In questo manoscritto vengono presentati i metodi di ossidazione dei periodici e di reticolazione della glutaraldeide per l'immobilizzazione covalente degli anticorpi su dischi di carta. È stata valutata l'attività di legame degli anticorpi immobilizzati. Sulla base di questi risultati, è stato utilizzato un metodo di reticolazione della glutaraldeide per sviluppare un nuovo test immunologico basato su carta per la rilevazione delle immunoglobuline G (IgG).
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Articolo metodologico
Covalente legame degli anticorpi al cellulosa dischi di carta e le loro applicazioni a occhio nudo colorimetrici Immunoassays
In questo articolo
Sommario
Abstract
Questo rapporto presenta due metodi per l'immobilizzazione covalente di anticorpi di cattura su filtro di cellulosa grado di carta n ° 1 (carta da filtro di media portata) dischi e di grado n ° 113 (carta da filtro rapido flusso) dischi. Questi dischi di carta di cellulosa sono stati innestati con gruppi funzionali amminici tramite una tecnica di accoppiamento silano prima gli anticorpi sono stati immobilizzati su di essi. metodi di reticolazione periodato di ossidazione e glutaraldeide sono stati usati per innestare anticorpi di cattura sui dischi di carta di cellulosa. Per garantire la massima capacità di legame degli anticorpi di cattura ai loro bersagli dopo l'immobilizzazione, sono stati studiati gli effetti di varie concentrazioni di periodato di sodio, glutaraldeide, e anticorpi di cattura sulla superficie dei dischi di carta. Gli anticorpi che sono stati rivestiti sui dischi di carta di cellulosa ammina-funzionalizzata tramite un agente reticolante glutaraldeide mostrato migliorata attività di legame al bersaglio rispetto al metodo di ossidazione periodato. IgG (nel siero riferimento mouse) è stato usato come target di riferimento in questo studio per testare l'applicazione di anticorpi immobilizzati covalentemente attraverso glutaraldeide. Un nuovo cartaceo, enzimatico test immunoenzimatico (ELISA) è stato sviluppato con successo e convalidato per l'individuazione di IgG. Questo metodo non richiede attrezzature, e può rilevare 100 ng / ml di IgG. La carta da filtro a flusso rapido era più sensibile della carta da filtro flusso medio. Il periodo di incubazione di questo test è stato breve e richiedeva piccoli volumi di campione. Questo occhio nudo, immunologico colorimetrica può essere esteso per rilevare altri obiettivi che sono identificati con ELISA convenzionale.
Introduzione
Lo studio diagnostico point-of-care (POCT) è importante per lo sviluppo di nuove strategie per la terapia, la medicina personalizzata, e assistenza domiciliare 1. Carte cellulosa sono ampiamente usati come piattaforme in saggi immunologici, come sono economici, accessibili e familiare agli utenti 2. Inoltre, la struttura porosa della carta di cellulosa possiede il potere di guidare il flusso di liquido senza ulteriore impatto energetico. Le registrazioni dei bioanalisi cartaceo può essere trovato già nel 20 ° secolo, quando cromatografia su carta è stato inventato nel 1952. L'esempio più diffuso è test immunocromatografici 3,....
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Protocollo
1. L'innesto Amine gruppi funzionali di cellulosa dischi di carta
- Preparare un pezzo di carta quadrato con una dimensione di 1 cm x 1 cm e 100 dischi di carta in carta di cellulosa di grado n ° 1 con un diametro di 6,0 mm (carta flusso medio filtro) utilizzando un punzone buco.
- Per derivare gruppi -NH 2 sui dischi di carta, mescolare 1 ml APS e 10 ml di acetone in una bottiglia di vetro da 50 ml sotto cappa. Aggiungere dischi di carta alla miscela APS reagente appena preparato, e incubare per 5 ore con agitazione orbitale (200 rpm) a temperatura ambiente 32.
Attenzione: maneggiare APS e acetone nella cappa. <....
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Risultati
Figura 3. trasformata di Fourier (FTIR) spettri di filtro flusso medio greggia e APS-trattata carta quadrato (A) e il filtro a flusso rapido carta quadrato (B). A. Gli spettri per non trattata filtro medio-flow quadrato di carta era simile a quella di APS trattate filtro medio-flusso di carta quadrato. L'aumento della intensità a bande di 902-1,170 cm -1
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Discussione
dirette di verniciatura affinità purificato capra anti-mouse IgG-Fc anticorpo di cattura su dischi di carta non modificato di cellulosa è stato eseguito per rilevare le concentrazioni di IgG. I risultati hanno indicato che, ulteriormente fissaggio degli anticorpi di cattura è richiesto per la riproducibilità. La tecnica silano è stata usata con successo per introdurre gruppi funzionali amminici ai dischi di carta di cellulosa 34. La concentrazione di APS colpisce l'immobilizzazione di anticorpi. Pertanto,.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dal Ministero dell'Istruzione, Singapore attraverso il Translational and Innovation Grant (MOE2012-TIF-2-G-009).
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Carta da filtro in cellulosa, grado 1 (carta da filtro a medio flusso) | GE Healthcare Pte Ltd Singapore | 1001 110 | |
| Carta da filtro di cellulosa, Grado 113 (carta da filtro a flusso rapido) | Sigma-Aldrich, Singapore | 1113-320 | |
| Glutaraldeide | Sigma-Aldrich, Singapore | G6257 | Grado II, 25% in H2O |
| Tensioattivo | Tween-20, Sigma-Aldrich, Singapore | P2287 | |
| Album di siero bovino. | Sigma-Aldrich, Singapore | A2153 | |
| Latte scremato in polvere | Louis Franç ois | Confezionato da Kitchen Capers, Singapore | |
| Tris base | Promega | H5135 | |
| Periodato di sodio | Merck | 106597 | |
| Na2HPO4 | Merck | 106585 | |
| KH2PO4 | Merck | 104873 | |
| NaCl | CALBIOCHEM | ||
| NaOH | Merck | 106462 | |
| HCl | Merck | 100317 | |
| soluzione salina tampone fosfato (PBS) | N/A | N/A | PBS, contenente 137 mmol/L NaCl, 2,7 mmol/L KCl, 8,0 mmol/ L Na2HPO4 e 1,5 mmol/L KH2PO4, è preparato con acqua e regolato a pH 7,4 con 0,1 mol/L NaOH o 0,1 mol/L HCl |
| Acetone | Tee Hai Chem Pte Ltd Singapore | 9005-68 | |
| Miscela di TMB e soluzione di perossido di idrogeno | Soluzione ultra TMB-ELISA in 1 fase, Thermo Scientific Pierce | 34029 | 1 L |
| Coniglio anti-umano IgG-FITC | TWC/Bio Pte Ltd | Singapore sc-2278 | |
| Capra coniugata perossidasi anti-coniglio IgG | TWC/Bio Pte Ltd Singapore | sc-2030 | |
| Affinità capra purificata anti-topo IgG-Fc rivestimento anticorpo | Bethyl Laboratories, Inc | A90-131A | |
| Riferimento per topi siero | Bethyl Laboratories, Inc | RS10-101-5 | 9,5 mg/ml |
| HRP capra coniugata anti-topo IgG-Fc rilevamento anticorpo | Bethyl Laboratories, Inc | A90-131P | |
| Equipment | |||
| Spettrofotometro a infrarossi a trasformata di Fourier | Shimadzu IR Prestige-21 | N/A | |
| Imager molecolare a fluorescenza | Pharos FXTM plus molecular imager, Bio-Rad, Singapore | N/A | |
| Forno | NUVE FN500 | N/A | |
| Turbo mixer VM-2000 | MYC LTD | N/A | |
| ImageJ | RGB, download gratuito | N/A |
Riferimenti
- Curtis, K. A., Rudolph, D. L., Owen, S. M. Rapid detection of HIV-1 by reverse-transcription, loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP). J. Virol. Methods. 151 (2), 264-270 (2008).
- Martinez, A. W., Phillips, S. T., Carrilho, E., Thomas, S. W., Sindi, H., Whitesides, G. M.
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Ristampe e permessi
