Abstract
Dieser Bericht stellt zwei Methoden für die kovalente Immobilisierung von Fänger-Antikörper auf Zellulosefilterpapierqualität No. 1 (mittel-Flow-Filterpapier) Scheiben und Qualität Nr 113 (Fast-Flow-Filterpapier) Discs. Diese Cellulosepapierscheiben wurden gepfropft mit funktionellen Amingruppen durch eine Silan-Kopplungstechnik bevor die Antikörper auf ihnen immobilisiert wurden. Periodat-Oxidation und Glutaraldehyd-Vernetzungsverfahren wurden verwendet, Capture-Antikörper auf den Cellulosepapierscheiben zu pfropfen. Um die maximale Bindungskapazität der Einfang-Antikörper an ihre Ziele nach der Immobilisierung wurden die Wirkungen verschiedener Konzentrationen von Natriumperiodat, Glutaraldehyd und Capture-Antikörper auf der Oberfläche der Papierscheiben wurden, um sicherzustellen, untersucht. Die Antikörper, die an den Amin-funktionalisierte Cellulose-Papierscheiben durch eine Glutaraldehyd-Vernetzungsmittel beschichtet wurden, zeigten Bindungsaktivität an die Ziel verbessert, wenn an die Periodat-Oxidationsverfahren im Vergleich. IgG (in Maus-Referenzserum) wurde als Referenzziel in dieser Studie verwendet, um die Anwendung der kovalent immobilisierte Antikörper durch Glutaraldehyd zu testen. Eine neue Papierbasis, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) wurde für den Nachweis von IgG erfolgreich entwickelt und validiert. Dieses Verfahren erfordert keine Ausrüstung, und es kann 100 ng / ml IgG erkennen. Der Fast-Flow-Filterpapier war empfindlicher als die mittlere Stromfilterpapier. Die Inkubationszeit dieses Tests war kurz und benötigt kleine Probenvolumina. Diese mit bloßem Auge kann colorimetrischen Immunoassays erweitert werden, um andere Ziele zu erkennen, die mit konventionellen ELISA identifiziert werden.
Introduction
Die Point-of-Care - Tests (POCT) diagnostische Studie ist wichtig für die Entwicklung neuer Strategien für die Therapie, personalisierte Medizin und Pflege zu Hause 1. Cellulose Papiere werden als Plattformen in Immunoassays weit verbreitet, da sie billig sind, zugänglich, und den Nutzern vertraut 2. Darüber hinaus besitzt die poröse Struktur von Cellulose-Papier die Leistung Flüssigkeitsstrom ohne zusätzliche Energieeinwirkung zu fahren. Aufzeichnungen von papierbasierten Bioanalytik kann bereits im 20. Jahrhundert gefunden werden, wenn das Papier Chromatographie zuerst im Jahr 1952. Die am weitesten verbreitete Beispiel ist immunchromatographischen Tests 3, wie Schwangerschaft und Diabetes erfunden wurde Teststreifen. Diese Tests liefern relativ schnelle Assayzeiten und kostengünstige Analyse 4. Aufgrund ihrer Einfachheit sind diese herkömmlichen Papierstreifentests wurden 5 in POCT Diagnostik weit verbreitet.
Nachweismethoden einschließlich farbmetrischen 6, elektro7 chemischen und Elektrochemilumineszenz 8 Methoden wurden Ziele zu messen , in biologischen Proben berichtet. Zusätzlich zu diesen quantitativen Verfahren, ein zuverlässiges Verfahren zum Nachweis von Antikörpern auf Cellulosepapier immobilisiert ist auch wichtig für die Entwicklung von Diagnostika. Unspezifische Adsorption ist die Hauptstrategie für die Antikörper auf der Oberfläche der papierbasierten Vorrichtungen 9, 10 , um sicherzustellen , maximale Bindungskapazität an ihre Ziele nach der Immobilisierung zu modifizieren. Allerdings ist eine vorherige Studie zeigten , dass Antikörper , die aus den Fasern auf Zellulosepapier adsorbiert werden , 11 um 40% desorbieren kann. Somit kann eine direkte Adsorption von Antikörpern auf Cellulose nicht reproduzierbare Ergebnisse 12 liefern. Kovalente Immobilisierung von Antikörpern, die auf den Papieroberflächen gepfropft werden , ist eine alternative Methode der Entwicklung wirksamer papierbasierten Bioassays 13. Es wurden verschiedene Verfahren zur Modifikation von Cellulose 14, 15 berichtet 12 Immobilisierung erhalten. Carbonyldiimidazol in Kombination mit 1-cyano-4-dimethylaminopyridinium Tetrafluoroborat 16; 1-Fluor-2-nitro-4-azidobenzene durch eine UV-basierte Aktivierungsstrategie 17, 18; eine chemoenzymatischen Strategie auf Xyloglucan Modifikation 19 basiert; eine 1,4-Phenylendiisothiocyanat Verknüpfungsmittel 20; Heteropolysaccharid Oxidation 21 Klick - Chemie 22; und kationische Porphyrine 23 verwendet wurden , um kovalent Biomoleküle auf Cellulosepapier zu immobilisieren. Chitosan modifizierte Papier wurde verwendet , um auf Papierbasis immunodevices 24-26 entwickeln , da es reichlich und biokompatibel ist 27. Chitosan ist kationisch und haftet stark an anionischen Cellulose 27. Die Capture-Antikörper sind auf dem Papier durch Beschichtung Chitosan und Glutaraldehyd Vernetzung immobilisiert. Periodat-Oxidation ist eine weitere Methode, um die capt zum Pfropfenure Antikörper auf der Zellulosepapier 28. In diesem Verfahren wird Natriumperiodat auf dem Papier getüpfelt 1,2-dihydroxyl (Glykol) Gruppen in Cellulose zu Aldehydgruppen direkt zu konvertieren. Die Aldehydgruppen werden dann verwendet , 28 kovalenten Bindungen zwischen Polysacchariden und Antikörper zu bilden. Obwohl die Herstellung einfach ist, ist es schwierig, Natriumperiodat vollständig auszuwaschen. Das ungewaschene Natriumperiodat kann eine weitere Oxidation der Antikörper führen, die auf dem Cellulosepapier immobilisiert sind, die Aktivität und die Stabilität der Antikörper beeinflussen N -. (3-dimethylaminopropyl) - N -ethylcarbodiimide Hydrochlorid und N - Hydroxysuccinimid Vernetzer werden auch verwendet , um kovalent Antikörper auf elektrogesponnen poly-L-Milchsäure und Celluloseacetat - Nanofasern für die Entwicklung von Nanofaser basierenden Tests 29 zu immobilisieren.
In dieser Studie wurde ein Silan-Kupplungstechnik verwendet funktionelle Amingruppen auf cellulos aufzupfropfene Papierscheiben. Diese Technik hilft, die ursprüngliche Porengröße, Feuchtigkeitsregulierung, und Filtrationsrate der Zellulosefilterpapiere, so dass maximale vertikale Durchströmung in Immunoassays zu behalten. Das Silan-Kopplungstechnik wurde in Biosensoren zu funktionalisieren Substratoberflächen mit sekundären Amingruppen, gefolgt von einer weiteren Modifikation unter Verwendung von Biomolekülen verwendet. Das Pfropfen von Amingruppen auf der Matrixoberfläche umfaßt eine Kondensationsreaktion zwischen OH - Gruppen des organofunktionellen Silans Mittel und Matrixsubstrat 30. Die Cellulosepapierscheiben wurden durch 3-Aminopropyltrimethoxysilan (APS) 31 mit Amingruppen durch Silan - Kupplungs funktionalisiert. Dies wurde durch kovalente Immobilisieren Fänger-Antikörper, gefolgt mit zwei verschiedenen Methoden. Das erste Verfahren beteiligt Bindung von Periodat oxidierten Fänger-Antikörper an die Amincellulosepapierscheiben funktionalisiert. Das zweite Verfahren verwendet Glutaraldehyd als Vernetzungsmittel die Erfassung Antibodi anhängenes zu den Amingruppen funktionalisierten Zellulosepapierscheiben. Die Anwesenheit von Capture-Antikörper wurde von Kaninchen-anti-human IgG-Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) bestätigt wird, eine Fluoreszenz Molecular Imager verwendet. Die Bindungsaktivität von Kaninchen-anti-human-IgG-FITC an Ziege-IgG-Anti-Kaninchen wurde auch von Peroxidase-Substrat ausgewertet. Die Wirkungen verschiedener Konzentrationen von Natriumperiodat, Glutaraldehyd und Einfang-Antikörper untersucht. Anwendungstest der immobilisierten Einfang-Antikörper wurde erfolgreich durch den Nachweis von IgG-Serum durchgeführt.
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Protocol
1. Verpflanzen funktionellen Amingruppen auf Cellulose Papierscheiben
- Bereiten Sie ein Stück Quadrat Papier mit einer Abmessung von 1 cm × 1 cm und 100 Papierscheiben aus Qualität Nr 1 Zellulosepapier mit einem Durchmesser von 6,0 mm (mittel-Flow-Filterpapier) mit einem Lochdurchschlag.
- Zur Ableitung NH2 - Gruppen auf den Papierscheiben, mischen Sie 1 ml APS und 10 ml Aceton in einem 50 ml - Glasflasche in der Abzugshaube. In Papierscheiben mit dem frisch APS Reagenz - Mischung hergestellt, und Inkubation für 5 Stunden mit Orbital Rühren (200 UpM) bei Raumtemperatur 32.
Vorsicht: Behandeln Sie APS und Aceton in der Abzugshaube. - Dekantieren überschüssige Lösung aus dem 50-ml-Glasflasche in einem organischen Abfallbehälter.
- In 10 ml Aceton zu der Glasflasche, gut mischen und dekantieren vollständig alle nicht umgesetzten APS und andere Verunreinigungen zu entfernen. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal.
- Verbreiten Sie die Papierscheiben auf dem Papiertuch und in einem 110 ° C heißen Ofen für 3 Stunden. Lassen Sie diePapierscheiben zu kühlen. Speichern der Scheiben in einer 50 ml-Zentrifugenröhrchen bei Raumtemperatur.
- Verwenden Sie Fourier - Transformations - Infrarot - Spektroskopie (FTIR) das Pfropfen von Amingruppen auf der Cellulose - Quadrat Papier zu überprüfen, wie weiter unten (3A) beschrieben.
- Schalten Sie den Computer und öffnen Sie die FTIR-Spektroskopie Instrument.
- Öffnen Sie die Software für FTIR-Spektroskopie.
- Gehen Sie zu 'Messung → Initialisieren ". Die Rechtecke für 'BS: KBr', 'Lampe: Infrarot "und" Laser "wird grün, wenn die Initialisierung abgeschlossen ist.
- Wählen Sie "Daten" unter den Rechtecke, und wählen Sie "% Transmission", "Happ-Genzel ',' 45 ',' 4.0 'und' Min: 400, Max: 4000" für "Messmodus", "Apodization ',' Nein. von Scans "," Auflösung "und" Range (cm-1) '.
- Klicken Sie auf "Messen".
- Wählen Sie "Datendatei" für die Hintergrunddaten. Schreibenunten die Kommentare.
- Klicken Sie auf "BKG", um die Basis für den Hintergrund zu erhalten.
- Befestigen Sie das Quadrat Papier auf dem Filmprobenhalter.
- Wählen Sie "Datendatei" für die Beispieldaten. Schreiben Sie die Kommentare unten.
- Klicken Sie auf "Probe", um die Spektren für die Probe zu erhalten.
- Schließen Sie die FTIR-Spektroskopie Anwendung und schalten Sie den Computer aus.
- Wiederholen Sie die Schritte (Schritte 1.1 bis 1.6) Amin-funktionalisierte Qualität Nr 113 Cellulose - Quadrat Papier und Scheiben (Fast-Flow - Filterpapier), die Vorbereitung und die FTIR - Spektren für die Qualität Nr 113 Quadrat Papier (3B) erhalten.
2. Kovalente Immobilisierung von Antikörpern auf Amin-funktionalisierte Cellulose Papierscheiben
Abbildung 1. Kovalente Immobilisierung von Antikörpern durch zwei verschiedene Methoden.A. Immobilisiert Antikörper auf Amin-funktionalisierten Zellulosepapierscheiben durch Periodat - Oxidation. Die Kohlenhydratreste wurden durch Natriumperiodat oxidiert, um Aldehydfunktionen erzeugen. Dann wurden die oxidierten Antikörpern beladen auf Amin-funktionalisierten Zellulosepapierscheiben. B. Die Antikörper wurden dann auf Amin-funktionalisierten Zellulosepapierscheiben durch Glutaraldehyd immobilisiert. Die Amin-funktionalisierten Zellulosepapierscheiben wurden in 0,05% Glutaraldehyd-Lösung getaucht, um Aldehydgruppen zu den Papierscheiben einzuführen. Nach dem Waschen wurden auf den Aldehyd funktionalisiert Papierscheiben geladen Antikörper. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
- Immobilisieren Antikörper auf Amin-funktionalisierte Cellulose - Papierscheiben durch Periodat - Oxidation (1A).
- Mischen Sie 1 ul 2,5 mM Natrium periodate mit 2 ul 0,1 mg / ml Kaninchen-anti-human-IgG-FITC und 7 & mgr; l 100 mM pH 5,5 Acetatpuffer in einem 1,5-ml-Röhrchen, und die Mischung im Dunkeln für 30 min inkubieren.
HINWEIS: Dieses Volumenverhältnis mehr oxidierter Antikörper bei Bedarf herzustellen. Verändern des Volumenverhältnisses der Konzentration von Natriumperiodat und Kaninchen-anti-human-IgG-FITC zu optimieren. - Verdünne die obigen Antikörperlösung mit 30 ul 50 mM Phosphatpuffersalzlösung (PBS; pH 7,4) auf ein Endvolumen von 40 & mgr; l.
- Bereiten Sie drei Amin-funktionalisierte Medium-Flow Filterpapierscheiben und drei Amin-funktionalisierte Fast-Flow Papierscheiben (wie in Abschnitt 1 beschrieben).
- Last 5 ul des Natriumperiodat oxidiert Kaninchen-anti-human-IgG-FITC auf jedes Medium Stromfilterpapierscheibe und 8 & mgr; l auf jeden schnellen Stromfilterpapierscheibe. Bewahren Sie diese Papierscheiben im Dunkeln für eine Stunde bei Raumtemperatur.
- Waschen jeder der Papierscheibe mit 0,2 ml Wasch Schwabbelscheibeer (50 mM Tris-Puffer mit 0,15 M NaCl und 0,05% Tensid, pH 7,4). Wiederholen Sie die Wäsche dreimal.
- Fotografieren die Fluoreszenzbilder durch ein Fluoreszenz Molecular Imager 32 , um die Anwesenheit von Antikörpern auf jedem Cellulosepapierscheibe zu identifizieren. Verwenden Sie leere Papierscheiben (mit der gleichen Konzentration von Antikörpern in Abwesenheit von Natriumperiodat behandelt) als Kontrolle (Abbildung S1 S3 Abbildung).
HINWEIS: Für experimentelle Optimierung, um die Konzentration von einem Parameter zu ändern, die optimiert werden muss, und die Konzentrationen aller anderen Parameter fixieren. Eine hohe Fluoreszenzintensität erhöht die Menge an Fänger-Antikörper, der auf den Cellulosepapierscheiben immobilisiert sind.
- Mischen Sie 1 ul 2,5 mM Natrium periodate mit 2 ul 0,1 mg / ml Kaninchen-anti-human-IgG-FITC und 7 & mgr; l 100 mM pH 5,5 Acetatpuffer in einem 1,5-ml-Röhrchen, und die Mischung im Dunkeln für 30 min inkubieren.
- Unbeweglichkeitseffekt Antikörper auf Amin funktionalisierten Zellulosepapierscheiben durch Glutaraldehyd (1B).
- Fügen Sie die drei APS behandelte Medium-Flow-Filterpapierscheiben und die drei schnellen Stromfilterpapierscheiben (described in Abschnitt 1) zu 2 ml 50 mM PBS (pH 7,4), die 0,05% Glutaraldehyd für 1 h enthält, mit orbital Rühren bei Raumtemperatur.
Vorsicht: Behandeln Sie Glutaraldehyd in der Abzugshaube. - Legen Sie drei Scheiben jeweils in zwei 1,5 ml Zentrifugenröhrchen. 1 ml deionisiertem (DI) Wasser zu jedem Röhrchen und schütteln die Röhrchen für 10 Sekunden. Entfernen Sie das Wasser, indem sie mit einer Pipette abgesaugt. Wiederholen Sie zwei weitere Male nicht umgesetztem Glutaraldehyd zu entfernen.
- Last 5 ul von 25 ug / ml Kaninchen-anti-human-IgG-FITC (Fänger-Antikörper) auf jedes Aldehyd-funktionalisierten Mittelströmungsfilterpapierscheibe, und fügen 8 ul auf jedes Aldehyd-funktionalisierten schnellen Stromfilterpapierscheibe. im Dunkeln inkubieren etwa 20 min bei Raumtemperatur. Dann werden 10 ul 50 mM PBS (pH 7,4) zu jeder Papierscheibe, ohne die Antikörper zu entfernen und für 40 min für die Amin Aldehydreaktion inkubieren.
- Waschen Sie die Papierscheiben mit 0,2 ml Waschpuffer auf einem Papiertuch. Wiederholen Sie diewaschen zweimal.
- Fotografieren die Fluoreszenzbilder durch ein Fluoreszenz Molecular Imager auf die Anwesenheit von Antikörpern auf jeder Zellulosepapierscheibe 33 zu überprüfen. Verwenden Sie leere Papierscheiben als Kontrolle.
HINWEIS: In 4 "0" steht für die leeren Papierscheibe , die mit der gleichen Konzentration von FITC-Antikörper in der Abwesenheit von Glutaraldehyd behandelt wurde; in 5A wurden die leere Papierscheiben mit Glutaraldehyd behandelt, aber keine FITC-Antikörper wurden auf die Papierscheiben geladen.
- Fügen Sie die drei APS behandelte Medium-Flow-Filterpapierscheiben und die drei schnellen Stromfilterpapierscheiben (described in Abschnitt 1) zu 2 ml 50 mM PBS (pH 7,4), die 0,05% Glutaraldehyd für 1 h enthält, mit orbital Rühren bei Raumtemperatur.
- Trocknen Sie die Papierscheiben (aus den Abschnitten 2.1 und 2.2) bei 37 ° C für 10 min.
- Blockieren die Papierscheiben mit 15 & mgr; l Blockierungspuffer (10% Magermilchpulver in 50 mM Tris-Puffer, pH 7,4, mit 0,15 M NaCl) für 10 min bei Raumtemperatur.
- Last 5 ul und 8 ul Peroxidase-konjugiertes Ziege-anti-Kaninchen-IgG in PBS (1: 10.000) auf Mittelströmung und schnelle Stromfilterpapierscheiben, respectively. inkubieren30 min im Dunkeln bei Raumtemperatur.
- Waschen Sie die Papierscheiben mit 0,2 ml Waschpuffer auf einem Papiertuch. Wiederholen Sie die Wäsche dreimal.
HINWEIS: Es ist nicht notwendig, die Waschpuffer, da die Ergebnisse durch den Puffer betroffen sind nicht zu entfernen. - Legen Sie eine 10 ul Gemisch aus 3,3 ', 5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB) und Wasserstoffperoxid-Lösung auf jeder Scheibe.
- Nehmen Sie Bilder der Papierscheiben mit einer Digitalkamera oder Smartphone nach 5 min Inkubation.
HINWEIS: In 5B, "0" steht für die Papierscheiben , die mit Glutaraldehyd behandelt wurden, gefolgt durch Laden Antikörper-HRP (Meerrettichperoxidase) Konjugat in Abwesenheit von FITC-Antikörper.
3. Papier-basierten ELISA für IgG-Nachweis
Abbildung 2. Schematische Darstellung der Papier-basierten ELISA for IgG - Nachweis. Fänger - Antikörper wurden auf den Aldehyd-funktionalisierten Zellulosepapierscheiben durch Glutaraldehyd kovalent immobilisiert. Die Cellulosepapierscheiben wurden mit Blockierungspuffer blockiert. Target IgG wurde dann zu den Scheiben gegeben, gefolgt von der Beladung von HRP-konjugiertem Antikörper Signal. Schließlich wurde das TMB und Wasserstoffperoxid - Mischung Lösung auf jede Papierscheibe für die Farbanzeige geladen. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
- 5 ml 0,05% Glutaraldehyd-Lösung (hergestellt in 50 mM PBS-Puffer, pH 7,4) auf eine 20 ml Glasflasche. Tauchen 15 aminfunktionalisierten Medium Stromfilterpapierscheiben in dieser Lösung und halten für 1 h mit Schütteln bei Raumtemperatur.
- Gleichzeitig wiederholen Sie Schritt 3,1 bis 15 weitere Aldehyd funktionalisiert schnell Stromfilterpapierscheiben herzustellen.
Vorsicht: Behandeln Sie Glutaraldehyd im RauchHaube.
- Gleichzeitig wiederholen Sie Schritt 3,1 bis 15 weitere Aldehyd funktionalisiert schnell Stromfilterpapierscheiben herzustellen.
- Zur Entfernung von nicht umgesetztem Glutaraldehyd aus den Papierscheiben, legen Sie die 15-Medium-Flow-Filterpapierscheiben in einem 15 ml Zentrifugenröhrchen, und die 15 schnellen Stromfilterpapierscheiben in einem anderen 15 ml Zentrifugenröhrchen. 5 ml DI-Wasser zu jedem Röhrchen und schütteln die Röhrchen für 10 Sekunden. Entfernen Sie das Wasser, indem sie mit einer Pipette abgesaugt. Wiederholen Sie zweimal nicht umgesetztes Glutaraldehyd zu entfernen.
- Trocknen Sie die Papierscheiben in einem 37 ° C-Ofen.
- Werden 5 ul und 8 ul 0,025 mg / ml Maus-IgG-Fc-Fragment, Antikörper gegen jede der Mittelströmung und schnellen Stromfilterpapierscheiben bzw. und für 20 min inkubieren.
- Zugabe von 10 ul 50 mM PBS (pH 7,4) zu jeder Papierscheibe, ohne die Antikörper zu entfernen und Inkubation für 40 min für die Amin Aldehydreaktion.
- Waschen Sie die Papierscheiben mit 0,2 ml Waschpuffer auf einem Papiertuch. Wiederholen Sie die Wäsche dreimal.
- Trocknen Sie die Papierscheiben in einem Ofen bei 37 ° C.
- Blockieren Sie die Papierscheiben with 15 ul Puffer für 10 min bei Raumtemperatur blockiert.
- Waschen Sie jeden Papierscheibe mit 0,2 ml Waschpuffer auf einem Papiertuch. Wiederholen Sie die Wäsche dreimal.
- Führen Sie IgG-Standards.
- Last 10 ul verschiedener IgG - Konzentrationen (beispielsweise 0, 10, 125, 250 und 500 ng / ml in PBS) auf jeder Scheibe in dreifacher Ausführung. Inkubieren für 1 h bei Raumtemperatur.
- Waschen Sie die Papierscheiben mit 0,2 ml Waschpuffer auf einem Papiertuch. Wiederholen Sie die Wäsche dreimal.
- Last 10 ul HRP konjugierten Maus-IgG-Fc-Fragment-Antikörper (1: 10.000, 10 mM PBS, pH 7,4) und bei Raumtemperatur für 1 Stunde inkubiert.
- Waschen Sie die Papierscheiben mit 0,2 ml Waschpuffer auf einem Papiertuch. Wiederholen Sie die Wäsche dreimal.
HINWEIS: Es ist nicht notwendig, die Waschpuffer, da die Ergebnisse durch die Anwesenheit von Puffer betroffen sind nicht zu entfernen. - Legen Sie eine 10 & mgr; l Mischung von TMB und Wasserstoffperoxid auf jeder Scheibe.
- Take Bilder aller Papierscheiben mit einer Digitalkamera oder Smartphone nach 5 min Inkubation.
HINWEIS: In 6A '0' steht für Papierscheiben mit Fänger - Antikörper Immobilisierung behandelt, und die Antikörper-HRP / TMB - Lösung ohne IgG - Serum. - Analysieren Sie die Intensität der einzelnen Papierscheibe im Bild durch Bild J.
- Konvertieren Sie die aufgenommenen Bilder in Schritt 3,15 bis '.tif' Format.
- Open 'Bild J' Software.
- Gehen Sie zu 'Datei → Öffnen ", wählen Sie das Bild zu analysieren.
- Wählen Sie die Form Schaltfläche "Oval".
- Gehen Sie zu 'Bild → Typ → 32 Bit ".
- Gehen Sie zu 'Bearbeiten → Invert ".
- Gehen Sie zu 'Analysieren → Messen ".
- Kopieren und die Daten in einer Tabelle zu analysieren.
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Representative Results
Abbildung 3. Fourier - Transformations - Infrarot (FTIR) Spektren von unbehandeltem und mittleren Stromfilter quadratischem Papier (A)-APS behandelt und schnelle Stromfilter quadratischem Papier (B). A. Die Spektren für unbehandeltes Medium-Flow-Filter quadratischem Papier war ähnlich dem von APS behandelte Medium-Flow-Filter quadratischem Papier. Die Zunahme der Intensitäten bei Bändern von 902-1,170 cm -1 und 1,210-1,500 cm -1 für die APS-behandelten quadratischem Papier gehörte Si-O-Cellulose und CH Deformationen SiOC-H - Gruppe. Das Inkrement der Banden bei 1.650 cm -1 und 2885 cm -1 gehört zum Biegen von -NH 2 und CH 2 Schwingungen von der saline propyl - Rest, respectively. B. Die charakteristischen Peaks in den 972 bis 1.180 cm -1 Bereich wurden der Si-O-Si zugeschrieben und SO-cellulose Anleihen. Der Peak bei 1.003 cm -1 wurde durch die Überlappung der Bindung Si-O-Si verursacht , und die CO - Streck von Cellulose. Alle Ergebnisse zeigen , dass APS erfolgreich auf die Cellulose - Quadrat Papiere aufgepfropft wurde. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Die Anwesenheit von funktionellen Amingruppen auf den Cellulosequadrat Papiere wurden durch FTIR bestimmt. 3 zeigt die FTIR - Spektren von unbehandelten, modifiziert Mittelfluss und schnelle Stromfilter quadratischen Papieren. Es gab drei Schritte bei der chemischen Modifizierung von Aminoalkylgruppen beteiligt, APS auf den Celluloseoberflächen verwenden. Erster Schritt involviert die Hydrolyse von APS das Silanol Derivat von APS bereitzustellen. Zweiter Schritt beinhaltete die Adsorption des hydrolysierten APS-Derivat auf den Cellulosefasern durch Wasserstoffbindung von OH-Gruppen aus dem hydrolyzed APS-Derivat und die Cellulosefasern. Schritt drei involviert die Kondensation des adsorbierten APS - Derivat, das zur Pfropfung des APS - Derivat auf den Cellulosefaseroberfläche über Si-OC Bindung und die Bildung von Si-O-Si Siloxanbrücken 34 geführt. Wie in 3A gezeigt ist , Struktureinheit der Inkrement der Bande bei 1.650 cm -1 wurde auf das Biegen von NH 2 -Gruppen zugeschrieben und ein Inkrement der Bande bei 2.885 cm -1 , entsprechend der CH 2 Schwingungen des Silans propyl. Für die Original - Medium-Flow - Filter quadratischem Papier, die Banden bei 902-1,170 cm -1 und 1,210-1,500 cm -1 entsprachen den Schwingungen der COC - Bindungen von glycosidischen Brücken und CH - Streckschwingungen. Nach Behandeln des quadratischen Papier mit APS zeigt die Zunahme der Intensität bei diesen beiden Bandbreiten dass sie zu Si-O-Cellulose und CH Deformationen SiOC-H-Gruppe. Ähnlich wie bei mittel flow filtern quadratischem Papier, die Spektren für modifizierte , schnelle Stromfilter quadratischem Papier auch bei 1.650 cm in der Intensität erhöht -1 für NH 2, aufgrund der chemischen Modifikation mit APS (3B). Die starken charakteristischen Peaks in den 972 bis 1.180 cm -1 Bereich wurden der Si-O-Si zugeschrieben und SO-Cellulose - Bindungen; die höchste Spitze wurde bei 1.003 cm -1 aufgrund der Überlappung der Si-O-Si - Bindung und der CO - Streck von Cellulose 34. Die charakteristischen Bindungen im Wellenlängenbereich zwischen 1.188 und 1.510 cm -1 für APS quadratischem Papier behandelt werden durch die Schwingungen der COC - Bindungen von glycosidischen Brücken und CH - Streckschwingungen verursacht. Die CH 2 Streckschwingung Anleihen wurden bei 2,800-2,980 cm -1 gezeigt und dem höchsten Peak bei 2.932 cm -1 für das APS - Quadrat Papier behandelt. Abschließend kann APS kovalent an No. 1 und No. 113 Filter Quadrat Papiere aufgepfropft werden.
Abbildung 4. Fluorescence Reaktionen auf verschiedene Konzentrationen von Glutaraldehyd in der Immobilisierung von IgG-FITC auf den Papierscheiben (Methode B) Einstellungen für Fluoreszenz Molecular Imager. Anregung 488 nm, Emission 530 nm, Auflösung, 100 Mikrometer . A: Fluorescence Reaktion auf 0, 0,001%, 0,005%, 0,01% und 0,050% Glutaraldehyd . B: Fluoreszenzantwort auf 0, 0,050%, 0,100%, 0,250% und 0,500% Glutaraldehyd. Die Konzentration an IgG-FITC auf jeder Scheibe betrug 0,01 mg / ml. Eine Erhöhung der Konzentration von Glutaraldehyd auf ein Maximum von 0,05% führte zu einer erhöhten Beladungsmenge von IgG-FITC. Die Konzentrationen von Glutaraldehyd über 0,05% verringert , um die Beladungsmenge an IgG-FITC. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version davon zu sehenZahl.
Abbildung 5. Fluoreszenzantwort (A) und kolorimetrische Ergebnis (B) von unterschiedlichen Konzentrationen an IgG-FITC auf der IgG-FITC-immobilisierte Mittelströmung und schnelle Stromfilterpapierscheiben (Methode B) Einstellungen für Fluoreszenz Molecular Imager. Excitation 488, nm, Emission 530 nm, Auflösung, 100 Mikrometer. # 1 für Note No. 1, Mittelflussfilterpapierscheibe und # 113 repräsentiert Qualität Nr 113 Fast-Flow Filterpapierscheibe. APS-modifizierte Papierscheiben wurden mit 0,05% Glutaraldehyd zuerst behandelt. Dann unterschiedliche Konzentrationen von IgG-FITC wurden auf die Glutaraldehyd modifizierte Papierscheiben geladen. Eine Erhöhung der Beladungskonzentration von IgG-FITC erhöht die Menge des immobilisierten IgG-FITC auf den Papierscheiben. Jedoch erhöhte Konzentrationen von immobilisierten IgG-FITC nicht die Bindungsfähigkeit an das Antigen zu verbessern. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Der grundlegende Arbeitsablauf für die kovalente Immobilisierung von Antikörpern auf Amin-funktionalisierte Cellulose - Papierscheiben ist in 1 dargestellt. Das Kaninchen - anti-human - IgG-FITC wurde auf den Cellulosepapierscheiben kovalent immobilisiert. Die Fluoreszenz von den Papierscheiben zeigte die Immobilisierung von Antikörpern gegen die Papierscheiben, und die Intensität der Fluoreszenz wurde auf die Konzentration von immobilisiertem Antikörper direkt proportional. Peroxidase-konjugierter Ziegen-anti-Kaninchen-IgG wurde dann aufgebracht, um die Bindungsfähigkeit der immobilisierten Antikörper zu bestimmen. Sekundäre Amingruppen und Aldehyd - Gruppen können miteinander reagieren , um eine Schiff'sche Base zu bilden, die in Biokonjugation 35 verwendet wurde. Sie waren auch hier für die kovalente Immobilisierung von Fänger verwendetAntikörper. In Verfahren A (1A), -NH 2 wurde auf den Cellulosepapierscheiben eingeführt und -CHO wurde aus dem Kaninchen - Anti-Human - IgG-FITC , abgeleitet durch Oxidation des Fc - Region der Antikörper mit Natriumperiodat. In gleicher Weise werden die Auswirkungen von verschiedenen Konzentrationen von Natriumperiodat und IgG-FITC-Antikörper wurden ebenfalls analysiert. Wie gezeigt in Abbildung S1 und Fig S2, Natriumperiodat von Konzentrationen von 0 bis 1 mM und dem Kaninchen - anti-human - IgG-FITC von 0,016 bis 0,16 mg / ml hatte wenig Wirkung auf die Oxidation von 0,08 mg / ml Kaninchen - anti-human IgG -FITC. Die Menge an Antikörper , die kovalent an die Papierscheiben gebunden waren , erhöhte sich mit zunehmender Konzentration der Fänger - Antikörper von 0 bis 0,075 mg / ml (Abb S3A).
Eine schwache Farbänderung wurde beobachtet, wenn die Bindungsfähigkeit durch die Peroxidase-Assay bestimmt wurde. Dies könnte durch die Verwendung vonüberschüssige Natriumperiodat, die mit den Einfang-Antikörper reagiert und bewirkt einen Verlust an Bindungsaktivität. Es ist wahrscheinlich, dass das Natriumperiodat kann nicht vollständig von den Papierscheiben gewaschen werden. Dies wurde durch das einfache Prinzip bestätigt, dass Natriumperiodat-Lösung eine gelbe Farbe verleiht, wenn es mit purpald Lösung gemischt. Daher Periodat oxidierten Antikörper wurden auf die Papierscheiben eingelegt und für 1 Stunde inkubiert. Die Papierscheiben wurden dreimal mit PBS (enthaltend 0,05% Tween-20) gewaschen, und dann wurde purpald Lösung dieser Scheiben hinzugefügt. Die Papierscheiben zeigte eine purpurne Farbe sofort das Vorhandensein von Aldehydgruppen von Periodat-oxidiertem Antikörper anzeigt. Diese violette Farbe zu gelb in 10 Minuten verändert, die das Vorhandensein von Natriumperiodat auf die Papierscheiben bestätigt.
Alternativ kann eine Glutaraldehyd-Vernetzungsmethode (Methode B, 1B) wurde verwendet , um das Amin zu verbinden groups aus den APS-behandelten Papierscheiben und Antikörper. Die Konzentrationen von Glutaraldehyd (Abbildung 4) und Kaninchen - anti-human - IgG-FITC (5A), die auf die Cellulosepapierscheiben geladen wurden optimiert. Wie in 4 gezeigt ist , erreichte die Fluoreszenzintensität ein Maximum von 0,05% Glutaraldehyd, was bedeutet , dass das Laden von Kaninchen - anti-human - IgG-FITC auf der Cellulosepapierscheibe gesättigt wurde bei dieser Konzentration; eine Erhöhung der Konzentration von Glutaraldehyd zu 2,5% zeigen keinen Anstieg in der Menge an Kaninchen - Anti-Human - IgG-FITC auf den Cellulosepapierscheiben (Abbildung S4). Die Fluoreszenzintensität erhöhte sich auch mit steigenden Konzentrationen an Kaninchen - anti-human - IgG-FITC, die auf die Papierscheiben (5A) geladen wurden. Eine blaue Farbe unmittelbar nach der Zugabe des TMB-Substrat und Wasserstoffperoxid Mischungslösung auf die Papierscheiben entwickelt, die die peroxidas enthaltenene konjugierte Nachweisantikörper (5B). Darüber hinaus Puffer blockiert, enthielt 10% Magermilchpulver wurde die Blocking - Effizienz nach 15 Wäschen (Abbildung S5) zu halten gezeigt. Verfahren B wurde die Anwendung der immobilisierten Antikörper zu testen ausgewählt, da sie die Bindungsaktivität an seine Ziel verbesserte demonstriert. Daher wurde für IgG-Nachweis eine 0,025 mg / ml Konzentration von Fänger-Antikörper verwendet.
Abbildung 6. Eichkurven für die Bestimmung von IgG von Papier-basierten ELISA. # 1 für Grade No. 1, mittlere Stromfilterpapierscheibe und # 113 repräsentiert Grade No. 113 schnell Stromfilterpapierscheibe. Das obere Feld A zeigt die Farbanzeige für Mittelfluss (# 1) und Fast-Flow (# 113) Cellulosepapierscheiben mit unterschiedlichen Konzentration an IgG. Die BodenplatteB stellt den ELISA Ergebnis für unterschiedliche Konzentration von IgG. Dreifache Ausführungen wurden verwendet , um die Standardabweichung (SD) zu bestimmen. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Ziege-anti-Maus-IgG-Fc-Fragment Einfang-Antikörper, IgG-Serum, und Ziege-anti-Maus-IgG-Fc-Fragment, Antikörper konjugiert HRP wurden für die Sandwich-Assay verwendet. Wie in Figur 6 und Figur S6 gezeigt, hatten die Konzentration von IgG - Serum 0-500 ng / ml eine lineare Beziehung mit kolorimetrischen Intensität , wenn jeder Schritt für 1 Stunde inkubiert. In S6 war die Farbvariation mit unterschiedlichen Konzentrationen von IgG offensichtlich für 1 Stunde Inkubation. Dennoch zeigen die Ergebnisse der 10 min Inkubation hatte keine offensichtliche Änderung in der Farbintensität mit verschiedenen Konzentrationen von IgG. Somit werden die sensitivity dieses Papier-basierten ELISA war für die praktische Point-of-Care-Tests zu entwickeln.
Abbildung S1. Fluoreszenz Reaktionen auf verschiedene Konzentrationen von Natriumperiodat (Methode A). Variierende Konzentrationen von Natriumperiodat wurden vermischt mit Kaninchen - anti-human - IgG-FITC in einer Konzentration von 0,016 mg / ml und für die Untersuchung der Antikörper - Oxidationsaktivität verwendet. die Konzentration von Natriumperiodat, erhöht die Beladungsmenge an IgG-FITC und erreichte ein Maximum bei 0,25 mm durch eine Erhöhung. Es wurde beobachtet, dass Konzentrationen von Natriumperiodat, die als diese höher waren nicht die Menge an immobilisierten IgG-FITC erhöhte. Dreifache Ausführungen wurden verwendet , um die Standardabweichung (SD) zu bestimmen. Bitte hier klicken , um diese Datei herunterzuladen.
Abbildung S2. Fluoreszenzantworts auf verschiedene Konzentrationen von Kaninchen anti-human - IgG-FITC (Methode A). Die Konzentration von Natriumperiodat betrug 0,25 mM in der Lösung für die Aktivität Studie Antikörper Oxidation, und die Endkonzentration von Kaninchen - anti-human - IgG-FITC auf jeder Scheibe war 0,016 mg / ml. Wenn die Konzentration von Natriumperiodat fixiert wurde, hatte die Konzentration von IgG-FITC geringe Wirkung auf die Oxidation von IgG-FITC. Dreifache Ausführungen wurden verwendet , um die Standardabweichung (SD) zu bestimmen. Bitte hier klicken , um diese Datei herunterzuladen.
Abbildung S3. Fluoreszenzantwort und kolorimetrische Ergebnis aus Beladung unterschiedlichen Konzentrationen an oxidiertem Kaninchen - anti-human - IgG-FITC auf die Papierscheiben (Methode A). Für Natriumperiodat Oxidation, 0,08 mg / ml IgG-FITC und 0,25 mM Natriumperiodat verwendet wurden. Die Verdünnung von Peroxidase-konjugiertem IgG anti-Kaninchen wurde1: 50.000. Eine Erhöhung der Beladungskonzentration von IgG-FITC auf den Cellulosepapierscheiben erhöht die Menge an immobilisiertem IgG-FITC, aber hatte keine Auswirkungen auf die Ziel verbindlich. Bitte hier klicken , um diese Datei herunterzuladen.
Abbildung S4. Fluoreszenz Antwort auf hohe Konzentrationen von Glutaraldehyd in der Immobilisierung von IgG-FITC auf den Cellulosepapierscheiben (Methode B). Die Konzentration von IgG-FITC auf jeder Scheibe betrug 0,01 mg / ml. Die Konzentrationen von Glutaraldehyd , die höher als 0,25% waren nicht die Menge an immobilisierten IgG-FITC auf den Cellulosepapierscheiben erhöhen. Bitte hier klicken , um diese Datei herunterzuladen.
Abbildung S5. Wirkung der Anzahl der Waschzeiten. A: war. Hing dreimal B: Waschen 15 mal. Capture - Antikörper auf die Cellulose - Quadrat Papier immobilisiert hatte noch eine gute Bindungsfähigkeit an ihre Ziele, auch wenn der Platz Papier 15 mal verwirbelt wurde. Bitte hier klicken , um diese Datei herunterzuladen.
Abbildung S6. Papier-basierten ELISA Ergebnis für IgG. Für die Konzentrationen von IgG 0-500 ng / ml, die Ergebnisse von einer Stunde Inkubation sind besser als die Ergebnisse von 10 - minütiger Inkubation. Bei hohen Konzentrationen von IgG, ist 10 Minuten genügend Zeit für die Inkubation. Dreifache Ausführungen wurden verwendet , um die Standardabweichung (SD) zu bestimmen. Bitte hier klicken , um diese Datei herunterzuladen.
Abbildung S7. Rasterelektronenmikroskopie (SEM) Bilder mittlerer Stromfilterpapier bei verschiedenen Vergrößerungen. A: 85X und B: 20.000facher. Feldemissions-Rasterelektronenmikroskopie (FE-SEM) bei 5 kV betrieben wurde, wurde verwendet, um die Teilchenmorphologie zu bestimmen. Die Zellulosefasern sind zufällig vernetzt. Bitte hier klicken , um diese Datei herunterzuladen.
Abbildung S8. REM - Aufnahmen von schnellen Stromfilterpapier in verschiedenen Vergrößerungen. A: 100X und B: 20.000facher. Feldemissions-Rasterelektronenmikroskopie (FE-SEM) bei 5 kV betrieben wurde, wurde verwendet, um die Teilchenmorphologie zu bestimmen. Die Zellulosefasern sind zufällig vernetzt. Bitte hier klicken , um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Direktbeschichtung von affinitätsgereinigtem Ziege-anti-Maus-IgG-Fc-Capture-Antikörper auf unmodifizierten Cellulosepapierscheiben wurde durchgeführt, um IgG-Konzentrationen nachzuweisen. Die Ergebnisse zeigten, dass es zur weiteren Fixierung der Fänger-Antikörper ist für die Reproduzierbarkeit erforderlich. Das Silan - Technik wurde erfolgreich einzuführen Amin - funktionellen Gruppen zu den Cellulosepapierscheiben 34 eingesetzt. Die Konzentration der APS betrifft die Immobilisierung von Antikörpern. Daher wurde die Menge an APS in Aceton optimiert. 1 ml der APS in 10 ml Aceton wurde eine optimale Konzentration der Amingruppe für die Immobilisierung von Antikörpern durch ein Glutaraldehyd-Vernetzungsmittel zum Pfropfen. Antikörper wurden auf den Cellulosepapierscheiben gepfropft durch Periodat-Oxidation und Glutaraldehyd-Vernetzungsverfahren. Unsere Ergebnisse zeigten, dass die Bindungskapazität von immobilisiertem Antikörper durch die Glutaraldehyd-Vernetzungsmethode war besser als die Periodat-Oxidationsverfahren für medium-Flow und schnelle Flussfilterpapierscheiben. Darüber hinaus Fänger-Antikörper, die auf Cellulose-Papierscheiben durch eine Glutaraldehyd Vernetzungsverfahren immobilisiert wurden, behielten ihre Funktion und sogar stabil immobilisiert waren, obwohl das Papier auf die mechanische Beanspruchung von 15 Wäschen durch Verwirbelung unterzogen wurde. Zehn Prozent der Magermilchpulver Blockierungspuffer wurde gefunden , seine Sperr Effizienz nach 15 Wäschen (Abbildung S5) zu halten.
Kovalent immobilisierte Antikörper wurden verwendet, um einen Sandwich-ELISA mit dem Nachweis von IgG durchzuführen. IgG bei einer Konzentration von 100 ng / ml wurde mit dem bloßen Auge unter Verwendung dieses Papierscheibe basierten Assay detektiert. Die Konzentration von IgG Serum 0-500 ng / ml ergab eine lineare Beziehung mit kolorimetrischen Intensität, wenn jeder Schritt für eine Stunde inkubiert wurde. Der Immunoassay - Tests für diese Papierscheibe ELISAs erforderlich weniger Probe - Reagenz und erschien effizienter als herkömmliche Immunoassays 36 zu sein Abbildung S7 und S8 Figur gezeigt. Wie in diesen Figuren dargestellt ist , sind die Fasern zufällig vernetzten für beide Arten von Filterpapierscheiben 25. Der Grund für diese hohe Empfindlichkeit kann die Dicke der Papierscheibe sein. Für einen schnellen Stromfilterpapierscheiben war die Dicke 420 & mgr; m im Vergleich zu 180 & mgr; m für den Mittelfluss Filterpapier. So wurden mehrere Einfang-Antikörper wahrscheinlich auf schnellen Stromfilterpapierscheiben immobilisiert werden, wodurch die Empfindlichkeit des Assays erhöhen würde. Zur gleichen Zeit wird die Porengröße für die schnellen Stromfilterpapierscheiben (30 um) war größer als die des Mediums Stromfilterpapierscheiben (11 & #181; m). Nach Papieroberfläche Blockieren wurde die Porengröße des ehemaligen immer noch groß genug, um Flüssigkeitsströmung ohne zusätzlichen Energiesystem zu fahren. Jedoch war die Strömungsrate für den Puffer in dem letzteren langsamer. Daher war Fast-Flow-Filterpapier besser als Mittelströmungsfilterpapier in der Anwendung von Immunoassays.
Die Reproduzierbarkeit der Antikörper an die immobilisierten Filterpapierscheiben wurde durch weitere Inkubation der Papierscheiben mit Peroxidase-konjugiertem Ziege-anti-Kaninchen-IgG und Detektion des kolorimetrischen Ergebnis bewertet, nachdem das Substrat TMB und Wasserstoffperoxid Mischungslösung geladen. Die Standardabweichung betrug weniger als 10% für diese papierbasierte Vorrichtung. Die Stabilität von Kaninchen - anti-human - IgG-FITC an den NH2 modifizierte Cellulosepapierscheiben wurde für bis zu zwei Monate getestet. Die Papierscheiben, die bei 4 ° C gelagert wurden behielten ihre Bindungsaktivität an Peroxidase-konjugiertem Ziegen-anti-Kaninchen-IgG mit einer leichten Abnahme ihrer binden Aktivität. Wenn jedoch die Antikörper immobilisiert Papierscheiben bei Raumtemperatur oder 60 ° C gelagert wurden, verloren sie ihre Bindungsaktivität aufgrund der Trockenheit und hohen Temperaturen. Die gefangenen Antikörper konnte destabilisiert und denaturiert unter diesen Bedingungen.
Es gibt einige wichtige Schritte bei der Immobilisierung der Capture-Antikörper auf den Cellulosepapierscheiben Glutaraldehyd als Vernetzungsmittel verwendet wird. Schritt 1.2 Amingruppen auf der Papierscheiben zu pfropfen ist ein kritischer Schritt bei der erfolgreichen kovalenten Immobilisierung von Fängerantikörper. Wenn dieser Schritt fehlschlägt, wird die gesamte Immobilisierungsprozesses scheitern. FTIR wurde verwendet, um Gruppen zu bestimmen, ob Amin erfolgreich auf den Papierscheiben (Schritt 1.6) immobilisiert waren. Zweitens ist die Pfropfung von Aldehydgruppen auf den Cellulosepapierscheiben ein weiterer kritischer Schritt (Schritt 2.2.1 und Schritt 3.1). Die Antikörper wurden auf den Cellulosepapierscheiben durch die Bildung einer Schiffschen Base kovalent immobilisiert. EndlichDer Schritt Capture-Antikörper auf den Filterpapierscheiben wichtig ist (Schritt 2.2.3, Schritt 3.4 und der Schritt 3.5) zu immobilisieren. Die Amingruppen aus den Fänger-Antikörper reagierten mit den Aldehyd-Gruppen aus den Cellulosepapierscheiben, die Antikörper auf den Papierscheiben zu befestigen. Wenn dieser Schritt nicht erfolgreich war, Fänger-Antikörper nicht auf die Papierscheiben zu immobilisieren und alle der ELISA-Anwendungstests würden negativ sein. Wir können eine Fluoreszenz Molecular Imager, um die Anwesenheit von Fänger-Antikörper zu bestimmen. Peroxidase-konjugiertes Ziege-anti-Kaninchen-IgG und Peroxidase-basierten kolorimetrischen Reaktionen können die Bindungsfähigkeit der immobilisierten Antikörper zu bestätigen, verwendet werden.
Dieses Protokoll kann einige Probleme, wie beispielsweise einem hohen Hintergrund zu dem Signal auftritt, kein Signal oder ein schwaches Signal, und eine ungleichmäßige Farbanzeige. Die möglichen Ursachen für diese Probleme und Fehlerbehebung Methoden zur Überwindung dieser Probleme werden im Folgenden erörtert. Hohe Hintergrundsignale treten in der Regel due zu einer kurzen Sperrzeit. Dies kann durch Erhöhung der Blockierung Inkubationszeit gelöst werden, das Waschen der Papierscheiben gründlich, und die Zugabe von überschüssigem Detektions-Antikörper-Konjugat-Enzym Vermeidung zu hohen Hintergrundsignalen zu entfernen. Die möglichen Gründe sind: Fehlen von Zielantigen, über blocking, unzureichende Inkubationszeit und eine nicht-funktionelle Detektionsantikörper Enzymkonjugat. Um diese Probleme zu überwinden, müssen die Zielantigene gegeben und für einen geeigneten Zeitraum inkubiert werden, um einen neuen Antikörper-Konjugat unter Verwendung von Speichern und es, wie vom Hersteller vorgeschlagen. Es ist ratsam, eine positive Kontrolle für den Nachweis umfassen. Ungleiche Farbe Ablesungen sind aufgrund der Stapelung von Papierscheiben während des Pfropfprozesses. Um dieses Problem zu vermeiden, müssen die Papierscheiben während des APS Pfropfverfahren getrennt werden und das Antigen und Detektions-Antikörper-Konjugat-Enzym muß bei jedem Schritt gleichmäßig auf der Papierscheibe verteilt werden.
Obwohl die papierbasierten Assay ist ein einfachesund kostengünstige Methode, gibt es Einschränkungen. Die Orientierung von Antikörpern auf der Substratoberfläche ist entscheidend für die Leistung des Immuntests, wie der Glutaraldehyd-Vernetzungsmittel reagiert mit den Amingruppen aus dem Fab-Region und der Fc-Region der Einfang-Antikörper. Somit treten die immobilisierten Antikörper nicht in einem hochorientiert. Da es mehr Amingruppen aus dem Fab-Region als aus der Fc-Region des IgG-Antikörper, die Bindungsaktivität der immobilisierten Antikörper ist, noch hoch genug für ihre Anwendung.
Verschiedene Oberflächenfunktionalisierung Methoden für Zellulosepapier wurden in einem kürzlich veröffentlichten Bericht 37 zusammengefasst. Reagenzien wie Divinylsulfon; 1,4-Phenylendiisothiocyanat; 4-Azido-Benzoldiazonium; Epichlorhydrin; 4-Azido-a-fluor-2-Nitrocyclohexan; und 4-Mercapto-Benzoldiazonium, könnte verwendet werden, um kovalent Biomolekülen auf Cellulosepapier immobilisiert. Adsorptions- und Einschluss wurden ebenfalls verwendetdie Zellulosepapier mit Biomolekülen zu beschichten. Im Vergleich zu den anderen Verfahren, wobei die Kombination des Silans Technik und der Glutaraldehyd-Vernetzungsmittel für die kovalente Immobilisierung von Antikörpern auf Cellulosepapier ist ein einfaches Verfahren. Zusätzlich kann diese Kombination nur geringe Auswirkungen auf die thermischen und mechanischen Eigenschaften der Cellulosepapier aufweisen, so dass die maximale vertikale Durchströmung in Immunoassays. Diese Strategie könnte erweitert werden, um andere Biomoleküle auf dem Zellulosepapier immobilisieren.
Die Methodik hier gezeigt, könnte möglicherweise auf die Detektion von beliebigen Analyten verlängert werden, solange direkte Antikörper gegen sie verfügbar sind. Dieses Verfahren kann auch zur Entwicklung Multiplexdetektion verwendet werden. Beispielsweise auf einem quadratischen Papier können verschiedene Bereiche für verschiedene Ziele unterscheiden. Die Einfang-Antikörper für die Ziele können durch eine Glutaraldehyd-Vernetzungsmittel auf ihren spezifischen Bereich immobilisiert werden. Dies kann durch die ELIS folgenEin Verfahren , um verschiedene Ziele zu erkennen. Somit ermöglicht das vorgeschlagene Verfahren die Papierbasis ELISA ein vielseitiges Werkzeug für die Detektion von anderen Zielen mit bloßem Auge.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cellulose filter paper, Grade 1 (medium flow filter paper) | GE Healthcare Pte Ltd Singapore | 1001 110 | |
| Cellulose filter paper, Grade 113 (Fast flow filter paper) | Sigma-Aldrich, Singapore | 1113-320 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich, Singapore | G6257 | Grade II, 25% in H2O |
| Surfactant | Tween-20, Sigma-Aldrich, Singapore | P2287 | |
| Bovine serum album | Sigma-Aldrich, Singapore | A2153 | |
| Skimmed milk powder | Louis François | Packed by Kitchen Capers, Singapore | |
| Tris base | Promega | H5135 | |
| Sodium periodate | Merck | 106597 | |
| Na2HPO4 | Merck | 106585 | |
| KH2PO4 | Merck | 104873 | |
| NaCl | CALBIOCHEM | 567441 | |
| NaOH | Merck | 106462 | |
| HCl | Merck | 100317 | |
| phosphate buffer saline (PBS) | N/A | N/A | PBS, containing 137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 8.0 mmol/L Na2HPO4 and 1.5 mmol/L KH2PO4, is prepared with water and adjusted to pH 7.4 with 0.1 mol/L NaOH or 0.1 mol/L HCl |
| Acetone | Tee Hai Chem Pte Ltd Singapore | 9005-68 | |
| Mixture of TMB and hydrogen peroxide solution | 1-Step ultra TMB-ELISA solution , Thermo Scientific Pierce | 34029 | 1 L |
| Rabbit anti-human IgG-FITC | TWC/Bio Pte Ltd Singapore | sc-2278 | |
| Peroxidase conjugated goat anti-rabbit IgG | TWC/Bio Pte Ltd Singapore | sc-2030 | |
| Affinity purified goat anti-Mouse IgG-Fc coating antibody | Bethyl Laboratories, Inc | A90-131A | |
| Mouse reference serum | Bethyl Laboratories, Inc | RS10-101-5 | 9.5 mg/ml |
| HRP conjugated goat anti-mouse IgG-Fc detection antibody | Bethyl Laboratories, Inc | A90-131P | |
| Equipment | |||
| Fourier transform infrared spectrophotometer | Shimadzu IR Prestige-21 | N/A | |
| Fluorescence molecular imager | Pharos FXTM plus molecular imager, Bio-Rad, Singapore | N/A | |
| Oven | NUVE FN500 | N/A | |
| Turbo mixer VM-2000 | MYC LTD | N/A | |
| ImageJ | RGB, free download | N/A |
References
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