Summary
hücre içi kayıt elektrofizyolojik teknik gösterdi ve bir kelebeğin bileşik gözünde tek fotoreseptör hücrelerinin spektral hassasiyetlerini belirlemek için kullanılır.
Abstract
Hücre içi kayıt tek bir hücre belirli bir uyarana tepki nasıl belirlemek için kullanılan güçlü bir tekniktir. vizyon araştırmada, hücre içi kayıt tarihsel bugün hala kullanılmakta olan farklı ışık uyaranlara karşı bireysel fotoreseptör hücrelerinin hassasiyetlerini incelemek için kullanılan ortak bir teknik olmuştur. Ancak, göz hücre içi kayıt deneyleri çoğaltmak isteyen araştırmacılar için literatürde detaylı metodoloji bir eksiklik kalır. Burada daha genel göz fizyolojisini incelemek için bir model olarak böceği sunuyoruz. Böcek fotoreseptör hücreleri gözün yüzeyine yakın bulunan ve bu nedenle ulaşmak kolay ve vizyonu katılan mekanizmaların birçok hayvan filumlarında boyunca korunduğu vardır. Biz e az önce deneyimi olan araştırmacılara bu teknik daha erişilebilir hale getirmek amacı ile, bir kelebeğin gözünde fotoreseptör hücrelerinin in vivo hücre içi kayıt için temel prosedür açıklanmaktadırlectrophysiology. Biz tek bir hücreye bir cam mikroelektrot ve nihayet kayıt işlemini kendisi nasıl takılacağını, kayıt için canlı kelebek nasıl hazırlanacağını, gerekli temel donanımları tanıtmak. Biz de bireysel hücre tiplerinin spektral duyarlılığı belirlemek için ham tepki verilerinin temel analizini açıklar. Bizim protokol spektral duyarlılığı belirleyen odaklanır rağmen, diğer uyaranlara (örneğin, polarize ışık) ve yöntemin varyasyonları bu kurulum için geçerlidir.
Introduction
nöronlar gibi hücrelerinin elektriksel özellikleri voltaj ve akım bir değişiklik olarak hücre zarlarından iyon akışını ölçmek sureti ile görülür. elektrofizyolojik teknikler çeşitli hücrelerde biyo etkinliklerini ölçmek için geliştirilmiştir. hayvanların gözlerine bulunan Nöronlar erişilebilir ve devre elektrofizyolojik çalışma için bu hücreleri iyi adaylar yapım, beyinde genellikle daha az karmaşıktır. Gözde elektrofizyoloji yaygın uygulamalar elektroretinografi (ERG) 1,2 ve mikroelektrot hücre içi kayıt bulunmaktadır. ERG, ya da bir hayvanın gözüne bir elektrot yerleştirme hafif bir uyan uygulamak ve yakındaki hücrelerin 3-6 tepkilerin bir toplamı olarak gerilim değişikliği ölçülmesini kapsar. tek bir kişi fotoreseptör hücrelerinin spektral hassasiyetlerini karakterize, özellikle ilgilenen varsa, genellikle birden fazla hücre tipleri aynı anda belirli bir uyarana farklı güçlerde de tepki; böylece onugözde spektral-benzer fotoreseptör hücrelerinin birkaç farklı türü vardır özellikle ERG verileri belirli hücre tiplerinin hassasiyetlerini belirlemek zor olabilir. Bir potansiyel çözelti göz çoğunluğu R1-6 hücrelerinde eksprese ilgi fotoreseptör (opsin) geni ile Drosophila oluşturmak ve sonra ERGler 7 yapmaktır. Bu yöntemin olası sakıncaları fotoreseptör protein 8 düşük ifadesine hayır ve transgenik hayvan üretimi ve tarama için uzun bir zaman dilimi bulunmaktadır. Spektral farklı fotoreseptör daha az çeşit gözlerde için, renkli filtreler ile gözün uyum böylece ERG bazı hücre tiplerinin katkı düşürücü spektral duyarlılık maxima 9 tahminini izin yardımcı olabilir.
Hücre içi kayıt ince bir elektrot bir hücreyi impales başka tekniktir ve bir uyarıcı uygulanır. elektrot kayıtları sadece o individual hücrenin tepkisi kayıt ve çoklu bireysel hücrelerin analiz fizyolojik farklı hücre tipleri 10-14 spesifik hassasiyetlerini verim böylece. Bizim protokol spektral duyarlılık analizi üzerinde duruluyor olsa da, keskin elektrotlar ile kayıt hücre içi temel ilkeleri diğer uygulamalar için değiştirilebilir vardır. Örneğin, bir numune farklı hazırlanmasını kullanarak, ve keskin kuvars elektrotlar kullanılarak, tek bir isteniyor soruya bağlı olarak, beyindeki optik lob veya diğer bölgelerde daha derin kayıt olabilir. Örneğin, bireysel fotoreseptör hücrelerinin 15 yanıt süreleri, optik hücre aktivitesi 19 da benzer teknikler ile kaydedilebilir veya renk uyaranlar kutuplaşma 20 ile değiştirilir olabilir 16 (lamina, medullayı veya lobula 17), beyin 18 veya diğer ganglion loblar -22 veya hareket 23,24 uyaranlara.
Fototransdüksiyon, süreç hangi ışık tarafındanEnerji absorbe edildi ve bir elektrokimyasal sinyaline dönüştürülür, hemen hemen tüm bugünkü hayvan fila 25 ortak eski bir özelliktir. fotoreseptör hücrelerinde bulunan ve görsel fototransdüksiyon başlatmaktan sorumludur görsel pigmenti rodopsin olduğunu. Tüm hayvanlarda Rhodopsins retina veya benzer molekül 26,27 türetilen bir opsin proteini, 7 transmembran G-protein kenetli reseptör ailesinin bir üyesi ve bir birleşik kromoforun oluşur. Amino asit dizisi ve kromofor yapısı opsin ışığın farklı dalgaboylarına karşı rodopsin absorbansı etkiler. Foton kromofor tarafından absorbe edildiğinde rodopsin sonuçta zara bağlı iyon kanalları 28 açılmasına neden olur hücrede bir G-proteini başlatarak, aktif hale gelir. En nöronlar farklı olarak, fotoreseptör hücrelerinin ışık uyarısına cevap değişen amplitüdünde görece bir değişiklik olarak ölçülebilir kademeli potansiyel değişimler geçirirler. Tipik olarak, belirli birfotoreseptör tipi tek opsin genini ifade (istisnalar 8,10,29-31 mevcut olsa da). Sofistike renk görme, birçok omurgalılarda ve eklembacaklılar bulunan türden, her biri veya bazen daha fazla rodopsin türlerini ifade fotoreseptör hücrelerinin yüzlerce ya da binlerce karmaşık bir gözle elde edilir. Görsel bilgi renk ve hareket ile tam bir görüntünün algılanması sonucu, göz ve beyinde karmaşık aşağı nöral sinyalizasyonu ile fotoreseptör mozaik üzerinde yanıtları karşılaştırarak yakalanır.
hücre içi kayıt yoluyla ışığın farklı dalga boylarında bir fotoreseptör hücre ham tepkilerini ölçmek sonra, onun spektral duyarlılığı hesaplamak mümkündür. Bu hesaplama fotoreseptör hücre yanıtı ancak 32 emer fotonların belirli özelliklerine, o emer fotonların sayısına bağlı olduğunu ifade Univariance İlkesi dayanmaktadır. Abso olan herhangi bir fotontepkiyi neden olacaktır rodopsin tarafından rbed. Uygulamada, bu hücrenin ham tepki genlik (rodopsin yüksek olasılık olduğu dalga boyu emici) (absorbe daha fazla foton) ışık şiddeti bir artış ya bağlı artış, ya da zirveye hassasiyeti doğru dalga boyunda bir kaymaya anlamına gelir. Biz bilinen yoğunluğu ve farklı dalga boylarında tepkiler aynı dalga boyunda ve aynı yoğunlukta ama bilinmeyen bağıl duyarlılık hücresel yanıtları ile ilgili bu prensip faydalanmak. Hücre tipleri genellikle dalga boyunda kendi duyarlılık doruklarına tarafından tespit edilir.
Burada geniş bir araştırma topluluğuna bu yöntem daha erişilebilir hale odaklanarak, hücre içi kayıt ve kelebek gözünde fotoreseptör spektral duyarlılık analizi için bir yöntem göstermektedir. Hücre içi kayıt, özellikle böcekler renk görme ile ilgili olarak, literatürde yaygın kalmakla birlikte, Tha buldukmateryal ve yöntemler t açıklamaları genellikle tekniğin yeniden üretimi için izin vermek için çok kısa bulunmaktadır. Biz onun daha kolay çoğaltma izin amacı ile video formatında bu yöntem mevcut. Biz de kolay elde ve uygun fiyatlı ekipmanlar kullanılarak tekniği açıklar. Biz yeni ve karmaşık teknik optimize ederken araştırma yavaşlatmak sık sık rapor değil ortak uyarılar, adres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bütün hayvanlar mümkün olduğunca insanca tedavi edildi. Böcekler Kosta Rika Entomoloji Supply, Kosta Rika pupa olarak sevk edildi.
1. Heliconius Pupa Bakımı
- Askıda Tüm pupa böcek iğne kullanılarak nemli bir bölmede 2-3 cm aralıklı.
- eclosion sonra, kanatlar sonra kurumaya nemlendirilmiş oda içinde en az 1 gün hayatta kelebekler tutmak Kayıttan önce günlük olarak seyreltilmiş bir bal çözeltisi beslemesi sağlar.
- hacimce yaklaşık% 20'lik bir bal çözeltisi su ile bal sulandırmak ve sığ Petri kabı içine dökün.
- , Petri kabı teker teker ayrı kelebekler getirin. onların ön tarsi ile çözüm dokunmadan üzerine, kelebekler otomatik olarak proboscides uzatacaktır ve Petri kabı içilir. onların hortum otomatik olarak uzatmak etmezse, dışarı burnumun çekin ve bal çözüm tanıtmak için forseps kullanabilir.
2. Optik Parça, Kalibrasyon ve MEASURDeneysel Işık Şartların ement
- gövde güç kaynağıdır ve parlak beyaz bir ışık sağlamak için en az bir metre uzunluğunda bir tablo bir ucunda bağlı bir kondansatör lens takımının bir 150 W ksenon ark lambası yerleştirin.
DİKKAT: Ksenon ark lambaları güçlü UV şiddetleri ile son derece parlak ışık üretirler. Koruyucu gözlük her zaman giyilmeli ve atmosferik oksijen ile UV ışığının etkileşimin neden olduğu ozon birikmesini önlemek için üretici tarafından yönlendirilen lamba kullanılmalıdır. - (Şekil 1) geçmesine konut düzeneğini çıkan ışık uzunluğunda bir optik parça bir metre kadar ayarlayın.
- dışında yaklaşık mesafelerde optik yolda aşağıdaki sırayla yer: 1) 40 cm kondansatör düzeneğinden bir dışbükey silis veya kuvars lens, 2) daha fazla birlikte ışık yolu Şu anda filtreler) 22 cm olan bir nötral yoğunluk filtresi tekerlek ( parça, 3) tahrik ünitesi ile bir deklanşör ND filtresiyle 14 cms, 4), içbükey bir silika veya kuvars lensi parçanın ucunda birlikte 6 cm daha hemen kapağın aşağıdaki bitişik ve 5), bir kolimatör ışını sensörü.
- collimating ışın prob 600 mikron çapında fiber optik kablo yapıştırın.
Not: ışık yoğunluğuna bağlı olarak, 5-10 mm çaplı fiber optik kablo için diğer preparatlarıyla kadar ışık sağlamak için gerekli olabilir ve bunun için ikame edilebilir. - derleme çıkan ışık demeti en yüksek yoğunlukta mümkün olduğunu böylece mesafe, yükseklik ve her optik elemanın açısını ayarlayın.
- optik parça elemanları farklı uygulamalar ile biraz farklı gibi, tüm unsurları UVA ve görünür aralıkta (315-700 nm) ışık ileten emin olun.
- optik parça monte edildikten sonra, bir spektrometre kullanılarak kurulum geçer ışığı ölçmek. İlk bilinen bir spektrumda ve üreticinin yazılımı ile bir kalibrasyon lamba kullanarak spektrometre kalibre edin.
Not: Biz (örn Avantes) netlik ama diğer üreticiler için Ocean Optics ürünlerini kullanarak kurmak aşağıdaki tarif karşılaştırılabilir ürün satmak.- ölçümler almadan önce tungsten kalibrasyon lamba en az 45 dakika çevirin.
- kalibre etmek için, yüklü ilişkili yazılımı ile bilgisayara USB üzerinden spektrometre takın. Sonra UV-görünür verici kosinüs giderici aracılığıyla tungsten kalibrasyon lambasına spektrometre bağlayın.
- "Dosya" sekmesinden "Yeni Mutlak Işınım Ölçümü" seçeneğini seçin ve spektrometre seçin ve "Kaynak".
- yeni bir kalibrasyon "cal" dosyası oluşturmak için yönergeleri izleyin. İstendiğinde, otomatik olarak spektrometre çıkışından düzeltilmiş spektrumu hesaplar yazılımı içine görünür ışık aralığı (300-800 nm) tungsten kalibrasyon lambanın bilinen spektrum için sağlanan veri dosyası yüklenemedi.
- Kalibrasyon dosyayı kaydedin. ne zaman initi bu dosyayı yükleyinspektrometre kullanılarak ışık spektrumları gelecekteki tüm ölçümler için yazılım alizing.
- spektrometre kalibre edildikten sonra, deney düzeneği ışık spektrumları kaydetmek için kullanabilirsiniz. Yazılım açıldığında Ahiret, "Yeni Mutlak Işınım Ölçümü" seçin ve önceden kaydedilmiş kalibrasyon dosyasını yüklemek. Sonraki spektrometresi tüm ışık bloke ederek karanlık bir spektrum alır.
- Şu anda istenilen deneysel ışık ölçüm koşulları spektrometresi ile entegrasyon süresi (4 msn) ayarlamak, taramalar (5) ortalamasını almak ve boxcar genişliği (5), bu yüzden spektrum düzgün ölçekli ve düzeltilir. farklı ölçümlerin o ışık şiddetleri mukayese edilebilir, böylece tüm spektral ölçümler için aynı ayarları saklayın.
- Tüm nötral yoğunluk filtreleri Deneyler sırasında kullanılmak üzere, zayıflatılmamıĢ beyaz ışık için spektrumunu ölçün ve her bant geçiren girişim filtresi için (Şekil 2).
- Mspektrometresi adım 2.2.2 den fiber optik kablonun serbest ucu koymak suretiyle ışık yolu herhangi bir filtre olmadan beyaz ışık spektrumu gözetim kuruluşunun onayını almıştır. Adım 2.3 yüklenen kalibrasyon dosyası ile, bir metin dosyası olarak spektrometrenin yazılımını kullanarak beyaz ışık spektrumu kaydedin.
Not: Spectra kaydedilen metin dosyaları dalga boyu liste olarak (x koordinatları) bir sütun ve ikinci sütunda ışığın yoğunluğu (y koordinatları) olarak, veri adım 2.6 için bir elektronik tabloya yüklenebilir böylece. - Adım 2.5.1 ile aynı kurulumu kullanarak, optik parça (ND) filtre tekerleği nötr yoğunluğunu çevirerek deneyler sırasında kullanılan her optik yoğunluk (OD) (0-3,5 OD) dan spektrumunu kaydedebilir ve metin dosyasını kaydetmek her OD.
- Adım 2.5.1 ile aynı kurulumu kullanarak, ışık yoluna tek 10 nm yarım bant genişliği girişim filtreleri bir yer ve her filtre için gözlemlenen spektrum kaydedin. 41 farklı girişim filtreleri her w için bu işlemi tekrarlayıni pik geçirgenlikleri 300 ila 700 nm her 10 nm aralıklı. Daha fazla ayrı (20 nm) aralıklı filtreler, çoğu uygulama için kabul edilebilir (spektrumları için, bakınız Şekil 2).
- Mspektrometresi adım 2.2.2 den fiber optik kablonun serbest ucu koymak suretiyle ışık yolu herhangi bir filtre olmadan beyaz ışık spektrumu gözetim kuruluşunun onayını almıştır. Adım 2.3 yüklenen kalibrasyon dosyası ile, bir metin dosyası olarak spektrometrenin yazılımını kullanarak beyaz ışık spektrumu kaydedin.
- ışığın şiddetindeki farklılıkları düzeltmek girişim filtreleri ışık yolu yerleştirildiğinde. Her bir girişim filtresi foton farklı sayısı geçmesine izin verir ve filtrelerin bazı düşük iletim Tüm filtreleri foton eşit sayıda izin verecek şekilde zor daha yoğunluğunun azaltılmasını mümkün kılar.
- her biri 10 nm bant genişliği girişim filtresi için bağıl yoğunluk (I) 'hesaplamak için, T (2.5.3 arasında) her biri 10 nm girişim filtresi spektral eğrisi altında kalan alan olan ifade, J = T / sn, de I çözmek ve s her filtre (520 nm'de bir örnek için bakınız Şekil 2) tepe dalga boyunda beyaz ışık maksimum mutlak ışınım (2.5.1 kaydedilen metin dosyası y değeri).
- tüm hesaplanan intensit bölmek2.6.1 hesaplanan maks yoğunluk değeri ile ler (adım 6.4) birine normalize ve her dalga boyunda, ham duyarlılık uygulanan bir düzeltme faktörü olarak kullanım için, normalize değerlerin devrik tutmak için kullanılır.
- Sadece bir kez bir dizi deney öncesinde adımları 2.6 ile 2.1 gerçekleştirin. Bir deney boyunca periyodik olarak ışık uyaranın şiddeti değişmez emin olmak için, parlak ışık ve nötral yoğunluk filtreleri altında Xenon ark lambası mutlak ışınımı kaydedin.
- girişim filtreleri üzerinden iletilen ışık herhangi bir hücresel yanıtı maksimum tepki amplitüdünün yaklaşırsa bir deney sırasında, sinyalini zayıflatmak ND filtreler kullanılır. ND filtreleri bir deney sırasında kullanıldığında, spektral duyarlılık hesaplanmasında yoğunluğu karşılık gelen azalma,.
- Deneyler başlamadan önce optik parça, kalibrasyon ve filtreler günler ya da haftalar ayarlayın. filtreleri tutmakToz birikmesini önlemek için kapalı.
3. Kayıt Cihazları Kurulumu
- Böyle bir Kardan kol çevresi (diyagram için bakınız Şekil 3) gibi bir Faraday kafesi ile kalibrasyon için kullanılan aynı fiber optik kabloyu Yem ve bir goniometrik cihazda monte edin. Kablo 10 cm uzaklıkta numunenin göz arasında olacaktır.
- Bir elektrot tutucu ile bir vibrationally izole masada bir metal sahne yerleştirin bir micromanipulator kontrolü altında aşamasında yukarıda doğrudan (Şekil 4) monte edilmiş. Numune baş kol dönme hareketi tarafından oluşturulan kürenin merkezinde olacak şekilde Kardan kolu yerleştirin.
- (Faraday kafesi içinde hazırlık yakın headstage) bir (Faraday kafesi dışında) amplifikatör ve preamplifier örnek alınacaktır metal aşamasında yukarıda headstage montaj içeren bir hücre içi preamplifier sistemi kullanarak.
- Bir aracılığıyla headstage için bir koaksiyel kablo bağlayınBNC bağlantısı. koaksiyel kablonun diğer ucunda açık sadece ucu bölmek ve iç telden kablonun dış metal kılıfı ayırın.
- diğer ucunda bir timsah klibi ile yalıtılmış bir bakır telin bir ucuna (toprak potansiyelinde tutulur) dış kılıfı lehimleyin. Bu timsah klibi örnek platformu (Adım 5.1.4) metal referans elektrot eklenecektir.
- kayıt elektrot olarak hizmet vermeye, ince gümüş tel koaksiyel kablonun iç tel lehim. Bu kablo kadar ince Aşama 5.2.3 çözeltisi doldurulmuş cam elektrot beslenmek üzere olmalıdır.
- gözün içine elektrod düşürmek için yakaladı, ve tekrar dışarı elektrot gözüne bir kez geri salladı olabilir, böylece Faraday kafesi dışında ahşap bankta bir sallanan kol ve tabanına bağlı Stereomikroskopta yerleştirin.
- Faraday kafesi düzgün topraklanmış içindeki her şeyin metal olun.
- Faraday kafesi dışında, preamplif takmak(Isteğe bağlı) 50-60 Hz gürültü düşürücü girişine er ve BNC T-adaptörünü kullanarak osiloskop bir kanala çıktı bağlayın.
- T-adaptörünün diğer ucunu kullanarak, donanım tek bir kanala osiloskop geçerek sinyalini bağlamak. preamplifikatör kaydedilen tepkiler bilgisayarda yazılım tarafından okunacak sağlayacak bir USB kablosu ile bilgisayara bu donanımı takın.
- Başka bir T-adaptörü kullanarak osiloskopun ikinci kanala optik izden deklanşör sürücüsünü takın ve göz (Adım 5.5) teslim ışığı yanıp sıklığını ve süresini kontrol edecek bir darbe jeneratörü bu bağlayın.
Not: teçhizat kendisi Kur yalnızca bir kez yapılması gerekir gerekir. kayıtları başlamaya hazır olana kadar burada kırın.
Kayıt günü 4. Hazırlık
- deneyden önce Xenon lamba en az 45 dakika çevirin ve pul önce cam mikroelektrot çektirmenin en az 30 dk açmakling cam elektrotlar.
- tüm kayıt ekipmanları (perde, amplifikatör, gürültü tutucu, darbe jeneratörü, osiloskop ve veri toplama donanım) açın ve deklanşör hiçbir ışık fiber optik kablo geçer varsayılan olarak kapalı olduğundan emin olun.
- İnce borosilikat (ya da alüminosilikat) cam mikroelektrot çektirmenin kullanarak cam Mikroelektronlar (100-250 MQ direnci idealdir) çekin. çekilirken sadece birkaç saat içinde cam elektrotlar kullanın.
- 3 M potasyum klorür (KCl) elektrotlara dolgu. Enjeksiyon boya, örneğin, bu çözelti, araştırmacının ihtiyaçlarına göre değiştirilebilir unutmayın.
5. Numune Hazırlık ve Kayıt Prosedürü
- numune hazırlamak
- Baş hareketsiz ve borunun bir ucunda çıkıntı yapan bir sıcak mum ile birlikte küçük bir plastik tüp içinde tek bir kelebek yapıştırın. Burnumun, antenleri ve kanatları (Şekil 5) aşağı balmumu.
- t basılı tutuno balmumu kuru parça ile karın ve karın arkasındaki tüp içinde bir ıslak mendil koyarak nemlendirilmiş tüp tutun. Numune tamamen hareketsiz olduğundan emin olun.
- Manyetik bir tabana bağlanmış olan bir bilyalı mafsal ile küçük bir platform üzerine balmumu küçük bir parça ile boru monte edin.
- bir mikroskop altında, bir referans elektrot olarak kullanılmak üzere, ağız parçaları ile kafa içine 0,125 mm çaplı bir gümüş tel yerleştirin. Deneyden önce, kalıcı bir platform kayıt için sahne üzerine yerleştirilen bir kez adım 3.3.2 bakır tel kendisine üzerinde klibi olabilir böyle bir şekilde platforma teli düzeltmek.
- Referans elektrot, uygun bir pozisyonda sonra hızlı bir şekilde eritilmesi ve daha sonra tel çevresinde balmumu soğutma yerinde tutulabilir.
- Küçük bir parça bir kırılabilir karbonlu çelik jilet, bıçak tutucu ile bıçak kavrama bölümünü kullanarak ve kesiyorum kornea kesmek için kullanın.
- ~ (10 ommatidi küçük bir delikSol korneada çapı a) kuruma önlemek için vazelin ile delik jilet kullanılarak ve kapatın.
- Kornea kesilir sonra, gözdeki hemolimf hızla donacaktır çünkü mümkün olduğunca çabuk göz içine kayıt elektrodu yerleştirin ve imkansız bir elektrot eklemek için yapmak. Mümkünse kayıt gerçekleşecek teçhizat diseksiyon.
Not: Bu optik defocus gibi Vazelin gözün geri kalanı bulaşmış olmamalıdır.- Henüz sahnede, kayıt teçhizat sahneye monte örnek ve platformu yerleştirin. timsah klipler kullanarak örnek platformunda referans elektrot adım 3.3.2 den headstage topraklama kablosunu bağlayın.
Not: hayvan aydınlatmak için kırmızı filtre kullanmak Mümkünse. - göz içine kayıt elektrodu düşürürken bir Stereoskop altında örnek kısaca ışık boynu ekleri ile bir ışık kaynağı kullanın.
- İçindeBir cam mikroelektrot arkasındaki KCl çözeltisi içine adım 3.3.3 den headstage bağlı gümüş tel sert. elektrot tutucu cam elektrot monte edin.
- mikroelektrot önce kornea üzerinde bir milimetre hakkında, korneada kesilmiş delik üzerinden doğrudan böylece elektrot tutucu ayarlayın. osiloskop üzerindeki potansiyel (mV) büyük bir değişim gösterdiği gibi, bir devre, tamamlanana kadar mikromanipülatör kullanarak göz içine mikroelektrot indirin.
- Henüz sahnede, kayıt teçhizat sahneye monte örnek ve platformu yerleştirin. timsah klipler kullanarak örnek platformunda referans elektrot adım 3.3.2 den headstage topraklama kablosunu bağlayın.
- Bir kez gözünde, Faraday kafesi dışında Stereoskop salıncak ve numune aydınlatan ışık kaynağı kapatın. Göz adapte karanlık olur böylece oda karanlık tutulmalıdır.
- amplifikatör 1 nA akımı uygulayarak ve voltaj değişimi belirterek elektrodun direncini kontrol ediniz. Direnç, tipik olarak 100-250 MQ aralığında olmalıdır. Yüksek dirençleri tıkanma ya da elektrodun eğilme ve elektrikli düşük direnç göstergesidirkaside kırılması.
- deklanşör 50 milisaniye süreli bir ışık flaş her 0,5 saniyede bir izin açılır, böylece darbe jeneratörü etkinleştirin ve deney süresince yanıp sönmeye devam sağlar.
- o kadar 50 msn süreli yanıp izin verir, böylece darbe jeneratörü ayarlayın. yanıp söner arasındaki bu süre 0.5 saniye duraklama deney sırasında mümkün olduğunca adapte karanlık yakın olarak numune tutar. Elli msn uzun flaş süreleri olarak yanıt aynı genlik ortaya edecek kısa flaş süresi yakındır.
- Başlangıçta ve deney (Adım 5.16) sonunda hem de yeniden ölçü yanıtları. yaklaşık yirmi dakikalık deney boyunca, bu flaş ayarları zamanla yanıtı aşağılamak değil. Farklı prepler bu flaş ayarları ayarlamalar gerekebilir.
- Fiber optik kablo, göze doğru yönlendirilir, böylece Kardan kolu yerleştirin.
- Her ışık yanıp gerilim değişikliği için osiloskop edin.voltaj negatif değişim elektrot henüz bir hücre girmedi anlamına gelir.
- bir maksimum gerilim yanıt olan en göze bir açı ile konumlandırılmış kadar numune yaklaşık Kardan kolunun hareket ettirilmesi.
- hafifçe elektrot tutucu tabanını dokunarak veya preamplifier Buzz işlevini kullanırken her iki yönde elektrot çok küçük dikey hareketleri neden ileri ve geri mikromanipülatör döndürün. Bir depolarizan hafif tepki osiloskop (Şekil 6) görünene kadar küçük ayarlamalar yaparak devam edin.
- bir ışık flaş büyük depolarizan sinyali üretir geliş açısını bulmak için tekrar Kardan kolu ayarlayın. mikromanipülatör ile küçük ayarlamalar yapmak ve elektrot stabil hücre kayıt ve tüm deney için hücrede kalacak emin olmak için gerektiğinde amplifikatör Buzz işlevini kullanın (Adım 5.11 bakınız).
- Kurulum istikrarlı sonra Reco başlamakrding. (: Gürültü oranı 1 sinyali en az 10) İstikrarlı bir kayıt potansiyeli, düşük arka plan gürültü ve sürekli büyük depolarizan tepki istirahat hiçbir değişiklik az olmalıdır.
- bilgisayarda yazılımı çalıştırın ve dört kanallı bir pop up pencere açılacaktır bir "yeni bir deneme," başlar.
- 500 mV yazılım penceresinin sağ üst köşesindeki gerilim ölçeği ayarlayın. ikinci kanal fonksiyon jeneratörü ile üretilen kare dalga kayıt olurken sinyal osiloskop ile veri toplama donanım beslenir, obtüratör açık olduğu zaman, ilk kanal gösteren, gerçek zamanlı olarak elektrot kaydedilen yanıtlar gösterecektir . Diğer iki kanal gereksiz vardır.
- Kayda başlamak ve yazılım deney süresince çalışmasına izin vermek için sağ alt köşesindeki "Başlat" düğmesini tıklatın. yanıtları açık şekilde eksenleri x (zaman) ve y (voltaj) zoom ayarlayın.
- İlk olarak, beyaz ışık ile 3.5 OD (yaklaşık 5-10 sn) ND filtre tekerleği ile 10 ayrı yanıtları kadar kayıt.
- Sonraki rekor 0.0 OD kadar her kombinasyonda 3,3 OD de yanıtların aynı sayıda, daha sonra 3.1, 3.0, 2.5, 2.3, 2.1, vb. ND filtresi serisi bu tepki genlikleri ağartma oluşursa, Bölüm 6'da yanıt-log yoğunluk eğrisi sağlamak deney sırasında parlak uyaranların az yanıp kullanacaktır.
- girişim filtreleri kullanarak, tüm dalga boylarına hücrenin yanıtı kaydedin.
- İlk zirve dalga boyu bulmak. ışık yolu (0.0 OD) ND filtre olmadan, ışık yolu UV verici filtre koyun ve kısaca yanıt genlik gözlemleyin. zirve yanıtı nerede olacak biraz fikir vermelidir mavi verici filtresi, yeşil verici filtre ve kırmızı verici filtre ile tekrarlayın.
- yaklaşık olarak filtreleri kullanın 350, 450, 550, 650 nm tepe hassasiyet genel bölgesini bulmak içinadım 5.14.1. Tüm dalga boyları sonraki adımda kaydedilmiş olacaktır çünkü tam dalga boyu bu ilk arama aşamasında önemli değil. tahminler zirve hassasiyetleri var, ya da daha önce kaydedilmişse, kullanımı bilinmektedir dalga boyları hızla tepe tepkisini belirlemek için.
- pik yanıtı kez ya da buna yakın tanımlanır, 10 yanıtların (yaklaşık 5 saniye) bu dalga boyunda kaydı.
- 10 nm adımlarda 300-700 nm, diğer girişim filtreleri ile pik yanıt kaydın dalga boyunda kaydettikten sonra. Zirveye başlatın ve pik yanıtı 520 nm'de ise, bu dalga boyu, ardından 510 nm rekor yanıtları, 530 takiben (örn tek ışık yolu bir filtreleri değiştirerek hem kısa ve uzun dalga boylarına doğru dışarı adım nm, 500 nm, 540 nm, 490 nm, 550 nm ve benzeri hayır) yanıt kalmayıncaya kadar.
- Filtre başına en fazla 10 yanıtların (5 saniye her) için izin verin. girişim filtreleri takas, hücre resp izinkinci zirve tepki zamanla aşağılayıcı olup olmadığını izlemek için yararlıdır ışık yolu, herhangi bir filtre olmadan beyaz ışık 1-2 yanıp söner. yanıtların sayısını azaltın veya ağartma oluşursa OD artırmak.
- her türlü girişimi filtre altında cevap 0 OD beyaz ışık altında maksimum tepki çok yakın ise, ND filtre ile zayıflatmak. girişim filtreleri ve bu deneyde kullanılan fiber optik kablonun boyutunu önemli ölçüde ışık yoğunluğunu azaltmak ve bu ND filtreleri, tipik olarak gerekli değildir.
- Kayıt önceki tepki genlikleri teyit için bir pseudoreplicate olarak hizmet vermektedir ve zamanla bozulmuş değil yanıtını sağlamaya yardımcı olur zirve yanıt etrafında kararlı, yeniden rekor dalga boylarını kalırsa. Bir kez tüm dalga boyları kaydedilir, yeniden rekor adım 5.12 olarak ND serisi altında yanıtları.
- kayıt yazılımı komple tıklayın "Dur" ve analiz için kayıt kaydettikten sonra.
- Bir deneyden sonra, dondurma, ya da hızla kafasını kesilmesinin ve toraks ezme ardından birkaç dakika boyunca soğutma bireyi feda.
- tüm ekipmanları kapatın. analizi yapmadan önce gerekirse burada kırın.
6. Spektral Duyarlılık Analizi
- Ham yanıtları kaydetmek için kullanılan yazılım ile, ND serisinde ve her girişim filtresi için her filtre için 10 ayrı cevapların ortalama yanıt genliği hesaplayın.
- Adımlar kaydedilen ND filtre serisi 5,12-5,13 (Şekil 7) bir yanıt-log yoğunluk (VlogI) işlevini oluşturun. y ekseninde her yoğunluğu X ekseni üzerinde yoğunluk (OD), ve yanıtın Log birimi çizerek bunu yapın.
- farklı dalga boylarında hücrenin spektral duyarlılığı elde etmek için, genellikle adım 6.2 verilerine Naka-Rushton denklemini uygun ve farklı dalga boylarında t deneysel olarak elde edilen spektral yanıtları ilişkilendirmek için bu denklemi kullanmak(Bu durumda beyaz ışık) sabit bir dalga boyu altındaki bu tepki ortaya çıkarmak için gerekli olan O göre foton.
Not: Naka-Rushton denklemi: Ben uyaran şiddeti V / V max = I n / (I n + K n), V yanıt genliği, V max maksimum tepki genliği, K uyarıcı ½ V max veren yoğunluğu ve n üstel eğimi. Çeşitli yöntemler eğri uydurma yazılımı ya da kod tabanlı istatistik paketi dahil olmak üzere, VlogI verilerine Bu denklemi uyacak şekilde kullanılabilir. - Basit hesaplamalar ve bir elektronik tablo programı kullanarak Naka-Rushton denklemini sığdırmak için, her uyaran yoğunluğu için VlogI yanıt verileri dönüştürmek: log [(V max / V) - 1]. Sonra iyi uyum doğrunun denklemi elde etmek için dönüştürülmüş veriler üzerinde lineer regresyon gerçekleştirin.
Not: V max herhangi ölçülen tepkiler daha büyük olmalıdır; Bu tutarlı tutmak için, bu yöntem V max% 1 gre olarak tahminEn yüksek ölçülen tepki daha onra. - regresyon çizgisinin denkleminden, (K) y-kesişim / n = negatif eğim alarak üs (n) tahmin ve oturum açın.
- farklı dalga boylarında hücrenin spektral duyarlılığı elde etmek için, genellikle adım 6.2 verilerine Naka-Rushton denklemini uygun ve farklı dalga boylarında t deneysel olarak elde edilen spektral yanıtları ilişkilendirmek için bu denklemi kullanmak(Bu durumda beyaz ışık) sabit bir dalga boyu altındaki bu tepki ortaya çıkarmak için gerekli olan O göre foton.
- Tahmin edilmiştir V max, n ve K parametreleri sonra, (V), belirli bir dalga boyunda ölçülen spektral tepki takarak, her dalga boyunda hücre spektral yanıtı ortaya çıkarmak için gerekli olan foton ve çözme nispi sayısını belirler I için
- Her dalga boyunda (adım 2.4.3 itibaren) her parazit filtresi için düzeltme faktörü ile adım 6.3 hesaplanan uyaran yoğunluğunu (I) çarpın.
- Onlar mukayese edilebilir, böylece hassasiyeti elde etmek için, tüm şiddetleri V log-I eğrisi ile ilgili olmalıdır. V max veya K ½ her dalga boyu yoğunluğu ile ilgili bunu Adım 6.2.3 hesaplanan.
- K. her düzeltilmiş dalga boyu yoğunluğunu (6.4 Adım) Çıkar
- Sonra her dalga boyu yoğunluğu, "Bu eklentimesafe K "değeri ve çarpma (-1) ile K.
- Sonraki her dalga boyuna serinin en düşük veri noktasının mutlak değer katarak pozitif tüm veri noktalarını getirmek.
- Adım 6.5.1 tüm yeni hesaplanan şiddetlerinin devrik alarak her dalga boyunda hassasiyeti bulun. duyarlılık spektrum 0 ile 1 arasında düşer, böylece verileri dönüştürmek.
- Aynı tip ortalamasının birden fazla hücreden standart hata çubukları veya% 95 güven aralıkları (Şekil 8) ile nihai yanıtları ve arsa kaydettikten sonra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kayıt kurulum birçok unsuru, bir yazılı açıklama yeterli ayrıntı sağlamaz. Şekil 1 tam kayıt kurulumu katılan bileşenlerin şematik olarak göstermektedir. Şekil 2'de, spektrumları bir düzeltme faktörü gereklidir neden sens ve ne bu düzeltme hesaplamak için gerekli olan vermek üzere, beyaz bir ışık ve her bir girişim filtresi için çizilir. 3 fotoğraf ve bunlar için kullanılan kardan kolun bir diyagramını göstermektedir deneyler. Şekil 4 kayıt sahne ve mikromanipülatör gösteren bir bileşik resimdir. 5 deney için bir kelebek hazırlanmasında birkaç adım göstermektedir.
Bir kayıt başladıktan sonra, hafif bir flaş yanıt olarak gerilim olumsuz bir değişim elektrodu Şekil 6a'da olduğu gibi, hücre dışında olduğu anlamına gelir. tepkisinin gücü elektrot yakınlığına bağlıdırBir fotoreseptör hücresi ve hafif flaş geliş açısına ucu. Tepkisi büyük olmalı (> 30 mV) ucu kazığa oturtmak için bir hücreye yeterince yakın önce. 6b Şekil bir fotoreseptör hücre içine girişini simgeleyen bir ışık uyarısına net bir depolarizan tepki gösterir. mutlak genlik ölçüde değişebilir, ancak (en azından 40 mV) dinlenme potansiyeli kararlı olması ve yanıtı, genlik büyük olmalıdır. Göreceli tepkisini ölçmek, bu nedenle sinyal gürültü oranı yüksek olması daha çok önemlidir. büyük ölçüde potansiyel değişiklikleri dinlenme durumunda, tepki dalga alışılmadık görünüyor veya maksimum tepki tüm girişim filtreleri imkansız hale karşısında sonra göreceli yanıtları karşılaştırarak, çok düşüktür. Kullanışsız kayıtların örnekleri Şekil 6c, 6d gösterilmiştir.
Başarılı bir kayıt tamamladıktan sonra, ND yanıtları çizilen olmalı ve Naka-Rushton denklemi verilerine 33 takılmalıdır, shown Şekil 7'de. Bu rakam her türlü girişimi filtreleri olmadan ND filtresi serilerini kullanarak çizilir. kayıt stabil ise, ND filtresi serisi verileri deney öncesi ve sonrası benzer olmalıdır. Protokol bölüm 6 hesaplamalarında açıklandığı gibi spektral duyarlılık, belirli bir dalga boyunda her yanıt (V) (I) için çözme, daha sonra Şekil 7'de VlogI arsa Naka-Rushton denklemi ayarlanması ile belirlenir.
Tek bir kayıt elde edilen spektral duyarlılık temsili bir örneği (Bu örnek lütfen unutmayın gerçek hesaplanan verileri gösterir, ancak bu sonuç yayınlanmamış olduğu gibi zirve kaymıştır) Şekil 8a çizilir. Hücre tipleri içindeki dalga boyunda en yüksek duyarlılık ve hassasiyet spektrumun genel şekli ile sınıflandırılabilir. Benzer hücre tipleri daha sonra ortalaması alınır ve ortalama duyarlılık figu her dalga boyunda standart hata barları ile çizilir8b yeniden. Bir böcek bulunan üç tipik hücre tiplerinin spektral duyarlılık Şekil 8C'de gösterilmiştir (büyüklük ve hata çubukları, gerçek verilerden hesaplanan, ancak tepe kaydırılır).
Şekil 1:. Işık yolu Recording Bileşenleri Bileşenleri şematik, kurulum numune ve donanım kayıt belirtilmiştir. Optik parça Faraday kafesi dışında ahşap bankta oturur. Xe, ksenon ark lambası, Cd, kondansatör montaj, Lx, dışbükey lens, ND, nötr yoğunluk filtresi tekerleği, Cf, parazit filtresi, S, deklanşör, Lc, içbükey lens, Co kolimatör ışın probu, Fo, fiber optik kablo. Faraday kafesi otururNumunenin etrafında ahşap tezgah. ahşap bank üzerinde oturur ama altında vibrationally izole mermer tablo dokunmaz. (Rc) kaydedilmesi ve referans (Rf) elektrotlar headstage (SS) bağlıdırlar. Re göz (E) sokulur ve Rf vücudun başka bir sokulur. Headstage Faraday kafesi dışında Pre amplifikatör (Pa) kurulum parçasıdır. Sinyal Humbug gürültü düşürücü (Hb) ile preamplifikatör geçti ve osiloskop (Os) içine almaktadır. Osiloskoptan sinyal Powerlab donanım (Plb'nin) üzerinden ve LabChart yazılım tarafından okunan dizüstü bilgisayar (CPU) geçirilir. Obtüratör osiloskopta ikinci bir kanal üzerinden iletilen bir fonksiyon jeneratörü (FG) ile kontrol edilir, ve bu sinyal daha kaydedilir olacak Ayrıca Powerlab donanımın ikinci bir kanal üzerinden geçirilebilir.
Şekil 2:. Beyaz Işık ve Girişim Filtre Spectra düzeltme faktörlerini hesaplamak için kullanılır protokolün adım 2.5 ölçülen spektrumları beyaz ışık yanı sıra, her 41 girişim filtreleri için, 300 ila 700 nm gösterilir. Her girişim filtresi spektrumlu ışık yolu sadece bu filtre ile ölçülür. T 520 en yüksek 520 nm filtre için spektrum içinde yer alan karşılık gelir ve s, 520 filtre 520 nm pik dalga boyunda, beyaz ışığın yoğunluğuna karşılık gelir. Bu değerler, protokolde aşama 2.6 de tarif edildiği gibi (bu durumda 520 nm), her filtre için düzeltme faktörleri hesaplanmasında kullanılır.
Şekil 3:. Deneylerde kullanılan kardan Kol Select Açıklaması Kardan kolu fiber optik kablo tutan ve tam küresel dönme ve hafif kaydedilen hücreye geliş düzgün bir açı verilebilir Açısal ayarlanmasını sağlar. (A) Yukarıdan aşağı görünüm. Bir açıda yan ve (b). Sayılar tüm panellerde aynı kısmına karşılık gelmektedir. (1) alt plaka yatay düzlemde tam dairesel dönmesini sağlar. (2), dikey levha dikey düzlemde kolun tam dairesel dönme sağlar. (3) Bu silindir ucunda fiber optik kablo metal kolunu tutar ve (2) dik dairesel dönme ikinci bir dikey düzlemi sağlar. (4) fiber optik kablo tutulur in kolun ucunda yer ve ışık deney düzeneği içinde numunenin konumu yöneliktir.
Şekil 4:. Kayıt Kur Bileşenleri (A) Plastik boru örneği tutmak için kullanılır. (B) örnek ve tüp monte edildiği platform Tepegöz görünümü. Manyetik taban (1) ile bilyalı ve eklem platform (C) Yandan görünüm. Referans elektrodu platforma (2) yan tarafında bulunan tutkal ve balmumu ile birlikte hareketsiz tutulur. Referans elektrot Krokodilli sarılı ve headstage referans elektrot klip eki alan (3) sağlayan, yerinde lehimlenmiş. 20X büyütme altında (D) Elektrot ucu. Ölçek çubuğu, 25 mikron. (E) Sahne, elektrot tutucu ve mikromanipülatör kurulumu. headstage (1) ile birlikte cihaz üzerinde sabitlenirgümüş kayıt tel (2) ve Krokodilli referans elektrot (3) eklenmiş. Elektrot taşıyıcı (4), bir el mikromanipülatör sabitlenir (5) altında bir sonrası dikey hareket için bir düğme ile ayarlanabilir veya itilebilir veya elektrot tutucu yatay hareketi için çekilebilir olan. numune manyetik platformu sadece elektrot tutucu altında aşamasında (6) üzerine oturur. (F) Faraday kafesi aşağı önünde çekti ya da bir ekran ile kayıt ayarını çevreler. Alüminyum folyo üstünde lastik yastıkları ile tüm ekipman altına yerleştirilir. fiber optik kablo (1) dışında optik izden kafesin içine açar ve sahne (3) doğru Kardan kolu (2) tarafından yönetilmektedir. Kayıt aşaması ve manipülatör cihazı kurulumu altında bir mermer masa üzerinde duran bir kum kutusu (4) yerleştirilir. Diğer tüm ekipman mermer tablo temas etmez ahşap tezgah üstünde durmaktadır. kum kutusu bir delik mermer masanın üstüne otururNumune tamamen vibrationally tahta masanın üzerine ekipman izole edilir, böylece ahşap masa kesip. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5:. Kelebek Hazırlık (A) bir kelebek tüpü ve baş, kanatların içine sokulur ve anten sıcak mum ile hareketsiz kılınmaktadır. kayıtsız elektrod (1), kuru bir balmumu parçasıdır karın (2) ve bir ıslak mendil numunesi arkasına yerleştirildiğinde yerinde tutmak için kullanılan bir ağız kısımlarına sokulur. (B) baş Close-up aşağı mumlu. göz (1) mum veya enkaz net tutulur kaydedilen edilecek ve referans elektrot (2), ağız parçaları içine yerleştirilir ve yerinde tutmak için üzerine sıcak balmumu hızla erir.(C) pembe-beyaz fotoreseptör hücre tabakası görülebilir göz oyulmuş bir delik. Siyah pigment ve sarı hemolenf yoktur. (D) gözüne yerleştirilmiş bir cam kayıt elektrodun (1), ve kayıtsız elektrot ile numunenin Yanal görünümü (2) osiloskop görüldüğü gibi bir devreyi tamamlamak gerekir kafa aşamasına bağlı. Görüntülemek için tıklayınız Bu rakamın daha büyük bir versiyonu.
Şekil 6:. Örnek Recordings Ham Tepkiler Her yanıt 50 msn süre (siyah çubuklar) tek bir ışık yanıp sönmeye gelir. (A) sadece görülmelidir büyük negatif gerilim değişim örneğiBir hücre girmeden önce. (B) Temiz bir kayıt, tipik olarak en az 40 mV küçük bir arka plan gürültü ve büyük bir depolarizan tepki olmalıdır. Nedeniyle ana zirve (ok başları) sonra negatif potansiyel değişime (C) fakir bir kaydın bir örneği. (D) kötü bir kayıt bir başka örnek. dinlenme potansiyeli büyük dalgalanmalar (kırmızı bar) ve tepki (ok) genliğini belirsiz olabilir arka plan gürültüsünün büyük miktarda geçiyor.
Şekil 7:. Tepki Yoğunluklu Log-Lineer Fonksiyon Katı çevreler bu deneysel kurulum için, 0 OD 3,5'ten bir hücrenin ölçülen tepkiler göstermektedir. Işık yoğunluğu logaritmik ölçekte olduğunu. Çok yüksek yoğunluklarda cevap doymuş ve çok düşük yoğunluklarda küçük bir tepki yerine hattı boyunca sıfıra bırakarak devam etmektedir. TO Naka-Rushton denklemi 33 bu non-lineer şekil (kesikli çizgi) takılmıştır.
Şekil 8:. Spektral Duyarlılık Örnekler (A) Tek temsilci hücrenin yanıtları kaydedildi ve bağıl spektral duyarlılık hesaplandı. Bu hücrenin zirve mavi ışığa en iyisi yanıt, yani 440 nm'de olduğunu. Tek hücre veri gürültülü (380 nm'de zirve) görünebilir. Aynı göreli tepe ve şekli ile (B) hücreler birlikte ortalaması alınır ve standart hata çubukları eklenir. Burada yedi kişiden yedi mavi hücreler hücre tipi 440 nm ışığa maksimum duyarlı bu türün var olduğunu güçlü bir kanıt sağlayan ortalaması alınmıştır. (Cı) Bu proses, bulunan tüm hücre tipleri için tekrar ve birlikte çizilebilir. Böcek gözleri spektral hassasiyetleri ama tipik bir ins büyük farklılıklarEKT 370 nm, 440 nm ve 510 nm, burada gösterilen doruklarına olabilir. Bu spektral duyarlılıkları tüm gerçek veriler kullanılarak hesaplanır, ancak veri henüz bu türler için yayınlanan çünkü doruklarına kaymış, unutmayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hücre içi kayıt nedeniyle ilgili pek çok teknik adımlara ana zor bir teknik olabilir. Başarılı deneyler için birkaç önemli noktalar dikkate alınmalıdır. İlk olarak, deney gerçekleştirilmiştir edildiği bir düzgün titreşimli izole tablo önemlidir. Birçok araştırmacı, tamamen üstün titreşim yalıtımı sağlayan, tabandan masanın üzerinde ayrı hava tabloları kullanın. Bizim kurulum mikromanipülatör / elektrot tutucu / numune sahne cihazı yerleştirildiği üstüne bir sandbox, kalın bir mermer tablo içerir. Bu içi gaz veya basınçlı hava ile erişim bir sınırlama, özellikle bir hava masaya etkili ve daha uygun fiyatlı bir alternatif. Ek vibrasyon emici önlemler pasif hava süspansiyonlu, ya da masa ayakları için yastıklama elemanlarının ek gibi alınabilir (örneğin, tenis topları, bisiklet tüpleri, kalın jel pedleri açıldı). Ayrıca, deney düzeneği bir içinde olması esastırher şeyi ile Faraday kafesi uygun şekilde topraklanmış. Faraday kafesi kaydederken kolay kafes içinde çalışırken ayrılmış ve ikame edilmiş olabilir önünde bir metal elek olmalıdır. Ortam elektriksel gürültü (ana AC güç kaynağından, özellikle 50 Hz gürültü) bile küçük bir miktar aksi takdirde iyi bir kayıt kullanılamaz hale getirebilir.
ommatidia çevreleyen örnek, hemolimf ve pigment katmanları hazırlarken başarılı kayıtları önleyebilir. kornea delik çok büyük kesilirse, vücutta hemolimf normal pompalama kararsız bir kayıt elde kesme sahasında yukarı ve aşağı hareket sıvı yüzeyi neden olur. delik kesilir sonra, hemolimf ve yüzey pigment katmanları vazelin ile mühürlü bile aşılmaz bir uyuz içine hızla pıhtısı olacak, bu nedenle en kısa sürede göz içine elektrot almak önemlidir. Ringer çözeltisi yerine de vazelin kullanılabilir. toprak elektrotu sokulabilirağız ya da bir kesim anten güdük içine.
Ayrıca, o kadar koyu adapte mümkün olduğunca hayvan tutmak için genellikle yararlıdır. Bu yöntem için, adımlar Faraday kafesi, kısa süreli uyaran yanıp söner (30-50 msn) ve yanıp söner (0.5 veya üstü) arasında yeterince düşük frekans girmesini Xenon lambası gelen kaçak ışığı bloke çok koyu kayıt odası tutmak içerir. Görsel pigmenti bir foton absorbe zaman rodopsin kromofor Tüm -3-hydroxyretinal 11 cis geçer - trans opsin proteininin konformasyonel değişikliği uyarılması ve G proteini başlatır Metarodopsin olarak tüm karmaşık, aktivasyon, -retinal Çağlayan. yüksek yoğunluklu ışık fiziksel opsin proteinden ayırmak için kromofor neden olduğunda foto-ağartma oluşur. dışarı düşmeden önce elektrot sadece stabil bir zaman belirli bir süre için hücre içinde gelen yanıtları kaydeder, çünkü Zaman bu deneyde bir sınırlayıcı faktörveya membran hasar görmüştür. Bu nedenle biz hücre kurtarmak için izin kırmak yok, ama biz zamanla hücrenin yanıtı aşağılamak değil bulduk flash kullanım süresi ve sıklığına yapmak. Foto-ağartıcı oluşursa iki ışık sıklığını ve şiddetini azaltmak için çok önemlidir.
membran nüfuz zaman kayıt sırasında elektrot tarafından büyük bir elektrot ucu veya büyük bir hareket hücreye zarar verebilir. Sadece iyi ipuçları kayıt için bir hücre yaklaşırken (en az ~ 100 MQ) ve küçük hareketler kullanılmalıdır. Hücre içi kayıt beyin kayıtları gibi diğer uygulamalar, uygulanırsa, son derece ince, sağlam bir elektrot kuvars camı kullanılarak çekilebilir, ancak özel bir çekici, bu elektrotlar için kullanılmalıdır. İlk programı çekerek bir elektrot yaparken, biz, elektrot dolgu sahte kurulumunda elektrot tutucu bunu güvence ve tuzlu su çözeltisi içinde ucu ve toprak elektrot yerleştirerek uç direnci kontrol etti. Next biz osiloskop gerilimdeki değişimi ölçmek için bir akım uyguladı. iki eksende hareket eden bir manuel mikromanipülatör kullanın elektrot ucu taşımak için. Diğer manipülatörler her üç eksen boyunca harekete izin ve bunlar bu veya daha karmaşık uygulamalar için kullanılabilecek dijital olanlar da dahil olmak üzere mevcuttur. kayıt için bir sahne inşa etmek birçok yolu vardır, donanım ve yazılım birçok farklı türde kayıt kullanılan ve gözlenen verilerin analizi vardır. Bizim kurulum kayıt teçhizat biri, basit, kolay ve uygun fiyatlı kurulum temsil eder.
VlogI eğrisi oluştururken, fonksiyonlar Naka ve Rushton 33 ve diğerleri çizilen tepkilerin doğrusal olmayan bölümleri için 34,35 hesabı tarafından geliştirilmiştir. Çeşitli yöntemler, bu eğri uyması için kullanılır ve başka yöntemler de uygun olmasına rağmen biz, eğri uydurma yazılımı gerektirmez böyle bir yöntemin sonucu çizilmiştir 36,37 (
yöntemin bir sınırlama çalışması organizmanın göz birden fazla genetik olarak benzer opsin ifade, mRNA'nın olası fotoreseptör hücre hangi spektral sınıfına karşılık gelen opsin tespit etmek zor olabilir. Bu sorunun üstesinden gelmek için, bu yöntem, boya enjeksiyonu ile in situ melezleme ya da başarılı opsins belirlemek için immünohistokimya kombine edilmiştir kaydedilen hücreler 10 olarak ifade.
Bizim yöntem basit ve görsel elektrofizyoloji ile yabancı araştırmacılar için erişilebilir. Bu teknik nörobilim yaygın, ancak belirli ve net yöntemler üretmek için bu yöntem zorlaştırır, literatürde mevcut değildir. Bu tekniğin birçok varyasyonu bulunmasına rağmen, biz bileşik göz spektral duyarlılığını ölçmek için basit bir yol sunar. Fizyolojik veriler görsel ekoloji ve evrim 41 hikayeleri delillerin önemli bir parçasıdır. Opsin dizi varyasyon fenotipik değişim için genetik temelini inceleyen çalışmalar için bu yöntem idealdir, bir fotoreseptör hücre hassasiyet ile yakından bağlantılıdır. Fotoreseptör hücre hassasiyetleri ölçümü de renk görme 42-46 önemli ayrımcılık eşikleri için fizyolojik temellerini gösteren davranışsal renk ayrımcılık deneyleri ile eşleştirilmiş olabilir. Örneğin Drosophila genetik ya da terapötik müdahaleler, bu Technique göz veya beyin de 47,48 düzgün fizyolojik fonksiyonu ölçmek için iyi bir yol olabilir. bizimki birinci ya da gözünde hücre içi kayıt en karmaşık yöntem olmamasına rağmen, bizim umudumuz, biz resmi nörobilim dışında araştırma programlarına üreme ve entegrasyon için daha kolay bu yöntem kullanılabilir hale olmasıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.
Acknowledgments
Biz teşvik için, bize ekipman kredi için kardan kol çevresini, Kimberly Jamison, Matthew McHenry ve Raju Metherate imalatı için geç Rudy Limburg teşekkür ve Almut Kelber ve Kentaro Arikawa. Bu çalışma ADB için bir Ulusal Bilim Vakfı (NSF) Bilimsel Araştırma KJM için Bursu ve NSF hibe IOS-1257627 tarafından desteklenen
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Butterfly pupae | Several local species available, need USDA permits for shipping. Carolina Bio Supply has several insect species that may be ordered within the U.S. without the need for additional permits | ||
| Large plastic cylinder | Any chamber that remains humidified will work | ||
| Insect pins, size 2 | BioQuip | 1208B2 | |
| 100% Desert Mesquite Honey | Trader Joe's | Any honey or sucrose solution will work | |
| Xenon Arc Lamp | Oriel Instruments | 66003 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
| Universal Power Supply | Oriel Instruments | 68805 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
| Optical Track | Oriel Instruments | 11190 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
| Rail Carrier, Large (2x) | Oriel Instruments | 11641 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
| Rail Carrier, Small (4x) | Oriel Instruments | 11647 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
| Thread Adaptor, 8-32 Male to 1/4-20 Male, pack of 10 | Newport Corporation | TA-8Q20-10 | |
| Optical Mounting Post, 1.0 in., 0.5 in. Dia. Stainless, 8-32 & 1/4-20 (5x) | Newport Corporation | SP-1 | |
| No Slip Optical Post Holder, 2 in., 0.5 in. Diameter Posts, 1/4-20 (5x) | Newport Corporation | VPH-2 | |
| Fixed lens mount, 50.8 mm | Newport Corporation | LH-2 | |
| Fixed lens mount, 25.4 mm | Newport Corporation | LH-1 | |
| Condenser lens assembly | Newport Corporation | 60006 | |
| Convex silica lens, 50.8 mm | Newport Corporation | SPX055 | |
| Six Position Filter Wheel, x2 | Newport Corporation | FW1X6 | |
| Filter Wheel Mount Hub | Newport Corporation | FWM | |
| Concave silica lens, 25.4 mm | Newport Corporation | SPC034 | |
| Collimator holder | Newport Corporation | 77612 | |
| Collimating beam probe | Newport Corporation | 77644 | |
| Ferrule Converter, SMA Termination to 11 mm Standard Ferrule | Newport Corporation | 77670 | This adapter allows the fiber optic to fit into the collimator holder |
| 600 μm diameter UV-vis fiber obtic cable | Oriel Instruments | 78367 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
| Shutter with drive unit | Uniblitz | 100-2B | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.1 OD | Newport | FRQ-ND01 | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.3 OD | Newport | FRQ-ND03 | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.5 OD | Newport | FRQ-ND05 | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 1.0 OD | Newport | FRQ-ND10 | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 2.0 OD | Newport | FRQ-ND30 | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 3.0 OD | Newport | FRQ-ND50 | |
| LS-1-Cal lamp | Ocean Optics | LS-1-Cal | |
| Spectrometer | Ocean Optics | USB-2000 | |
| SpectraSuite Software | Ocean Optics | ||
| Interference bandpass filter, 300 nm | Edmund Optics | 67749 | |
| Interference bandpass filter, 310 nm | Edmund Optics | 67752 | |
| Interference bandpass filter, 320 nm | Edmund Optics | 67754 | |
| Interference bandpass filter, 330 nm | Edmund Optics | 67756 | |
| Interference bandpass filter, 340 nm | Edmund Optics | 65614 | |
| Interference bandpass filter, 350 nm | Edmund Optics | 67757 | |
| Interference bandpass filter, 360 nm | Edmund Optics | 67760 | |
| Interference bandpass filter, 370 nm | Edmund Optics | 67761 | |
| Interference bandpass filter, 380 nm | Edmund Optics | 67762 | |
| Interference bandpass filter, 390 nm | Edmund Optics | 67763 | |
| Interference bandpass filter, 400 nm | Edmund Optics | 65732 | |
| Interference bandpass filter, 410 nm | Edmund Optics | 65619 | |
| Interference bandpass filter, 420 nm | Edmund Optics | 65621 | |
| Interference bandpass filter, 430 nm | Edmund Optics | 65622 | |
| Interference bandpass filter, 440 nm | Edmund Optics | 67764 | |
| Interference bandpass filter, 450 nm | Edmund Optics | 65625 | |
| Interference bandpass filter, 460 nm | Edmund Optics | 67765 | |
| Interference bandpass filter, 470 nm | Edmund Optics | 65629 | |
| Interference bandpass filter, 480 nm | Edmund Optics | 65630 | |
| Interference bandpass filter, 492 nm | Edmund Optics | 65633 | |
| Interference bandpass filter, 500 nm | Edmund Optics | 65634 | |
| Interference bandpass filter, 510 nm | Edmund Optics | 65637 | |
| Interference bandpass filter, 520 nm | Edmund Optics | 65639 | |
| Interference bandpass filter, 532 nm | Edmund Optics | 65640 | |
| Interference bandpass filter, 540 nm | Edmund Optics | 65642 | |
| Interference bandpass filter, 550 nm | Edmund Optics | 65644 | |
| Interference bandpass filter, 560 nm | Edmund Optics | 67766 | |
| Interference bandpass filter, 570 nm | Edmund Optics | 67767 | |
| Interference bandpass filter, 580 nm | Edmund Optics | 65646 | |
| Interference bandpass filter, 589 nm | Edmund Optics | 65647 | |
| Interference bandpass filter, 600 nm | Edmund Optics | 65648 | |
| Interference bandpass filter, 610 nm | Edmund Optics | 65649 | |
| Interference bandpass filter, 620 nm | Edmund Optics | 65650 | |
| Interference bandpass filter, 632 nm | Edmund Optics | 65651 | |
| Interference bandpass filter, 640 nm | Edmund Optics | 65653 | |
| Interference bandpass filter, 650 nm | Edmund Optics | 65655 | |
| Interference bandpass filter, 660 nm | Edmund Optics | 67769 | |
| Interference bandpass filter, 671 nm | Edmund Optics | 65657 | |
| Interference bandpass filter, 680 nm | Edmund Optics | 67770 | |
| Interference bandpass filter, 690 nm | Edmund Optics | 65659 | |
| Interference bandpass filter, 700 nm | Edmund Optics | 67771 | |
| Faraday cage | Any metal structure will work that can be grounded and that fits the experimental setup. | ||
| Stereomicroscope, 6X, 12X, 25X, 50X magnification | Wild Heerbrugg | Wild M5 | Any Stereomicroscope will do |
| Microscope stand with swinging arm and heavy base | McBain Instruments | Any heavy base with arm will do | |
| Cardan arm | Custom built, See Figure 4 | ||
| Fiber-lite high intensity illuminator | Dolan-Jenner | MI-150 | For lighting specimen |
| Fiber-lite goose-neck light guide | Dolan-Jenner | EEG 2823 | Any goose-neck light guide will do |
| Marble table | |||
| Raised wooden table | Hole should be cut through this table so that the sandbox can rest on the marble table underneath | ||
| Wooden box filled with sand | custom built, any box with sand | ||
| Manipulator | Carl Zeiss - Jena | ||
| Electrode holder | |||
| Specimen stage | |||
| Alligator clip wires for grounding | |||
| Insulated copper wire | |||
| Silver wire, 0.125 mm diameter | World Precision Instruments | AGW0510 | |
| BNC cables | |||
| Preamplifier with headstage | Dagan Corporation | IX2-700 | |
| Humbug Noise reducer | Quest Scientific | Humbug | |
| Oscilloscope, 30 MHz, 2 CH, Dual Trace, Alt-triggering, without probe | EZ Digital | os-5030 | |
| BNC T-adapter | |||
| Powerlab hardware 2/20 | ADI instruments | ML820 | |
| Labchart software | ADI instruments | Chart 5 | |
| 10 MHz Pulse Generator | BK Precision | 4030 | |
| Glass pipette puller | Sutter Instruments | P-87 | |
| Borosillicate glass capillaries with filament | World Precision Instruments | 1B120F-4 | |
| Potassium chloride, 3 M | |||
| Slotted plastic tube | |||
| Low melting temperature wax | |||
| Soldering Iron | Weller | ||
| Platform with ball-and-socket magnetic base | Hama photo and video | ||
| Double edge carbon steel, breakable razor blade | Electron Microscopy Sciences | 72004 | |
| Vaseline | |||
| Microsoft Excel | Microsoft |
References
- Beckmann, H., et al. Spectral sensitivity in Onychophora (velvet worms) revealed by electroretinograms, phototactic behaviour and opsin gene expression. J. Exp. Biol. 218, 915-922 (2015).
- Leboulle, G., et al. Characterisation of the RNA interference response against the long-wavelength receptor of the honeybee. Insect Biochem. Mol. Biol. 43, 959-969 (2013).
- Martinez-Harms, J., et al. Evidence of red sensitive photoreceptors in Pygopleurus israelitus Coleoptera) and its implications for beetle pollination in the southeast Mediterranean. J. Comp. Physiol. A. 198, 451-463 (2012).
- Knox, B. E., et al.
- Salcedo, E., Zheng, L., Phistry, M., Bagg, E. E., Britt, S. G. Molecular basis for ultraviolet vision in invertebrates. J. Neurosci. 23, 10873-10878 (2003).
- Salcedo, E., et al. Blue- and green-absorbing visual pigments of Drosophila: ectopic expression and physiological characterization of the R8 photoreceptor cell-specific Rh5 and Rh6 rhodopsins. J. Neurosci. 19, 10716-10726 (1999).
- Vilinsky, I., Johnson, K. G. Electroretinograms in Drosophila: robust and genetically accessible electrophysiological system for the undergraduate laboratory. J. Undergrad. Neurosci. Educ. 11, 149-157 (2012).
- Hu, X., Leming, M. T., Whaley, M. A., O'Tousa, J. E. Rhodopsin coexpression in UV photoreceptors of Aedes aegypti Anopheles gambiae mosquitoes. J. Exp. Biol. 217, 1003-1008 (2014).
- Telles, F. J., et al. Out of the blue: the spectral sensitivity of hummingbird hawkmoths. J. Comp. Physiol. A. 200, 537-546 (2014).
- Arikawa, K., Mizuno, S., Kinoshita, M., Stavenga, D. G. Coexpression of two visual pigments in a photoreceptor causes an abnormally broad spectral sensitivity in the eye of the butterfly Papilio xuthus. J. Neurosci. 23, 4527-4532 (2003).
- Arikawa, K., et al. An ultraviolet absorbing pigment causes a narrow-band violet receptor and a single-peaked green receptor in the eye of the butterfly Papilio. Vision Res. 39, 1-8 (1999).
- Cronin, T. W., Jarvilehto, M., Weckstrom, M., Lall, A. B. Tuning of photoreceptor spectral sensitivity in fireflies (Coleoptera: Lampyridae). J. Comp. Physiol. A. 186, 1-12 (2000).
- Skorupski, P., Doring, T. F., Chittka, L. Photoreceptor spectral sensitivity in island and mainland populations of the bumblebee, Bombus terrestris. J. Comp. Physiol. A. 193, 485-494 (2007).
- Stalleicken, J., Labhart, T., Mouritsen, H. Physiological characterization of the compound eye in monarch butterflies with focus on the dorsal rim area. J. Comp. Physiol. A. 192, 321-331 (2006).
- Skorupski, P., Chittka, L. Photoreceptor processing speed and input resistance changes during light adaptation correlate with spectral class in the bumblebee, Bombus impatiens. PLoS One. 6, 25989 (2011).
- Yang, E. -C., Osorio, D. Spectral sensitivities of photoreceptors and lamina monopolar cells in the dragonfly, Hemicordulia tau. J. Comp. Physiol. A. 169, (1991).
- Yang, E. C., Lin, H. C., Hung, Y. S. Patterns of chromatic information processing in the lobula of the honeybee, Apis mellifera L. J. Insect Physiol. 50, 913-925 (2004).
- Rosner, R., Homberg, U. Widespread sensitivity to looming stimuli and small moving objects in the central complex of an insect brain. J. Neurosci. 33, 8122-8133 (2013).
- Trager, U., Homberg, U. Polarization-sensitive descending neurons in the locust: connecting the brain to thoracic ganglia. J. Neurosci. 31, 2238-2247 (2011).
- Heinze, S., Reppert, S. M. Sun compass integration of skylight cues in migratory monarch butterflies. Neuron. 69, 345-358 (2011).
- Greiner, B., Cronin, T. W., Ribi, W. A., Wcislo, W. T., Warrant, E. J. Anatomical and physiological evidence for polarisation vision in the nocturnal bee Megalopta genalis. J. Comp. Physiol. A. 193, 591-600 (2007).
- Stowasser, A., Buschbeck, E. K. Electrophysiological evidence for polarization sensitivity in the camera-type eyes of the aquatic predacious insect larva Thermonectus marmoratus. J. Exp. Biol. 215, 3577-3586 (2012).
- Osorio, D. Directionally selective cells in the locust medulla. J. Comp. Physiol. A. 159, 841-847 (1986).
- Nordström, K., Barnett, P. D., Moyer de Miguel, I. M., Brinkworth, R. S., O'Carroll, D. C. Sexual dimorphism in the hoverfly motion vision pathway. Curr. Biol. 18, 661-667 (2008).
- Plachetzki, D. C., Fong, C. R., Oakley, T. H. The evolution of phototransduction from an ancestral cyclic nucleotide gated pathway. Proc. Biol. Sci. 277, 1963-1969 (2010).
- Feuda, R., Hamilton, S. C., McInerney, J. O., Pisani, D. Metazoan opsin evolution reveals a simple route to animal vision. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 18868-18872 (2012).
- Palczewski, K., et al. Crystal structure of rhodopsin: A G protein-coupled receptor. Science. 289, 739-745 (2000).
- Hardie, R. C., Raghu, P.
- Katti, C., et al. Opsin co-expression in Limulus differential regulation by light and a circadian clock. J. Exp. Biol. 213, 2589-2601 (2010).
- Smith, W. C., Price, D. A., Greenberg, R. M., Battelle, B. A. Opsins from the lateral eyes and ocelli of the horseshoe crab, Limulus polyphemus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 6150-6154 (1993).
- Sison-Mangus, M. P., Bernard, G. D., Lampel, J., Briscoe, A. D. Beauty in the eye of the beholder: the two blue opsins of lycaenid butterflies and the opsin gene-driven evolution of sexually dimorphic eyes. J. Exp. Biol. 209, 3079-3090 (2006).
- Rushton, W. Review Lecture. Pigments and signals in colour vision. J. Physiol. 220, 1-31 (1972).
- Naka, K. I., Rushton, W. A. S-potentials from luminosity units in the retina of fish (Cyprinidae). J. Physiol. 185, 587-599 (1966).
- Lipetz, L. E. Handbook of Sensory Physiology. Vol. 1. Principles of Receptor Physiology. Loewenstein, W. R. 1, Springer. Berlin Heidelberg. Ch. 6 191-225 (1971).
- Matić, T., Laughlin, S. B. Changes in the intensity-response function of an insect's photoreceptors due to light adaptation. J. Comp. Physiol. A. 145, 169-177 (1981).
- Evans, L. S., Peachey, N. S., Marchese, A. L. Comparison of three methods of estimating the parameters of the Naka-Rushton equation. Documenta Ophthalmologica. 84, 19-30 (1993).
- Aylward, G. W. A simple method of fitting the Naka-Rushton equation. Clinical Vision Sciences. 4, 275-277 (1989).
- Stavenga, D. G., Smits, R. P., Hoenders, B. J. Simple exponential functions describing the absorbance bands of visual pigment spectra. Vision Res. 33, 1011-1017 (1993).
- Bernard, G. D.
- Ogawa, Y., et al. Coexpression of three middle wavelength-absorbing visual pigments in sexually dimorphic photoreceptors of the butterfly Colias erate. J. Comp. Physiol. A. 198, 857-867 (2012).
- Briscoe, A. D., Chittka, L. The evolution of color vision in insects. Annu. Rev. Entomol. 46, 471-510 (2001).
- Kelber, A., Thunell, C., Arikawa, K. Polarisation-dependent colour vision in Papilio butterflies. J. Exp. Biol. 204, 2469-2480 (2001).
- Kelber, A., Balkenius, A., Warrant, E. J. Scotopic colour vision in nocturnal hawkmoths. Nature. 419, 922-925 (2002).
- Koshitaka, H., Kinoshita, M., Vorobyev, M., Arikawa, K. Tetrachromacy in a butterfly that has eight varieties of spectral receptors. Proc. Biol. Sci. 275, 947-954 (2008).
- Blackiston, D., Briscoe, A. D., Weiss, M. R. Color vision and learning in the monarch butterfly, Danaus plexippus (Nymphalidae). J. Exp. Biol. 214, 509-520 (2011).
- Sison-Mangus, M. P., Briscoe, A. D., Zaccardi, G., Knuttel, H., Kelber, A. The lycaenid butterfly Polyommatus icarus uses a duplicated blue opsin to see green. J. Exp. Biol. 211, 361-369 (2008).
- Schneuwly, S., et al. Drosophilia ninaA gene encodes an eye-specific cyclophilin (cyclosporine A binding protein). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (1989).
- Luan, Z., Reddig, K., Li, H. S. Loss of Na(+)/K(+)-ATPase in Drosophila leads to blindness and age-dependent neurodegeneration. Exp. Neurol. 261, 791-801 (2014).
