Summary
細胞内記録の電気生理学的技術を実証し、バタフライの複眼における単一の光受容体細胞の分光感度を決定するために使用されます。
Abstract
細胞内記録は、単一の細胞が与えられた刺激に応答することができる方法を決定するために使用される強力な手法です。ビジョン研究では、細胞内記録は、歴史的に今日でも使用されている異なる光刺激に対する個々の光受容細胞の感度を研究するために使用される一般的な技術となっています。しかし、目に細胞内記録実験を複製することを望む研究者のための文献で詳細な方法論の不足が残っています。ここでは、より一般的には目の生理機能を調べるためのモデルとして昆虫を提示します。昆虫視細胞は、眼の表面付近に位置するので、簡単に行くことができている、とビジョンに関与する機構の多くは、動物門を越えて保存されています。私たちは、電子が少し前に経験を持つ研究者へのこの技術は、よりアクセスしやすくすることを目標に、蝶の眼における光受容体細胞のin vivoでの細胞内記録のための基本的な手順を説明しますlectrophysiology。我々は、単一の細胞内へのガラス微小電極、最後に記録手順自体を挿入する方法、記録のためのライブ蝶を準備する方法、必要な基本的な設備を導入します。我々はまた、個々の細胞型の分光感度を測定するための生のレスポンスデータの基本的な分析を説明します。我々のプロトコルは、分光感度を決定することに焦点を当てているが、他の刺激（ 例えば 、偏光）及び方法のバリエーションは、このセットアップに適用可能です。
Introduction
例えば、神経細胞などの細胞の電気的特性は、電圧又は電流の変化として、細胞膜を横切るイオンの流れを測定することによって観察されます。電気種々の技術は、細胞内の生体事象を測定するために開発されてきました。動物の眼で見られるニューロンはアクセス可能であり、その回路は、これらの細胞を電気生理学的研究のための良い候補を作り、多くの場合、脳内のよりも複雑ではありません。目の中の電気生理学の一般的なアプリケーションは、電図（ERG）1,2および微小電極の細胞内記録を含みます。 ERGは、動物の眼内または上に電極を配置し、光刺激を印加し、全ての周辺セル3-6の応答の和として電圧の変化を測定することを含みます。一つは、個々の光受容細胞の分光感度を特徴付けるにおいて特に興味がある場合、多くの場合、複数の細胞型は、同時に与えられた刺激とは異なる強度で応答します。したがって眼におけるスペクトル的に類似した光受容体細胞のいくつかの異なる種類がある場合は特にERGデータから特定の細胞型の感度を決定することは困難です。 1つの可能な解決法は、眼の過半数R1-6細胞で発現関心の感光体（オプシン）遺伝子を有するトランスジェニックショウジョウバエを作成し、ERGを7を実行することです。この方法の潜在的な欠点は、感光体タンパク質8、およびトランスジェニック動物の作製およびスクリーニングのための長い時間枠の低発現に何が含まれていません。スペクトル的に別個の光受容体の少ない種類の目のために、着色されたフィルタを使用して、目の適応は、それによって分光感度極大9の推定を可能にして、ERGにいくつかの細胞型の寄与を低下させることを支援することができます。
細胞内記録は、微細な電極は、セルをimpales別の技術であり、刺激が適用されます。電極レコードだけがINDIVidual細胞の応答の記録と、複数の個々の細胞を分析して、生理学的に異なる細胞型の特定の感度10-14を得ることができるようにします。我々のプロトコルは、分光感度の分析に焦点を当てているが、シャープな電極を有する細胞内記録の基本的な原理は、他のアプリケーションに修正可能です。例えば、試料の異なる調製物を用い、かつシャープな石英電極を用いて、1は、提起された課題に応じて、脳内の視神経葉や他の地域でより深いから記録することができます。例えば、個々の光受容体細胞15の応答時間は、視神経内の細胞活性は、19にも同様の技術を用いて記録することができ、または色刺激は、偏光20と置き換えることができる16（薄層、髄質またはlobula 17）、脳18または他の神経節のローブ-22または運動は23,24を刺激しました。
光情報伝達、光による処理エネルギーが吸収され、電気信号に変換され、ほぼすべての今日の動物門25に共通の古代の特色です。視細胞で見られ、視覚的な光伝達を開始する責任視覚色素はロドプシンです。すべての動物におけるロドプシンは、網膜または類似の分子26,27由来するオプシンタンパク質、7膜貫通Gタンパク質共役受容体ファミリーのメンバー、および関連する発色団で構成されています。オプシンのアミノ酸配列と発色団の構造は、光の異なる波長にロドプシンの吸光度に影響を与えます。光子は、発色団に吸収されるとロドプシンは、最終的には膜結合型イオンチャンネル28の開口部につながる細胞内のGタンパク質のカスケードを開始する、活性化。ほとんどのニューロンとは異なり、光受容体細胞を光刺激の変化に応答振幅の相対的な変化として測定することができる段階的な電位変化を受けます。一般的に与えられました感光体の種類が唯一のオプシン遺伝子を発現する（例外は8,10,29-31存在しますが）。洗練されたカラービジョンは、多くの脊椎動物と節足動物に見られる種類のもので、それぞれが1つまたは時折それ以上のロドプシン型を発現する光受容細胞の数百または数千の複雑な目で達成されます。視覚情報は、色や動きの完全な画像の認識結果として、眼と脳内の複雑な下流の神経シグナリングを介して感光体モザイクを超える応答を比較することによって捕捉されます。
細胞内記録を介して異なる波長の光を光受容細胞の生の応答を測定した後、その分光感度を算出することができます。この計算は、光受容体細胞の応答は、それが32を吸収した光子の特定の特性にそれが吸収する光子の数に依存するが、ではないことを述べてUnivarianceの原理に基づいています。 absoである任意の光子応答の同じ種類を誘導するロドプシンによってrbed。実際には、これは、細胞の生の応答振幅が原因（より多くの光子が吸収する）、 またはそのピーク感度（その波長を吸収するロドプシンの確率が高い）に向けて波長のシフトに光強度の増加のいずれかに増加することを意味します。我々は、既知の強度と異なる波長での応答に同じ波長と同じ強度が、未知の相対感度で細胞応答を関連で、この原理を利用しています。細胞型は、しばしば波長におけるそれらの感度ピークによって識別されます。
ここでは、より広い研究コミュニティには、この方法は、よりアクセスしやすくに焦点を当てて、細胞内記録と蝶の眼における光受容体の分光感度の分析のための1つの方法を示します。細胞内記録は、特に昆虫における色覚に関して、文献に共通のままであるが、我々はthaのを発見しました材料および方法のトンの記述は、通常、技術の再生を可能にするにはあまりにも短いです。私たちは、その簡単に複製を可能にする目的で、ビデオ形式で、この方法を提示します。我々はまた、容易に入手可能で手頃な価格の機器を用いた手法について説明します。私たちは、新しい、複雑な技術を最適化する際、研究を遅く頻繁に報告されていない一般的な注意事項に取り組みます。
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Protocol
全ての動物は、可能な限り人道的に扱われました。昆虫は、コスタリカ昆虫サプライ、コスタリカから蛹として出荷されました。
1. Heliconius蛹ケア
- ハングは、すべての蛹は虫ピンを使用して、加湿チャンバー内で2〜3センチメートル離間しました。
- 羽化後、翼は加湿チャンバー中に少なくとも1日の生きている蝶を維持し、記録する前に、毎日希蜜液を供給後、乾燥させます。
- 体積で約20％の蜂蜜溶液に水と蜂蜜を希釈し、浅いペトリ皿に注ぎます。
- ペトリ皿、1つずつ個別の蝶を持参してください。そのフロントtarsusの複数形で溶液に触れる際に、蝶が自動的にペトリ皿から自分proboscidesや飲み物を拡張します。その口吻が自動的に延長しない場合、アウト口先を引き、蜂蜜溶液にそれを導入するために鉗子を使用しています。
2.オプティカルトラック、キャリブレーション、およびMeasur試作光条件のement
- ハウジングとユニバーサル電源、明るい白色光を提供するために、少なくとも1メートル長いテーブルの一端に取り付けられた集光レンズアセンブリと150 Wキセノンアークランプを配置します。
注意：キセノンランプは、強い紫外線強度で非常に明るい光を生成します。保護メガネを常に着用すると、製造業者の指示に従ってランプが大気中の酸素とUV光との相互作用によって引き起こされるオゾンの蓄積を防止するために使用されるべきです。 - （ 図1）を通過するようにハウジングアセンブリを出る光のための長さは光学トラック1メートルを設定します。
- 離れておおよその距離を有する光学トラック上の次の順序での場所：1）40センチメートルコンデンサーアセンブリから凸シリカまたは石英レンズ、2）さらに沿った光路で現在フィルタなし）22センチメートルと中性フィルターホイール（ 14センチメートルNDフィルタからの駆動ユニットとトラック、3）シャッター秒、さらにトラックの遠端に沿って4）凹面シリカ又は石英レンズすぐ隣のシャッター以下、及び5）コリメートビームプローブ6 cmです。
- コリメートビームプローブに600μmの直径の光ファイバケーブルを貼り付けます。
注：光の強度に応じて5〜10 mmの直径の光ファイバケーブルは、他のプレップに十分な光を提供するために必要とされてもよく、この置換されていてもよいです。 - アセンブリを出る光ビームは、可能な限り最高の強度であるように、各光学素子の距離、高さと角度を調整します。
- 光学トラック要素は、異なるアプリケーションと多少異なる場合がありますように、すべての要素がUVAと可視範囲（315から700ナノメートル）の光を透過することを確認してください。
- 光学トラックが組み立てられると、分光計を使用してセットアップを通過する光を測定します。既知のスペクトルとメーカーのソフトウェアを使用してキャリブレーションランプを使用して第1の分光器のキャリブレーションを行います。
注意：私たちは、次は、明確にするためにオーシャンオプティクス製品を使用して設定するが、他のメーカー（ 例えば 、Avantes）が同等の製品を販売して説明します。- 測定を行う前にタングステンキャリブレーションランプ少なくとも45分をオンにします。
- キャリブレーションを行うには、関連するソフトウェアがインストールされているコンピュータにUSB経由で分光器を取り付けます。その後、紫外可視透過コサインコレクタを介してタングステン校正ランプに分光器を接続してください。
- 「ファイル」タブから「新絶対放射照度測定」を選択し、として分光器を選択し、「ソース」。
- 新しいキャリブレーション「CAL」ファイルを作成するために、画面の指示に従ってください。プロンプトが表示されたら、自動的に分光器の出力から補正スペクトルを計算するソフトウェア、に可視光領域（300〜800 nm）のタングステン校正ランプの既知のスペクトルのため提供されたデータファイルをロードします。
- キャリブレーションファイルを保存します。時のinitiこのファイルをロードします分光計を用いて光スペクトルのすべての将来の測定のためのソフトウェアをalizing。
- 分光計を校正したら、実験からの光のスペクトルを記録するために、これを使用しています。ソフトウェアを開いたとき以後、「新絶対放射照度測定」を選択し、以前に保存したキャリブレーションファイルをロードします。次分光計にすべての光を遮断することにより、ダークスペクトルを取ります。
- 分光計は、現在の所望の実験の光条件を測定することで、積分時間（4秒）を調整し、平均化するためのスキャン（5）、及びボックスカー幅（5）ので、スペクトルが正しくスケーリングされ、平滑化されます。異なる測定からの光強度を比較することができるように、すべてのスペクトル測定のために同じ設定をしてください。
- すべての中性密度フィルタを実験の間に使用されるために、減衰白色光についてのスペクトルを測定し、各バンドパス干渉フィルタのため（ 図2）。
- M分光計にステップ2.2.2から光ファイバケーブルの自由端を固定することにより、光路内の任意のフィルタなしで、白色光スペクトルをeasure。ステップ2.3からロードされたキャリブレーションファイルを使用して、テキストファイルとして分光器のソフトウェアを使用して白色光スペクトルを保存します。
注：スペクトルは保存されたテキストファイルは、波長をリストとして（X座標）の列と第2列の光の強度（y座標）は、データがステップ2.6スプレッドシートにロードすることができるようにします。 - ステップ2.5.1と同じ設定を使用して、光学トラックに中性濃度（ND）フィルタホイールを回転させることによって、実験中に使用されるそれぞれの光学密度（OD）（0〜3.5 OD）からのスペクトルを記録し、テキストファイルを保存します各OD。
- ステップ2.5.1と同じ設定を使用して、10nmの半値幅の干渉フィルタを光路内に1つずつ配置し、各フィルタについて観察されたスペクトルを記録します。 41異なる干渉フィルタワットごとに、この手順を繰り返しi番目のピーク透過率は、300〜700nmの10nmごとに離間しました。さらに離れ（20 nm）の間隔をあけフィルタはほとんどの用途に許容される（スペクトルについて、 図2を参照）。
- M分光計にステップ2.2.2から光ファイバケーブルの自由端を固定することにより、光路内の任意のフィルタなしで、白色光スペクトルをeasure。ステップ2.3からロードされたキャリブレーションファイルを使用して、テキストファイルとして分光器のソフトウェアを使用して白色光スペクトルを保存します。
- 干渉フィルタは、光路に配置されたときに、光の強度の違いを補正します。各干渉フィルタは、光子の異なる総数が通過することを可能にし、いくつかのフィルタの低透過率は、すべてのフィルタは、光子の同数を許可するように、それは難しい、さらに強度を減衰させることができます。
- 各10 nmの帯域幅の干渉フィルタのための相対強度（I）を計算するために、Tは（2.5.3から）各10 nmの干渉フィルタのスペクトル曲線下の面積で表現、私は= T /秒、中に私のために解決、およびsは、各フィルタのピーク波長における白色光の最大絶対放射照度（2.5.1から保存したテキストファイルのy値）（520 nmでの例については、 図2を参照）です。
- すべての計算されたintensitを分割一つに正規化し、各波長での生の感度に適用される補正係数として使用するための相対的な正規化された値の逆数を取る2.6.1で算出した最大強度値によってIES（ステップ6.4参照）。
- 一度だけの実験のセットの前に、手順2.6を介して2.1を実行します。実験の過程で定期的に光刺激の強度が変化しないことを確認するため、明るい光とNDフィルターの下のキセノンアークランプの絶対放射照度を記録。
- 干渉フィルタを透過した光を任意の細胞応答は最大応答振幅に近づくと、実験の過程で、信号を減衰させるためにNDフィルターを使用しています。 NDフィルタは、実験中に使用される場合、分光感度の計算中強度の対応する減少を占めます。
- 光学トラックを設定し、キャリブレーション、および実験を開始する前に数日または数週間をフィルタリングします。フィルタをキープ埃の蓄積を防ぐために覆われました。
3.録音機器のセットアップ
- このようなカルダン腕周囲長（図については、 図3を参照）のようなファラデーケージを介してキャリブレーションに使用したのと同じ光ファイバケーブルをフィードし、ゴニオメトリックデバイスにマウントします。ケーブルは約10cm離れた標本の目からになります。
- 電極ホルダーに振動分離されたテーブルの上に金属ステージを配置し、マイクロマニピュレーター（ 図4）の制御下に直接ステージ上に取り付けられました。検体の頭部が腕の回転運動によって作成された球の中心にくるようにカルダンアームを配置します。
- （ファラデーケージ外）増幅器を含む細胞内のプリアンプ・システムを使用して、プリアンプ（ファラデーケージの中にある予備校の近くにヘッドステージは、）試料が配置される金属ステージ上にヘッドステージをマウントします。
- ヘッドステージに同軸ケーブルを接続経由BNC接続。同軸ケーブルのもう一方の端に開いた先端のみを分割して、インナーワイヤからのケーブルの外側金属シースを分離します。
- もう一方の端のワニ口クリップ付き絶縁銅線の一端に（グランド電位に保持）外部シースを半田付けします。このワニ口クリップは、試料プラットフォーム（ステップ5.1.4）上の金属参照電極に付着します。
- 記録電極として機能するように、細い銀線に同軸ケーブルのインナーワイヤをハンダ付けします。このワイヤは、ステップ5.2.3で解決策を充填したガラス電極に供給するのに十分に薄くなければなりません。
- 目の中に電極を下げることで振られ、電極が目にしたら出て再び戻って揺動させることができるように、ファラデーケージの外に木製のベンチにスイングアームとベースに取り付け実体顕微鏡を配置します。
- ファラデーケージの内側に必ずすべての金属を作ることが適切に接地されています。
- ファラデーケージの外で、preamplifを添付50〜60 Hzのノイズリデューサ（オプション）の入力に小胞体、およびBNC T-アダプタを使用して、オシロスコープの1チャンネルに出力を接続します。
- T-アダプタのもう一方の端を使用して、ハードウェアの1チャネルにオシロスコープを通過する信号を接続します。プリアンプで記録された応答は、コンピュータ上のソフトウェアで読み取ることを可能にするUSBケーブルでコンピュータにこのハードウェアを取り付けます。
- 別のT-アダプタを使用して、オシロスコープの2番目のチャネルを光学トラックからシャッタードライバを添付し、目（ステップ5.5）に供給される光点滅の頻度および持続時間を制御するパルス発生器にこれを接続します。
注意：リグ自体のセットアップは一度だけ実行する必要がある必要があります。録音を開始する準備ができるまで、ここで休憩。
レコーディングの日に4準備
- 実験前キセノンランプ、少なくとも45分の電源をオンにし、PUL前のガラス微小電極プラー少なくとも30分をオン玲ガラス電極。
- 全ての記録機器（シャッター、アンプ、ノイズ除去、パルス発生器、オシロスコープ、およびデータ集録ハードウェア）をオンにして、光が光ファイバケーブルを通過しないので、シャッターはデフォルトで閉じられていることを確認してください。
- 細かいホウケイ酸（またはアルミノシリケート）、ガラス微小電極プラーを用いてガラス微小電極を（100から250MΩの抵抗が理想的である）プル。引っ張られるのほんの数時間以内にガラス電極を使用してください。
- 3 M塩化カリウム（塩化カリウム）で電極を埋め戻し。注入染料、例えば 、この溶液は、研究者のニーズに応じて変更されてもよいことに留意されたいです。
5.試料準備と録音の手順
- 試験片を準備
- ヘッドは不動とチューブの一端から突出しているので、ホットワックスで小さなプラスチックチューブ内の個々の蝶を貼り付けます。吻、アンテナ、および翼（ 図5）を押しWAX。
- トンを押しながら彼は、ワックスの乾燥片と腹部と腹部の後ろにチューブ内のウェットティッシュを置くことによって加湿チューブを保持します。試料が完全に不動であることを確認します。
- 磁気ベースに取り付けられたボールソケットジョイントを持つ小さなプラットフォームにワックスの小片を使用してチューブをマウントします。
- 解剖顕微鏡下では、参照電極として使用されるように口器を介してヘッドに0.125ミリメートル径の銀線を挿入します。実験の前に、恒久的にプラットフォームは記録のためにステージ上に配置されると、ステップ3.3.2で銅線がそれの上にクリップできるような方法で、プラットフォームにワイヤーを固定します。
- 参照電極は、適切な位置になると、それは迅速に溶融した後、ワイヤの周りにワックスを冷却して所定の位置に保持することができます。
- ブレードホルダーで破壊可能な炭素鋼かみそりの刃、刃のグリップ部を使用し、角膜を切断するために使用する小片を断ちます。
- 〜（10 ommatidiを小さな穴をカット左の角膜における直径）カミソリの刃を使用し、乾燥を防ぐために、ワセリンで穴を塞ぎます。
- 角膜が切断されると、眼の中の体液を迅速に硬化するため、可能な限り迅速に眼の中に記録電極を挿入し、それが不可能に電極を挿入することを可能にします。可能な場合は、記録が行われるリグに解剖を行います。
注：これは光学系をデフォーカスされますようワセリンは、目の残りの部分に塗布するべきではありません。- ない既にステージ上場合は、記録リグでステージ上に搭載された試料とプラットフォームを配置します。ワニ口クリップを使用して試料のプラットフォーム上の基準電極へステップ3.3.2からヘッドステージアース線を接続します。
注：動物を照明する赤フィルタを使用可能な場合。 - 眼の中に記録電極を下げながら、簡単にステレオスコープの下で試料を点灯するグースネック添付ファイル付きの光源を使用してください。
- にガラス微小電極の後ろにKCl溶液にステップ3.3.3からヘッドステージに接続された銀線をSERT。電極ホルダーのガラス電極をマウントします。
- 微小電極は、以前に角膜上記ミリメートルについて、角膜にカット穴の上に直接あるので、電極ホルダを調整します。オシロスコープ上の潜在的に大きな変化（MV）で示されるように回路が完成するまで、マイクロマニピュレーターを用いて、眼の中に微小電極を下げます。
- ない既にステージ上場合は、記録リグでステージ上に搭載された試料とプラットフォームを配置します。ワニ口クリップを使用して試料のプラットフォーム上の基準電極へステップ3.3.2からヘッドステージアース線を接続します。
- いったん目に、ファラデーケージ外にステレオスコープをスイングし、標本を照明する光源をオフにします。目は暗順応になるので、部屋が暗い保たれるべきです。
- アンプから1 nAの電流を印加し、電圧の変化に注目することによって、電極の抵抗を確認してください。抵抗は、一般的に100から250MΩ間の範囲であるべきです。高い抵抗があるelectrの閉塞の指標や電極の曲げ、および低抵抗で頌歌破損。
- シャッターが0.5秒ごとに50ミリ秒の持続時間を有する光のフラッシュを可能に開くように、パルス発生器を活性化し、そしてそれは実験期間中点滅継続することができます。
- それは最大50ミリ秒の持続時間の点滅を可能にするように、パルス発生器を調整します。点滅間のこの期間および0.5秒のポーズは、実験中に可能な限り暗順応に近いように試料を保持します。五十ミリ秒は長いフラッシュ期間として応答で同じ振幅を誘発する最も短いフラッシュ期間の近隣にあります。
- 実験（ステップ5.16）の始めと終わりの両方におけるRe-措置応答。約20分間の実験の過程で、これらのフラッシュの設定は、時間をかけて応答を低下させることはありません。別のプレップは、これらのフラッシュ設定の調整が必要になる場合があります。
- 光ファイバケーブルは、目に向けられるようにカルダンアームの位置を調整します。
- 各光フラッシュと電圧変化のためのオシロスコープを確認してください。電圧の負の変化は、電極がまだセルに入っていないことを意味します。
- それは最大電圧応答が存在する時に目には角度で配置されるまで、試料の周りカルダンアームを移動します。
- 軽く電極ホルダのベースをタップするか、プリアンプにバズの機能を使用しながら、両方の方向に電極の非常に小さな縦の動きを引き起こし、前後にマイクロマニピュレーターを回します。脱分極光応答はオシロスコープ（ 図6）に表示されるまで微調整を行うことを続行します。
- 光のフラッシュが最大の脱分極信号を生成する入射角を見つけるために、再度カルダンアームを調整します。マイクロマニピュレータとの微調整を行い、電極を安定的に細胞を記録し、それが全体の実験のために細胞内にとどまることされていることを確認し、必要に応じてアンプのバズの機能を使用する（ステップ5.11を参照してください）。
- セットアップが安定したら、RECOを開始rding。 （：対雑音比1信号少なくとも10）安定した記録が無い静止電位の変化、低バックグラウンドノイズ、および一貫して大規模な脱分極応答に少しを持っている必要があります。
- コンピュータにソフトウェアを実行し、4つのチャネルでポップアップウィンドウを開きます」新しい実験を、 "開始。
- 500 mVのにソフトウェアのウィンドウの右上に電圧スケールを調整します。信号をオシロスコープを介してデータ集録ハードウェアに供給されている場合は、2番目のチャネルは、ファンクション・ジェネレータによって生成された方形波を記録しつつ、第1のチャネルは、シャッターが開いているときに示す、リアルタイムで電極から記録された応答を表示します。 。他の2つのチャネルは不要です。
- 録音を開始し、ソフトウェアは実験期間中に実行できるようにするには右下の隅で「スタート」をクリックしてください。応答が明確になるように、軸X（時間）とy（電圧）のズームを調整します。
- まず、白色光で、3.5 OD（約5〜10秒）で、NDフィルタホイールと10個々の応答まで録音。
- 次のレコード0.0 ODまでのすべての組み合わせで3.3 ODでの回答の数が同じ場合、3.1、3.0、2.5、2.3、2.1、など。 NDフィルタシリーズにこれらの応答振幅は漂白が発生した場合は、第6節で応答ログ強度曲線を提供し、実験の過程で明るい刺激の少ないフラッシュを使用します。
- 干渉フィルターを使用して、全ての波長に対する細胞の応答を記録します。
- 第1のピーク波長を見つけます。光路（0.0 OD）でのNDフィルターなしで、光路にUV透過フィルタを配置し、簡単に応答振幅を観察します。ピーク応答がされる場所のいくつかのアイデアを与える必要があり、青色透過フィルタ、緑色透過フィルタ、赤色透過フィルタ、と繰り返します。
- にピーク感度の一般的な領域を見つけるために、約350、450、550で650 nmでのフィルタを使用ステップ5.14.1。すべての波長が次のステップに記録されますので、正確な波長は、この初期探索段階では重要ではありません。推定値は、ピーク感度の存在、またはそれらは以前に記録されている場合は、すぐにピーク応答を識別することが知られている波長を使用しています。
- ピーク応答またはそれに近いが識別されると、10の応答（約5秒）のために、この波長での記録。
- ピーク応答の波長で記録した後、他の干渉フィルタを持つレコード、10 nmのステップで300〜700ナノメートルから。ピークからスタートし、ピーク応答が520nmである場合、この波長まず、その後、510 nmで記録応答は、530に続いて、例えば （1により光路1からのフィルタを交換することにより、両方の短いと長い波長に向かってステップアウトナノメートル、500ナノメートル、540ナノメートル、490ナノメートル、550ナノメートルなど無応答には存在しなくなるまで）。
- フィルタごとに最大10の応答（5秒ずつ）を可能にします。干渉フィルターを交換する時、細胞はRESPを可能にします二のピーク応答は、時間の経過とともに劣化されているかどうかを監視するために有用である光路、内の任意のフィルタなしの白色光の1-2点滅します。応答の数を減らすか、漂白が発生した場合にODを増加させます。
- 任意の干渉フィルタの下の応答が0 ODにおける白色光の下での最大応答に近すぎる場合には、NDフィルターで減衰させます。干渉フィルタと、この実験で用いた光ファイバケーブルのサイズが大きく、光の強度を減衰させるので、NDフィルタは、典型的には必要とされません。
- 記録は、以前の応答振幅を確認するためのpseudoreplicateとして機能し、応答が時間の経過とともに劣化していない確実にするのに役立つピーク応答、周囲に安定し、再記録波長残っている場合。一旦全ての波長は応答がステップ5.12のように、NDシリーズの下で、再記録に記録されています。
- 記録が完了し、クリックしたら、ソフトウェアの「停止」、および分析のために記録を保存します。
- 実験後、凍結、または迅速に頭を切断し、胸部を粉砕し、その後数分間冷却することにより個人を犠牲に。
- すべての機器をシャットダウンします。分析を行う前に、必要に応じて、ここで休憩。
6.分光感度解析
- ソフトウェアは、生の応答を記録するために使用して、ND系列に、各干渉フィルタの各フィルタ10の個々の応答の平均応答振幅を計算します。
- ステップ5.12から5.13（ 図7）に記録されたNDフィルタシリーズからの応答ログ強度（VlogI）関数を作成します。 X軸上の強度（OD）の対数単位をプロットすることによってこれを行い、そしてy軸上の各々の強度に応じ。
- 異なる波長でセルの分光感度を導出するために、一般的にステップ6.2からのデータへの那珂ラシュトン式に合わせて、異なる波長のトンの実験的に得られたスペクトル応答を関連付けるために、この方程式を使用O相対光子は一定の波長（この場合には、白色光）の下で、その応答を誘発するのに必要。
注：那珂ラシュトン式は、V / V maxの =私は、n /（I N + K n）で、私は刺激強度であり、Vは応答振幅で、V maxは最大応答振幅であり、Kは刺激であります半V maxに与え強度、nは指数関数の傾きです。種々の方法がVlogI曲線フィッティングソフトウェアを含むデータ、またはコードベースの統計パッケージにこの式をフィットするために使用することができます。 - 簡単な計算やスプレッドシートプログラムを使用して、那珂ラシュトン方程式を適合させるために、それぞれの刺激強度のためVlogI応答データを変換：ログ[（V 最大 / V） - 1]。そして、最高のフィットの直線の方程式を得るために変換されたデータに線形回帰を行います。
注：V maxは 、任意の測定された応答よりも大きくなければなりません。この一貫性を保つために、この方法は、1％のGREとしてV maxを推定します最高測定された応答よりもATER。 - 回帰直線の式から、（K）はy切片/ N =負の勾配をとることにより指数（n）を推定し、ログインします。
- 異なる波長でセルの分光感度を導出するために、一般的にステップ6.2からのデータへの那珂ラシュトン式に合わせて、異なる波長のトンの実験的に得られたスペクトル応答を関連付けるために、この方程式を使用O相対光子は一定の波長（この場合には、白色光）の下で、その応答を誘発するのに必要。
- V MAX、N、およびKのためのパラメータ（V）として与えられた波長で測定されたスペクトル応答を接続し、解くことにより、各波長でのセルのスペクトル応答を誘発するために必要な光子の相対数を決定し、推定された後I.用
- 各波長で（ステップ2.4.3）から各干渉フィルタのための補正係数により、ステップ6.3から算出刺激強度（I）を乗算します。
- 彼らは比較することができるので、感度を得るために、すべての強度がVログ-Iカーブに関連していなければなりません。 V 最大またはKを1/2に各波長の強度を関連付けることにより、これを行い、ステップ6.2.3で算出しました。
- K.から各補正された波長強度（ステップ6.4）を引きます
- 次に、各波長の強度のために、「これを追加（-1）によってKのK "値からの距離、および乗算します。
- 次の各波長に直列に最も低いデータ点の絶対値を加算することにより、正のすべてのデータポイントをもたらします。
- ステップ6.5.1からすべて新しく計算された強度の逆数をとることによって、各波長での感度を探します。感度スペクトルが0と1の間に収まるようにデータを変換します。
- 同じタイプの平均の2つ以上のセルからの標準誤差バーまたは95％信頼区間（ 図8）で、最終的な応答プロットを記録しました。
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Representative Results
録画設定の多くの要素については、書面による説明は十分な詳細情報を提供していません。 図1は、完全な記録のセットアップに含まれるコンポーネントの概略図です。 図2において、スペクトルは補正係数が必要とされる理由の感覚、何この補正を計算するために必要とさを与えるために、白色光、各干渉フィルタのためにプロットされている。 図3は、写真を示し、カルダンアームの図は、これらのために使用されます実験。 図4は、記録ステージとマイクロマニピュレーターを示す合成画像である。 図5は、実験のために蝶の製造におけるいくつかのステップを示しています。
記録が開始されると、光のフラッシュに応答して、電圧の負の変化は、電極は、 図6aのように、細胞の外にあることを意味します。応答の強さは、電極の距離によって異なります視細胞、および光フラッシュの入射角度に傾けます。先端が突き刺すために、細胞に十分近くなる前に応答が（> 30 mVの）大きさであるべきである。 図6bは、光受容細胞への侵入を意味する、光刺激に対する明確な脱分極応答を示しています。絶対振幅がかなり異なるが、（少なくとも40 mVの）静止電位は安定であるべきであり、応答振幅が大きくなければなりません。我々は、相対的な応答を測定するので、信号対雑音比が高いことがより重要です。静止電位の変化が大きく、応答波形が異常に見える、または最大応答が低すぎる場合には、すべての干渉フィルタを横切って相対的な応答を比較することはできなくなります。使用不可の記録の例は、 図6c、図6dに示されています。
成功した記録が完了した後、ND応答をプロットする必要があり、なかなか-Rushtonの式がデータ33に装着する必要があり、よhown 図7に。この図は、任意の干渉フィルターなしNDフィルターシリーズを使用してプロットされています。記録が安定している場合は、NDフィルタシリーズからのデータは、実験前と後に類似していなければなりません。プロトコルの第6の計算で説明したように分光感度は、所与の波長での各応答（V）は（I）について解く次に、 図7にVlogIプロットに那珂Rushtonの式をフィッティングすることによって決定されます。
単一の記録から派生分光感度の代表例は、 図8aにプロットされている（この例に注意してください実際の計算されたデータを示しているが、この結果は未発表であるようにピークがシフトしています）。細胞型は、同様の波長でピーク感度と感度スペクトルの全体的な形状によって分類することができます。同様の細胞型は、その後平均化され、平均感度がFiguの各波長で標準エラーバーでプロットされています8bを再。昆虫である3つの典型的な細胞型の分光感度は、 図8cに示されている（大きさ及び誤差バーは実際のデータから計算されるが、ピークがシフトしています）。
図1：録音構成要素の概略光路のコンポーネント、セットアップを検体、及び記録ハードウェアが示されています。光学トラックは、ファラデーケージの外に木製のベンチに座っている。 キセノン 、キセノンアークランプ、 カドミウム 、凝縮器アセンブリ、LX、凸レンズ、ND、中性フィルターホイール、Cfは 、干渉フィルター、S、シャッター、Lcは 、凹レンズ、 共同コリメートビームプローブ、Foは、光ファイバケーブル。ファラデーケージは上に座っています検体の周りに木製のベンチ。木製のベンチは、上記の座っているが、下に振動分離された大理石のテーブルには触れていません。 （RC）を記録し、参照（RF）電極は、ヘッドステージ（HS）に取り付けられている。Rcは 、眼（E）に導入され、Rfは身体の他の部分に導入されます。ヘッドステージは、ファラデーケージ外のプリアンプ（PA）セットアップの一部です。信号はペテン師ノイズリデューサヘモグロビン（Hb）を介して、オシロスコープ（OS）にプリアンプから渡されます。オシロスコープからの信号ははPowerLabハードウェア（PLB）を介して、それがLabchartソフトウェアによって読み取られるラップトップコンピュータ（CPU）に渡されます。シャッターは、オシロスコープ上に第二のチャネルを通過する関数発生器（FG）により制御され、この信号は、同様に記録されようとしている場合ものPowerLabハードウェア上の第2チャネルを通過することができます。
図2：白色光と干渉フィルタのスペクトル補正係数を計算するために使用されるプロトコルのステップ2.5で測定されたスペクトルは、白色光だけでなく、それぞれの41干渉フィルタのために、300〜700nmの示されています。各干渉フィルタのスペクトルが光路にのみ、そのフィルタを用いて測定されます。 T 520は、ピークは520nmのフィルタについてのスペクトルの下の領域に対応し、S 520はフィルタ、520ナノメートルのピーク波長の白色光の強度に対応します。プロトコルのステップ2.6で説明したように、これらの値（この場合は520 nm）の各フィルタのための補正係数を計算するのに使用されます。
図3：実験で使用したカルダンアームペリメーターの説明はカルダンアームは、光ファイバケーブルを保持し、その光が記録されているセルに入射適切な角度で送達することができるので、完全な球形の回転や角度の調整を可能にします。 （A）トップダウンビュー。 （B）の角度でサイドからの眺め。数字は、すべてのパネルで同じ部分に対応しています。 （1）底板は、水平面内で完全な円形の回転を可能にします。 （2）垂直板は、垂直面での腕の完全な円形の回転を可能にします。 （3）シリンダの端部に光ファイバケーブルを有する金属アームを保持し、それは、（2）に対して垂直な円形の回転の第2の垂直面を可能にします。 （4）光ファイバケーブルを保持し、Inは、アームの端部に配置し、光が実験における試料の位置に向けられています。
図4：録音の設定のコンポーネント （A）プラスチックチューブは、試料を保持するために使用されます。 （B）検体とチューブが搭載されたプラットフォームの俯瞰図。磁気ベース（1）とボール・ジョイントプラットフォームの（C）は側面図。参照電極は、プラットフォーム（2）の側に接着剤やワックスで不動に保ちます。参照電極は、ワニ口クリップに巻き付け、所定の位置にはんだ付けし、ヘッドステージ参照電極（3）をクリッピングすることができ取付け領域を提供します。 20X倍率下（D）電極先端。スケールバー、25μmで。 （E）ステージ、電極ホルダー、マイクロマニピュレーターのセットアップ。ヘッドステージ（1）を、装置上に固定されています。銀記録線（2）、及びワニ口クリップと参照電極（3）が取り付けられています。 （4）がその下ポストと手動マイクロマニピュレーター（5）に固定された電極ホルダーは、垂直移動用ノブで調節してもよいし、電極ホルダーの水平移動のための押し引きすることができます。試料との磁気プラットフォームは、単に電極ホルダー下のステージ（6）に位置しています。 （F）は、ファラデーケージは、前面にプルアップまたはプルダウンすることができる画面で録画設定を取り囲んでいます。アルミニウム箔を上部にゴム製のパッドですべての機器の下に配置されています。光ファイバケーブル（1）は、外部光トラックからケージに導き、段階（3）に向かってカルダンアーム（2）によって指示されます。記録ステージとマニピュレータ装置は、セットアップの下に大理石のテーブルの上に載ってサンドボックス（4）に配置されています。他のすべての機器は、大理石のテーブルには触れていない木製の作業台の上に載っています。サンドボックスは、穴に大理石のテーブルの上に座って試料が完全に振動木製卓上上の機器から隔離されているように、木製のテーブルから切り出さ。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5：バタフライプレップ （A）蝶は、チューブ内に挿入され、頭、羽、およびアンテナは、ホットワックスで固定化されています。不関電極は口器（1）に挿入され、ドライワックスの片を腹部（2）を押したままに使用され、ウェットティッシュは、試料の後方に配置されています。 （B）ヘッドのクローズアップダウンワックスを塗りました。 （1）から記録される眼ワックスまたは破片から明確に維持され、かつ基準電極（2）口器に挿入され、ホットワックスを素早く所定の位置に保持するためにその上に溶融されます。（C）ピンク白色光受容体細胞層を見ることができる目に穴カット。ブラック顔料と黄色の体液は存在しません。 （D）は、眼に配置されたガラス記録電極（1）、および不関電極と試料の側面図は、（2）オシロスコープで見られるように、回路を完了する必要がヘッドステージに取り付けられた。 ご覧になるにはこちらをクリックしてください。この図の拡大版。
図6：サンプル録音からの生のレスポンスの各応答は、50ミリ秒の持続時間（黒棒）の単一の光のフラッシュに対応しています。 （A）だけ見るべき大きな負の電圧変化の例セルに入る前に。 （B）きれいな記録は、典型的には少なくとも40 mVでの、少しのバックグラウンドノイズと大きな脱分極応答を持っている必要があります。 （C）によるメインピーク後の負の電位変化（矢印）への記録不良の例。 （D）悪い記録の他の例。静止電位は、大きな変動を受けている（赤いバー）と背景雑音の大量応答（矢印）の大きさを不明瞭にすることができます。
図7：レスポンス-強度対数線形機能黒丸は、この実験のために、0 ODに3.5からセルの測定された応答を示します。光強度は対数目盛です。非常に高い強度で応答が飽和している、と非常に低い強度で小さな応答ではなく、線に沿ってゼロに落とすの持続します。 T彼ナカ-Rushtonの方程式33は、この非直線状（点線）に取り付けられています。
図8：分光感度の例 （A）単一の代表的な細胞の応答を記録し、相対分光感度を算出しました。このセルのピークは、青色光に最高の応答を意味し、440 nmです。単一セルデータが（380 nmでピーク）ノイジーに見えるかもしれません。同じ相対ピークと形状（B）細胞を一緒に平均化され、標準誤差のバーが追加されます。ここでは、7人から7の青色細胞は、細胞型は440 nmの光を最大限に敏感なこの種に存在することの強力な証拠を提供し平均しました。 （C）このプロセスは、見つかったすべての細胞型に対して繰り返され、一緒にプロットすることができます。昆虫の目は彼らの分光感度が大きく異なりますが、一般的なインECTは370nmで、440nmで、510 nmで、ここに示されたピークを有していてもよいです。これらのスペクトル感度は、すべての実際のデータを用いて計算されますが、データはまだこの種のために公開されていないため、ピークがシフトされた、注意してください。
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Discussion
細胞内記録が原因関与する多くの技術的な手順に習得するのが困難な技術であることができます。成功した実験のために、いくつかの重要な点を考慮する必要があります。まず、実験が行われた正常振動絶縁テーブルを有することが重要です。多くの研究者が完全に優れた振動絶縁を与え、ベースから卓上を分離する空気テーブルを使用します。私たちのセットアップは、マイクロマニピュレーター/電極ホルダ/試料ステージ装置を置かれる、上部のサンドボックスと厚い大理石のテーブルが含まれます。これは、社内のガスまたは圧縮空気へのアクセスが制限である場合は特に、空気テーブルに効果的な、より手頃な価格の代替手段です。追加の振動吸収対策は、このような受動的なエアサスペンション、またはテーブル脚（ 例えば 、開かれたテニスボール、自転車のチューブ、厚いゲルパッド）にクッション性元素の添加としてもよいです。また、実験は内側にあることが不可欠です正しく接地されたすべてとファラデーケージ。ファラデーケージは、ケージ内で作業するときは削除され、記録時に容易に交換することができます前面に金属メッシュスクリーンを持っている必要があります。周囲の電気的ノイズ（主AC電源から、特に50 Hzのノイズ）の少量でもそうしないと良好な記録が使用できなくなることができます。
試料を調製する場合、個眼の周囲の体液と顔料層が成功した記録を防止することができます。角膜に穴が大きすぎるカットされている場合は、体内の体液の正常なポンピングは液面が不安定な記録で、その結果、切断部位で上下に移動させます。穴が切断されると、血リンパおよび表面の顔料層は、ワセリンで封止されても不可解なかさぶたに急速に凝固しますので、できるだけ早く目に電極を得ることが重要です。リンゲル液はまた、代わりにワセリンを用いてもよいです。接地電極に導入してもよいです口器やカットアンテナの切り株に。
さらに、多くの場合、暗順応できるだけ動物を維持すると便利です。この方法では、ステップは、非常に暗いレコーディングルームを保ちファラデーケージに入るのキセノンランプからの迷光を遮断する、短時間の刺激が点滅（30-50ミリ秒）、および点滅（0.5以上）との間に十分低い周波数が含まれます。視覚色素が光子を吸収すると、ロドプシンにおける発色団は、すべてに-3-hydroxyretinal 11- シスからスイッチ- トランスオプシンタンパク質の構造変化を誘導し、およびGタンパク質を開始メタロドプシンなどの複合体全体を活性化、レチナールカスケード。高強度の光が発色団が物理的にオプシンタンパク質から分離させる際に光退色が発生します。それが出て落ちる前に電極が唯一の安定し一定期間の細胞内からの応答を記録するための時間は、この実験の制限要因でありますまたは膜が損傷しています。このような理由から、我々は、細胞が回復できるようにするには壊れませんが、我々は時間をかけて細胞の応答が低下することはありません発見したフラッシュ時間と周波数を使用するのです。光退色が発生した場合、光の周波数と強度の両方を減少させることが重要です。
膜を貫通するときに記録時には、電極による大きな電極先端または大きな動きは、細胞を損傷することがあります。記録のための細胞に接近したときにのみ細かいヒント（少なくとも〜100MΩ）と小さな動きを使用する必要があります。細胞内記録は、脳記録などの他のアプリケーションに適用される場合、非常に微細な、頑丈な電極は、石英ガラスを使用して引っ張ることができるが、特殊なプラーは、これらの電極に使用されなければなりません。最初のプログラムを引っ張っ電極を作製する際に、我々は、電極を再充填モックセットアップで電極ホルダーに固定し、食塩水でチップと接地電極を配置することにより、チップ抵抗を調べました。 Nextが、私たちは、オシロスコープの電圧の変化を測定するための電流を適用しました。電極先端を移動するには、我々は、2つの軸に沿って移動する手動マイクロマニピュレーターを使用します。他のマニピュレータは、すべての3つの軸に沿った移動を可能にし、これらは、このより複雑な用途に使用することができるデジタル含め存在します。記録のためのステージを構築するための多くの方法があり、記録及び観測データの分析に使用されるハードウェアとソフトウェアのさまざまな種類があります。私たちのセットアップは、記録リグの1、シンプル簡単、かつ手頃な価格設定を表します。
VlogI曲線を構築するには、プロット応答の非直線部分について那珂とラシュトン33等34,35のアカウントが開発した機能。様々な方法は、データにこの曲線に適合するように使用され、他の方法も適しているものの、我々は、カーブフィッティングソフトウェアを必要とせず、そのような方法の結果をプロットしている36,37 （
この方法の1つの制限は、試験生物は、眼内の複数の遺伝的類似オプシンを発現する場合、mRNAがそう光受容細胞のどのスペクトルクラスに対応するオプシン識別することは困難であることです。この問題を克服するために、この方法はうまく記録セル10内で発現オプシンを識別するために色素注射でおよびin situハイブリダイゼーションまたは免疫組織化学的に合成されました。
我々の方法は、簡単で視覚電気生理学に不慣れな研究者のためにアクセス可能です。この技術は、神経科学では一般的ですが、具体的かつ明確な方法は再現することが、この方法が困難、文献に存在しません。この技術には多くのバリエーションが存在するが、我々は複眼の分光感度を測定するための簡単な方法を提供します。生理学的データは、視覚的な生態学と進化41の物語における証拠の重要な部分です。オプシン配列変異は、表現型の変化のための遺伝的基礎を調べる研究のため、この方法に最適です、光受容細胞の感受性と密接にリンクされています。光受容細胞の感度の測定はまた、色覚42-46で重要な弁別閾値のための生理学的基礎を示し、行動色識別アッセイと対にすることができます。例えばショウジョウバエの遺伝的または治療的な操作で、このトンechniqueは、目や脳だけでなく47,48の適切な生理学的機能を測定するための良い方法にすることができます。私たちは、最初のまたは眼内の細胞内記録の最も複雑な方法ではありませんが、私たちの希望は、我々は正式な神経科学の外の研究プログラムでの再生と統合のため、この方法は、より簡単に利用できるようにすることができるということです。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。
Acknowledgments
私たちは励ましのために、私たちに機器を貸し出すためのカルダン腕周囲長、キンバリージャミソン、マシューマクヘンリー、およびラジュMetherateを製造するための後半ルディリンブルフに感謝し、Almutケルバーと健太郎有川。この作品は、ADBに国立科学財団（NSF）大学院研究KJMへのフェローシップとNSF助成金IOS-1257627によってサポートされていました
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Butterfly pupae | Several local species available, need USDA permits for shipping. Carolina Bio Supply has several insect species that may be ordered within the U.S. without the need for additional permits | ||
| Large plastic cylinder | Any chamber that remains humidified will work | ||
| Insect pins, size 2 | BioQuip | 1208B2 | |
| 100% Desert Mesquite Honey | Trader Joe's | Any honey or sucrose solution will work | |
| Xenon Arc Lamp | Oriel Instruments | 66003 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
| Universal Power Supply | Oriel Instruments | 68805 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
| Optical Track | Oriel Instruments | 11190 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
| Rail Carrier, Large (2x) | Oriel Instruments | 11641 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
| Rail Carrier, Small (4x) | Oriel Instruments | 11647 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
| Thread Adaptor, 8-32 Male to 1/4-20 Male, pack of 10 | Newport Corporation | TA-8Q20-10 | |
| Optical Mounting Post, 1.0 in., 0.5 in. Dia. Stainless, 8-32 & 1/4-20 (5x) | Newport Corporation | SP-1 | |
| No Slip Optical Post Holder, 2 in., 0.5 in. Diameter Posts, 1/4-20 (5x) | Newport Corporation | VPH-2 | |
| Fixed lens mount, 50.8 mm | Newport Corporation | LH-2 | |
| Fixed lens mount, 25.4 mm | Newport Corporation | LH-1 | |
| Condenser lens assembly | Newport Corporation | 60006 | |
| Convex silica lens, 50.8 mm | Newport Corporation | SPX055 | |
| Six Position Filter Wheel, x2 | Newport Corporation | FW1X6 | |
| Filter Wheel Mount Hub | Newport Corporation | FWM | |
| Concave silica lens, 25.4 mm | Newport Corporation | SPC034 | |
| Collimator holder | Newport Corporation | 77612 | |
| Collimating beam probe | Newport Corporation | 77644 | |
| Ferrule Converter, SMA Termination to 11 mm Standard Ferrule | Newport Corporation | 77670 | This adapter allows the fiber optic to fit into the collimator holder |
| 600 μm diameter UV-vis fiber obtic cable | Oriel Instruments | 78367 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
| Shutter with drive unit | Uniblitz | 100-2B | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.1 OD | Newport | FRQ-ND01 | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.3 OD | Newport | FRQ-ND03 | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.5 OD | Newport | FRQ-ND05 | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 1.0 OD | Newport | FRQ-ND10 | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 2.0 OD | Newport | FRQ-ND30 | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 3.0 OD | Newport | FRQ-ND50 | |
| LS-1-Cal lamp | Ocean Optics | LS-1-Cal | |
| Spectrometer | Ocean Optics | USB-2000 | |
| SpectraSuite Software | Ocean Optics | ||
| Interference bandpass filter, 300 nm | Edmund Optics | 67749 | |
| Interference bandpass filter, 310 nm | Edmund Optics | 67752 | |
| Interference bandpass filter, 320 nm | Edmund Optics | 67754 | |
| Interference bandpass filter, 330 nm | Edmund Optics | 67756 | |
| Interference bandpass filter, 340 nm | Edmund Optics | 65614 | |
| Interference bandpass filter, 350 nm | Edmund Optics | 67757 | |
| Interference bandpass filter, 360 nm | Edmund Optics | 67760 | |
| Interference bandpass filter, 370 nm | Edmund Optics | 67761 | |
| Interference bandpass filter, 380 nm | Edmund Optics | 67762 | |
| Interference bandpass filter, 390 nm | Edmund Optics | 67763 | |
| Interference bandpass filter, 400 nm | Edmund Optics | 65732 | |
| Interference bandpass filter, 410 nm | Edmund Optics | 65619 | |
| Interference bandpass filter, 420 nm | Edmund Optics | 65621 | |
| Interference bandpass filter, 430 nm | Edmund Optics | 65622 | |
| Interference bandpass filter, 440 nm | Edmund Optics | 67764 | |
| Interference bandpass filter, 450 nm | Edmund Optics | 65625 | |
| Interference bandpass filter, 460 nm | Edmund Optics | 67765 | |
| Interference bandpass filter, 470 nm | Edmund Optics | 65629 | |
| Interference bandpass filter, 480 nm | Edmund Optics | 65630 | |
| Interference bandpass filter, 492 nm | Edmund Optics | 65633 | |
| Interference bandpass filter, 500 nm | Edmund Optics | 65634 | |
| Interference bandpass filter, 510 nm | Edmund Optics | 65637 | |
| Interference bandpass filter, 520 nm | Edmund Optics | 65639 | |
| Interference bandpass filter, 532 nm | Edmund Optics | 65640 | |
| Interference bandpass filter, 540 nm | Edmund Optics | 65642 | |
| Interference bandpass filter, 550 nm | Edmund Optics | 65644 | |
| Interference bandpass filter, 560 nm | Edmund Optics | 67766 | |
| Interference bandpass filter, 570 nm | Edmund Optics | 67767 | |
| Interference bandpass filter, 580 nm | Edmund Optics | 65646 | |
| Interference bandpass filter, 589 nm | Edmund Optics | 65647 | |
| Interference bandpass filter, 600 nm | Edmund Optics | 65648 | |
| Interference bandpass filter, 610 nm | Edmund Optics | 65649 | |
| Interference bandpass filter, 620 nm | Edmund Optics | 65650 | |
| Interference bandpass filter, 632 nm | Edmund Optics | 65651 | |
| Interference bandpass filter, 640 nm | Edmund Optics | 65653 | |
| Interference bandpass filter, 650 nm | Edmund Optics | 65655 | |
| Interference bandpass filter, 660 nm | Edmund Optics | 67769 | |
| Interference bandpass filter, 671 nm | Edmund Optics | 65657 | |
| Interference bandpass filter, 680 nm | Edmund Optics | 67770 | |
| Interference bandpass filter, 690 nm | Edmund Optics | 65659 | |
| Interference bandpass filter, 700 nm | Edmund Optics | 67771 | |
| Faraday cage | Any metal structure will work that can be grounded and that fits the experimental setup. | ||
| Stereomicroscope, 6X, 12X, 25X, 50X magnification | Wild Heerbrugg | Wild M5 | Any Stereomicroscope will do |
| Microscope stand with swinging arm and heavy base | McBain Instruments | Any heavy base with arm will do | |
| Cardan arm | Custom built, See Figure 4 | ||
| Fiber-lite high intensity illuminator | Dolan-Jenner | MI-150 | For lighting specimen |
| Fiber-lite goose-neck light guide | Dolan-Jenner | EEG 2823 | Any goose-neck light guide will do |
| Marble table | |||
| Raised wooden table | Hole should be cut through this table so that the sandbox can rest on the marble table underneath | ||
| Wooden box filled with sand | custom built, any box with sand | ||
| Manipulator | Carl Zeiss - Jena | ||
| Electrode holder | |||
| Specimen stage | |||
| Alligator clip wires for grounding | |||
| Insulated copper wire | |||
| Silver wire, 0.125 mm diameter | World Precision Instruments | AGW0510 | |
| BNC cables | |||
| Preamplifier with headstage | Dagan Corporation | IX2-700 | |
| Humbug Noise reducer | Quest Scientific | Humbug | |
| Oscilloscope, 30 MHz, 2 CH, Dual Trace, Alt-triggering, without probe | EZ Digital | os-5030 | |
| BNC T-adapter | |||
| Powerlab hardware 2/20 | ADI instruments | ML820 | |
| Labchart software | ADI instruments | Chart 5 | |
| 10 MHz Pulse Generator | BK Precision | 4030 | |
| Glass pipette puller | Sutter Instruments | P-87 | |
| Borosillicate glass capillaries with filament | World Precision Instruments | 1B120F-4 | |
| Potassium chloride, 3 M | |||
| Slotted plastic tube | |||
| Low melting temperature wax | |||
| Soldering Iron | Weller | ||
| Platform with ball-and-socket magnetic base | Hama photo and video | ||
| Double edge carbon steel, breakable razor blade | Electron Microscopy Sciences | 72004 | |
| Vaseline | |||
| Microsoft Excel | Microsoft |
References
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