that beskrivelser af materialer og metoder er normalt for kort til at muliggøre reproduktion af teknikken. Vi præsenterer denne metode i videoformat med det formål at tillade dens lettere replikation. Vi beskriver også den teknik bruger let kan indhentes og billig udstyr. Vi løse fælles advarsler, som ofte ikke indberettes, hvilket bremser forskning, når optimere en ny og kompleks teknik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr blev behandlet som humant som muligt. Insekter blev afsendt som pupper fra Costa Rica Entomological Supply, Costa Rica.
1. Heliconius Pupper Care
- Hang alle pupper afstand 2-3 cm fra hinanden i et fugtigt kammer ved hjælp insekt ben.
- Efter eclosion, tillader vinger tørre derefter holde sommerfugle i live i mindst 1 dag i et fugtigt kammer og foder en fortyndet honning løsning dagligt før optagelse.
- Fortynd honning med vand til omkring en 20% honning løsning i volumen, og hældes i en lavvandet petriskål.
- Bring individuelle sommerfugle til petriskålen, én efter én. Ved at berøre løsning med deres front tarsi, vil sommerfuglene automatisk udvide deres proboscides og drikke fra petriskålen. Hvis deres snabel ikke automatisk udvide bruge pincet til at trække snabel ud og introducere den til honning løsning.
2. Optisk Bane, kalibrering, og Measurement af Eksperimentelle lysforhold
- Placer en 150 W Xenon arc lampe med boliger og universel strømforsyning og en vedhæftet kondensator linse montering på den ene ende af et bord på mindst en meter lang tid at levere klart hvidt lys.
ADVARSEL: Xenon buelamper producerer ekstremt kraftigt lys med stærke UV intensiteter. Beskyttelsesbriller, bør der på alle tidspunkter og lampen skal bruges som anvist af producenten for at forhindre ophobning af ozon forårsaget af vekselvirkning af UV-lys med atmosfærisk ilt. - Opsæt en optisk bane en meter i længden for lyset forlader huset forsamling til at passere gennem (figur 1).
- Placer i følgende rækkefølge på det optiske spor med omtrentlige afstande fra hinanden: 1) en konveks silica eller kvarts linse 40 cm fra kondensatoren samling, 2) et filter med neutral tæthed hjul (med ingen filtre øjeblikket i strålegangen) 22 cm længere henne sporet, 3) en lukker med drivenhed 14 cm fra ND filters, 4) en konkav silica eller kvarts linse umiddelbart op efter lukkeren, og 5) en kollimerende stråle sonde 6 cm længere henne den fjerneste ende af sporet.
- Forsynes med et 600 um diameter fiberoptisk kabel til kollimeringsorganerne stråle sonden.
Bemærk: Afhængigt af lysintensitet, kan en 5-10 mm diameter fiberoptisk kabel, levere nok lys til andre preps og kan erstatte dette. - Justere afstanden, højde og vinkel af hvert optisk element, således at lysstrålen forlader aggregatet er på det højeste intensitet muligt.
- Som optiske spor elementer kan variere lidt med forskellige applikationer, at alle elementer transmittere lys i UVA- og synlige område (315-700 nm).
- Når den optiske spor er samlet, måle det lys, der passerer gennem konfigurationen via en spektrometer. Kalibrere spektrometeret først under anvendelse af en kalibrering lampe med en kendt spektrum og producentens software.
Note: Vi beskriver følgende opsætning hjælp Ocean Optics produkter til klarhed, men andre producenter (f.eks Avantes) sælger sammenlignelige produkter.- Tænd for wolfram kalibreringen lampen mindst 45 minutter, før du tager målingerne.
- For at kalibrere, vedhæfte spektrometer via USB til en computer med det tilhørende software installeret. Tilslut derefter spektrometer til wolfram kalibrering lampe via en UV-synlig transmitterende cosinus korrektion.
- Vælg "Ny Absolute udstråling Measurement" fra fanen "Filer", og vælg den spektrometer som "Source".
- Følg anvisningerne for at oprette en ny kalibrering "cal" fil. Når du bliver bedt indlæse forudsat datafil for det kendte spektrum af wolfram kalibrering lampe i det synlige lys (300-800 nm) i softwaren, som automatisk beregner den korrigerede spektrum fra spektrometer output.
- Gem kalibreringen fil. Indlæs denne fil, når initializing softwaren til alle fremtidige målinger af lys spektre ved hjælp af spektrometer.
- Når spektrometer er kalibreret, bruge dette til at optage lys spektre fra forsøgsopstillingen. Herefter når softwaren åbnes, vælg "Ny Absolute udstråling måling" og indlæse tidligere gemte kalibrering fil. Næste tage en mørk spektrum ved at blokere alt lys til spektrometer.
- Med spektrometer øjeblikket måle de ønskede eksperimentelle lysforhold, justere integrationstiden (4 ms), til scanninger gennemsnit (5), og boxcar bredde (5), så spektret er korrekt skaleret og glattet. Bevare indstillingerne de samme for alle spektrale målinger, således at lysintensiteter fra forskellige målinger kan sammenlignes.
- Måle spektre for usvækket hvidt lys, for alle neutrale filtre tæthed, der skal anvendes ved forsøg, og for hver bandpass interferensfilter (figur 2).
- Measure det hvide lysspektrum uden filtre i lysbanen ved at anbringe den frie ende af det fiberoptiske kabel fra trin 2.2.2 til spektrometer. Med kalibreringen fil indlæst fra trin 2.3, gemme hvide lysspektrum ved hjælp af spektrometer software som en tekstfil.
Bemærk: Spectra gemmes som tekstfiler liste bølgelængden (x koordinater) i en kolonne og intensiteten af lys (y koordinater) i den anden kolonne, således at data kan indlæses i et regneark for trin 2.6. - Ved hjælp af samme setup som trin 2.5.1, optage spektret fra hver optiske densitet (OD) (0-3,5 OD), der anvendes ved forsøg ved at dreje den neutrale tæthed (ND) filter hjul i den optiske bane, og gemme tekstfilen for hver OD.
- Ved hjælp af samme setup som trin 2.5.1, placere 10 nm halv båndbredde interferens filtre én efter én ind i strålegangen og optage spektret observeret for hvert filter. Gentag denne procedure for hver af 41 forskellige interferensfiltre wi'te peak transmittanser afstand hver 10 nm fra 300 til 700 nm. Filtre indbyrdes afstand (20 nm) er acceptable for de fleste anvendelser (for spektre, se figur 2).
- Measure det hvide lysspektrum uden filtre i lysbanen ved at anbringe den frie ende af det fiberoptiske kabel fra trin 2.2.2 til spektrometer. Med kalibreringen fil indlæst fra trin 2.3, gemme hvide lysspektrum ved hjælp af spektrometer software som en tekstfil.
- Korrekt for forskelle i intensiteten af lys, når interferensfiltre anbringes i lysbanen. Hver interferensfilter tillader forskellige antal af fotoner til at passere, og den lave transmission af nogle filtre gør det vanskeligt at yderligere svække intensiteten så alle filtre tillader lige mange fotoner.
- At beregne den relative intensitet (I) for hver 10 nm båndbredde interferensfilter, løse for jeg i udtrykket, I = T / sek, hvor T er arealet under den spektrale kurve for hver 10 nm interferensfilter (fra 2.5.3) og s er den maksimale absolutte irradians (y-værdien af gemte tekstfil fra 2.5.1) hvidt lys ved topbølgelængden af hvert filter (Se figur 2 for et eksempel ved 520 nm).
- Opdel alle beregnede intensiterne ved max intensitet værdien beregnet i 2.6.1, der omsætter til en, og tage den reciprokke værdi af de relative normaliserede værdier til anvendelse som en korrektionsfaktor anvendes på den rå følsomhed ved hver bølgelængde (se trin 6.4).
- Udfør trin 2.1 til 2.6 kun én gang før et sæt af eksperimenter. I løbet af et eksperiment med jævne registrere absolutte irradians af Xenon buelampe under skarpt lys og neutralfiltre, for at sikre intensiteten af lyset stimulus ændres ikke.
- I løbet af et eksperiment, hvis nogen cellulær respons på lys, der transmitteres gennem interferensfiltre nærmer sig den maksimale respons amplitude, bruge ND-filtre til at dæmpe signalet. Hvis der anvendes ND-filtre under et forsøg, udgør det tilsvarende fald i intensitet under beregningen af spektral følsomhed.
- Opsætning optisk track, kalibrering og filtre dage eller uger før eksperimenter begynde. Hold filtredækket for at forhindre ophobning af støv.
3. recording-udstyr Setup
- Feed samme fiberoptiske kabel anvendes til kalibrering gennem et Faradays bur og montere på en goniometrisk enhed, såsom en Cardan arm omkreds (se figur 3 for diagram). Kablet vil være omkring 10 cm fra øjet af prøven.
- Placer en metal-scene på en vibrationally isoleret bord med en elektrodeholder monteret direkte over scenen under styring af en mikromanipulator (figur 4). Placer Cardan armen, således at prøveemnet hoved er i centrum af sfæren skabt af armens rotationsbevægelse.
- Brug et intracellulært forforstærker-system, som omfatter en forstærker (uden for Faradays bur) og forforstærker (hovedtrin, nær prep inde i Faradays bur) montere hovedtrin over metal-scene, hvor prøven vil blive placeret.
- Tilslut et koaksialkabel til hovedtrin via enBNC-forbindelse. Flækkede kun toppen på den anden ende af koaksialkablet, og adskille den ydre metalkappe af kablet fra den indre ledning.
- Lod den ydre kappe (holdt ved jordpotentiale) til den ene ende af en isoleret kobbertråd med et krokodillenæb i den anden ende. Denne krokodillenæb vil knytte til metallet referenceelektrode på prøven platform (trin 5.1.4).
- Lod den indre ledning af koaksialkablet til en tynd sølvtråd, som skal fungere som registreringselektroden. Denne ledning bør være tynd nok til at blive ført ind i opløsningen fyldt glaselektroden i trin 5.2.3.
- Placer et stereomikroskop fastgjort til en svingarm og base på træ bænk uden for Faradays bur, således at den kan svinges i at sænke elektroden ind i øjet, og svingede tilbage ud igen, når elektroden er i øjet.
- Sørg for, at alt metal inde i Faradays bur jordforbindelse.
- Uden for Faradays bur, vedhæfte preamplifis til indgangen på en 50-60 Hz støj reducering (valgfrit), og tilslutte udgangen til en kanal af et oscilloskop ved hjælp af et BNC T-adapter.
- Brug af den anden ende af den T-adapter, tilslutte signalet passerer gennem oscilloskopet til en kanal af hardwaren. Vedhæft denne hardware til en computer via et USB-kabel, som vil give svar optaget med forforstærker læses af software på computeren.
- Fastgør lukkeren driver fra den optiske vej til den anden kanal af oscilloskopet anvendelse af en anden T-adapter og forbinde denne med en impulsgenerator, der vil styre hyppigheden og varigheden af lysglimt, der leveres til øjet (trin 5.5).
Bemærk: Opsætning af selve riggen bør kun skal gøres en gang. Break her indtil den er klar til at begynde optagelser.
4. Prep på dagen for optagelse
- Tænd for Xenon lampe mindst 45 min før forsøget og slå på glasset mikroelektrode aftrækker mindst 30 minutter før pulLing glas elektroder.
- Tænd alt kontrolapparat (lukker, forstærker, støj eliminator, puls generator, oscilloskop, og dataopsamling hardware) og sørg for, at lukkeren er lukket som standard, så ingen lys passerer gennem det fiberoptiske kabel.
- Træk fine borsilikat (eller aluminosilicat) glas mikroelektroder (100-250 MOhm modstand er ideel) ved hjælp af et glas mikroelektrode aftrækker. Brug glas elektroder inden for kun et par timers for at blive trukket.
- Efterfylde elektroderne med 3 M Kaliumchlorid (KCl). Bemærk, at denne løsning kan ændres i henhold til forskerens behov, f.eks farvestof injektion.
5. Prøvetagning Prep og optagelse Procedure
- Forbered Specimen
- Anbringer en individuel sommerfugl inde i et lille plastikrør med varm voks, så hovedet er immobile og rager ud fra den ene ende af røret. Voks ned snabel, antenner, og vinger (figur 5).
- Hold than abdomen med en tør stykke voks og holde røret befugtet ved at placere en våd væv inde i røret bag maven. Sørg for, at prøven er helt immobile.
- Monter slangen med et lille stykke voks på en lille platform med en kugle- og muffeleddet, der er fæstnet til en magnetisk base.
- Under et dissektionsmikroskop, indsætte en sølvtråd mm i diameter 0,125 ind i hovedet via munddele, der skal anvendes som reference elektrode. Før forsøget, permanent at fiksere wiren til platformen på en sådan måde, at kobbertråden i trin 3.3.2 kan klippe på det, når platformen anbringes på scenen til optagelse.
- Når referenceelektroden er i en passende stilling, kan det holdes på plads af hurtigt smeltende og derefter afkøling voks omkring tråden.
- Ved hjælp af en brydbar kulstofstål barberblad, greb del af vingen med en knivholder og brække et lille stykke til brug til skæring hornhinden.
- Skær et lille hul (~ 10 ommatidien i diameter) i venstre hornhinden ved hjælp af barberblad og forsegle hullet med vaseline for at forhindre udtørring.
- Når hornhinden er skåret, skal du indsætte optagelsen elektrode i øjet så hurtigt som muligt, fordi hæmolymfe i øjet hurtigt vil hærde og gøre det umuligt at tilføje en elektrode. Hvis det er muligt at udføre dissektion i riggen, hvor optagelsen finder sted.
Bemærk: Vaseline bør ikke smøres på resten af øjet, da dette vil defokusere optikken.- Hvis det ikke allerede på scenen, skal du placere monterede prøven og platform ind på scenen i optagelsen riggen. Slut hovedtrin stelledning fra trin 3.3.2 til referenceelektroden på prøven platform ved hjælp krokodillenæb.
Bemærk: Hvis det er muligt at bruge et rødt filter til at belyse dyret. - Brug en lyskilde med svanehals vedhæftede filer til kortvarigt lyse prøven under et Stereoskopet samtidig sænke optagelsen elektrode ind i øjet.
- Isert den sølvtråd forbundet til hovedtrin fra trin 3.3.3 i KCI-opløsning i bagsiden af et glas mikroelektrode. Monter glasset elektrode på indehaveren elektroden.
- Juster elektrodeholderen så mikroelektrode er direkte over hullet tidligere klippet i hornhinden, omkring en millimeter over hornhinden. Sænk mikroelektrode i øjet ved hjælp af mikromanipulator indtil et kredsløb er afsluttet, som vist ved en stor ændring i potentiale (mV) på oscilloskopet.
- Hvis det ikke allerede på scenen, skal du placere monterede prøven og platform ind på scenen i optagelsen riggen. Slut hovedtrin stelledning fra trin 3.3.2 til referenceelektroden på prøven platform ved hjælp krokodillenæb.
- Når i øjet, svinge Stereoskopet uden for Faradays bur, og sluk for lyskilde, der oplyser prøven. Rummet skal holdes mørke, så øjet bliver mørk tilpasset.
- Kontrollér modstanden af elektroden ved at anvende en 1 nA strøm fra forstærkeren og bemærke ændringen i spænding. Resistens bør typisk være i området mellem 100-250 MOhm. Højere modstande er indikative for blokering eller bøjning af elektroden, og en lav modstande på strømode brud.
- Aktiver impulsgeneratoren så lukkeren åbnes tillader et lysglimt med et 50 ms varighed hver 0,5 sekund, og tillade dens fortsatte blinke under hele forsøget.
- Juster impulsgeneratoren så den tillader glimt af op til 50 ms varighed. Denne varighed og 0,5 sek pause mellem blink holder prøven så tæt til mørk tilpasset som muligt i løbet af forsøget. Halvtreds msek er tæt på den korteste flash varighed, der vil fremkalde den samme amplitude som svar som længere flash varigheder.
- Re-foranstaltning svar på både i begyndelsen og slutningen af forsøget (trin 5.16). I løbet af ca. en tyve minutters eksperiment, har disse blitzindstillinger ikke forringe respons over tid. Forskellige preps kan kræve justeringer af disse flash indstillinger.
- Placer Cardan armen, så det fiberoptiske kabel er rettet mod øjet.
- Tjek oscilloskopet for spænding forandring med hver lys flash.En negativ ændring af spændingen betyder, at elektroden ikke er trådt en celle.
- Flyt Cardan arm omkring prøven, indtil den er placeret i en vinkel på øjet, hvor der er en maksimal spænding respons.
- Drej mikromanipulator frem og tilbage, hvilket meget små lodrette bevægelser af elektroden i begge retninger, mens let at trykke på bunden af holderen elektroden eller ved at bruge Buzz-funktionen på forforstærkeren. Fortsæt med at lave små justeringer, indtil en depolariserende lys reaktion vises på oscilloskopet (figur 6).
- Juster Cardan armen igen for at finde indfaldsvinklen hvor et lysglimt producerer den største depolariserende signal. Lav små justeringer med mikromanipulator og bruge Buzz-funktionen på forstærkeren efter behov for at sikre, at elektroden er stabilt optager cellen, og at det vil blive i cellen for hele forsøget (Se trin 5.11).
- Når opsætningen er stabil, begynde recording. En stabil optagelse bør have lidt at ingen ændring i hvilende potentiale, lav støj baggrund, og en konsekvent stor depolariserende respons (mindst 10: 1 signal-støj-forhold).
- Kør software på computeren, og begynde en "ny eksperiment", som vil åbne et pop up-vindue med fire kanaler.
- Juster spændingen skalaen i øverste højre hjørne af softwaren vinduet til 500 mV. Den første kanal vil vise svarene registreret fra elektroden i realtid, mens den anden kanal optager firkantbølgen frembragt af funktionsgenerator, hvis signalet føres til dataopsamlingshardware via oscilloskop, som viser, når lukkeren er åben . De andre to kanaler er unødvendige.
- Klik på "Start" i nederste højre hjørne for at starte optagelsen, og så softwaren til at køre under hele forsøget. Juster zoom på x (tid) og y (spænding) akser, således at svarene er klare.
- Først med hvidt lys, optage op til 10 individuelle svar med ND-filteret hjulet på 3,5 OD (ca. 5-10 sek).
- Næste rekord det samme antal besvarelser på 3,3 OD, derefter 3,1, 3,0, 2,5, 2,3, 2,1, osv i enhver kombination til 0,0 OD. Disse respons amplituder til ND-filteret serien vil give respons-log intensitet kurve i § 6. Hvis der opstår blegning, bruge færre glimt af lyse stimuli i løbet af forsøget.
- Optag reaktionen af cellen til alle bølgelængder, ved hjælp af interferensfiltre.
- Først finde peak bølgelængde. Uden ND filtre i lysvejen (0,0 OD), placere et UV transmitterende filter i strålegangen og kortvarigt observere responsamplituden. Gentag med en blå transmitterende filter, et grønt transmitterende filter, og en rød transmitterende filter, som skulle give en idé om, hvor spidsresponsen vil være.
- Bruge filtre ved ca. 350, 450, 550, 650 nm for at finde det generelle område af top følsomhed itrin 5.14.1. Den nøjagtige bølgelængde betyder ikke noget i denne indledende søgning fase, fordi alle bølgelængder vil blive registreret i det næste trin. Hvis skøn findes af peak følsomheder, eller de tidligere har været registreret, at bruge kendte bølgelængder hurtigt at identificere spidsresponsen.
- Når spidsresponsen eller tæt på det identificeres, optage ved denne bølgelængde i 10 reaktioner (ca. 5 sek).
- Efter optagelsen ved bølgelængden med maksimal respons, optage med de andre interferens filtre, 300-700 nm ved 10 nm trin. Start fra toppen og træde ud mod både kortere og længere bølgelængder ved at bytte filtrene ud fra strålegangen én efter én (fx hvis spidsresponsen er på 520 nm, rekord reaktioner ved denne bølgelængde først, derefter 510 nm, efterfulgt af 530 nm, 500 nm, 540 nm, 490 nm, 550 nm, og så videre, indtil der ikke er der ingen respons).
- Tillad op til 10 besvarelser pr filter (5 sek hver). Når swapping interferens filtre, tillade cellen at RespOND til 1-2 glimt af hvidt lys uden filter i strålegangen, hvilket er nyttigt for at overvåge, om spidsresponsen er nedværdigende over tid. Reducer antallet af besvarelser eller øge OD hvis blegning opstår.
- Hvis svaret under nogen interferens filter er for tæt på den maksimale respons under hvidt lys ved 0 OD, derefter dæmpe med ND-filtre. De interferensfiltre og størrelsen af det fiberoptiske kabel anvendt i dette eksperiment spænder dæmpe intensiteten af lys og så er typisk ikke behov for ND-filtre.
- Hvis optagelsen forbliver stabile, re-record bølgelængder omkring spidsresponsen, der tjener som en pseudoreplicate for at bekræfte tidligere respons amplituder og med til at sikre reaktionen har ikke nedbrudt over tid. Når alle bølgelængder registreres, re-record svarene under ND-serien, som i trin 5.12.
- Når optagelsen er færdig klik på "Stop" på softwaren, og gemme optagelsen til analyse.
- Efter et eksperiment, ofrer individet ved frysning, eller køling i flere minutter efterfulgt af hurtig overskæring hovedet og knusning brystkassen.
- Luk alt udstyr ned. Break her, hvis nødvendigt, før at gøre analysen.
6. Spectral Følsomhedsanalyse
- Med den software, der anvendes til at registrere rå reaktioner, beregne middelværdien responsamplituden af 10 individuelle svar for hvert filter i ND-serien og for hver interferens filter.
- Opret en svar-log intensitet (VlogI) funktion fra ND filter serien registreret i trin 5,12-5,13 (figur 7). Gør dette ved at plotte log enheder af intensitet (OD) på X-aksen, og reaktionerne på hver intensitet på y-aksen.
- At udlede spektral følsomhed af cellen ved forskellige bølgelængder, passer typisk Naka-Rushton ligning til dataene fra trin 6.2, og bruge denne ligning til at relatere eksperimentelt opnåede spektrale responser af forskellige bølgelængder to relative fotoner, der kræves for at fremkalde dette svar under en konstant bølgelængde (i dette tilfælde hvidt lys).
Bemærk: Naka-Rushton ligning er: V / V max = I n / (I n + K n), hvor I er stimulus intensitet, V er responsamplituden, Vmax er den maksimale reaktion amplitude, K er den stimulus intensitet giver ½ Vmax, og n er den eksponentielle hældning. Forskellige fremgangsmåder kan anvendes til at passe denne ligning til VlogI data, herunder kurvetilpasningssoftware eller kodebaseret statistiske pakker. - For at passe til Naka-Rushton ligning ved hjælp af simple beregninger og et regnearksprogram, transformere svardataene VlogI for hver stimulus intensitet: log [(V max / V) - 1]. Derefter udfører lineær regression på de transformerede data at hente ligningen for linjen i bedste pasform.
Bemærk: V max skal være større end eventuelle målte respons; at holde denne konsekvent, denne metode anslår V max 1% greater end den højeste målte respons. - Fra ligningen af regressionslinjen, anslår eksponenten (n) ved at tage den negative hældning, og log (K) = y-skæringspunkt / n.
- At udlede spektral følsomhed af cellen ved forskellige bølgelængder, passer typisk Naka-Rushton ligning til dataene fra trin 6.2, og bruge denne ligning til at relatere eksperimentelt opnåede spektrale responser af forskellige bølgelængder to relative fotoner, der kræves for at fremkalde dette svar under en konstant bølgelængde (i dette tilfælde hvidt lys).
- Når parametrene for V max, n, og K er blevet anslået, bestemme den relative antal fotoner, der kræves for at fremkalde den spektrale reaktion af cellen ved hver bølgelængde ved at tilslutte den målte spektrale respons ved en given bølgelængde som (V) og løsning til I.
- Multiplicer den beregnede stimulus intensitet (I) fra trin 6.3 med korrektionsfaktoren for hvert interferensfilter (fra trin 2.4.3) ved hver bølgelængde.
- At få følsomhed, skal alle intensiteter være relateret til V log-I kurven, så de kan sammenlignes. Gør dette ved at relatere hver bølgelængde intensitet til ½ V max eller K, beregnet i trin 6.2.3.
- Træk hver korrigeret bølgelængde intensitet (trin 6.4) fra K.
- Så for hver bølgelængde intensitet, tilføje denne "afstand fra K "værdi til K, og ganges med (-1).
- Næste bringe alle datapunkter positive ved tilsætning den absolutte værdi af den laveste datapunkt i serien til hver bølgelængde.
- Find følsomhed ved hver bølgelængde ved at tage den reciprokke værdi af alle nyligt beregnede intensiteter fra trin 6.5.1. Omdan data, så følsomheden spektrum falder mellem 0 og 1.
- Efter optagelse fra mere end én celle af samme gennemsnit typen de endelige svar og plot med standardafvigelse barer eller 95% konfidensintervaller (Figur 8).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For mange elementer i opsætningen optagelse, er en skriftlig beskrivelse ikke give nok detaljer. Figur 1 er en skematisk af de involverede i det komplette indspilning setup komponenter. I figur 2 er spektre afbildet for hvidt lys og hver interferensfilter for at give en fornemmelse af, hvorfor en korrektionsfaktor er nødvendig, og hvad der er behov for at beregne denne korrektion. Figur 3 viser billeder og et diagram over Cardan arm, der anvendes til disse eksperimenter. Figur 4 er et sammensat billede, der viser optagelsen scenen og mikromanipulator. Figur 5 viser flere trin i udarbejdelsen af en sommerfugl til eksperimentet.
Når en optagelse begynder, en negativ ændring i spænding som reaktion på en lysglimt betyder, at elektroden er uden for en celle, som i figur 6a. Styrken af responset afhænger nærhed af elektrodentip til en fotoreceptor celle, og indfaldsvinklen af lyset flash. Svaret bør være stor (> 30 mV), før spidsen er nær nok til en celle til spidde. Figur 6b viser en klar depolariserende svar på en lys-stimulering, der betyder indrejse i en fotoreceptor celle. Den hvilende potentiale bør være stabil og svaret amplitude bør være store (mindst 40 mV), selv om det absolutte amplitude kan variere betydeligt. Vi måler relativ respons, så det er mere vigtigt, at signal-støj-forholdet er højt. Hvis hvilende potentielle ændringer i høj grad, svaret bølgeform ser unormal, eller den maksimale reaktion er for lav, derefter sammenligne relative responser på tværs af alle interferensfiltre bliver umulig. Eksempler på ubrugelige optagelser er vist i figur 6c, 6d.
Efter at have afsluttet en vellykket optagelse, skal ND svarene plottes og Naka-Rushton ligningen skal monteres på de data 33, shown i figur 7. Dette tal er afbildet ved hjælp af ND-filter serien uden indblanding filtre. Hvis optagelsen er stabil, bør data fra ND-filteret serien være ens før og efter forsøget. Spectral følsomhed bestemmes ved at montere Naka-Rushton ligning til VlogI plottet i figur 7, så løsningen for (I) for hvert svar (V) ved en given bølgelængde, som forklaret i beregningerne af § 6 i protokollen.
Et repræsentativt eksempel på spektral følsomhed afledt af en enkelt optagelse er afbildet i figur 8a (bemærk eksempel viser real beregnede data, men toppen er blevet forskudt, da dette resultat er ikke publiceret). Celletyper kan klassificeres ved peak følsomhed på et tilsvarende bølgelængde og samlede form af følsomhed spektrum. Lignende celletyper midles da og den gennemsnitlige følsomhed er plottet med standardfejllinjer ved hver bølgelængde i Figure 8b. Spektrale følsomhed tre typiske celletyper fundet i et insekt er vist i figur 8c (størrelse og fejlsøjler beregnes ud fra reelle data, men toppene forskydes).
Figur 1:. Skematisk af Recording Komponenter Komponenter i strålegangen, modellen setup, og optagelse hardware er angivet. Optisk track sidder på træbænk uden for Faradays bur. Xe, xenon bue lampe, Cd, kondensator forsamling, Lx, konveks linse, ND, neutral tæthed filter hjul, Cf, interferens filter, S, lukkertid, Lc, konkave linse, Co , kollimerende stråle probe, Fo, fiberoptisk kabel. Faraday bur sidder påtræbænk omkring prøven. Den træbænk sidder over, men ikke røre vibrationally isolerede marmor bord nedenunder. Optagelse (Rc) og reference (RF) elektroder er fastgjort til hovedtrin (Hs). Rc indføres i øjet (E) og Rf indføres i en anden del af kroppen. Den hovedtrin er en del af opsætningen forforstærker (Pa) uden for Faradays bur. Signalet er gået fra forforstærkeren gennem Humbug støj reducering (Hb), og ind i oscilloskop (Os). På oscilloskopet signalet ledes gennem PowerLab hardware (PLB) og ind i bærbare computer (CPU), hvor det læses af Labchart software. Lukkeren styres af en funktionsgenerator (Fg), som ledes gennem en anden kanal på oscilloskopet, og kan også føres gennem en anden kanal på PowerLab hardware, hvis dette signal vil blive registreret som godt.
Figur 2:. White Light og Interference Filter Spectra anvendt til at beregne Correction Faktorer Den spektre målt i trin 2.5 i protokollen, er vist 300-700 nm, for hvidt lys samt hver af de 41 interferensfiltre. Hver interferens filter spektrum måles med kun at filter i strålegangen. T 520 svarer til arealet under spektret for filteret med peak 520 nm, og s 520 svarer til intensiteten af hvidt lys ved topbølgelængde af filteret, 520 nm. Disse værdier anvendes ved beregningen af korrektionsfaktorerne for hvert filter (i dette tilfælde 520 nm) som beskrevet i trin 2.6 i protokollen.
Figur 3:. Beskrivelse af Cardan Arm Perimeter anvendt i forsøgene The Cardan arm holder det fiberoptiske kabel og giver fuld sfærisk rotation og vinkelindstilling således at lys kan leveres på det rigtige indfaldsvinkel til cellen, der optages. (A) Top down visning. (B) Udsigt fra siden i en vinkel. Numre svarer til den samme del i alle paneler. (1) Bundpladen tillader fuld cirkulær rotation i det vandrette plan. (2) Den lodrette plade tillader fuld cirkulær rotation af armen i et lodret plan. (3) Denne cylinder holder metal arm med fiberoptiske kabel på enden, og det giver en anden lodret plan cirkulært drejning vinkelret på (2). (4) Den fiberoptiske kabel holdes in sted ved enden af armen, og lys er rettet mod placeringen af modellen i forsøgsopstillingen.
Figur 4:. Komponenter i Recording Setup (A) Plastikslange bruges til at holde prøven. (B) Overhead visning af den platform, som prøven og røret er monteret. (C) fra siden af kugle-og-fælles platform med magnetisk bund (1). Henvisning elektrode holdes ubevægelige med lim og voks på siden af platformen (2). Referenceelektrode viklet omkring krokodillenæb og loddet fast, hvilket giver en vedhæftning område, hvor hovedtrin referenceelektrode kan fastgøre (3). (D) elektrodespids under 20X forstørrelse. Scale bar, 25 um. (E) Stage, elektrodeholder, og mikromanipulator setup. Den hovedtrin (1) er fastgjort over apparatet medsølv optagelse wire (2), og referenceelektroden med krokodillenæb (3) fastgjort. Elektroden holder (4) er fastgjort til en manuel mikromanipulator (5) med en lavere stilling, der kan justeres med en drejeknap til lodret bevægelse eller kan skubbes eller trækkes til horisontal bevægelse af indehaveren af elektroden. Den magnetiske platform med prøven sidder på scenen (6) lige under holderen elektroden. (F) Faraday bur omgiver optagelsen setup med en skærm, der kan trækkes op eller ned i fronten. Aluminiumfolie er placeret under alt udstyr med gummipuder på toppen. Det fiberoptiske kabel (1) fører ind i buret fra det optiske spor udenfor, og er instrueret af Cardan armen (2) mod scenen (3). apparater Optagelsen scenen og manipulator er placeret i en sandkasse (4) hviler på en marmor bord under opsætningen. Alt andet udstyr hviler på træbænk top, der ikke rører marmor bordet. Den sandkasse sidder på toppen af marmor bordet i et hulskåret ud af træbord, så prøven helt er vibrationally isoleres fra udstyret på træ bordplade. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5:. Butterfly Prep (A) Sommerfuglen er indført i røret og hovedet, vinger og antenner immobiliseres med varm voks. Den indifferente elektrode indsættes i de munddele (1), er et stykke af tør voks bruges til at holde maven (2), og en våd væv er placeret bag prøven. (B) Close-up af hovedet voksbehandlet ned. Øjet, der skal optages fra (1) holdes klart voks eller snavs, og referenceelektrode (2) indsættes i de munddele og varm voks er hurtigt smeltet over den for at holde det på plads.(C) Et hul skæres i øjet, hvor den lyserøde-hvide fotoreceptor cellelag kan ses. Sort pigment og gul hemolymph er fraværende. (D) Lateral billede af prøven med et glas optagelse elektrode (1) er placeret i øjet, og den indifferente elektrode (2) fastgjort til hovedet scenen, der skal udfylde et kredsløb som ses på oscilloskopet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6:. Rå Svar fra Sample Recordings Hver reaktion svarer til et enkelt lys flash af 50 ms varighed (sorte søjler). (A) Et eksempel på den store negative spænding ændring, der skal ses blotfør ind i en celle. (B) En ren optagelse bør have ringe baggrundsstøj og en stor depolariserende reaktion, typisk på mindst 40 mV. (C) Et eksempel på en dårlig optagelse på grund af den negative potentiale ændring efter den vigtigste peak (pilespidser). (D) Et andet eksempel på en dårlig optagelse. Den hvilende potentiale undergår store udsving (rød bar) og den store mængde af baggrundsstøj kan tilsløre amplituden af respons (pilespids).
Figur 7:. Reaktion-Intensity Log-lineær funktion fyldte cirkler viser de målte responser af en celle 3,5-0 OD, for denne eksperimentelle opsætning. Lysintensitet er på en logaritmisk skala. Ved meget høje intensiteter svaret er mættet, og ved meget lave intensiteter en lille reaktion fortsætter i stedet for at droppe til nul langs linjen. Than Naka-Rushton ligning 33 er monteret på denne ikke-lineære form (stiplet linje).
Figur 8:. Spektral følsomhed Eksempler (A) En enkelt repræsentativ celle svar blev registreret og relativ spektral følsomhed blev beregnet. Toppen af denne celle er ved 440 nm, hvilket betyder at det reagerer bedst til blåt lys. Enkelt celle data kan se støjende (top ved 380 nm). (B) Celler med samme relative top og form midles sammen og tilsættes standardfejllinjer. Her blev syv blå celler fra syv personer i gennemsnit leverer stærke beviser for, at en celletype der findes i denne art maksimalt følsomme over for lys ved 440 nm. (C) Denne proces kan gentages for alle celletyper fundet, og plottet sammen. Insekt øjne varierer meget i deres spektrale følsomhed, men en typisk insect kan have toppe er vist her, ved 370 nm, 440 nm og 510 nm. Bemærk, disse spektrale følsomheder er alle beregnet ved hjælp af reelle data, men toppene er blevet flyttet, fordi dataene endnu ikke er offentliggjort for denne art.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Intracellulær optagelse kan være en vanskelig teknik at mestre grund af de mange tekniske trin involveret. For vellykkede eksperimenter må anses flere vigtige punkter. For det første er det vigtigt at have en korrekt vibrationally-isoleret bord, hvorpå eksperimentet udføres. Mange forskere bruger luft tabeller, som fuldstændig adskiller bordpladen fra basen, hvilket giver overlegen vibrationsisolering. Vores setup indebærer en tyk marmor bord med en sandkasse på toppen, der omgiver scenen apparatet mikromanipulator / elektrodeholder / prøve. Dette er en effektiv og billigere alternativ til en luft bord, især hvis adgangen til in-house gas eller trykluft er en begrænsning. Kan træffes en sådan Ekstra vibrationsabsorberende foranstaltninger passiv luftaffjedring, eller tilsætning af stødabsorberende elementer til bordbenene (f.eks åbnede tennisbolde, cykel rør, tykke gel pads). Endvidere er det vigtigt, at forsøgsopstillingen være inde i enFaradays bur med alt jordforbindelse. Faraday bur bør have en metal mesh sigte foran, der kan fjernes, når der arbejdes inde i buret og udskiftes let ved optagelse. Selv en lille mængde af omgivende elektrisk støj (især 50 Hz støj fra de vigtigste AC strømforsyning) kan gøre en ellers god optagelse ubrugelig.
Ved udarbejdelsen af eksemplar, hemolymph og pigment lag omgiver ommatidia kan forhindre succesfulde optagelser. Hvis hullet i hornhinden er skåret for stor, normal pumpning af hæmolymfe i kroppen forårsager væskeoverfladen at bevæge sig op og ned på den afskårne site, hvilket resulterer i en ustabil optagelse. Når hullet er skåret, vil hæmolymfe og overflade pigment lag koagulere hurtigt til en uigennemtrængelig skurv selv når forseglet med vaseline, så det er vigtigt at få elektroden i øjet så hurtigt som muligt. Ringers opløsning, kan også anvendes i stedet for vaseline. Jordelektroden kan indføres i denmunddele eller ind stumpen af et snit antenne.
Desuden er det ofte nyttigt at holde dyret så mørk-tilpasset som muligt. Til denne metode, indbefatter trin holder optagerum meget mørke, blokerer falsk lys fra Xenon lampe fra at komme ind på Faradays bur, kortvarige stimulus blinker (30-50 ms), og en tilstrækkelig lav frekvens mellem blink (0,5 eller større). Når et visuelt pigment absorberer en foton, kromoforen i rhodopsin skifter fra 11- cis-3-hydroxyretinal for alle - trans -retinal, inducere konformationelle ændring af opsin protein, og aktivering af hele komplekset som metarhodopsin, der initierer G-proteinet kaskade. Foto-blegning opstår, når høj intensitet lys får kromoforen til fysisk adskilt fra opsin protein. Tiden er en begrænsende faktor i dette eksperiment, fordi elektroden vil kun stabilt optage svar fra inden i cellen i en vis periode inden den falder udeller membranen er beskadiget. Af denne grund har vi ikke bryder for at tillade cellen at komme sig, men vi bruger en flash varighed og frekvens, som vi har fundet ikke nedbrydes cellens respons over tid. Det er vigtigt at mindske både hyppigheden og intensiteten af lys, hvis foto-blegning opstår.
Under optagelse kan en stor elektrode tip eller stor bevægelse af elektroden beskadige cellen, når gennemtrænger membranen. Kun fine tips (mindst ~ 100 MQ) og små bevægelser skal bruges, når du nærmer en celle til optagelse. Hvis intracellulær optagelse anvendes på andre applikationer, såsom hjerne optagelser, kan ekstremt fine, solide elektroder trækkes ved hjælp af kvartsglas, men et specialiseret aftrækker skal anvendes til disse elektroder. Når først gør en elektrode trække program, vi kontrolleres tip modstand ved opfyldning elektroden, sikring den til indehaveren af elektroden i en mock setup, og placere spidsen og jorden elektrode i saltvandsopløsning. Next vi anvendt en strøm til at måle ændringen i spænding på oscilloskopet. For at flytte elektrodespidsen vi bruger en manuel mikromanipulator, der bevæger sig langs to akser. Der findes andre manipulatorer herunder digitale dem, der tillader bevægelse langs alle tre akser, og disse kan anvendes til denne eller mere komplekse applikationer. Der er mange måder at bygge en scene til optagelse, og der er mange forskellige typer af hardware og software, der anvendes i registrering og analyse af observerede data. Vores setup repræsenterer en enkel, nem og økonomisk overkommelig opsætning af optagelsen riggen.
Ved konstruktion af VlogI kurven, funktioner er udviklet af Naka og Rushton 33 og andre 34,35 konto for de ikke-lineære dele af de plottede svar. Forskellige metoder anvendes til at passe denne kurve til dataene, og vi afbildet resultaterne af en sådan metode, der ikke kræver kurvetilpasning software, selv om andre metoder er også egnede 36,37 (
En begrænsning ved metoden er, at hvis undersøgelsen organismen udtrykker mere end én genetisk lignende opsin i øjet, kan det være vanskeligt at identificere, hvilke opsin mRNA sandsynligvis svarer til hvilken spektral klasse af fotoreceptor celle. For at overvinde dette problem, er denne metode blevet kombineret med dye-injektioner og in situ hybridisering eller immunhistokemi til at identificere de opsiner udtrykt i optagede celler 10.
Vores metode er enkel og tilgængelig for forskere ukendte med visuel elektrofysiologi. Denne teknik er almindelig i neurovidenskab, men specifik og klare metoder er fraværende i litteraturen, hvilket gør denne fremgangsmåde vanskelig at reproducere. Selvom mange variationer af denne teknik findes, tilbyder vi en enkel måde at måle spektral følsomhed forbindelsen øjet. Den fysiologiske data er et vigtigt stykke bevismateriale i historier om visuel økologi og evolution 41. Opsin sekvensvariation er tæt forbundet med følsomheden af en fotoreceptor celle, hvilket gør denne metode ideel til undersøgelser der undersøger det genetiske grundlag for fænotypisk forandring. Måling af fotoreceptor celle følsomheder kan også parres med analyser adfærdsmæssige forskelsbehandling farve, der viser den fysiologiske grundlag for grænseværdier vigtige forskelsbehandling i farvesyn 42-46. I genetiske eller terapeutiske manipulationer i Drosophila for eksempel denne technique kan være en god måde at måle korrekt fysiologiske funktion af øjet eller hjernen samt 47,48. Selvom vores er ikke den første eller den mest komplekse metode til intracellulær optagelse i øjet, vores håb er, at vi kan gøre denne metode mere let tilgængelige for reproduktion og integration i forskningsprogrammer uden for formelle neurovidenskab.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi takker sent Rudy Limburg for opdigte de Kardankryds arm omkreds, Kimberly Jamison, Matthew McHenry, og Raju Metherate for udlån os udstyr, og Almut Kelber og Kentaro Arikawa, for opmuntring. Dette arbejde blev støttet af en National Science Foundation (NSF) Graduate Research Fellowship til KJM og NSF tilskud IOS-1.257.627 til ADB
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Butterfly pupae | Several local species available, need USDA permits for shipping. Carolina Bio Supply has several insect species that may be ordered within the U.S. without the need for additional permits | ||
| Large plastic cylinder | Any chamber that remains humidified will work | ||
| Insect pins, size 2 | BioQuip | 1208B2 | |
| 100% Desert Mesquite Honey | Trader Joe's | Any honey or sucrose solution will work | |
| Xenon Arc Lamp | Oriel Instruments | 66003 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
| Universal Power Supply | Oriel Instruments | 68805 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
| Optical Track | Oriel Instruments | 11190 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
| Rail Carrier, Large (2x) | Oriel Instruments | 11641 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
| Rail Carrier, Small (4x) | Oriel Instruments | 11647 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
| Thread Adaptor, 8-32 Male to 1/4-20 Male, pack of 10 | Newport Corporation | TA-8Q20-10 | |
| Optical Mounting Post, 1.0 in., 0.5 in. Dia. Stainless, 8-32 & 1/4-20 (5x) | Newport Corporation | SP-1 | |
| No Slip Optical Post Holder, 2 in., 0.5 in. Diameter Posts, 1/4-20 (5x) | Newport Corporation | VPH-2 | |
| Fixed lens mount, 50.8 mm | Newport Corporation | LH-2 | |
| Fixed lens mount, 25.4 mm | Newport Corporation | LH-1 | |
| Condenser lens assembly | Newport Corporation | 60006 | |
| Convex silica lens, 50.8 mm | Newport Corporation | SPX055 | |
| Six Position Filter Wheel, x2 | Newport Corporation | FW1X6 | |
| Filter Wheel Mount Hub | Newport Corporation | FWM | |
| Concave silica lens, 25.4 mm | Newport Corporation | SPC034 | |
| Collimator holder | Newport Corporation | 77612 | |
| Collimating beam probe | Newport Corporation | 77644 | |
| Ferrule Converter, SMA Termination to 11 mm Standard Ferrule | Newport Corporation | 77670 | This adapter allows the fiber optic to fit into the collimator holder |
| 600 μm diameter UV-vis fiber obtic cable | Oriel Instruments | 78367 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
| Shutter with drive unit | Uniblitz | 100-2B | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.1 OD | Newport | FRQ-ND01 | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.3 OD | Newport | FRQ-ND03 | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.5 OD | Newport | FRQ-ND05 | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 1.0 OD | Newport | FRQ-ND10 | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 2.0 OD | Newport | FRQ-ND30 | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 3.0 OD | Newport | FRQ-ND50 | |
| LS-1-Cal lamp | Ocean Optics | LS-1-Cal | |
| Spectrometer | Ocean Optics | USB-2000 | |
| SpectraSuite Software | Ocean Optics | ||
| Interference bandpass filter, 300 nm | Edmund Optics | 67749 | |
| Interference bandpass filter, 310 nm | Edmund Optics | 67752 | |
| Interference bandpass filter, 320 nm | Edmund Optics | 67754 | |
| Interference bandpass filter, 330 nm | Edmund Optics | 67756 | |
| Interference bandpass filter, 340 nm | Edmund Optics | 65614 | |
| Interference bandpass filter, 350 nm | Edmund Optics | 67757 | |
| Interference bandpass filter, 360 nm | Edmund Optics | 67760 | |
| Interference bandpass filter, 370 nm | Edmund Optics | 67761 | |
| Interference bandpass filter, 380 nm | Edmund Optics | 67762 | |
| Interference bandpass filter, 390 nm | Edmund Optics | 67763 | |
| Interference bandpass filter, 400 nm | Edmund Optics | 65732 | |
| Interference bandpass filter, 410 nm | Edmund Optics | 65619 | |
| Interference bandpass filter, 420 nm | Edmund Optics | 65621 | |
| Interference bandpass filter, 430 nm | Edmund Optics | 65622 | |
| Interference bandpass filter, 440 nm | Edmund Optics | 67764 | |
| Interference bandpass filter, 450 nm | Edmund Optics | 65625 | |
| Interference bandpass filter, 460 nm | Edmund Optics | 67765 | |
| Interference bandpass filter, 470 nm | Edmund Optics | 65629 | |
| Interference bandpass filter, 480 nm | Edmund Optics | 65630 | |
| Interference bandpass filter, 492 nm | Edmund Optics | 65633 | |
| Interference bandpass filter, 500 nm | Edmund Optics | 65634 | |
| Interference bandpass filter, 510 nm | Edmund Optics | 65637 | |
| Interference bandpass filter, 520 nm | Edmund Optics | 65639 | |
| Interference bandpass filter, 532 nm | Edmund Optics | 65640 | |
| Interference bandpass filter, 540 nm | Edmund Optics | 65642 | |
| Interference bandpass filter, 550 nm | Edmund Optics | 65644 | |
| Interference bandpass filter, 560 nm | Edmund Optics | 67766 | |
| Interference bandpass filter, 570 nm | Edmund Optics | 67767 | |
| Interference bandpass filter, 580 nm | Edmund Optics | 65646 | |
| Interference bandpass filter, 589 nm | Edmund Optics | 65647 | |
| Interference bandpass filter, 600 nm | Edmund Optics | 65648 | |
| Interference bandpass filter, 610 nm | Edmund Optics | 65649 | |
| Interference bandpass filter, 620 nm | Edmund Optics | 65650 | |
| Interference bandpass filter, 632 nm | Edmund Optics | 65651 | |
| Interference bandpass filter, 640 nm | Edmund Optics | 65653 | |
| Interference bandpass filter, 650 nm | Edmund Optics | 65655 | |
| Interference bandpass filter, 660 nm | Edmund Optics | 67769 | |
| Interference bandpass filter, 671 nm | Edmund Optics | 65657 | |
| Interference bandpass filter, 680 nm | Edmund Optics | 67770 | |
| Interference bandpass filter, 690 nm | Edmund Optics | 65659 | |
| Interference bandpass filter, 700 nm | Edmund Optics | 67771 | |
| Faraday cage | Any metal structure will work that can be grounded and that fits the experimental setup. | ||
| Stereomicroscope, 6X, 12X, 25X, 50X magnification | Wild Heerbrugg | Wild M5 | Any Stereomicroscope will do |
| Microscope stand with swinging arm and heavy base | McBain Instruments | Any heavy base with arm will do | |
| Cardan arm | Custom built, See Figure 4 | ||
| Fiber-lite high intensity illuminator | Dolan-Jenner | MI-150 | For lighting specimen |
| Fiber-lite goose-neck light guide | Dolan-Jenner | EEG 2823 | Any goose-neck light guide will do |
| Marble table | |||
| Raised wooden table | Hole should be cut through this table so that the sandbox can rest on the marble table underneath | ||
| Wooden box filled with sand | custom built, any box with sand | ||
| Manipulator | Carl Zeiss - Jena | ||
| Electrode holder | |||
| Specimen stage | |||
| Alligator clip wires for grounding | |||
| Insulated copper wire | |||
| Silver wire, 0.125 mm diameter | World Precision Instruments | AGW0510 | |
| BNC cables | |||
| Preamplifier with headstage | Dagan Corporation | IX2-700 | |
| Humbug Noise reducer | Quest Scientific | Humbug | |
| Oscilloscope, 30 MHz, 2 CH, Dual Trace, Alt-triggering, without probe | EZ Digital | os-5030 | |
| BNC T-adapter | |||
| Powerlab hardware 2/20 | ADI instruments | ML820 | |
| Labchart software | ADI instruments | Chart 5 | |
| 10 MHz Pulse Generator | BK Precision | 4030 | |
| Glass pipette puller | Sutter Instruments | P-87 | |
| Borosillicate glass capillaries with filament | World Precision Instruments | 1B120F-4 | |
| Potassium chloride, 3 M | |||
| Slotted plastic tube | |||
| Low melting temperature wax | |||
| Soldering Iron | Weller | ||
| Platform with ball-and-socket magnetic base | Hama photo and video | ||
| Double edge carbon steel, breakable razor blade | Electron Microscopy Sciences | 72004 | |
| Vaseline | |||
| Microsoft Excel | Microsoft |
References
- Beckmann, H., et al. Spectral sensitivity in Onychophora (velvet worms) revealed by electroretinograms, phototactic behaviour and opsin gene expression. J. Exp. Biol. 218, 915-922 (2015).
- Leboulle, G., et al. Characterisation of the RNA interference response against the long-wavelength receptor of the honeybee. Insect Biochem. Mol. Biol. 43, 959-969 (2013).
- Martinez-Harms, J., et al. Evidence of red sensitive photoreceptors in Pygopleurus israelitus Coleoptera) and its implications for beetle pollination in the southeast Mediterranean. J. Comp. Physiol. A. 198, 451-463 (2012).
- Knox, B. E., et al.
- Salcedo, E., Zheng, L., Phistry, M., Bagg, E. E., Britt, S. G. Molecular basis for ultraviolet vision in invertebrates. J. Neurosci. 23, 10873-10878 (2003).
- Salcedo, E., et al. Blue- and green-absorbing visual pigments of Drosophila: ectopic expression and physiological characterization of the R8 photoreceptor cell-specific Rh5 and Rh6 rhodopsins. J. Neurosci. 19, 10716-10726 (1999).
- Vilinsky, I., Johnson, K. G. Electroretinograms in Drosophila: robust and genetically accessible electrophysiological system for the undergraduate laboratory. J. Undergrad. Neurosci. Educ. 11, 149-157 (2012).
- Hu, X., Leming, M. T., Whaley, M. A., O'Tousa, J. E. Rhodopsin coexpression in UV photoreceptors of Aedes aegypti Anopheles gambiae mosquitoes. J. Exp. Biol. 217, 1003-1008 (2014).
- Telles, F. J., et al. Out of the blue: the spectral sensitivity of hummingbird hawkmoths. J. Comp. Physiol. A. 200, 537-546 (2014).
- Arikawa, K., Mizuno, S., Kinoshita, M., Stavenga, D. G. Coexpression of two visual pigments in a photoreceptor causes an abnormally broad spectral sensitivity in the eye of the butterfly Papilio xuthus. J. Neurosci. 23, 4527-4532 (2003).
- Arikawa, K., et al. An ultraviolet absorbing pigment causes a narrow-band violet receptor and a single-peaked green receptor in the eye of the butterfly Papilio. Vision Res. 39, 1-8 (1999).
- Cronin, T. W., Jarvilehto, M., Weckstrom, M., Lall, A. B. Tuning of photoreceptor spectral sensitivity in fireflies (Coleoptera: Lampyridae). J. Comp. Physiol. A. 186, 1-12 (2000).
- Skorupski, P., Doring, T. F., Chittka, L. Photoreceptor spectral sensitivity in island and mainland populations of the bumblebee, Bombus terrestris. J. Comp. Physiol. A. 193, 485-494 (2007).
- Stalleicken, J., Labhart, T., Mouritsen, H. Physiological characterization of the compound eye in monarch butterflies with focus on the dorsal rim area. J. Comp. Physiol. A. 192, 321-331 (2006).
- Skorupski, P., Chittka, L. Photoreceptor processing speed and input resistance changes during light adaptation correlate with spectral class in the bumblebee, Bombus impatiens. PLoS One. 6, 25989 (2011).
- Yang, E. -C., Osorio, D. Spectral sensitivities of photoreceptors and lamina monopolar cells in the dragonfly, Hemicordulia tau. J. Comp. Physiol. A. 169, (1991).
- Yang, E. C., Lin, H. C., Hung, Y. S. Patterns of chromatic information processing in the lobula of the honeybee, Apis mellifera L. J. Insect Physiol. 50, 913-925 (2004).
- Rosner, R., Homberg, U. Widespread sensitivity to looming stimuli and small moving objects in the central complex of an insect brain. J. Neurosci. 33, 8122-8133 (2013).
- Trager, U., Homberg, U. Polarization-sensitive descending neurons in the locust: connecting the brain to thoracic ganglia. J. Neurosci. 31, 2238-2247 (2011).
- Heinze, S., Reppert, S. M. Sun compass integration of skylight cues in migratory monarch butterflies. Neuron. 69, 345-358 (2011).
- Greiner, B., Cronin, T. W., Ribi, W. A., Wcislo, W. T., Warrant, E. J. Anatomical and physiological evidence for polarisation vision in the nocturnal bee Megalopta genalis. J. Comp. Physiol. A. 193, 591-600 (2007).
- Stowasser, A., Buschbeck, E. K. Electrophysiological evidence for polarization sensitivity in the camera-type eyes of the aquatic predacious insect larva Thermonectus marmoratus. J. Exp. Biol. 215, 3577-3586 (2012).
- Osorio, D. Directionally selective cells in the locust medulla. J. Comp. Physiol. A. 159, 841-847 (1986).
- Nordström, K., Barnett, P. D., Moyer de Miguel, I. M., Brinkworth, R. S., O'Carroll, D. C. Sexual dimorphism in the hoverfly motion vision pathway. Curr. Biol. 18, 661-667 (2008).
- Plachetzki, D. C., Fong, C. R., Oakley, T. H. The evolution of phototransduction from an ancestral cyclic nucleotide gated pathway. Proc. Biol. Sci. 277, 1963-1969 (2010).
- Feuda, R., Hamilton, S. C., McInerney, J. O., Pisani, D. Metazoan opsin evolution reveals a simple route to animal vision. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 18868-18872 (2012).
- Palczewski, K., et al. Crystal structure of rhodopsin: A G protein-coupled receptor. Science. 289, 739-745 (2000).
- Hardie, R. C., Raghu, P.
- Katti, C., et al. Opsin co-expression in Limulus differential regulation by light and a circadian clock. J. Exp. Biol. 213, 2589-2601 (2010).
- Smith, W. C., Price, D. A., Greenberg, R. M., Battelle, B. A. Opsins from the lateral eyes and ocelli of the horseshoe crab, Limulus polyphemus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 6150-6154 (1993).
- Sison-Mangus, M. P., Bernard, G. D., Lampel, J., Briscoe, A. D. Beauty in the eye of the beholder: the two blue opsins of lycaenid butterflies and the opsin gene-driven evolution of sexually dimorphic eyes. J. Exp. Biol. 209, 3079-3090 (2006).
- Rushton, W. Review Lecture. Pigments and signals in colour vision. J. Physiol. 220, 1-31 (1972).
- Naka, K. I., Rushton, W. A. S-potentials from luminosity units in the retina of fish (Cyprinidae). J. Physiol. 185, 587-599 (1966).
- Lipetz, L. E. Handbook of Sensory Physiology. Vol. 1. Principles of Receptor Physiology. Loewenstein, W. R. 1, Springer. Berlin Heidelberg. Ch. 6 191-225 (1971).
- Matić, T., Laughlin, S. B. Changes in the intensity-response function of an insect's photoreceptors due to light adaptation. J. Comp. Physiol. A. 145, 169-177 (1981).
- Evans, L. S., Peachey, N. S., Marchese, A. L. Comparison of three methods of estimating the parameters of the Naka-Rushton equation. Documenta Ophthalmologica. 84, 19-30 (1993).
- Aylward, G. W. A simple method of fitting the Naka-Rushton equation. Clinical Vision Sciences. 4, 275-277 (1989).
- Stavenga, D. G., Smits, R. P., Hoenders, B. J. Simple exponential functions describing the absorbance bands of visual pigment spectra. Vision Res. 33, 1011-1017 (1993).
- Bernard, G. D.
- Ogawa, Y., et al. Coexpression of three middle wavelength-absorbing visual pigments in sexually dimorphic photoreceptors of the butterfly Colias erate. J. Comp. Physiol. A. 198, 857-867 (2012).
- Briscoe, A. D., Chittka, L. The evolution of color vision in insects. Annu. Rev. Entomol. 46, 471-510 (2001).
- Kelber, A., Thunell, C., Arikawa, K. Polarisation-dependent colour vision in Papilio butterflies. J. Exp. Biol. 204, 2469-2480 (2001).
- Kelber, A., Balkenius, A., Warrant, E. J. Scotopic colour vision in nocturnal hawkmoths. Nature. 419, 922-925 (2002).
- Koshitaka, H., Kinoshita, M., Vorobyev, M., Arikawa, K. Tetrachromacy in a butterfly that has eight varieties of spectral receptors. Proc. Biol. Sci. 275, 947-954 (2008).
- Blackiston, D., Briscoe, A. D., Weiss, M. R. Color vision and learning in the monarch butterfly, Danaus plexippus (Nymphalidae). J. Exp. Biol. 214, 509-520 (2011).
- Sison-Mangus, M. P., Briscoe, A. D., Zaccardi, G., Knuttel, H., Kelber, A. The lycaenid butterfly Polyommatus icarus uses a duplicated blue opsin to see green. J. Exp. Biol. 211, 361-369 (2008).
- Schneuwly, S., et al. Drosophilia ninaA gene encodes an eye-specific cyclophilin (cyclosporine A binding protein). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (1989).
- Luan, Z., Reddig, K., Li, H. S. Loss of Na(+)/K(+)-ATPase in Drosophila leads to blindness and age-dependent neurodegeneration. Exp. Neurol. 261, 791-801 (2014).
