Abstract
Denne rapporten presenterer to metoder for kovalent immobilisering av fangst antistoffer på cellulose filter papirkvalitet No. 1 (filter papir medium-flow) plater og klasse nr 113 (hurtig-flow filter papir) plater. Disse cellulosepapirskivene ble podet med amin-funksjonelle grupper ved et silan-koplings teknikk før antistoffer ble immobilisert på dem. Perjodatoksidering og glutaraldehyd tverrbindingsmetoder ble anvendt for å pode fangst-antistoffer på cellulosepapirskiver. For å sikre den maksimale bindingskapasitet av de fange antistoffer til sine mål etter immobilisering, ble effekten av forskjellige konsentrasjoner av natrium-perjodat, glutaraldehyd, og fange antistoffer på overflaten av papirskivene undersøkt. Antistoffene som ble belagt med amin-funksjonalisert cellulosepapirskivene gjennom et glutaraldehyd-kryssbindingsmiddel viste forbedret bindingsaktivitet til målet i forhold til periodat oksydasjon metode. IgG (mus i referanseserum) ble anvendt som en referanse mål i denne studien for å teste anvendelsen av kovalent immobiliserte antistoffer via glutaraldehyd. En ny papirbasert, enzymbundet immunosorbent assay (ELISA) ble utviklet og validert for påvisning av IgG. Denne metoden krever ikke utstyr, og det kan oppdage 100 ng / ml IgG. Den raskt strømningsfilterpapiret var mer sensitiv enn den middels strømningsfilterpapir. Inkubasjonstiden av denne analysen var kort og kreves små prøvevolumer. Dette blotte øye, kan kolo immunologisk bli utvidet til å oppdage andre mål som er identifisert med konvensjonell ELISA.
Introduction
Den point-of-care testing (POCT) diagnostisk studie er viktig for utvikling av nye strategier for therapeutics, personlig medisin, og hjemmesykepleien en. Cellulosepapir er mye brukt som plattformer i immunoanalyser, da de er billige, tilgjengelige og kjent for brukere 2. I tillegg er den porøse struktur av cellulosepapir besitter kraft til å drive væskestrømmen uten ytterligere energipåvirkning. Registreringer av papirbaserte bioanalyse kan bli funnet så tidlig som det 20. århundre, da papir kromatografi ble først oppfunnet i 1952. Den mest utbredte eksemplet er Immunokromatografisk tester 3, som for eksempel graviditet og diabetes teststrimler. Disse testene gir relativt raske analysetider og billig analyse fire. På grunn av sin enkelhet, har disse konvensjonelle papir stripe tester blitt mye brukt i POCT diagnostikk 5.
Deteksjonsmetoder, inkludert kolo 6, elektrokjemisk 7, og 8 elektrokjemiluminescens metoder har blitt rapportert å måle mål i biologiske prøver. I tillegg til disse kvantitative metoder, en pålitelig metode for immobilisering av antistoffer på cellulosepapir er også viktig for utvikling av diagnostiske anordninger. Ikke-spesifikk adsorpsjon er hovedstrategi for modifisering av antistoffer på overflaten av det papirbaserte anordninger 9, 10 for å sikre maksimal bindingskapasitet til sine mål etter immobilisering. Men en tidligere studie viste at antistoffer som er adsorbert på cellulosepapir kan desorbere fra fibrene 11 med 40%. Således kan direkte adsorpsjon av antistoffene på cellulose ikke gi reproduserbare resultater 12. Kovalent immobilisering av antistoffer som er podet på papiroverflater er en alternativ metode for å utvikle effektive papirbaserte bioanalyser 13. Forskjellige metoder er blitt rapportert for modifisering av cellulose 14, 15 12. Karbonyldiimidazol kombinert med 1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluorborat 16; 1-fluor-2-nitro-4-azidobenzene gjennom en UV-basert aktiverings strategi 17, 18; en chemoenzymatic strategi basert på xyloglucan modifisering 19; en 1,4-phenylenediisothiocyanate bindingsmiddel 20; heteropolysakkarid oksidasjon 21 klikk kjemi 22; og kationiske porfyriner 23 er blitt brukt til kovalent immobilisering av biomolekyler på cellulosepapir. Kitosan modifisert papiret har blitt brukt for å utvikle papirbaserte immunodevices 24-26, siden det er rikelig og biokompatibelt 27. Chitosan er kationiske og fester seg sterkt til anionisk cellulose 27. De fange antistoffer er immobilisert på papir gjennom kitosan belegg og glutaraldehyd tverrbinding. Periodat oksydasjon er en annen metode for poding av capture antistoffer på cellulose papir 28. I denne fremgangsmåten blir natriumperjodat flekket på papiret for å omdanne 1,2-dihydroksyldiarylenforbindelse (glykol) grupper i cellulosen direkte til aldehydgrupper. Aldehydgruppene blir så brukt til å danne kovalente bindinger mellom polysakkarider og antistoffer 28. Selv om fremstillingen er enkel, er det vanskelig å fullstendig vaske ut natriumperjodat. Den uvaskede natriumperjodat kan føre til ytterligere oksydasjon av de antistoffer som er immobilisert på den cellulosepapir, som påvirker aktiviteten og stabiliteten av antistoffene N -. (3-dimetylaminopropyl) - N-etylkarbodiimidhydroklorid og N-hydroksysuccinimid kryssbindere benyttes også for å kovalent immobilisering av antistoffer på elektrospunnede poly-L-melkesyre og celluloseacetat nanofibers for utvikling av nanofiber-baserte analyser 29.
I denne studien ble en silan-koplings teknikk som brukes til å pode amin-funksjonelle grupper på cellulosee papir plater. Denne teknikken bidrar til å beholde den opprinnelige porestørrelse, transporterende, og filtreringshastigheten for cellulosefilterpapir, slik at maksimale vertikale gjennomstrømnings i immunoanalyser. Den silan-koblingsteknikken har vært mye brukt i biosensorer for å funksjonalisere substratoverflater med sekundære amingrupper, etterfulgt av ytterligere modifikasjon ved hjelp av biomolekyler. Podingen av amingrupper på matrisen overflate omfatter en kondensasjonsreaksjon mellom -OH-grupper av de organofunksjonelle silan midler og matriks substrat 30. Cellulosepapirskivene ble funksjonalisert med amingrupper av silan-koblings gjennom 3-aminopropyltrimethoxysilan (APS) 31. Dette ble etterfulgt av kovalent immobilisering av fangst-antistoffer ved hjelp av to forskjellige metoder. Den første metoden er involvert bindingen av perjodat oksidert fange antistoffer til aminfunksjonaliserte cellulosepapirskiver. Den andre metoden som brukes glutaraldehyd som en kryssbindingsmiddel for å feste fangst antibodies til amingruppefunksjon cellulose papir plater. Tilstedeværelsen av fangst-antistoffer ble bekreftet av kanin-anti-humant IgG-fluorescein-isotiocyanat (FITC), ved anvendelse av en fluorescens molekyl imager. Den bindende aktivitet av kanin-anti-humant IgG-FITC for å geite-anti-kanin-IgG ble også evaluert av peroksidase-substrat. Effekten av forskjellige konsentrasjoner av natrium-perjodat, glutaraldehyd, og fange antistoffer ble undersøkt. Anvendelsen test av den immobiliserte fangst-antistoffet ble vellykket utført ved påvisning av IgG serum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Negl Amine funksjonelle grupper på cellulosepapir plater
- Fremstille ett stykke av kvadratisk papir med en dimensjon på 1 cm x 1 cm og 100 papirskiver laget fra klasse No. en cellulosepapir med en diameter på 6,0 mm (mellom strømning filterpapir) ved anvendelse av et hulle.
- For å utlede -NH2 grupper på papir plater, bland 1 ml APS og 10 ml aceton i en 50 ml glassflaske i avtrekksskap. Legg papirskiver til den nylagede APS-reagens-blanding, og inkuber i 5 timer med orbital omrøring (200 rpm) ved romtemperatur 32.
Forsiktig: Håndter APS og aceton i avtrekksskap. - Dekanter overflødig oppløsning fra 50 ml glassflaske til en organisk avfallsbeholder.
- Tilsett 10 ml aceton til den glassflaske, bland godt og dekanter fullstendig å fjerne eventuelle uomsatte APS og andre urenheter. Gjenta dette trinnet to ganger.
- Spre papirskiver på papirhåndkle og legges i en 110 ° C ovn i 3 timer. Tillatpapir plater for å kjøle seg ned. Oppbevarer platene i et 50 ml sentrifugerør ved romtemperatur.
- Bruke Fourier transform infrarød spektroskopi (FTIR) for å kontrollere podingen av amingrupper på cellulosen firkantet papir, slik det er beskrevet nedenfor (figur 3A).
- Slå på datamaskinen og åpne FTIR spektroskopi instrument.
- Åpne programvaren for FTIR spektroskopi.
- Gå til "Measurement → Initial '. Rektanglene for 'BS: KBR',: vil "Lamp Infrarød" og "Laser" bli grønn når initialisering er ferdig.
- Velg 'Data' under rektangler, og velg «% Transmittance ',' Happ-Genzel ',' 45 ',' 4.0 ', og' Min: 400 Max: 4000" for "Measurement Mode ',' Apodization ',' Nei. skanninger ',' oppløsning ', og' Range (cm-1) '.
- Klikk "Mål".
- Velg "Data file" for bakgrunnsdata. Skrivened kommentarene.
- Klikk "BKG" for å få grunnlinjen for bakgrunnen.
- Fest firkantet papir på filmen prøveholderen.
- Velg "Data file 'for eksempel data. Skriv ned kommentarene.
- Klikk "Sample" for å oppnå spektra for prøven.
- Lukk FTIR spektroskopi programmet og slå av datamaskinen.
- Gjenta trinnene ovenfor (trinn 1.1 til 1.6) for å forberede amin-funksjon grade No. 113 cellulose firkantet papir og plater (fast-flow filter papir), og få FTIR spektrene for karakteren No. 113 kvadrat papir (figur 3B).
2. Kovalent Immobilisering av antistoffer på Amin-funksjoncellulosepapir Discs
Figur 1. Kovalent immobilisering av antistoffer ved to forskjellige metoder.A. Antistoffer immobilisert på aminfunksjon cellulose papir plater gjennom perjodatoksidering. De karbohydratrester ble oksydert med natriumperjodat for å produsere funksjonelle grupper, aldehydgrupper. Deretter ble de oksyderte antistoffene fylt på amin-funksjonalisert cellulosepapirskiver. B. Antistoffene ble deretter immobilisert på amin-funksjonalisert cellulosepapirskivene gjennom glutaraldehyd. Aminfunksjonaliserte cellulosepapirskiver ble neddykket i 0,05% glutaraldehyd-løsning for å innføre aldehydgrupper til papirskiver. Etter vasking, ble antistoffer lastet ned på aldehyd funksjon papir plater. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Immobilisere antistoffene på amin-funksjonalisert cellulosepapirskivene gjennom periodat oksydasjon (figur 1A).
- Bland 1 mL av 2,5 mM natrium periodate med 2 ul 0,1 mg / ml kanin-anti-humant IgG-FITC og 7 ul av 100 mM pH 5,5 acetatbuffer i et 1,5 ml rør, og inkubere blandingen i mørke i 30 min.
MERK: Følg denne volum-forhold til å forberede mer oksidering antistoffer hvis nødvendig. Endrer volum-forhold for å optimalisere konsentrasjonen av natrium-perjodat og kanin-anti-humant IgG-FITC. - Fortynn den ovennevnte antistoffløsning med 30 pl av 50 mM fosfatbuffer saltvann (PBS; pH 7,4) til et endelig volum på 40 ul.
- Forbered tre aminfunksjon medium-flow filter papir plater og tre aminfunksjon rask-flow papirskiver (som beskrevet i punkt 1).
- Belastning 5 ul av natrium-perjodat oxydert kanin-anti-humant IgG-FITC bort på hvert medium strømsfilterpapirskive og 8 ul ut mot hver hurtig-strømfilter papirskive. Oppbevar disse papirskiver i mørket i en time ved romtemperatur.
- Vask hver av de papirskive med 0,2 ml vaske buffer (50 mM Tris-buffer med 0,15 M NaCl og 0,05% overflateaktivt middel, pH 7,4). Gjenta vask tre ganger.
- Fotografere fluorescens bilder gjennom en fluorescens molekylær kamera for å identifisere tilstedeværelsen av antistoffer på hver cellulose papir plate 32. Bruk tomme papirskiver (som ble behandlet med den samme konsentrasjon av antistoff i fravær av natrium-perjodat) som en kontroll (figur S1 til fig S3).
NB: For eksperimentell optimalisering, endrer konsentrasjonen av en parameter som skal optimaliseres og feste av konsentrasjonene av alle andre parametre. En høy fluorescensintensitet øker mengden av fangst-antistoffer som er immobilisert på cellulosepapirskiver.
- Bland 1 mL av 2,5 mM natrium periodate med 2 ul 0,1 mg / ml kanin-anti-humant IgG-FITC og 7 ul av 100 mM pH 5,5 acetatbuffer i et 1,5 ml rør, og inkubere blandingen i mørke i 30 min.
- Immobilisere antistoffene på aminfunksjonaliserte cellulosepapirskivene gjennom glutaraldehyd (figur 1B).
- Tilsett tre APS behandlet medium-strømningsfilter papirskiver og de tre hurtig-strømningsfilter papirskiver (desbert i avsnitt 1) i 2 ml 50 mM PBS (pH 7,4) som inneholder 0,05% glutaraldehyd i 1 time, med orbital omrøring ved romtemperatur.
Forsiktig: Håndter glutaraldehyd i avtrekksskap. - Plasser tre plater hver i to 1,5 ml sentrifugerør. Tilsett 1 ml deionisert (DI) vann til hvert rør og rørene riste i 10 sek. Fjerne vannet ved å aspirere med en pipette. Gjenta to ganger til for å fjerne eventuelt ureagert glutaraldehyd.
- Belastning 5 ul av 25 ug / ml kanin-anti-humant IgG-FITC (fangst-antistoffet) på hver aldehyd-funksjonaliserte medium fristrømfilter papirskive, og legge til 8 mL på hver aldehyd-funksjonaliserte hurtig returfilteret papirskive. Inkuber i mørke i ca. 20 minutter ved romtemperatur. Deretter tilsettes 10 ul av 50 mM PBS (pH 7,4) til hver papirskive uten å fjerne antistoffene og inkuberes i 40 min for amin aldehyd reaksjonen.
- Vask papirskiver med 0,2 ml vaskebuffer på toppen av et papirhåndkle. Gjentavaske to ganger.
- Fotografere fluorescens bilder gjennom en fluorescens molekylær imager for å se på tilstedeværelsen av antistoffer på hver cellulose papir plate 33. Bruk tomme papirskiver som en kontroll.
MERK: I figur 4, '0' står for den tomme papirskive som ble behandlet med den samme konsentrasjon av FITC-antistoff i fravær av glutaraldehyd; i figur 5A, ble den tomme papirskiver ble behandlet med glutaraldehyd, men ingen FITC-antistoff ble applisert på papirskiver.
- Tilsett tre APS behandlet medium-strømningsfilter papirskiver og de tre hurtig-strømningsfilter papirskiver (desbert i avsnitt 1) i 2 ml 50 mM PBS (pH 7,4) som inneholder 0,05% glutaraldehyd i 1 time, med orbital omrøring ved romtemperatur.
- Tørk de papirskiver (fra §§ 2.1 og 2.2) ved 37 ° C i 10 min.
- Blokkere papirskiver med 15 ul blokkeringsbuffer (10% skummet tørrmelk i 50 mM Tris-buffer, pH 7,4, med 0,15 M NaCl) i 10 minutter ved romtemperatur.
- Belastning 5 ul og 8 ul av peroksidase-konjugert geite-anti-kanin-IgG i PBS (1: 10000) på mellom strømning og filterpapirskivene fast-flow, respektivt. Inkuber i30 minutter i mørke ved romtemperatur.
- Vask papirskiver med 0,2 ml vaskebuffer på toppen av et papirhåndkle. Gjenta vask tre ganger.
MERK: Det er ikke nødvendig å fjerne vaskebufferen som resultatene ikke blir påvirket av buffer. - Laste en 10 pl blanding av 3,3 ', 5,5'-tetrametylbenzidin (TMB) og hydrogenperoksidløsning på hver plate.
- Ta bilder av papir plater med et digitalt kamera eller smarttelefon etter 5 min av inkubasjon.
MERK: I figur 5B, '0' står for papir plater som ble behandlet med glutaraldehyd, etterfulgt av lasting av antistoff-HRP (pepperrotperoksidase) konjugat i fravær av FITC-antistoff.
3. Paper-baserte ELISA for IgG Detection
Figur 2. Skjematisk fremstilling av papirbasert ELISA for IgG gjenkjenning. Capture antistoffer ble kovalent immobilisert på aldehyd-funksjon cellulose papir plater gjennom glutaraldehyd. Cellulosepapirskivene ble blokkert med blokkeringsbuffer. Målet IgG ble deretter tilsatt til platene, etterfulgt av lasting av HRP-konjugert signal antistoffer. Til slutt ble TMB og hydrogen peroxide blanding løsning lastet på hver papirskive for fargen avlesning. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Tilsett 5 ml av 0,05% glutaraldehyd-oppløsning (fremstilt i 50 mM PBS-buffer, pH 7,4) til en 20 ml glassflaske. Dyppe 15 aminfunksjonaliserte medium-strømningsfilter papirskivene i denne løsning og holde i 1 time med risting ved romtemperatur.
- Samtidig, for å gjenta trinn 3,1 forberede ytterligere 15 aldehyd funksjon rask-flow filter papir plater.
Forsiktig: Håndter glutaraldehyd i røykhette.
- Samtidig, for å gjenta trinn 3,1 forberede ytterligere 15 aldehyd funksjon rask-flow filter papir plater.
- For å fjerne uomsatt glutaraldehyd fra papirskiver, plassere 15 medium-strømningsfilter papirskiver i et 15 ml sentrifugerør, og 15 fast-flow filter papirskivene i en annen 15 ml sentrifugerør. Tilsett 5 ml DI-vann til hvert rør og rørene riste i 10 sek. Fjerne vannet ved å aspirere med en pipette. Gjenta to ganger for å fjerne ureagert glutaraldehyd.
- Tørke papirskivene i en 37 ° C ovn.
- Tilsett 5 ul og 8 ul av 0,025 mg / ml muse-IgG-Fc-fragment antistoff til hver av de mellomstrømnings og filterpapir rask strømning plater, henholdsvis, og inkuber i 20 min.
- Tilsett 10 pl av 50 mM PBS (pH 7,4) til hver papirskive uten å fjerne antistoffene og inkuberes i 40 min for amin aldehyd reaksjonen.
- Vask papirskiver med 0,2 ml vaskebuffer på toppen av et papirhåndkle. Gjenta vask tre ganger.
- Tørk papiret platene i en ovn ved 37 ° C.
- Blokker papir plater wed 15 ul blokkeringsbuffer i 10 min ved romtemperatur.
- Vask hver papirskive med 0,2 ml vaskebuffer på toppen av et papirhåndkle. Gjenta vask tre ganger.
- Kjør IgG standarder.
- Belastning 10 ul av forskjellige IgG-konsentrasjoner (for eksempel, 0, 10, 125, 250, og 500 ng / ml i PBS) på hver plate i tre eksemplarer. Inkuber i 1 time ved romtemperatur.
- Vask papirskiver med 0,2 ml vaskebuffer på toppen av et papirhåndkle. Gjenta vask tre ganger.
- Belastning 10 ul av HRP konjugert mus-IgG-Fc-fragment antistoff (1: 10 000, 10 mM PBS, pH 7,4) og inkuberes i 1 time ved romtemperatur.
- Vask papirskiver med 0,2 ml vaskebuffer på toppen av et papirhåndkle. Gjenta vask tre ganger.
MERK: det er ikke nødvendig å fjerne vaskebufferen som resultatene ikke påvirkes av nærværet av buffer. - Legg i en 10 mL blanding av TMB og hydrogen peroxide på hver plate.
- TAKE bilder av alle papirskiver med et digitalt kamera eller smarttelefon etter 5 min av inkubasjon.
MERK: I figur 6A, '0' står for papirskiver behandlet med fangst antistoff immobilisering, og antistoff-HRP / TMB løsning uten IgG serum. - Analyser intensiteten av hver papirskive på bildet av bilde J.
- Konvertere bilder tatt i trinn 3,15 til "TIF" format.
- Åpne "Bilde J 'programvare.
- Gå til "Fil → Åpne ', velge bilde å analysere.
- Velg form knappen "Oval".
- Gå til "Bilde → Skriv → 32 bit".
- Gå til Rediger → Inverter '.
- Gå til "Analyser → Measure '.
- Kopier og analysere data i et regneark.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 3. Fourier transform infrarød (FTIR) spektra av ubehandlet og APS-behandlet medium fristrømfilter firkantet papir (A) og hurtig returfilteret kvadratisk papir (B). A. Spektrene for ubehandlet medium fristrømfilter kvadratisk papir var lik den i APS behandlet medium fristrømfilter kvadratisk papir. Økningen i intensiteter ved bånd 902-1,170 cm-1 og 1,210-1,500 cm-1 for APS-behandlede firkantet papir tilhørte Si-O-cellulose og CH deformasjoner av SIOC-H-grupper, henholdsvis. Økningen av bandene på 1650 cm -1 og 2,885 cm -1 tilhører bøying av NH 2 og CH 2 vibrasjoner fra saltvann propyl-delen, henholdsvis. B. De karakteristiske topper i 972 til 1180 cm -1 avstands kunne tilskrives Si-O-Si og SO-cellulose obligasjoner. Toppen ved 1.003 cm-1 ble forårsaket av overlappingen av Si-O-Si-binding og CO strekking av cellulose. Alle resultatene viser at APS ble vellykket podet på cellulose firkantede papirene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Nærværet av aminfunksjonelle grupper på de cellulosefirkant papirer ble bestemt ved FTIR. Figur 3 viser FTIR-spektra av ubehandlet, modifisert, medium-strømning og filter firkant papirer fast-flow. Det var tre trinn som er involvert i den kjemiske modifikasjon av aminoalkylgrupper, ved hjelp av APS på de cellulose flater. Trinn en involverte hydrolyse av APS for å tilveiebringe det silanol derivat av APS. Trinn to involverte adsorpsjon av hydrolyserte APS-derivatet på cellulosefibrene ved hydrogenbinding av OH-grupper fra hydrolyzed APS derivat og cellulosefibrene. Trinn tre involvert kondensering av den adsorberte APS-derivat, noe som førte til poding av APS-derivatet på cellulosefiberoverflaten gjennom Si-OC binding og dannelse av Si-O-Si broer siloksan-34. Som vist i figur 3A, er inkrement av båndet ved 1650 cm-1 ble tilskrevet bøying av NH 2 grupper og en økning av det bånd ved 2,885 cm-1 tilsvarende CH 2 vibrasjoner av silanet propyl del. For den opprinnelige medium-flow filter firkantet papir, båndene ved 902-1,170 cm -1 og 1,210-1,500 cm -1 samsvarer med vibrasjonene fra COC obligasjoner av glykosid broer og CH strekker vibrasjoner. Etter behandling av den firkantede papir med APS, er økningen i styrke ved disse to båndbredder indikerer at de hører til Si-O-cellulose og CH deformasjoner av SIOC-H-grupper, henholdsvis. I likhet med middels flow filtrere firkantet papir, spektrene for modifiserte hurtig returfilteret kvadratisk papir også økt i intensitet ved 1650 cm-1 for -NH2, på grunn av kjemisk modifikasjon med APS (figur 3B). De sterke karakteristiske topper i 972 til 1180 cm -1 avstands kunne tilskrives Si-O-Si og SO-cellulose bindinger; den høyeste toppen var ved 1003 cm-1 på grunn av overlappingen av Si-O-Si-binding og CO strekking av cellulose 34. De karakteristiske obligasjoner i bølgelengdeområdet mellom 1188 og 1510 cm -1 for APS behandlet firkantet papir er forårsaket av vibrasjoner av COC obligasjoner av glykosid broer og CH strekker vibrasjoner. De CH 2 strekker vibrasjons obligasjoner ble vist på 2,800-2,980 cm -1 og den høyeste toppen var på 2932 cm -1 for APS behandlet firkantet papir. Som konklusjon, kan APS bli kovalent podet til No. 1 og nr 113 filter kvadrat papirer.
Figur 4. Fluorescens svar på ulike konsentrasjoner av glutaraldehyd i immobilisering av IgG-FITC på papirskiver (metode B) Innstillinger for fluorescens molekylær imager. Eksitasjon, 488 nm, emisjon, 530 nm, oppløsning, 100 mikrometer A:. Fluorescens respons på 0, 0,001%, 0,005%, 0,01% og 0,050% glutaraldehyd B:. Fluorescens respons på 0, 0.050%, 0.100%, 0.250% og 0.500% glutaraldehyd. Konsentrasjonen av IgG-FITC på hver plate var 0,01 mg / ml. En økning i konsentrasjonen av glutaraldehyd til et maksimum på 0,05% resulterte i en økt laste mengde av IgG-FITC. Konsentrasjoner av glutaraldehyd over 0,05% redusert lasting mengde IgG-FITC. Klikk her for å se en større versjon av dennefigur.
Figur 5. Fluorescens respons (A) og kolorimetrisk resultat (B) av forskjellige konsentrasjoner av IgG-FITC på IgG-FITC-immobilisert mellom strømning og filterpapirskiver rask strømning (metode b) Innstillinger for fluorescens molekylær imager: Eksitasjon. , 488 nm, emisjon 530 nm, oppløsning, 100 mikrometer. 1 betegner grad No. 1, filterpapirskive medium-strømning, og # 113 representerer karakter No. 113 hurtig returfilteret papirskive. APS-modifisert papirskivene ble behandlet med 0,05% glutaraldehyd først. Deretter ble forskjellige konsentrasjoner av IgG-FITC lastet ombord i glutaraldehyd modifisert papirskiver. Ved å øke laste konsentrasjonen av IgG-FITC økte mengden av den immobiliserte IgG-FITC på papirskiver. Imidlertid har økte konsentrasjoner av immobilisert IgG-FITC ikke øke bindingskapasiteten til antigenet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Den grunnleggende arbeidsflyt for kovalent immobilisering av antistoffer på amin-funksjonalisert cellulosepapirskivene er vist i figur 1. Kanin-anti-humant IgG-FITC ble kovalent immobilisert på cellulosepapirskiver. Fluorescensen fra papirskivene indikerte immobilisering av antistoffer mot papirskiver, og intensiteten av fluorescens var direkte proporsjonal med konsentrasjonen av immobiliserte antistoffer. Peroksidasekonjugert geite-anti-kanin-IgG ble deretter brukt for å bestemme bindingsevnen til immobiliserte antistoffer. Sekundære amingrupper og aldehydgrupper kan reagere med hverandre for å danne en Schiff-base, som har vært brukt i bioconjugation 35. De ble også brukt her for kovalent immobilisering av fangstantistoffer. I metode A (figur 1A), -NH2 ble introdusert for cellulosepapirskiver og -CHO ble avledet fra kanin-anti-humant IgG-FITC ved oksydasjon av Fc-regionen av antistoffene med natriumperjodat. På samme måte ble effekten av forskjellige konsentrasjoner av natrium-periodat og IgG-FITC antistoff også analysert. Som vist i fig S1 og fig S2, natriumperjodat fra konsentrasjoner på 0 til 1 mm, og kanin-anti-humant IgG-FITC 0,016 til 0,16 mg / ml hadde liten effekt på oksidasjon av 0,08 mg / ml kanin-anti-humant IgG -FITC. Mengden av antistoff som er kovalent bundet til de papirskiver økes med økende konsentrasjon av fangst-antistoffer fra 0 til 0,075 mg / ml (figur S3A).
En svak fargeforandring ble observert når bindeevne ble bestemt ved peroksydase-analysen. Dette kan være på grunn av bruk avoverskudd av natrium-perjodat, som reagerer med fangst-antistoffer og forårsaker et tap av bindingsaktivitet. Det er sannsynlig at den natriumperjodat ikke helt kan vaskes bort fra papirskiver. Dette ble bekreftet av det enkle prinsippet at natriumperjodat løsningen gir en gul farge når de blandes med purpald løsning. Derfor ble perjodat oksyderte antistoffer applisert på papirplater og inkubert i 1 time. De papirskivene ble vasket tre ganger med PBS (inneholdende 0,05% Tween-20), og deretter purpald oppløsning ble tilsatt til disse plater. Papiret plater viste en fiolett farge umiddelbart, noe som indikerer nærværet av aldehydgrupper fra perjodatoksidert antistoffer. Fiolett farge forandret seg til gul i løpet av 10 minutter, noe som bekreftet nærværet av natrium-perjodat på papirskiver.
Alternativt ble et glutaraldehyd-tverrbindingsmetode (fremgangsmåte B, figur 1B) som brukes til å koble aminet gruppps fra APS-behandlet papir plater og antistoffer. Konsentrasjonene av glutaraldehyd (figur 4) og kanin-anti-humant IgG-FITC (figur 5A) som ble fylt på cellulosepapirskivene ble optimalisert. Som vist i figur 4, fluorescensintensiteten nådde et maksimum på 0,05% glutaraldehyd, noe som betyr at belastningen av kanin-anti-humant IgG-FITC ble mettet på cellulosepapirskive ved denne konsentrasjonen; en økning i konsentrasjonen av glutaraldehyd på 2,5% ikke viser en økning i mengden av kanin-anti-humant IgG-FITC på cellulosepapirskiver (figur S4). Fluorescensintensiteten økte også med økende konsentrasjoner av kanin-anti-humant IgG-FITC som ble lastet på papirskiver (figur 5A). En blå farge utvikles umiddelbart ved tilsetning av TMB substrat og hydrogenperoksyd blandingen løsning på papirskiver, som inneholdt peroxidase konjugerte gjenkjenning antistoffer (figur 5B). I tillegg blokkeringsbuffer som inneholdt 10% skummetmelkpulver ble vist å beholde den blokkerende effektivitet etter 15 vaskinger (figur S5). Metode B ble valgt for å teste anvendelsen av de immobiliserte antistoffer, som det vist forbedret bindingsaktivitet til målet. Derfor, ble en 0,025 mg / ml konsentrasjon av fangst-antistoffer anvendt for IgG-deteksjon.
Figur 6. Kalibreringskurver for bestemmelse av IgG ved papir-baserte ELISA. # 1 representerer grad No. 1, filterpapirskive medium-strømning, og # 113 representerer karakter No. 113 hurtig returfilteret papirskive. Det øvre panel A presenterer fargen avlesning for mellomstrøm (# 1) og fast-flow (# 113) cellulosepapirskiver med forskjellig konsentrasjon av IgG. Det nederste panelB viser ELISA-resultatet for forskjellig konsentrasjon av IgG. Triplicates ble benyttet for å bestemme standardavvik (SD). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Geit-anti-mus-IgG-Fc-fragment-fangst-antistoff IgG serum, og geite-anti-muse-IgG-Fc-fragment antistoff konjugert HRP ble brukt for sandwich-analyse. Som vist i figur 6 og figur S6, vil konsentrasjonen av IgG serum fra 0 til 500 ng / ml hadde en lineær sammenheng med kolorimetrisk intensitet når hvert trinn ble inkubert i 1 time. I fig S6, fargevariasjon med forskjellige konsentrasjoner av IgG var åpenbart i 1 time med inkubering. Likevel, har resultatene av 10 minutters inkubasjon ikke viser en tydelig forandring i fargeintensiteten med forskjellige konsentrasjoner av IgG. Dermed blir sensitivity av papirbasert ELISA var egnet for å utvikle praktisk point-of-care testing.
Figur S1. Fluorescens respons på forskjellige konsentrasjoner av natrium-periodat (metode A). Varierende konsentrasjoner av natrium-perjodat ble blandet med kanin-anti-humant IgG-FITC ved en konsentrasjon på 0,016 mg / ml og anvendt for å studere antistoff oksydasjon aktivitet. Ved å øke konsentrasjonen av natrium-perjodat, lasting mengden av IgG-FITC øket og nådde et maksimum ved 0,25 mM. Det ble observert at konsentrasjonen av natrium-perjodat som var høyere enn dette ikke øke mengden av immobilisert IgG-FITC. Triplicates ble benyttet for å bestemme standardavvik (SD). Klikk her for å laste ned denne filen.
Figur S2. fluorescens responss til forskjellige konsentrasjoner av kanin-anti-humant IgG-FITC (metode A). Konsentrasjonen av natrium-perjodat var 0,25 mM i løsningen for antistoffet oksydasjonsaktiviteten studium, og sluttkonsentrasjonen av kanin-anti-humant IgG-FITC på hver plate var 0,016 mg / ml. Når konsentrasjonen av natrium-perjodat ble fastsatt, vil konsentrasjonen av IgG-FITC hadde liten virkning på oksydasjonen av IgG-FITC. Triplicates ble benyttet for å bestemme standardavvik (SD). Klikk her for å laste ned denne filen.
Figur S3. Fluorescerende reaksjon og kolorimetrisk resultat fra lasting av forskjellige konsentrasjoner av oksydert kanin-anti-humant IgG-FITC på papirskiver (metode A). For natriumperjodat oksydasjon, 0,08 mg / ml IgG-FITC og 0,25 mM natriumperjodat ble anvendt. Den fortynning av peroksydase-konjugert anti-kanin-IgG var1: 50.000. Økning av laste konsentrasjonen av IgG-FITC på cellulosepapirskiver økt mengden av immobilisert IgG-FITC, men ikke har en effekt på målet bindende. Klikk her for å laste ned denne filen.
Figur S4. Fluorescens respons til høye konsentrasjoner av glutaraldehyd i immobiliseringen av IgG-FITC på cellulosepapirskiver (Metode B). Konsentrasjonen av IgG-FITC på hver plate var 0,01 mg / ml. Konsentrasjoner av glutaraldehyd som var høyere enn 0,25% ikke øke mengden av immobilisert IgG-FITC på cellulose papir plater. Klikk her for å laste ned denne filen.
Figur S5. Effekt av antall vaske ganger. A: var. Hing tre ganger B: vask 15 ganger. Capture antistoffer immobilisert på cellulose torget papiret fortsatt hadde god bindingskapasitet til sine mål, selv om plassen papiret ble vortex 15 ganger. Klikk her for å laste ned denne filen.
Figur S6. Papir-baserte ELISA-resultat for IgG. For konsentrasjonen av IgG fra 0 til 500 ng / ml, og resultatene fra en times inkubasjon er bedre enn resultatene fra 10 minutters inkubering. For høye konsentrasjoner av IgG, 10 minutter er nok tid for inkubasjon. Triplicates ble benyttet for å bestemme standardavvik (SD). Klikk her for å laste ned denne filen.
Figur S7. Scanning elektronmikroskopi (SEM) bilder av medium-flow filter papir på forskjellige forstørrelser. A: 85X og B: 20,000X. Feltavgi scanning elektronmikroskopi (FE-SEM) som opererer ved 5 kV ble anvendt for å bestemme den partikkelmorfologi. Cellulosefibrene er tilfeldig tverrbundet. Klikk her for å laste ned denne filen.
Figur S8. SEM bilder av hurtig strømning filterpapir ved forskjellige forstørrelser. A: 100X og B: 20,000X. Feltavgi scanning elektronmikroskopi (FE-SEM) som opererer ved 5 kV ble anvendt for å bestemme den partikkelmorfologi. Cellulosefibrene er tilfeldig tverrbundet. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Direkte belegg av affinitetsrenset geite-anti-mus-IgG-Fc-fangst-antistoff på umodifiserte cellulosepapirskiver ble utført for å påvise IgG-konsentrasjoner. Resultatene indikerte at, ytterligere fiksering av fangst-antistoffer er nødvendig for reproduserbarhet. Silanet teknikken ble med hell anvendt for å innføre aminfunksjonelle grupper til de cellulosepapirskiver 34. Konsentrasjonen av APS påvirker immobilisering av antistoffer. Derfor er mengden av APS i aceton ble også optimalisert. 1 ml av APS i 10 ml aceton ble en optimal konsentrasjon for poding av amingruppen for immobilisering av antistoffer gjennom et glutaraldehyd-tverrbindingsmiddel. Antistoffer ble podet på cellulosepapirskiver ved periodat oksydasjon og glutaraldehyd tverrbindingsmetoder. Våre resultater viste at bindingskapasiteten av immobiliserte antistoffer via glutaraldehyd tverrbindingsmetode var bedre enn den perjodatoksidering metode for medium-flow og rask flyt-filter papir plater. Videre fange antistoffer, som var immobilisert på cellulosepapirskivene gjennom et glutaraldehyd-tverrbindingsmetode, beholdt sin funksjon og var stabilt immobilisert selv om papiret ble utsatt for mekaniske påkjenninger av 15 vasker ved virvling. Ti prosent av skummetmelkpulver blokkerende buffer ble funnet å beholde sin sperrende effektivitet etter 15 vaskinger (figur S5).
De kovalent immobiliserte antistoffer ble brukt til å utføre en sandwich ELISA med påvisning av IgG. IgG ved en konsentrasjon på 100 ng / ml ble påvist med det blotte øye ved å bruke dette papiret platebasert assay. Konsentrasjonen av IgG serum fra 0 til 500 ng / ml viste en lineær sammenheng med kolorimetrisk intensitet, da hvert trinn ble inkubert i en time. Immunoanalysen testing for dette papirplatebasert ELISA kreves mindre prøve-reagens og syntes å være mer effektive enn konvensjonelle immunoassays 36 figur S7 og S8 fig, respektivt. Som vist i disse figurer, at fibrene er tilfeldig tverrbundet for begge typer filterpapirskiver 25. Årsaken til denne høye følsomhet kan være tykkelsen på papirskive. For hurtig-strømningsfilter papirskiver tykkelsen var 420 um sammenlignet med 180 um for mellom strømning filterpapir. Således flere fangst-antistoffer var sannsynlig å bli immobilisert på fast-strømningsfilter papirskiver, noe som ville ytterligere øke sensitiviteten av analysen. På samme tid, at porestørrelsen for de hurtig-strømningsfilter papirskiver (30 uM) var større enn den til mellomstrømningsfilterpapirskiver (11 & #181, m). Etter at papiroverflate blokkering, porestørrelsen av det tidligere var likevel stort nok til å drive væskestrømmen uten en ekstra kraftsystem. Imidlertid er strømningshastigheten for buffer i den sistnevnte var langsommere. Derfor hurtig-flow filterpapiret var bedre enn mellom strømning filterpapir ved anvendelse av immunoanalyser.
Reproduserbarheten av antistoffene på de immobiliserte filterpapirskiver ble evaluert ved ytterligere inkubering av papirskivene med peroksidase-konjugert geite-anti-kanin-IgG og deteksjon av den kolorimetriske resultatet etter lasting av TMB substrat og hydrogenperoksyd blanding oppløsning. Standardavviket var mindre enn 10% for dette papir-basert enhet. Stabiliteten av kanin-anti-humant IgG-FITC på -NH2 modifiserte cellulosepapirskiver ble testet i opptil to måneder. Papiret plater som ble lagret ved 4 ° C opprettholdt deres bindingsaktivitet til peroksidase-konjugert geite-anti-kanin-IgG med en liten nedgang i deres binding aktivitet. Imidlertid, når de antistoff immobilisert papirskivene ble lagret ved værelsestemperatur eller 60 ° C, mistet deres bindingsaktivitet på grunn av tørrhet og høy temperatur. De fangede antistoffer kunne ha destabilisert og denaturert under disse forholdene.
Det er noen kritiske trinn i immobiliseringen av fangst-antistoffer på cellulosepapirskiver ved hjelp av glutaraldehyd, som tverrbindingsmiddel. Trinn 1,2 til pode amingrupper på papirskiver er et kritisk punkt i den vellykkede kovalente immobilisering av fangst antistoffer. Hvis dette trinnet mislykkes, vil hele immobilisering prosessen mislykkes. FTIR ble anvendt for å bestemme hvorvidt amingrupper ble med hell immobilisert på papirskiver (trinn 1.6). For det andre er podingen av aldehydgrupper på cellulosepapirskivene et kritisk trinn (trinn 2.2.1 og trinn 3.1). Antistoffene ble immobilisert kovalent på cellulosepapirskivene gjennom dannelsen av en Schiff-base. Endelig, Skritt for å immobilisere fange antistoffer på filterpapirskiver er viktig (trinn 2.2.3, trinn 3.4, og trinn 3.5). Amingruppene fra fangst antistoffer reagerte med aldehydgruppene fra cellulose papir plater for å fikse antistoffene på papir plater. Hvis dette trinnet var mislykket, vil fange antistoffer ikke immobilisere på papirskiver og alle de ELISA-testene søknads ville være negative. Vi kan bruke en fluorescens molekylkamera for å bestemme tilstedeværelsen av fangst-antistoffer. Peroksidase-konjugert geite-anti-kanin-IgG og peroxydase-baserte kolorimetriske reaksjoner kan anvendes for å bekrefte bindingskapasitet av de immobiliserte antistoffer.
Denne protokollen kan støte på noen problemer, for eksempel en høy bakgrunn til signalet, noe signal eller et svakt signal, og en ujevn farge avlesning. De mulige årsakene til disse problemene og feilsøkingsmetoder for å overvinne disse problemene er omtalt nedenfor. Høye bakgrunnssignaler oppstår vanligvis due til en kort sperre tid. Dette kan løses ved å øke sperre inkubasjonstid, vasking av papirskivene grundig, og unngår tilsetning av overskudd av deteksjonsantistoff konjugert enzym for å fjerne høye bakgrunnssignaler. De mulige årsaker inkluderer et fravær av mål-antigen, over blokkering, utilstrekkelig inkubasjonstid, og en ikke-funksjonell deteksjon-antistoff-enzym-konjugat. For å overvinne disse problemene, må målantigener blir tilsatt og inkubert i et passende tidsrom ved hjelp av en ny antistoff-konjugat og lagring av det som foreslått av produsenten. Det er lurt å ta med en positiv kontroll for deteksjon. Ujevn farge avlesningene på grunn av stabling av papirskivene under podeprosessen. For å unngå dette problem, må papirskivene skal separeres under APS podeprosessen, og antigenet og deteksjonsantistoff konjugert enzym må fordeles jevnt på papirskive på hvert trinn.
Selv om det papirbaserte analysen er en enkelog kostnadseffektiv metode, er det begrensninger. Orienteringen av antistoffer på substratoverflaten er kritisk for utførelsen av immunoanalyse, som glutaraldehyd tverrbindingsmidlet reagerer med amingruppene fra Fab-regionen og Fc-regionen av fangst antistoffer. Dermed trenger de immobiliserte antistoffene ikke forekomme i en sterkt orientert måte. Siden det er flere amingrupper fra Fab-region enn fra Fc-regionen av IgG-antistoffer, er bindingsaktiviteten til de immobiliserte antistoffene fremdeles er høy nok for anvendelsen.
Ulike overflaten funksjonalise metoder for cellulose papir ble oppsummert i en fersk rapport 37. Reagenser slik som divinylsulfon; 1,4-phenylenediisothiocyanate; 4-azido-benzenediazonium; epiklorhydrin; 4-azido-a-fluor-2-nitrocyclohexane; og 4-merkapto-benzenediazonium, kan brukes til kovalent immobilisering av biomolekyler på cellulosepapir. Adsorpsjon og entrapment ble også benyttetå belegge cellulose papir med biomolekyler. Sammenlignet med andre fremgangsmåter, kombinasjonen av silanet teknikk og glutaraldehyd tverrbindingsmiddel for kovalent immobilisering av antistoffer på cellulosepapir er en enkel metode. I tillegg kan denne kombinasjon har liten effekt på den termiske og mekaniske ytelse av cellulosepapir, slik at den maksimale vertikale gjennomstrømning i immunoanalyser. Denne strategien kan bli utvidet til å immobilisere andre biomolekyler på cellulose papir.
Metodikken demonstrert her kan potensielt bli utvidet til påvisning av en hvilken som helst analytt, så lenge som direkte antistoffer mot det er tilgjengelig. Denne fremgangsmåten kan også benyttes til å utvikle multiplex deteksjon. For eksempel på en firkantet papir, kan ulike områder skilles for ulike mål. De fange antistoffer for målene kan immobiliseres via et glutaraldehyd-kryssbindingsmiddel på sin bestemt område. Dette kan bli etterfulgt av ELISEn fremgangsmåte for å detektere forskjellige mål. Dermed gjør den foreslåtte fremgangsmåte det papirbaserte ELISA et allsidig verktøy for detektering av andre mål ved hjelp av det blotte øye.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cellulose filter paper, Grade 1 (medium flow filter paper) | GE Healthcare Pte Ltd Singapore | 1001 110 | |
| Cellulose filter paper, Grade 113 (Fast flow filter paper) | Sigma-Aldrich, Singapore | 1113-320 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich, Singapore | G6257 | Grade II, 25% in H2O |
| Surfactant | Tween-20, Sigma-Aldrich, Singapore | P2287 | |
| Bovine serum album | Sigma-Aldrich, Singapore | A2153 | |
| Skimmed milk powder | Louis François | Packed by Kitchen Capers, Singapore | |
| Tris base | Promega | H5135 | |
| Sodium periodate | Merck | 106597 | |
| Na2HPO4 | Merck | 106585 | |
| KH2PO4 | Merck | 104873 | |
| NaCl | CALBIOCHEM | 567441 | |
| NaOH | Merck | 106462 | |
| HCl | Merck | 100317 | |
| phosphate buffer saline (PBS) | N/A | N/A | PBS, containing 137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 8.0 mmol/L Na2HPO4 and 1.5 mmol/L KH2PO4, is prepared with water and adjusted to pH 7.4 with 0.1 mol/L NaOH or 0.1 mol/L HCl |
| Acetone | Tee Hai Chem Pte Ltd Singapore | 9005-68 | |
| Mixture of TMB and hydrogen peroxide solution | 1-Step ultra TMB-ELISA solution , Thermo Scientific Pierce | 34029 | 1 L |
| Rabbit anti-human IgG-FITC | TWC/Bio Pte Ltd Singapore | sc-2278 | |
| Peroxidase conjugated goat anti-rabbit IgG | TWC/Bio Pte Ltd Singapore | sc-2030 | |
| Affinity purified goat anti-Mouse IgG-Fc coating antibody | Bethyl Laboratories, Inc | A90-131A | |
| Mouse reference serum | Bethyl Laboratories, Inc | RS10-101-5 | 9.5 mg/ml |
| HRP conjugated goat anti-mouse IgG-Fc detection antibody | Bethyl Laboratories, Inc | A90-131P | |
| Equipment | |||
| Fourier transform infrared spectrophotometer | Shimadzu IR Prestige-21 | N/A | |
| Fluorescence molecular imager | Pharos FXTM plus molecular imager, Bio-Rad, Singapore | N/A | |
| Oven | NUVE FN500 | N/A | |
| Turbo mixer VM-2000 | MYC LTD | N/A | |
| ImageJ | RGB, free download | N/A |
References
- Curtis, K. A., Rudolph, D. L., Owen, S. M. Rapid detection of HIV-1 by reverse-transcription, loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP). J. Virol. Methods. 151 (2), 264-270 (2008).
- Martinez, A. W., Phillips, S. T., Carrilho, E., Thomas, S. W., Sindi, H., Whitesides, G. M. Simple telemedicine for developing regions: camera phones and paper-based microfluidic devices for real-time, off-site diagnosis. Anal. Chem. 80 (10), 3699-3707 (2008).
- Lode, P. V. Point-of-care immunotesting: approaching the analytical performance of central laboratory methods. Clin. Biochem. 38 (7), 591-606 (2005).
- Posthuma-Trumpie, G. A., Amerongen, A. V., Korf, J., Berkel, W. J. V. Perspectives for on-site monitoring of progesterone. Trends Biotechnol. 27 (11), 652-660 (2009).
- Lim, D. V., Simpson, J. M., Kearns, E. A., Kramer, M. F. Current and developing technologies for monitoring agents of bioterrorism and biowarfare. Clin. Microbiol. Rev. 18 (4), 583-607 (2005).
- Li, X., Tian, J., Shen, W. Progress in patterned paper sizing for fabrication of paperbased microfluidic sensors. Cellulose. 17 (3), 649-659 (2010).
- Nie, Z., et al. Electrochemical sensing in paper-based microfluidic devices. Lab Chip. 10, 477-483 (2010).
- Delaney, J. L., Hogan, C. F., Tian, J., Shen, W. Electrogenerated chemiluminescence detection in paper-based microfluidic sensors. Anal. Chem. 83 (4), 1300-1306 (2011).
- Oh, Y. K., Joung, H. A., Kim, S., Kim, M. G. Vertical flow immunoassay (VFA) biosensor for a rapid one-step immunoassay. Lab Chip. 13 (5), 768-772 (2013).
- Cheng, C. M., et al.
- Jarujamrus, P., Tian, J., Li, X., Siripinyanond, A., Shiowatana, J., Shen, W. Mechanisms of red blood cells agglutination in antibody-treated paper. Analyst. 137 (9), 2205-2210 (2012).
- Credou, J., Volland, H., Dano, J., Berthelot, T. A one-step and biocompatible cellulose functionalization for covalent antibody immobilization on immunoassay membranes. J. Mat. Chem. B. 1, 3277-3286 (2013).
- Kong, F., Hu, Y. F. Biomolecule immobilization techniques for bioactive paper fabrication. Anal. Bioanal. Chem. 403, 7-13 (2012).
- Orelma, H., Teerinen, T., Johansson, L. S., Holappa, S., Laine, J. CMC-modified cellulose biointerface for antibody conjugation. Biomacromolecules. 13, 1051-1058 (2013).
- Yu, A., et al. Biofunctional paper via covalent modification of cellulose. Langmuir. 28 (30), 11265-11273 (2012).
- Stollner, D., Scheller, F. W., Warsinke, A. Activation of cellulose membranes with 1,1′-carbonyldiimidazole or 1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate as a basis for the development of immunosensors. Anal Biochem. 304 (2), 157-165 (2002).
- Bora, U., Sharma, P., Kannan, K., Nahar, P. Photoreactive cellulose membrane - a novel matrix for covalent immobilization of biomolecules. J. Biotechnol. 126 (2), 220-229 (2006).
- Sharma, P., Basir, S. F., Nahar, P. Photoimmobilization of unmodified carbohydrates on activated surface. J Colloid Interface Sci. 342 (1), 202-204 (2010).
- Brumer, H., Zhou, Q., Baumann, M. J., Carlsson, K., Teeri, T. T. Activation of crystalline cellulose surfaces through the chemoenzymatic modification of xyloglucan. J. Am. Chem. Soc. 126 (18), 5715-5721 (2004).
- Araujo, A. C., Song, Y., Lundeberg, J., Stahl, P. L., Brumer, H. Activated paper surfaces for the rapid hybridization of DNA through capillary transport. Anal Chem. 84 (7), 3311-3317 (2012).
- Xu, C., Spadiut, O., Araujo, A. C., Nakhai, A., Brumer, H. Chemo-enzymatic Assembly of Clickable Cellulose Surfaces via Multivalent Polysaccharides. ChemSusChem. 5 (4), 661-665 (2012).
- Filpponen, I., et al. Generic method for modular surface modification of cellulosic materials in aqueous medium by sequential "click" reaction and adsorption. Biomacromolecules. 13 (3), 736-742 (2012).
- Feese, E., Sadeghifar, H., Gracz, H. S., Argyropoulos, D. S., Ghiladi, R. A. Photobactericidal porphyrin-cellulose nanocrystals: synthesis, characterization, and antimicrobial properties. Biomacromolecules. 12 (10), 3528-3539 (2011).
- Zang, D., Ge, L., Yan, M., Song, X., Yu, J. Electrochemical immunoassay on a 3D microfluidic paper-based device. Chem. Commun. 48 (39), 4683-4685 (2012).
- Ge, L., Yan, J. X., Song, X. R., Yan, M., Ge, S. J., Yu, J. H. Three-dimensional paper-based electrochemiluminescence immunodevice for multiplexed measurement of biomarkers and point-of-care testing. Biomaterials. 33 (4), 1024-1031 (2012).
- Wang, S., et al. Paper-based chemiluminescence ELISA: lab-on-paper based on chitosan modified paper device and wax-screen-printing. Biosens. Bioelectron. 31 (1), 212-218 (2012).
- Koev, S. T., et al. Chitosan: an integrative biomaterial for lab-on-a-chip devices. Lab Chip. 10, 3026-3042 (2010).
- Wang, S. M., et al. Simple and covalent fabrication of a paper device and its application in sensitive chemiluminescence immunoassay. Analyst. 137 (16), 3821-3827 (2012).
- Sadira, S., Prabhakaranc, M. P., Wicaksonob, D. H. B., Ramakrishna, S. Fiber based enzyme-linked immunosorbent assay for C-reactive protein. Sensor Actuat B-Chem. 205, 50-60 (2014).
- Koga, H., Kitaoka, T., Isogai, A. In situ modification of cellulose paper with amino groups for catalytic applications. J. Mater. Chem. 21, 9356-9361 (2011).
- Klemm, D., Heublein, B., Fink, H. P., Bohn, A. Cellulose: fascinating biopolymer and sustainable raw material. Angew. Chem., Int. Ed. 44 (22), 3358-3393 (2005).
- Fernandes, S. C. M., et al. Bioinspired antimicrobial and biocompatible bacterial cellulose membranes obtained by surface functionalization with aminoalkyl groups. ACS Appl. Mater. Interfaces. 5 (8), 3290-3297 (2013).
- Pharos FX plus molecular imager instructions, Catalog Number 170-9460. , (2005).
- Tee, Y. B., Talib, R. A., Abdan, K., Chin, N. L., Basha, R. K., Yunos, K. F. M.
- Xing, Y., et al. Bioconjugated quantum dots for multiplexed and quantitative immunohistochemistry. Nat Protoc. 2, 1152-1165 (2007).
- Guidi, A., Laricchia-Robbio, L., Gianfaldoni, D., Revoltella, R., Del Bono, G. Comparison of a conventional immunoassay (ELISA) with a surface plasmon resonance-based biosensor for IGF-1 detection in cows' milk. Biosens Bioelectron. 16, 971-977 (2001).
- Ahmed, S., Bui, M. N., Abbas, A. Paper-based chemical and biological sensors: Engineering aspects. Biosens Bioelectron. 77, 249-263 (2016).
