Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

קשר הקוולנטי של נוגדני דיסקי נייר תאיים ואת היישומים שלהם ב Immunoassays מדד-צבע Naked-עין

Published: October 21, 2016 doi: 10.3791/54111
Automatic Translation
1, 2, 1, 1
1School of Applied Science, Temasek Polytechnic, 2University of Applied Sciences Utrecht

Abstract

דוח זה מציג שני שיטות הקיבוע קוולנטי של נוגדנים לכידים על כיתת נייר תאי מסנן מס '1 (נייר סינון בינוני זרימה) דיסקים ו כיתת מס' 113 (נייר סינון מהיר זרימה) דיסקים. דיסקי נייר התאיים אלה היו מורכבים עם קבוצות פונקציונליות אמינות באמצעות טכניקת צימוד silane לפני הנוגדנים היו משותקים עליהם. חמצון glutaraldehyde periodate צולב מקשרי שיטות שמשו שתל נוגדנים לכידים על דיסקי נייר התאי. על מנת להבטיח את קיבולת מחייב המקסימלי של הנוגדנים הלכידים לייעדם לאחר קיבוע, את ההשפעות של ריכוזים שונים של נתרן periodate, glutaraldehyde, ונוגדנים ללכוד על פני השטח של דיסקי נייר נחקרו. הנוגדנים שהיו מצופים על דיסקי נייר תאי פונקציונלי האמינים באמצעות סוכן glutaraldehyde cross-linking הראו משופרת פעילות מחייבת את היעד כשמשווה את שיטת חמצון periodate. IgG (בסרום עכבר הפניה) שמש כיעד התייחסות במחקר זה לבחון את היישום של נוגדנים משותקים קוולנטית דרך glutaraldehyde. Assay immunosorbent חדש המבוסס על נייר, enzyme-linked (ELISA) פותח בהצלחה ומאומת לצורך זיהוי של IgG. שיטה זו אינה דורשת ציוד, והוא יכול לזהות 100 ng / ml של IgG. העיתון מסנן במהירות הזרימה היה יותר רגיש מאשר נייר הסינון הבינוני-זרימה. תקופת הדגירה של assay זה היה קצר נדרש כרכים מדגם קטן. בעין בלתי מזוינת זה, ניתן להאריך immunoassay colorimetric לזהות מטרות אחרות המזוהות עם קונבנציונאלי ELISA.

Introduction

הבדיקות בנקודת הטיפול (POCT) מחקר אבחון חשוב לפיתוח אסטרטגיות חדשות עבור תרופות, רפואה אישית, ואת הטיפול הביתי 1. ניירות תאיות נמצאות בשימוש נרחב כמו פלטפורמות ב immunoassays, כפי שהם זולים, נגישים, ומוכר למשתמשים 2. בנוסף, המבנה הנקבובי של נייר תאי בעל הכח לנהוג זרימת נוזל ללא השפעת אנרגיה נוספת. רשום של bioanalysis מבוסס נייר ניתן למצוא מוקדם ככל המאה ה -20, כאשר כרומטוגרפיה נייר הומצא ראשון בשנת 1952. הדוגמא הנפוצה ביותר היא בדיקות immunochromatographic 3, כגון רצועות בדיקת הריון וסוכרת. בדיקות אלה מספקים פעמי assay מהירות יחסית וניתוח זול 4. בשל הפשטות שלהם, בדיקות רצועת נייר הרגילות אלה כבר בשימוש נרחב אבחון POCT 5.

שיטות איתור לרבות אלקטרו colorimetric 6,כימי 7, ו electrochemiluminescence 8 שיטות דווחו למדוד מטרות דגימות ביולוגיות. בנוסף שיטות כמותיות אלה, שיטה אמינה עבור משתק נוגדנים על נייר תאי חשובה גם לפיתוח מכשירים לאבחון. ספיחה שאינו ספציפי היא האסטרטגיה העיקרית שינוי לנוגדנים על פני השטח של מכשירים מבוססי נייר 9, 10 על מנת להבטיח קיבולת מחייב המקסימלי ליעדם לאחר קיבוע. עם זאת, מחקר קודם נוגדנים הראה כי הם נספגים על נייר תאי יכולים desorb מהסיבי 11 ב -40%. לכן, ספיחה ישירה של נוגדנים על תאית לא יכולה לספק תוצאות לשחזור 12. קוולנטיים וקיבוע של נוגדנים כי הם מורכבים על משטחי נייר הוא שיטה חלופית לפתח bioassays מבוסס נייר שנכנס לתוקף ב -13. שיטות שונות דווחו על השינוי של תאית 14, 15 12. Carbonyldiimidazole בשילוב עם 1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate 16; 1-fluoro-2-נטר-4-azidobenzene באמצעות אסטרטגית הפעלה מבוססת-UV 17, 18; אסטרטגיה chemoenzymatic מבוסס על 19 שינוי xyloglucan; סוכן מקשר 1,4-phenylenediisothiocyanate 20; חמצון 21 heteropolysaccharide כימיה לחץ 22; ו פורפירינים קטיוני 23 שימשו כדי לשתק ביומולקולות קוולנטית על נייר תאית. Chitosan שונה נייר נעשה שימוש כדי לפתח בסיס נייר immunodevices 24-26 שכן הוא שופע ביולוגי 27. Chitosan הוא קטיוני דבק בתוקף תאית anionic 27. הנוגדנים הלכידים הם משותקים על הנייר באמצעות ציפוי chitosan ו glutaraldehyde cross-linking. חמצון periodate שיטה אחרת עבור השתלת קפטנוגדנים יור על הנייר התאי 28. בשיטה זו, periodate נתרן הוא הבחין על הנייר להמיר קבוצות 1,2-dihydroxyl (גליקול) תאית ישירות לקבוצות אלדהיד. קבוצות אלדהיד משמשות ליצירת קשרים קוולנטיים בין סוכרים ונוגדנים 28. למרות הייצור הוא פשוט, קשה לשטוף periodate נתרן לחלוטין. Periodate נתרן הרחוץ יכול לגרום התחמצנות נוספת של הנוגדנים הם משותקים על הנייר התאי, המשפיע על הפעילות ויציבות של הנוגדנים N -. (3-dimethylaminopropyl) - N hydrochloride -ethylcarbodiimide ו- N linkers צלב -hydroxysuccinimide משמש גם כדי קוולנטית לשתק נוגדנים על nanofibers יצטט תאית והחומצה פולי- L- לקטית electrospun לפיתוח מבחנים מבוסס nanofiber 29.

במחקר זה, טכניקת צימוד silane שמשה שתל קבוצות פונקציונליות אמינות על cellulosדיסקי נייר דואר. טכניקה זו מסייעת לשמור על הגודל הנקבובי המקורי, פתילה, וסינון שיעור של ניירות לסנן תאית, מה שמאפשר immunoassays זרימה דרך אנכי מרבי. טכניקת צימוד silane כבר בשימוש נרחב biosensors כדי functionalize משטחי מצע עם קבוצות אמין משניות, ואחריו ביומולקולות באמצעות שינויים נוספים. ההשתלה של קבוצות אמינות על פני שטח מטריקס מהווה תגובת דחיסה בין קבוצות -OH של סוכני מצע מטריקס silane organofunctional 30. דיסקי הנייר התאיים היו פונקציונליים עם קבוצות אמינות על ידי צימוד silane באמצעות 3-aminopropyltrimethoxysilane (APS) 31. זאת בעקבות נוגדנים לכידת משתק קוולנטית באמצעות שתי שיטות שונות. השיטה הראשונה מעורבת מחייב של נוגדנים לכידים periodate מתחמצנים ל דיסקי נייר תאי פונקציונלי האמינים. השיטה השנייה השתמשו glutaraldehyde כסוכן cross-linking לצרף את לכידת antibodies את דיסקי נייר תאית קבוצה פונקציונלית האמינים. נוכחות נוגדנים לכידת אושרה על ידי isothiocyanate אנטי אנושי ארנב IgG-והעמסת (FITC), באמצעות תרמי מולקולרי פלואורסצנטי. הפעילות מחייבת שפן אנטי אנושי IgG-FITC כדי עז IgG נגד הארנב גם הוערכה על ידי מצע peroxidase. ההשפעות של ריכוזים שונים של נתרן periodate, glutaraldehyde, ונוגדנים ללכוד נחקרו. מבחן היישום של הנוגדן ללכוד משותקת בוצע בהצלחה באמצעות זיהוי של סרום IgG.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. קבוצות הארכת אמינים פונקציונליות על דיסקי נייר תאיים

  1. הכן פיסת נייר מרובע עם מימד של 1 ס"מ × 1 ס"מ, 100 דיסקים נייר עשויים מנייר תאית כיתה מס '1 בקוטר של 6.0 מ"מ (נייר סינון בינוני זרימה) באמצעות אגרוף חור.
  2. לגזור -NH 2 קבוצות על דיסקים נייר, לערבב 1 APS מ"ל ו -10 מ"ל אצטון בתוך בקבוק זכוכית 50 מ"ל ב למכסה המנוע קטר. להוסיף דיסקים נייר לתערובת מגיב מוכן טרי APS, דגירה במשך 5 שעות עם ערבוב מסלולית (200 סל"ד) בטמפרטורת החדר 32.
    זהירות: טפל APS ואצטון למכסת מנוע הקטר.
  3. למזוג פתרון עודף מהבקבוק זכוכית 50 מ"ל לתוך מיכל פסולת אורגנית.
  4. הוסף 10 מ"ל של אצטון לבקבוק זכוכית, מערבבים היטב למזוג לחלוטין להסיר כל APS unreacted וזיהומים אחרים. חזור על פעולה זו פעמיים.
  5. מורחים את הדיסקים נייר על מגבת נייר ומניחים בתנור C 110 מעלות במשך 3 שעות. אפשרדיסקי נייר לצינון. לאחסן את התקליטורים שפופרת 50 מ"ל צנטריפוגות בטמפרטורת החדר.
  6. השתמש ספקטרוסקופיית פורה (FTIR) כדי לבדוק את השתלת קבוצות האמינו על הנייר המרובע התאי, כמתואר להלן (איור 3 א).
    1. הפעל את המחשב ולפתוח את המכשיר ספקטרוסקופיה FTIR.
    2. פתח את תוכנת ספקטרוסקופיה FTIR.
    3. עבור אל 'מדידת → האתחול'. המלבנים עבור 'BS: KBR', 'מנורה: אינפרא אדום' ו 'לייזר' יהפוך לירוק כאשר אתחול נגמר.
    4. בחר "נתונים" מתחת מלבנים, ובחר '% העברה', 'Happ-גנזל', '45', '4.0', ו 'Min: 400, מקס: 4000' עבור 'מצב מדידה "," אפודיציה', ' לא. סריקות ',' החלטה ', ו' הטווח (סנטימטר-1) ".
    5. לחץ על 'מדוד'.
    6. בחר "קובץ נתונים 'עבור נתוני רקע. לִכתוֹבבמורד התגובות.
    7. לחץ על 'BKG' כדי לקבל את הבסיס עבור הרקע.
    8. תקן את הנייר המרובע על בעל מדגם סרט.
    9. בחר "קובץ נתונים 'עבור נתוני המדגם. רשום את ההערות.
    10. לחץ על 'מדגם' להשיג את הספקטרום למדגם.
    11. סגור את יישום ספקטרוסקופיה FTIR ולכבות את המחשב.
  7. חזור על השלבים לעיל (שלבי 1.1 עד 1.6) כדי להכין 113 מס 'כיתה אמינה-פונקציונלי נייר תאי מרובע ודיסקים (נייר סינון מהיר זרימה), ולקבל את ספקטרום FTIR עבור נייר מרובע כיתת מס' 113 (איור 3).

2. קוולנטיים קיבוע של נוגדנים על דיסקי נייר תאיים האמין פונקציונליים

איור 3
איור 1. קוולנטיים וקיבוע של נוגדנים על ידי שתי שיטות שונות.א. נוגדנים משותקים על דיסקי נייר תאיים אמינים פונקציונלי באמצעות חמצון periodate. שאריות הפחמימות היו חמצון על ידי נתרן periodate לייצר קבוצות פונקציונליות אלדהיד. לאחר מכן, נוגדני החמצון הועמסו דיסקי נייר תאיים פונקציונלי אמינים. B. הנוגדנים היו משותקים ואילך דיסקי נייר תאי פונקציונלי אמינים דרך glutaraldehyde. דיסקי הנייר התאיים פונקציונלי האמינים הושרו בתמיסת glutaraldehyde 0.05% להכניס קבוצות אלדהיד את דיסקי נייר. לאחר כביסה, נוגדנים הועמסו על דיסקי נייר פונקציונלי אלדהיד. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

  1. לשתק נוגדנים על דיסקי נייר תאיים פונקציונלי אמינים באמצעות חמצון periodate (איור 1 א).
    1. מערבבים 1 μl של 2.5 מ"מ נתרן periodate עם 2 μl של 0.1 מ"ג / מ"ל ​​ארנב אנטי אנושי IgG-FITC ו -7 μl של 100 מ"מ pH 5.5 חיץ אצטט צינור 1.5 מ"ל, ו דגירה תערובת בחושך במשך 30 דקות.
      הערה: בצע יחס נפח זה להכין נוגדנים מושחרים יותר במידת צורך. שינוי יחס נפח כדי לייעל את הריכוז של periodate נתרן אנטי אנושי IgG-FITC ארנב.
    2. לדלל את הפתרון נוגדן מעל עם 30 μl של 50 מ"מ חיץ מלוחים פוספט (PBS; pH 7.4) לנפח סופי של 40 μl.
    3. להכין שלושה דיסקים אמינים פונקציונליים בינוני זרימת מסנן נייר ושלושה פונקציונליים-אמין דיסקי נייר מהר-זרימה (כמתואר בסעיף 1).
      1. טען 5 μl של הארנב נתרן periodate חמצון אנטי אנושי IgG-FITC על כל דיסק בינוני זרימה מסנן נייר 8 μl על כל דיסק נייר סינון מהיר זרימה. שמור דיסקים נייר אלה בחושך במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
    4. לשטוף כל דיסק נייר עם 0.2 מיליליטר של חובב כביסהאה (50 מ"מ טריס חיץ עם 0.15 M NaCl ו 0.05 פעילי שטח%, pH 7.4). חזור על לשטוף שלוש פעמים.
    5. צלם את תמונות הקרינה באמצעות תרמי מולקולרי פלואורסצנטי לזהות הנוכחות של נוגדנים בכל דיסק נייר תאי 32. להשתמש בתקליטורי נייר ריק (שטופלו באותו ריכוז של נוגדנים בהעדר periodate נתרן) כביקורת (איור S1 איור S3).
      הערה: לקבלת אופטימיזציה ניסיון, לשנות את הריכוז של פרמטר אחד כי צריך להיות מותאמים ולתקן הריכוזים של כל פרמטרים האחרים. עוצמת קרינה גבוהה מגדילה את כמות הנוגדנים לכידים כי הם משותקים על דיסקי נייר התאי.
  2. לשתק נוגדנים על דיסקי נייר תאי פונקציונליים אמינים דרך glutaraldehyde (האיור 1B).
    1. מוסיף את הדיסקים בינוני זרימה מסננת פיסת נייר מיוחדת השלושה APS ואת דיסקי נייר סינון השלושה מהר-זרימה (described בסעיף 1) 2 מ"ל של 50 מ"מ PBS (pH 7.4) המכיל glutaraldehyde 0.05% במשך שעה 1, עם ערבוב מסלולית בטמפרטורת החדר.
      זהירות: טפל glutaraldehyde למכסת מנוע הקטר.
    2. מניחים שלושה דיסקים בכל בשני צינורות 1.5 מ"ל צנטריפוגות. הוסף 1 מ"ל של deionized (DI) מים על צינור אחד ולנער צינורות במשך 10 שניות. הסר את המים על ידי aspirating עם טפטפת. חזור פעמיים נוספות כדי להסיר כל glutaraldehyde unreacted.
    3. טען 5 μl של 25 מיקרוגרם / מיליליטר ארנב נגד לנוגדנים אנושיים-FITC (נוגדן ללכוד) על כל דיסק נייר סינון בינוני זרימה פונקציונלית-אלדהיד, ולהוסיף 8 μl על כל דיסק נייר סינון אלדהיד פונקציונלי במהירות זרימה. דגירה בחושך במשך כ 20 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, להוסיף 10 μl של 50 מ"מ PBS (pH 7.4) לכל דיסק נייר מבלי להסיר את הנוגדנים ו דגירה של 40 דקות עבור התגובה אלדהיד אמין.
    4. לשטוף את הדיסקים נייר עם 0.2 מ"ל של חיץ הכביסה על גבי מגבת נייר. חזור עללשטוף פעמיים.
    5. צלם את תמונות הקרינה באמצעות תרמי מולקולרי פלואורסצנטי כדי לבדוק את הימצאותם של נוגדנים בכל דיסק נייר תאי 33. להשתמש בתקליטורי נייר ריקים כביקורת.
      הערה: באיור 4, '0' מייצג את הדיסק נייר ריק וטופל ריכוז זהה של FITC-נוגדן בהעדר glutaraldehyde; באיור 5A, את דיסקי נייר הריקים טופלו glutaraldehyde, אבל אף נוגדני FITC הועמסו על דיסקי נייר.
  3. יבש את הדיסקים נייר (מ בסעיפים 2.1 ו -2.2) בשעה 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
  4. חסום את הדיסקים נייר עם 15 μl של חיץ חסימת (10% ברפרוף אבקת חלב ב 50 מ"מ טריס חיץ, pH 7.4, עם 0.15 M NaCl) במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  5. טען 5 μl ו -8 μl של מצומדות peroxidase IgG נגד ארנב עז ב PBS (1: 10,000) על זרימת בינוני ודיסקים נייר סינון מהיר זרימה, בהתאמה. דגירה30 דקות בחושך בטמפרטורת החדר.
  6. לשטוף את הדיסקים נייר עם 0.2 מ"ל של חיץ הכביסה על גבי מגבת נייר. חזור על לשטוף שלוש פעמים.
    הערה: אין צורך להסיר את חיץ הכביסה כמו התוצאות אינן מושפעות למאגר.
  7. טען תערובת 10 μl של 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) פתרון מי חמצן על כל דיסק.
  8. קח תמונות של דיסקי נייר עם מצלמה דיגיטלית או טלפון חכם לאחר 5 דקות של דגירה.
    הערה: איור 5 ב, '0' מייצג את הדיסקים נייר טופלו glutaraldehyde, ואחריו טעינת נוגדן-HRP (peroxidase צנון סוס) המצומד בהעדר FITC-נוגדן.

3. נייר מבוסס ELISA עבור IgG איתור

איור 2
איור 2. ייצוג סכמטי של ELISA מבוסס נייר FOזיהוי r IgG. לכידת נוגדנים היו משותקים קוולנטית על דיסקי נייר תאי פונקציונלי-אלדהיד דרך glutaraldehyde. דיסקי הנייר התאיים נחסמו עם חסימת חיץ. יעד IgG נוספה אז את הדיסקים, ואחריו את הטעינה של HRP-מצומדות נוגדני אות. לבסוף, את תערובת חמצן ומימן TMB הפתרון הועמס כל דיסק נייר את הודעת הצבע. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

  1. הוסף 5 מ"ל של תמיסת glutaraldehyde 0.05% (מוכן 50 חיץ מ"מ PBS, pH 7.4) על בקבוק זכוכית 20 מ"ל. לטבול 15 דיסקי נייר סינון אמינים פונקציונלי בינוני זרימה בפתרון זה ולשמור במשך שעה 1 עם רעד בטמפרטורת חדר.
    1. במקביל, חזור על שלב 3.1 להכין עוד 15 דיסקי נייר סינון פונקציונליים אלדהיד במהירות זרימה.
      זהירות: טפל glutaraldehyde של קטרמכסה מנוע.
  2. כדי להסיר glutaraldehyde unreacted מתקליטורי הנייר, הנח 15 הדיסקים בינוני זרימה מסנן נייר צינור צנטריפוגות 15 מ"ל, ו -15 דיסקים במהירות זרימת מסנן הנייר עוד 15 צינור צנטריפוגות מ"ל. הוסף 5 מ"ל מים DI צינור אחד ולנער צינורות במשך 10 שניות. הסר את המים על ידי aspirating עם טפטפת. חזור פעמיים כדי להסיר כל glutaraldehyde unreacted.
  3. ייבש את דיסקי נייר בתנור 37 מעלות צלזיוס.
  4. הוסף 5 μl ו -8 μl של 0.025 מ"ג / מ"ל ​​נוגדנים שבר העכבר IgG-Fc לכל אחד הדיסקים בינוני זרימה מהירה זרימת מסנן נייר, בהתאמה, ו דגירה במשך 20 דקות.
  5. הוסף 10 μl של 50 מ"מ PBS (pH 7.4) לכל דיסק נייר מבלי להסיר את הנוגדנים ו דגירה של 40 דקות עבור התגובה אלדהיד אמין.
  6. לשטוף את הדיסקים נייר עם 0.2 מ"ל של חיץ הכביסה על גבי מגבת נייר. חזור על לשטוף שלוש פעמים.
  7. ייבש את דיסקי נייר בתנור על 37 מעלות צלזיוס.
  8. חסום את הדיסקים נייר wה- i 15 μl של חיץ חסימת במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  9. לשטוף כל דיסק נייר עם 0.2 מ"ל של חיץ הכביסה על גבי מגבת נייר. חזור על לשטוף שלוש פעמים.
  10. הפעל סטנדרטי IgG.
    1. טען 10 μl של ריכוזי IgG שונים (למשל, 0, 10, 125, 250, ו -500 ng / ml ב PBS) על כל דיסק בשלושה עותקים. דגירה עבור שעה 1 בטמפרטורת החדר.
  11. לשטוף את הדיסקים נייר עם 0.2 מ"ל של חיץ הכביסה על גבי מגבת נייר. חזור על לשטוף שלוש פעמים.
  12. טען 10 μl של העכבר מצומדות HRP IgG-Fc נוגדנים שבר (1: 10,000, 10 מ"מ PBS, pH 7.4), ו דגירה במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר.
  13. לשטוף את הדיסקים נייר עם 0.2 מ"ל של חיץ הכביסה על גבי מגבת נייר. חזור על לשטוף שלוש פעמים.
    הערה: אין צורך להסיר את חיץ הכביסה כמו התוצאות אינן מושפעות על ידי הנוכחות של מאגר.
  14. טען תערובת 10 μl של TMB ואת מי חמצן על כל דיסק.
  15. Tתמונות אקה של כל הדיסקים נייר עם מצלמה דיגיטלית או טלפון חכם לאחר 5 דקות של דגירה.
    הערה: באיור 6A, '0' עומד דיסקים פיסת נייר מיוחד עם קיבוע נוגדן ללכוד, והפתרון נוגדן-HRP / TMB ללא סרום IgG.
  16. לנתח את העוצמה של כל דיסק נייר בתמונה לפי תמונות J.
    1. המר את התמונות שצולמו בשלב 3.15 לפורמט '.tif'.
    2. התוכנה פותחת את 'תמונת J'.
    3. עבור אל 'קובץ → פתח ", לבחור את התמונה כדי לנתח.
    4. בחר את לחצן הצורה 'הסגלגל ".
    5. עבור אל '→ תמונה סוג → 32 ביט ".
    6. עבור אל 'הפוך → ערוך'.
    7. עבור אל 'נתח → מדוד'.
    8. העתק ולנתח את הנתונים בגיליון אלקטרוני.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

איור 3
פורה איור 3. להפוך ספקטרום אינפרא אדום (FTIR) נייר מרובע מסנן בינוני זרימת מטופל APS שטופל (א) ונייר כיכר במהירות זרימת המסנן (B). א. הספקטרום עבור נייר מרובע מסנן בינוני זרימת מטופל היה דומה לזה של נייר מרובע מסנן מטופלי APS הבינוני-זרימה. הגידול בעוצמות ב להקות של 902-1,170 ס"מ -1 ו 1,210-1,500 -1 ס"מ עבור נייר מרובע שטופלו APS שייך Si-O-תאית דפורמציות CH של קבוצות SIOC-H, בהתאמה. התוספת של הלהקות 1,650 -1 סנטימטר ו 2,885 -1 סנטימטר שייך הכיפוף של -NH 2 ו- CH 2 רעידות מן המחצית המלוחה propyl, בהתאמה. ב. פסגות מאפיין של 972 עד 1,180 -1 ס"מ מגוון יוחסו Si-O-Si ו SO-ceאג"ח llulose. השיא ב 1,003 -1 ס"מ נגרם על ידי חפיפה של אג"ח Si-O-Si ואת CO מתיחה של תאית. כל התוצאות מראים כי APS היה מורכב בהצלחה על הניירות המרובעים התאי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

הנוכחות של קבוצות פונקציונליות אמינות על הניירות המרובעים התאיים נקבעה על ידי FTIR. איור 3 מציג את ספקטרום FTIR של מטופל, שינוי בינוני זרימה וניירות מרובעים מסנן במהירות זרימה. היו שלושה שלבים המעורבים השינוי הכימי של קבוצות aminoalkyl, באמצעות APS על המשטחים התאיים. שלב ראשון מעורב הידרוליזה של APS לספק נגזר silanol של APS. שלב שני מעורבים ספיחה של הנגזר APS הידרוליזה על סיבי תאית דרך מליטה מימן של קבוצות OH מן hydrolyzed APS נגזרים סיבי תאית. שלב שלישי מעורב ההתעבות של נגזר APS adsorbed, שהובילה ההשתלה של נגזר APS על פני השטח של תאית הסיבים באמצעות מליטת Si-OC ויצירת גשרי siloxane Si-O-Si 34. כפי שניתן לראות באיור 3 א, תוספת של הלהקה ב 1,650 -1 ס"מ יוחס כיפוף של קבוצות NH 2 ו תוספת של הלהקה ב 2,885 -1 ס"מ המתאים CH 2 תנודות של מחצית propyl silane. על פי העיתון המרובע המסנן בינוני זרימה המקורי, הלהקות ב 902-1,170 סנטימטר -1 ו 1,210-1,500 -1 סנטימטר תואמות את התנודות של אג"ח COC גשרי glycosidic ותנודות מתיחת CH. לאחר טיפול נייר המרובע עם APS, העלייה בעוצמת ב רוחבי הלהקה שני אלה עולה כי הם שייכים Si-O-תאי דפורמציות CH של קבוצות SIOC-H, בהתאמה. בדומה-fl בינוני ow לסנן נייר מרובע, הספקטרום עבור נייר מרובע מסנן במהירות זרימה שונה גם גבר על 1,650 -1 סנטימטר עבור -NH 2, בשל השינוי הכימי עם APS (איור 3B). פסגות המאפיין החזקות 972 1,180 -1 סנטימטר המגוון יוחסו אג"ח Si-O-Si ו SO-תאי; הפסגה הגבוהה ביותר היה ב 1,003 -1 ס"מ עקב חפיפה של אג"ח Si-O-Si ואת CO מתיחה של תאית 34. אגרות החוב מאפיין בטווח אורכי הגל בין 1,188 ו 1,510 -1 סנטימטר עבור APS מטופלי נייר מרובע נגרמות על ידי התנודות של אג"ח COC גשרי glycosidic ותנודות מתיחת CH. אגרות חוב רטט מתיחת 2 CH הוצגו 2,800-2,980 -1 סנטימטר ואת הפסגה הגבוהה ביותר היה ב 2,932 -1 סנטימטר עבור APS מטופלי נייר מרובע. לסיכום, APS יכול להיות מורכב קוולנטית מס '1 ו 113 ניירות מרובעים מסנן.

יפ-together.within-page = "1"> איור 4
איור 4. תגובות קרינה לריכוזים שונים של glutaraldehyde של חוסר התנועה של IgG-FITC על דיסקי נייר (שיטה ב) הגדרות עבור תרמי מולקולרי פלואורסצנטי:. עירור, 488 ננומטר, פליטה, 530 ננומטר, רזולוציה, מיקרומטר 100 A:. קרינה בתגובה 0, 0.001%, 0.005%, 0.01% ו 0.050% glutaraldehyde B:. בתגובה הקרינה 0, 0.050%, 0.100%, 0.250% ו 0.500 glutaraldehyde%. ריכוז IgG-FITC בכל דיסק היה 0.01 מ"ג / מ"ל. גידול בריכוז של glutaraldehyde עד למקסימום של 0.05% נבע בסכום טעינה ארוך יותר של IgG-FITC. ריכוזים של glutaraldehyde מעל 0.05% הפחיתו את כמות הטעינה של IgG-FITC. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של זהדמות.

איור 5
איור 5. תגובה הקרינה (א) ו תוצאה colorimetric (B) של ריכוזים שונים של IgG-FITC על דיסקים IgG-FITC-משותקת זרימה בינונית ומהירה זרימה מסנן נייר (שיטה ב) הגדרות עבור תרמי מולקולרי פלואורסצנטי:. עירור , 488 ננומטר, פליטה, 530 ננומטר, רזולוציה, מיקרומטר 100. # 1 מייצג כיתה מס '1, דיסק נייר סינון בינוני-זרימה, ו # 113 מייצג מס כיתה 113 דיסק נייר סינון מהיר זרימה. דיסקי נייר שונה APS טופלו glutaraldehyde 0.05% ראשונים. לאחר מכן, ריכוזים שונים של IgG-FITC הועמסו על דיסקי נייר שונה glutaraldehyde. הגדלת ריכוז העמסת IgG-FITC הגדילה את סכום IgG-FITC משותקת על דיסקים נייר. עם זאת, ריכוזי מוגבר משותקת IgG-FITC לא שיפר את יכולת קשירה של אנטיגן. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

את העבודה הבסיסית של חוסר התנועה קוולנטי של נוגדנים על דיסקי נייר תאיים פונקציונלי אמינים מוצגת באיור 1. אנטי-אדם ארנב IgG-FITC היה משותק קוולנטית על דיסקי נייר התאי. הקרינה מתקליטורי הנייר הצביעה על חוסר התנועה של נוגדני דיסקי הנייר, ואת עוצמת הקרינה הייתה ביחס ישר לריכוז של נוגדנים משותקים. IgG נגד הארנב העז peroxidase מצומדות הייתה מכן להחיל כדי לקבוע את היכולת המחייבת של הנוגדנים המשותקים. קבוצות אמינות משתי וקבוצות אלדהיד יכולים להגיב אחד עם השני כדי ליצור בסיס שייף, אשר נעשה שימוש bioconjugation 35. הם שימשו גם כאן חוסר תנועה קוולנטי של לכידתנוגדנים. בשיטה (איור 1 א), -NH 2 הוצג בפני דיסקים נייר תאית -CHO נגזרה IgG-FITC אנטי אנושי ארנב על ידי חמצון באזור Fc של נוגדנים עם periodate נתרן. באותו אופן, את ההשפעות של ריכוזים שונים של periodate נתרן נוגדני IgG-FITC נותחו גם. כפי שניתן לראות בתרשים S1 ואיור S2, נתרן periodate מריכוזי של 0 ל -1 מ"מ ואת אנטי אנושי IgG-FITC שפן 0.016 כדי 0.16 מ"ג / מ"ל היתה השפעה רבה על חמצון של 0.08 מ"ג / ארנב מ"ל אנטי אנושי IgG -FITC. כמות הנוגדנים נקשרו קוולנטית הדיסקים נייר גדל עם ריכוז גדל והולך של נוגדנים ללכוד מ 0 עד 0.075 מ"ג / מ"ל (איור S3A).

שינוי צבע קלוש נצפה כאשר יכולת המחייב נקבעה על ידי assay peroxidase. זה יכול להיות בגלל השימושperiodate העודף נתרן, אשר מגיב עם הנוגדנים הלכידים וגורם להפסד של פעילות מחייבת. סביר להניח כי periodate נתרן לא ניתן לכבס לחלוטין מן הדיסקים נייר. זו אושרה על ידי עיקרון פשוט כי פתרון נתרן periodate מספק צבע צהוב כאשר מעורבב עם פתרון purpald. לכן, נוגדני חמצון periodate הועמסו על דיסקי נייר וטופחו במשך שעה 1. דיסקי הנייר נשטפו שלוש פעמים עם PBS (המכיל 0.05%-20 tween), ולאחר מכן פתרון purpald התווסף הדיסקים האלה. הדיסקים נייר הראה צבע סגול מיד, המעידים על נוכחות של קבוצות אלדהיד מ נוגדנים-חמצון periodate. צבע סגול זה השתנה לצהוב תוך 10 דקות, אשר אישר את נוכחותו של periodate נתרן על דיסקים נייר.

לחלופין, cross-linking glutaraldehyde שיטה (שיטת B, איור 1B) שימש לקשר את grou אמיןps מהתקליטורים ונוגדני נייר שטופל APS. ריכוזי glutaraldehyde (איור 4) ארנב אנטי אנושי IgG-FITC (איור 5 א) כי הועמסו על דיסקים נייר תאית היו אופטימיזציה. כפי שניתן לראות בתרשים 4, עוצמת הקרינה הגיעה למקסימום של 0.05% glutaraldehyde, כלומר את הטעינה של הארנב נגד לנוגדנים אנושיים-FITC הפכה רוויה בתקליטור תאית נייר בריכוז זה; עלייה בריכוז של glutaraldehyde 2.5% לא מצביעה על עלייה בסך של אנטי אנושי הארנב IgG-FITC על דיסקי נייר התאי (האיור S4). עוצמת הקרינה גם גדלה עם ריכוזים גוברים של הארנב נגד לנוגדנים אנושיים-FITC כי הועמסו על דיסקי נייר (איור 5 א). צבע כחול פתח מייד עם התוספת של פתרון תערובת מצע ומימן TMB מי את דיסקי נייר, שהכיל את peroxidasנוגדני איתור דואר מצומדות (איור 5). בנוסף, חסימת חיץ שהכיל 10% ברפרוף אבקת חלב הוצגה כדי לשמר את יעילות החסימה אחרי 15 שטיפות (איור S5). שיטה ב נבחר כדי לבדוק את היישום של הנוגדנים המשותקים, כפי שהוכיח משופרת פעילות מחייבת למטרתה. לפיכך, ריכוז 0.025 מ"ג / מ"ל ​​של נוגדנים לכידת שימש לגילוי IgG.

איור 6
עקומות כיול איור 6. לקביעת IgG ידי מבוססי נייר ELISA. # 1 מייצג כיתה מס '1, דיסק נייר סינון בינוני-זרימה, ו # 113 מייצג מס כיתה 113 דיסק נייר סינון מהיר זרימה. א 'הפנל העליונה מציגה את הודעת הצבע עבור זרימה בינונית (# 1) ומהירה-זרימה (# 113) דיסקי נייר תאי עם ריכוז שונה של IgG. הפאנל התחתוןB מציג את התוצאה ELISA עבור ריכוז שונה של IgG. Triplicates שימשו כדי לקבוע את סטיית התקן (SD). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

עיזים אנטי עכבר IgG-Fc שבר ללכוד נוגדנים, סרום IgG, ועז אנטי עכבר נוגדנים IgG-Fc שבר מצומדות HRP שימשו עבור assay כריך. כפי שניתן לראות בתרשים 6 ואיור S6, ריכוז בסרום IgG מן 0 500 מ"ל / ng היו יחסים ליניארי בעוצמה colorimetric כאשר כל שלב הודגר במשך שעה 1. באיור S6, וריאציה בצבע עם ריכוזים שונים של IgG היה ברור במשך שעה 1 של דגירה. עם זאת, התוצאות של דגירת 10 דקות לא הראו שינוי ברור בעוצמת הצבע עם ריכוזים שונים של IgG. לפיכך, sensitivity של ELISA מבוסס נייר זה היה מתאים לפיתוח בדיקות צבע של טיפול מעשיות.

איור S1. תגובות קרינה לריכוזים שונים של periodate נתרן (השיטה א). ריכוזים שונים של periodate נתרן עורבבו עם IgG-FITC אנטי אנושי ארנב בריכוז של 0.016 מ"ג / מ"ל ומשומש לחקר פעילות חמצון נוגדן. על ידי הגדלת ריכוז נתרן periodate, כמות הטעינה של IgG-FITC עלתה והגיעה לכל היותר ברמה של 0.25 מ"מ. היה נראה כי ריכוזי periodate נתרן שהיו גבוהים יותר מאשר זה לא להגדיל את כמות משותקת IgG-FITC. Triplicates שימשו כדי לקבוע את סטיית התקן (SD). אנא לחץ כאן להורדת הקובץ הזה.

איור S2. בתגובת קרינהים לריכוזים שונים של ארנב נגד לנוגדנים אנושיים-FITC (שיטה). ריכוז periodate נתרן היה 0.25 מ"מ הפתרון לחקר פעילות נוגדן חמצון, ואת הריכוז הסופי של ארנב נגד לנוגדנים אנושיים-FITC בכל דיסק היה 0.016 מ"ג / מ"ל. כאשר ריכוז הנתרן periodate היה קבוע, ריכוז IgG-FITC היתה השפעה רבה על חמצון של IgG-FITC. Triplicates שימשו כדי לקבוע את סטיית התקן (SD). אנא לחץ כאן להורדת הקובץ הזה.

איור S3. בתגובה הקרינה ואת התוצאה colorimetric טעינת ריכוזים שונים של אנטי אנושי ארנב חמצון IgG-FITC על דיסקים נייר (שיטה א). לחמצון periodate נתרן, 0.08 מ"ג / מ"ל של IgG-FITC ו periodate נתרן 0.25 מ"מ שימשו. הדילול של IgG נגד הארנב peroxidase מצומדות היה1: 50,000. הגדלת ריכוז העמסת IgG-FITC על דיסקים נייר תאית הגדילה את כמות IgG-FITC משותקת, אבל לא הייתה השפעה על היעד מחייב. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

איור S4. בתגובה הקרינה לריכוזים גבוהים של glutaraldehyde של חוסר תנועה של IgG-FITC על דיסקים נייר תאית (שיטה ב '). ריכוז IgG-FITC בכל דיסק היה 0.01 מ"ג / מ"ל. ריכוזים של glutaraldehyde כי היו גבוהים יותר מאשר 0.25% לא להגדיל את כמות משותקת IgG-FITC על דיסקי נייר התאי. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

איור S5. השפעת מספר פעמי כביסה. ת: היה. הינג שלוש פעמים B: כביסה 15 פעמים. נוגדנים לכידים משותקים על הנייר התאי המרובע עדיין היו קיבולת מחייב טובה המטרות שלהם, אף על פי נייר כיכר vortexed 15 פעמים. אנא לחץ כאן להורדת הקובץ הזה.

איור S6. נייר מבוסס תוצאת ELISA עבור IgG. עבור הריכוזים של IgG מ 0 500 מיליליטר / ng, התוצאות משעה של דגירה עדיפות על התוצאות מ 10 דקות של דגירה. עבור ריכוזים גבוהים של IgG, 10 דקות זה מספיק זמן הדגירה. Triplicates שימשו כדי לקבוע את סטיית התקן (SD). אנא לחץ כאן להורדת הקובץ הזה.

איור S7. במיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) תמונות נייר סינון בינוני זרימה בהגדלות שונות. ת: 85X ו- B: 20,000X. במיקרוסקופ אלקטרוני פליטת סריקת שדה (FE-SEM) הפועלים 5 kV הועסק כדי לקבוע את מורפולוגיה החלקיקים. סיבי תאית הם באקראי צולבים. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

איור S8. SEM תמונות של נייר סינון מהיר זרימה בהגדלות שונות. ת: 100X ו- B: 20,000X. במיקרוסקופ אלקטרוני פליטת סריקת שדה (FE-SEM) הפועלים 5 kV הועסק כדי לקבוע את מורפולוגיה החלקיקים. סיבי תאית הם באקראי צולבים. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ציפוי ישיר של נוגדן ללכוד IgG-Fc אנטי העכבר עז מטוהרת זיקה על דיסקי נייר תאיים ללא שינוי בוצע כדי לזהות ריכוזי IgG. התוצאות הצביעו על כך, קיבעון נוסף של הנוגדנים הלכידים נדרש עבור שחזור. טכניקת silane שמשה בהצלחה להציג קבוצות פונקציונליות אמינות אל הדיסקים התאיים נייר 34. ריכוז APS משפיע על חוסר התנועה של נוגדנים. לפיכך, הסכום של APS אצטון היה מותאם גם. 1 מ"ל של APS 10 מ"ל של אצטון היה ריכוז אופטימלי עבור השתלת קבוצה אמינית עבור קיבוע של נוגדנים באמצעות סוכן cross-linking glutaraldehyde. נוגדנים היו מורכבים על דיסקי נייר התאי על ידי חמצון periodate ו glutaraldehyde שיטות cross-linking. התוצאות שלנו גילו כי קיבולת המחייב של נוגדנים משותקים בשיטת glutaraldehyde cross-linking הייתה טובה יותר מאשר שיטת חמצון periodate עבור medזרימה ium ודיסקים נייר זרימה מסנן מהר. יתר על כן, לכידת נוגדנים, אשר היו משותקים על דיסקי נייר תאיים באמצעות שיטת glutaraldehyde cross-linking, שומרים תפקידם היו משותקים ביציבות למרות הנייר היה נתון ללחץ המכאני של 15 שטיפות ידי vortexing. עשרה אחוזים למאגר חסימת אבקת חלב דל השומן נמצאו לשמר יעיל החסימה שלה אחרי 15 שטיפות (איור S5).

הנוגדנים המשותקים קוולנטית שמשו לבצע ELISA כריך עם זיהוי של IgG. IgG בריכוז של ml 100 ng / זוהה עם בעין בלתי מזוינת באמצעות assay מבוסס דיסק במאמר זה. ריכוז בסרום IgG מן 0 500 מ"ל / ng הראה קשר לינארי בעוצמה colorimetric, כאשר כל שלב היה וטופחו במשך שעה אחת. בדיקת immunoassay עבור דיסק במאמר זה מבוסס ELISA נדרשה מגיב מדגם פחות שנראה יעיל יותר immunoassays הקונבנציונלי 36 באיור S7 ואיור S8, בהתאמה. כפי שמודגם דמויות אלה, הסיבים הם באקראי צולבים עבור שני סוגי דיסקים נייר פילטר 25. הסיבה רגישות גבוה זה יכול להיות בעובי של דיסק נייר. דיסקי נייר סינון מהיר זרימת העובי היה 420 מיקרומטר לעומת 180 מיקרומטר עבור נייר סינון בינוני-זרימה. לכן, יותר נוגדני בשבי היו צפויים להיות משותק על דיסקי נייר סינון מהיר זרימה, אשר נוספת יגדילו את הרגישות של assay. במקביל, הגודל הנקבובי עבור דיסקי נייר סינון מהיר זרימה (30 מיקרומטר) היה גדול יותר מזה של דיסקי נייר בינוני זרימה המסננת (11 & #181; מ '). לאחר חסימת משטח נייר, הגודל הנקבובי של לשעבר עדיין היה גדול מספיק כדי לנהוג זרימת נוזל ללא מערכת תוספת כוח. עם זאת, שיעור הזרימה של חיץ באחרון היה איטי. לכן, נייר סינון מהיר זרימה היה טוב יותר מאשר נייר סינון בינוני זרימה ביישום של immunoassays.

השחזור של הנוגדנים על דיסקי נייר סינון המשותקים הוערך על ידי דגירה נוספת של דיסקי נייר עם IgG נגד ארנב העז peroxidase מצומדות וזיהוי של תוצאת colorimetric לאחר טעינת פתרון תערובת TMB מצע ומימן פרוקסיד. סטיית התקן היה פחות מ -10% עבור מכשיר המבוסס על נייר זה. היציבות של אנטי אנושי הארנב IgG-FITC על דיסקי נייר התאיים השונים -NH 2 נבדקה עד חודשים. דיסקי הנייר אוחסנו ב 4 ° C נשמרו פעילות המחייב שלהם peroxidase מצומדות העז IgG נגד ארנב עם ירידה קלה דו שלהםnding פעילות. עם זאת, כאשר את הדיסקים נייר משותקת נוגדן אוחסנו בטמפרטורת החדר או 60 מעלות צלזיוס, הם איבדו את פעילות מחייב שלהם בשל יובש וטמפרטורה גבוהה. הנוגדנים שנתפסו יכולים לערעור ו מפוגל בתנאים אלה.

ישנם כמה צעדים קריטיים והקיבוע של נוגדנים לכידים על דיסקי נייר התאי באמצעות glutaraldehyde כסוכן cross-linking. שלב 1.2 להשתיל קבוצות האמינו על דיסקי נייר הוא שלב קריטי וקיבוע קוולנטיים המוצלח של נוגדנים ללכוד. אם הצעד הזה נכשל, תהליך הקיבוע כולו ייכשל. FTIR שמש כדי לקבוע אם קבוצות אמינות היו משותקות בהצלחה על דיסקי נייר (שלב 1.6). שנית, ההשתלה של קבוצות אלדהיד על דיסקי נייר התאי היא עוד שלב קריטי (שלב 2.2.1 ו שלב 3.1). הנוגדנים היו משותקים קוולנטית על דיסקי נייר התאי דרך ההיווצרות של בסיס שייף. סוף כל סוף, הצעד כדי לשתק נוגדנים לכידים על דיסקי נייר פילטר חשוב (שלב 2.2.3, שלב 3.4, ו שלב 3.5). הקבוצות האמינות מן הנוגדנים הלכידים הגיבו עם קבוצות אלדהיד מתקליטורי הנייר התאי לתקן את הנוגדנים על דיסקי נייר. אם צעד זה לא עלה יפה, נוגדנים לכידים לא לשתק על דיסקי נייר כל בדיקות יישום ELISA יהיה שלילי. אנחנו יכולים להשתמש תרמי מולקולרי פלואורסצנטי כדי לקבוע את הנוכחות של נוגדנים ללכוד. Peroxidase מצומדות IgG נגד הארנב עז ותגובות colorimetric מבוסס peroxidase ניתן להשתמש כדי לאשר את קיבולת המחייב של הנוגדנים המשותקים.

פרוטוקול זה עלול להיתקל כמה בעיות, כגון רקע גבוה לאות, אין אות או אות חלשה, וכן הודעת צבע אחידה. הסיבות האפשריות של בעיות אלה ושיטות תקלות עבור להתגבר על בעיות אלה נדונים להלן. אותות רקע גבוהים מתרחשים בדרך כלל duדואר לזמן חסימה קצר. אפשר לפתור זאת על ידי הגדלת זמן דגירת החסימה, שטיפת דיסקי נייר ביסודיות, והימנעות התוספת של אנזים המצומד נוגדן זיהוי העודף להסיר אותות רקע גבוהים. הסיבות האפשריות כוללות היעדר אנטיגן היעד, על חסימה, זמן דגירה מספיק, וכן המצומד אנזים נוגדן זיהוי שאינו פונקציונלי. כדי להתגבר על בעיות אלה, אנטיגנים היעד יש להוסיף וטופחו במשך תקופה מתאימה הזמן באמצעות המצומד נוגדן חדש ואחסונו כפי שהוצע על ידי היצרן. רצוי לכלול שליטה חיובית לצורך זיהוי. readouts צבע האחיד הן בשל הערמה של דיסקי נייר במהלך תהליך ההשתלה. כדי להימנע מבעיה זו, את דיסקי נייר יש להפריד במהלך תהליך השתלת APS, ואת אנזים המצומד נוגדן אנטיגן וזיהוי חייב להתפרס באופן אחיד על דיסק נייר בכל שלב.

למרות assay מבוסס הנייר הוא פשוטועלות שיטה יעילה, יש מגבלות. האוריינטציה של נוגדנים על פני המצע הוא קריטי ביצועים של immunoassay, כסוכן glutaraldehyde cross-linking מגיב עם קבוצות האמין מאזור Fab והאזור Fc של נוגדנים ללכוד. לפיכך, נוגדנים המשותקים אינם מתרחשים באופן אורינטציה מאוד. מאחר שיש קבוצות אמינות יותר מאזור Fab מ מאזור Fc של נוגדנים מסוג IgG, הפעילות המחייבת של הנוגדנים המשותקים עדיין גבוהה מספיק עבור היישום שלהם.

שיטות functionalization המשטח שונות עבור נייר תאי סוכמו בדו"ח אחרון 37. ריאגנטים כגון sulfone divinyl; 1,4-phenylenediisothiocyanate; 4-azido-benzenediazonium; epichlorohydrin; 4-azido-א-fluoro-2-nitrocyclohexane; ו -4-mercapto-benzenediazonium, יכול לשמש כדי לשתק ביומולקולות קוולנטית על נייר תאי. ספיחה על המלכוד גם נוצלוכדי לצפות את הנייר התאי ביומולקולות. בהשוואה לשיטות האחרות, שילוב של טכניקת silane ואת glutaraldehyde סוכן cross-linking עבור קיבוע קוולנטי של נוגדנים על נייר תאי הוא שיטה פשוטה. בנוסף, השילוב הזה יכול להיות השפעה מועטת על הביצועים התרמיים מכאניים של נייר התאי, מה שמאפשר את הזרימה דרך אנכי מרבי immunoassays. אסטרטגיה זו יכולה להתארך עד לשתק ביומולקולות אחרות על הנייר התאי.

המתודולוגיה הפגינה כאן ניתן תהיה להרחיב באופן פוטנציאלי זיהוי של כל אנליטי, כל עוד נוגדנים ישירים נגדה זמינים. שיטה זו יכולה לשמש גם כדי לפתח זיהוי זמני. לדוגמא, על נייר מרובע, אזורים שונים ניתן להבחין מטרות שונות. לכידתו נוגדנים עבור המטרות יכולים להיות משותקים באמצעות סוכן glutaraldehyde cross-linking באזור המסוים שלהם. זה יכול להיות מלווה על ידי ELISהליך לאיתור מטרות שונות. לכן, השיטה המוצעת הופך את כלי תכליתי ELISA מבוססי נייר לצורך זיהוי של מטרות אחרות באמצעות בעין בלתי מזוינת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cellulose filter paper, Grade 1 (medium flow filter paper) GE Healthcare Pte Ltd Singapore  1001 110
Cellulose filter paper, Grade 113 (Fast flow filter paper) Sigma-Aldrich, Singapore 1113-320
Glutaraldehyde Sigma-Aldrich, Singapore G6257 Grade II, 25% in H2O
Surfactant Tween-20, Sigma-Aldrich, Singapore P2287
Bovine serum album  Sigma-Aldrich, Singapore A2153
Skimmed milk powder Louis François  Packed by Kitchen Capers, Singapore
Tris base Promega H5135
Sodium periodate Merck 106597
Na2HPO4 Merck 106585
KH2PO4 Merck 104873
NaCl CALBIOCHEM 567441
NaOH Merck 106462
HCl Merck 100317
phosphate buffer saline (PBS) N/A N/A PBS, containing 137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 8.0 mmol⁠/⁠L Na2HPO4 and 1.5 mmol/L KH2PO4, is prepared with water and adjusted to pH 7.4 with 0.1 mol/L NaOH or 0.1 mol/L HCl
Acetone Tee Hai Chem Pte Ltd Singapore 9005-68
Mixture of TMB and hydrogen peroxide solution  1-Step ultra TMB-ELISA solution , Thermo Scientific Pierce 34029 1 L
Rabbit anti-human IgG-FITC TWC/Bio Pte Ltd Singapore sc-2278
Peroxidase conjugated goat anti-rabbit IgG TWC/Bio Pte Ltd Singapore sc-2030
Affinity purified goat anti-Mouse IgG-Fc coating antibody Bethyl Laboratories, Inc A90-131A
Mouse reference serum Bethyl Laboratories, Inc RS10-101-5 9.5 mg/ml
HRP conjugated goat anti-mouse IgG-Fc detection antibody Bethyl Laboratories, Inc A90-131P
Equipment
Fourier transform infrared spectrophotometer Shimadzu IR Prestige-21  N/A
Fluorescence molecular imager Pharos FXTM plus molecular imager, Bio-Rad, Singapore N/A
Oven NUVE FN500 N/A
Turbo mixer VM-2000 MYC LTD N/A
ImageJ RGB, free download N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Curtis, K. A., Rudolph, D. L., Owen, S. M. Rapid detection of HIV-1 by reverse-transcription, loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP). J. Virol. Methods. 151 (2), 264-270 (2008).
  2. Martinez, A. W., Phillips, S. T., Carrilho, E., Thomas, S. W., Sindi, H., Whitesides, G. M. Simple telemedicine for developing regions: camera phones and paper-based microfluidic devices for real-time, off-site diagnosis. Anal. Chem. 80 (10), 3699-3707 (2008).
  3. Lode, P. V. Point-of-care immunotesting: approaching the analytical performance of central laboratory methods. Clin. Biochem. 38 (7), 591-606 (2005).
  4. Posthuma-Trumpie, G. A., Amerongen, A. V., Korf, J., Berkel, W. J. V. Perspectives for on-site monitoring of progesterone. Trends Biotechnol. 27 (11), 652-660 (2009).
  5. Lim, D. V., Simpson, J. M., Kearns, E. A., Kramer, M. F. Current and developing technologies for monitoring agents of bioterrorism and biowarfare. Clin. Microbiol. Rev. 18 (4), 583-607 (2005).
  6. Li, X., Tian, J., Shen, W. Progress in patterned paper sizing for fabrication of paperbased microfluidic sensors. Cellulose. 17 (3), 649-659 (2010).
  7. Nie, Z., et al. Electrochemical sensing in paper-based microfluidic devices. Lab Chip. 10, 477-483 (2010).
  8. Delaney, J. L., Hogan, C. F., Tian, J., Shen, W. Electrogenerated chemiluminescence detection in paper-based microfluidic sensors. Anal. Chem. 83 (4), 1300-1306 (2011).
  9. Oh, Y. K., Joung, H. A., Kim, S., Kim, M. G. Vertical flow immunoassay (VFA) biosensor for a rapid one-step immunoassay. Lab Chip. 13 (5), 768-772 (2013).
  10. Cheng, C. M., et al. Paper-based ELISA. Angew. Chem. 122 (28), 4881-4884 (2010).
  11. Jarujamrus, P., Tian, J., Li, X., Siripinyanond, A., Shiowatana, J., Shen, W. Mechanisms of red blood cells agglutination in antibody-treated paper. Analyst. 137 (9), 2205-2210 (2012).
  12. Credou, J., Volland, H., Dano, J., Berthelot, T. A one-step and biocompatible cellulose functionalization for covalent antibody immobilization on immunoassay membranes. J. Mat. Chem. B. 1, 3277-3286 (2013).
  13. Kong, F., Hu, Y. F. Biomolecule immobilization techniques for bioactive paper fabrication. Anal. Bioanal. Chem. 403, 7-13 (2012).
  14. Orelma, H., Teerinen, T., Johansson, L. S., Holappa, S., Laine, J. CMC-modified cellulose biointerface for antibody conjugation. Biomacromolecules. 13, 1051-1058 (2013).
  15. Yu, A., et al. Biofunctional paper via covalent modification of cellulose. Langmuir. 28 (30), 11265-11273 (2012).
  16. Stollner, D., Scheller, F. W., Warsinke, A. Activation of cellulose membranes with 1,1′-carbonyldiimidazole or 1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate as a basis for the development of immunosensors. Anal Biochem. 304 (2), 157-165 (2002).
  17. Bora, U., Sharma, P., Kannan, K., Nahar, P. Photoreactive cellulose membrane - a novel matrix for covalent immobilization of biomolecules. J. Biotechnol. 126 (2), 220-229 (2006).
  18. Sharma, P., Basir, S. F., Nahar, P. Photoimmobilization of unmodified carbohydrates on activated surface. J Colloid Interface Sci. 342 (1), 202-204 (2010).
  19. Brumer, H., Zhou, Q., Baumann, M. J., Carlsson, K., Teeri, T. T. Activation of crystalline cellulose surfaces through the chemoenzymatic modification of xyloglucan. J. Am. Chem. Soc. 126 (18), 5715-5721 (2004).
  20. Araujo, A. C., Song, Y., Lundeberg, J., Stahl, P. L., Brumer, H. Activated paper surfaces for the rapid hybridization of DNA through capillary transport. Anal Chem. 84 (7), 3311-3317 (2012).
  21. Xu, C., Spadiut, O., Araujo, A. C., Nakhai, A., Brumer, H. Chemo-enzymatic Assembly of Clickable Cellulose Surfaces via Multivalent Polysaccharides. ChemSusChem. 5 (4), 661-665 (2012).
  22. Filpponen, I., et al. Generic method for modular surface modification of cellulosic materials in aqueous medium by sequential "click" reaction and adsorption. Biomacromolecules. 13 (3), 736-742 (2012).
  23. Feese, E., Sadeghifar, H., Gracz, H. S., Argyropoulos, D. S., Ghiladi, R. A. Photobactericidal porphyrin-cellulose nanocrystals: synthesis, characterization, and antimicrobial properties. Biomacromolecules. 12 (10), 3528-3539 (2011).
  24. Zang, D., Ge, L., Yan, M., Song, X., Yu, J. Electrochemical immunoassay on a 3D microfluidic paper-based device. Chem. Commun. 48 (39), 4683-4685 (2012).
  25. Ge, L., Yan, J. X., Song, X. R., Yan, M., Ge, S. J., Yu, J. H. Three-dimensional paper-based electrochemiluminescence immunodevice for multiplexed measurement of biomarkers and point-of-care testing. Biomaterials. 33 (4), 1024-1031 (2012).
  26. Wang, S., et al. Paper-based chemiluminescence ELISA: lab-on-paper based on chitosan modified paper device and wax-screen-printing. Biosens. Bioelectron. 31 (1), 212-218 (2012).
  27. Koev, S. T., et al. Chitosan: an integrative biomaterial for lab-on-a-chip devices. Lab Chip. 10, 3026-3042 (2010).
  28. Wang, S. M., et al. Simple and covalent fabrication of a paper device and its application in sensitive chemiluminescence immunoassay. Analyst. 137 (16), 3821-3827 (2012).
  29. Sadira, S., Prabhakaranc, M. P., Wicaksonob, D. H. B., Ramakrishna, S. Fiber based enzyme-linked immunosorbent assay for C-reactive protein. Sensor Actuat B-Chem. 205, 50-60 (2014).
  30. Koga, H., Kitaoka, T., Isogai, A. In situ modification of cellulose paper with amino groups for catalytic applications. J. Mater. Chem. 21, 9356-9361 (2011).
  31. Klemm, D., Heublein, B., Fink, H. P., Bohn, A. Cellulose: fascinating biopolymer and sustainable raw material. Angew. Chem., Int. Ed. 44 (22), 3358-3393 (2005).
  32. Fernandes, S. C. M., et al. Bioinspired antimicrobial and biocompatible bacterial cellulose membranes obtained by surface functionalization with aminoalkyl groups. ACS Appl. Mater. Interfaces. 5 (8), 3290-3297 (2013).
  33. Pharos FX plus molecular imager instructions, Catalog Number 170-9460. , (2005).
  34. Tee, Y. B., Talib, R. A., Abdan, K., Chin, N. L., Basha, R. K., Yunos, K. F. M. Aminosilane-grafted cellulose. BioResourses. 8 (3), 4468-4483 (2013).
  35. Xing, Y., et al. Bioconjugated quantum dots for multiplexed and quantitative immunohistochemistry. Nat Protoc. 2, 1152-1165 (2007).
  36. Guidi, A., Laricchia-Robbio, L., Gianfaldoni, D., Revoltella, R., Del Bono, G. Comparison of a conventional immunoassay (ELISA) with a surface plasmon resonance-based biosensor for IGF-1 detection in cows' milk. Biosens Bioelectron. 16, 971-977 (2001).
  37. Ahmed, S., Bui, M. N., Abbas, A. Paper-based chemical and biological sensors: Engineering aspects. Biosens Bioelectron. 77, 249-263 (2016).

Tags

ביוכימיה גיליון 116 דיסקי נייר תאי טכניקת silane חוסר תנועה קוולנטיים glutaraldehyde זיהוי IgG immunoassay
קשר הקוולנטי של נוגדני דיסקי נייר תאיים ואת היישומים שלהם ב Immunoassays מדד-צבע Naked-עין
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Peng, Y., Gelder, V. V., Amaladoss,… More

Peng, Y., Gelder, V. V., Amaladoss, A., Patel, K. H. Covalent Binding of Antibodies to Cellulose Paper Discs and Their Applications in Naked-eye Colorimetric Immunoassays. J. Vis. Exp. (116), e54111, doi:10.3791/54111 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter