Introduction
Post-transcriptionele genexpressie nauwkeurig geregeld, beginnend met DNA transcriptie in de kern. Gecontroleerd door RNA-bindende eiwitten (RBPs), mRNA biogenese en metabolisme optreden in hoogdynamische ribonucleoproteïnepartikels (RNP's), die associëren en dissociëren met een substraat precursor mRNA tijdens de progressie van RNA metabolisme 1-3. Dynamische veranderingen in RNP componenten beïnvloeden de post-transcriptionele lot van een mRNA en zorgt voor kwaliteitsborging tijdens de bewerking van primaire transcripten hun nucleaire handel en lokalisatie, hun activiteit als mRNA sjablonen voor translatie en de uiteindelijke omzet van rijpe mRNA.
Talrijke proteïnen worden aangeduid als RBPs vanwege hun geconserveerde aminozuur domeinen, zoals de RNA herkenningsmotief (RRM), de dubbelstrengs RNA-bindende domein (RBD) en stukken van basische residuen (bijvoorbeeld arginine, lysine en glycine) 4. RBPs zijn routinematiggeïsoleerd door immunoprecipitatie en strategieën worden gescreend om hun verwante RNAs identificeren. Sommige RBPs co-regulering pre-mRNA die functioneel gerelateerd, aangeduid als RNA regulonen 5-8. Deze RBPs hun cognate mRNA en soms niet-coderende RNA vormen katalytische RNP dat in samenstelling variëren; hun uniciteit komt door verschillende combinaties van geassocieerde factoren, alsmede de chronologische volgorde, locatie, en de duur van hun interacties 9.
RNA immunoprecipitatie (RIP) is een krachtige techniek om RNP's uit cellen te isoleren en geassocieerde transcripten middels sequentieanalyse 10-13 identificeren. Verhuizen van kandidaat om genoombrede screening haalbaar is door middel van RIP in combinatie met een microarray-analyse 14 of high-throughput sequencing (RNAseq) 15. Evenzo kan co precipiterende eiwitten worden geïdentificeerd door massaspectrometrie, of ze voldoende overvloedig en scheidbaar van de co-precipiterende antilichaam 16,17. Hierbij gaan we in de methode voor het isoleren van RNP componenten van een specifieke verwante RNA uit gekweekte menselijke cellen, maar de benadering veranderbaar voor oplosbare lysaten van plantencellen, schimmels, virussen en bacteriën. Stroomafwaarts analyses van het materiaal zijn onder andere kandidaat identificatie en validatie door immunoblot, massaspectrometrie, biochemische enzymatische test, RT-qPCR, microarray en RNAseq, zoals samengevat in figuur 1.
Gezien de fundamentele rol van RNP's in het reguleren van genexpressie op post-transcriptioneel niveau, veranderingen in de expressie van component RBPs of de toegang voor verwante RNA's kunnen schadelijk voor de cellen en zijn geassocieerd met verschillende soorten aandoeningen, waaronder neurologische ziekten 18. DHX9 / RNA helicase A (RHA) nodig voor de vertaling van bepaalde mRNAs van cellulaire en retrovirale oorsprong 6. Deze verwante RNA's vertonen structureel verwante cis-werkende elementen binnen hun5 'UTR, die wordt aangeduid als de post-transcriptionele controle element (PCE) 19. RHA-PCE activiteit voor de doeltreffende cap-afhankelijke translatie van vele retrovirussen, zoals HIV-1, en groeiregulerende genen, waaronder JUND 6,20,21. Gecodeerd door een essentieel gen (dhx9), RHA is essentieel voor celproliferatie en de neerwaartse regulatie elimineert cellevensvatbaarheid 22. De moleculaire analyse van RHA-PCE RNP is een essentiële stap voor het begrijpen waarom RHA-PCE activiteit noodzakelijk om celproliferatie te regelen.
De precieze karakterisering van de RHA-PCE RNP componenten bij steady state of bij fysiologische verstoring van de cel vereist de selectieve verrijking en de vangst van de RHA-PCE RNP's in voldoende overvloed voor downstream-analyse. Hier PCEgag retroviraal RNA werd gelabeld met 6 kopieën van de cis-werkende RNA-bindingsplaats voor het MS2 manteleiwit (CP) in het open leesraam. De MS2 manteleiwit werd exogenously co-uitgedrukt PCEgag RNA door plasmide transfectie aan de RNP assemblage in groeiende cellen te vergemakkelijken. RNP die het MS2 manteleiwit met cognate MS2-tag PCEgag RNA werden immunogeprecipiteerd uit het celextract en vastgelegd op magnetische korrels (Fig 2a). Selectief vangen de RNP componenten gebonden aan de PCE, werd het geïmmobiliseerde RNP geïncubeerd met een oligonucleotide complementair aan sequenties distaal van de PCE, die een RNA-DNA-hybride dat het substraat voor RNase H activiteit. Aangezien PCE is gelegen in het 5 'uiteinde van de 5' onvertaalde gebied, het oligonucleotide complementair is aan het RNA-sequenties naast de retrovirale translatie startplaats (gag startcodon). RNase H klieving bij de gag startcodon bezit de 5 'UTR van het geïmmobiliseerde complex RNP, die was verkregen als elutiemiddel. Daarna werd het monster geëvalueerd door RT-PCR voor de daarbij PCEgag en door SDS PAGE en immunoblot bevestigt het captu bevestigenre van de doelgroep MS2 manteleiwit. Een validatie van de PCE-geassocieerde RNA bindend eiwit, DHX9 / RNA helicase A, werd vervolgens uitgevoerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
| buffer Samenstellingen |
| Wash Buffer: |
| 50 mM Tris-HCl, pH 7,4 |
| 150 mM NaCl |
| 3 mM MgCl2 |
| Buffer met laag zoutgehalte: |
| 20 mM Tris-HCl, pH 7,5 |
| 10 mM NaCl |
| 3 mM MgCl2 |
| 2 mM DTT |
| 1x proteaseremmer cocktail EDTA-vrij |
| RNase out 5 pl / ml (RNase-remmer) |
| Cytoplasma Lysis Buffer: |
| 0,2 M sucrose |
| 1,2% Triton X-100 |
| NETN-150 Wash Buffer: |
| 20 mM Tris-HCl, pH 7,4 |
| 150 mMNaCl |
| 0,5% NP-40 |
| 3 mM MgCl2 |
| 10% Glycerol |
| Binding Buffer: |
| 10 mM HEPES pH 7,6 |
| 40 mM KCl |
| 3 mM MgCl2 |
| 2 mM DTT |
| 5% glycerol |
Tabel 2: Buffer samenstellingen.
1. Bereiding van de cellen en de affiniteitsmatrix
- Cultuur een cellijn van belang sub- confluentie (80%) in een 10 cm schaal. Gebruik 10 cm platen voor onafhankelijke immunoprecipitaties (IP) van een FLAG-tag NLS-MS2 manteleiwit. Voer de IP met behulp van antisera aan het FLAG-epitooplabel. Als uiting van de FLAG-tag MS2 manteleiwit plasmide, transfecteren cellen 24-48 uur voorafgaand aan de oogst 20.
LET OP: Een bijzondere RNP kan worden verrijkt uit kernenergie of cytoplasmaic lysaten of een biochemisch-gefractioneerde voorbereiding, zoals een fractie van een sucrosegradiënt. Aanbevolen wordt het lysaat van niet-getransfecteerde cellen te oogsten parallel een extra negatieve controle instellen. - Transfer 60 pi per IP-proteïne G magnetische kraal slurry naar een 1,7 ml microcentrifugebuis.
- Plaats de buis op een magneet rek voor reactievaatjes de korrels te scheiden van de opslagoplossing.
- Verwijder de storage oplossing door voorzichtig de opstelling ervan met een micropipet.
- Haal de buis uit de magneet rack.
- Wassen en equilibreren de bolletjes met 600 pi (10 maal het gebruikte volume van korrels) van 1 x wasbuffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 3 mM MgCl2 en 150 mM NaCl) en eind-over-eind rotatie van 3 min bij kamertemperatuur.
- Plaats de buis op de magneet rek en verwijder de wasbuffer.
- Voeg 10 volumes (600 pl) van 1 x wasbuffer en immunoprecipitatie FLAG antilichaam aan het evenwicht gebracht protein G magnetische korrels (volgens de door de fabrikant voor een immunoprecipitatie hoeveelheid) en roteren end-over-end bij kamertemperatuur gedurende ten minste 30 min aan de immunoprecipitatie antilichaam te conjugeren. Gebruik de overeenkomstige isotype IgG als geschikte antilichaam negatieve controle.
- Plaats de buis op de magneet rek aan de parels te verzamelen en de supernatant te verwijderen.
- Haal de buis uit de magneet rek en was de antilichaam-geconjugeerde kralen met 10 volumina (600 ui) van 1 x wasbuffer en rotatie gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur. Herhaal deze stap twee keer.
- Plaats de buis op de magneet rek en verwijder de wasbuffer.
2. Oogsten de RNP
NB: Bereid de RNP's tijdens de incubatietijd na stap 1.8.
- Verwijderen cultuurmedium uit de cellen door aspiratie en was de cellen tweemaal met 1-5 ml ijskoude 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Gebruik een cel schraper om nat te verjagen,hechtende cellen vóór de winning door centrifugeren bij 226 g gedurende 4 min bij 4 ° C.
- Voeg 375 ul ijskoude, low-salt buffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 3 mM MgCl2, 10 mM NaCl, 2 mM DTT, 1 x protease-inhibitor cocktail, EDTA-vrij, en 5 ul / ml RNase Inhibitor) aan de celpellet en laat zwellen door het op ijs gedurende 5 minuten.
OPMERKING: Pas de hoeveelheid zoutarme buffer volgens de grootte van de celpellet. Voor 1,2 x 10 6 cellen van een 10 cm plaat, 375 ul buffer voldoende. - Om de cytoplasmatische cellysaat verzamelen, voeg 125 ul ijskoude lysisbuffer (0,2 M sucrose / 1,2% Triton X-100), en voer vervolgens 10 slagen met een Dounce homogenisator dat was pre-gekoeld in een ijsemmer.
OPMERKING: Om de totale cel extract verzamelen, wordt standaard RIPA lysisbuffer aanbevolen voor oplossen van de nucleoplasm / chromatine. - Spin in een microfuge op topsnelheid (16.000 x g) gedurende 1 minuut; dit zal de supernatant van puin een duidelijknd kernen.
- Breng de supernatant naar een nieuwe 1,7 ml microcentrifuge buis die op ijs is. Bepaal de totale eiwitconcentratie door een standaard laboratorium voorkeursmethode, zoals de Bradford assay 23. Reserveren een hoeveelheid van ten minste 10% bij een Western blot analyse, worden gebruikt als input control. Gebruik de geoogste cellysaat onmiddellijk voor immunoprecipitatie of bewaard worden bij -80 ° C voor latere analyse.
LET OP: In onze ervaring, kunnen deze monsters worden opgeslagen en enkele maanden later gebruikt voor immunoprecipitatie analyse, zonder een compromis van integriteit.
3. Immunoprecipitatie
- Voeg het gewenste volume van de geoogste cellysaat, gebaseerd op de eiwitconcentratie bepaald in stap 2,5, de beoogde antilichaam-geconjugeerde kralen. Gebruik 1x wasbuffer, komt het totale volume op 600 pl en draai end-over-end voor 90 min bij kamertemperatuur.
LET OP: Deze periode is voldoende om te generereneen robuuste isolatie van hoge affiniteit RNP-complexen met minimale niet-specifieke binding. Verdun RNP alternatieve bronnen, zoals fracties van een sucrosegradiënt, ten minste 1: 1 met 1 x wasbuffer en vervolgens incubeer ze met eerder bereide bead-antilichaam complexen, zoals hierboven vermeld. - Na 90 min incubatie, plaatst het IP buis op de magneet rek om de kralen te verzamelen. Behouden het supernatant doorstroming.
LET OP: Deze eerste flow-through is een belangrijke controle monster naar IP-efficiëntie te meten. Een immunoblot bepaling een indicatie van IP efficiëntie en de specificiteit van de onderzochte interacties. Het wordt aanbevolen om deze supernatant voor downstream-analyse te houden. - Was het RNP gebonden antilichaam-geconjugeerde kralen met 10 volumina (600 ui) ijskoude NETN-150 wasbuffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 0,5% NP40, en 10% glycerol) onder rotatie gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur. Herhaal stap 3 keer.
LET OP: Deze buffer verschilt van de lysis buffer en vermindert effectief zwakke of niet-specifieke verenigingen. - Na de laatste maal wassen, resuspendeer de geïmmobiliseerde RNP-complexen in 60 ul ijskoude 1x bindingsbuffer (10 mM HEPES, pH 7,6, 40 mM KCl, 3 mM MgCl2, 5% glycerol en 2 mM DTT) en reserve 10% van het geïmmobiliseerde complex kralen voor Western blot en 20% voor RNA-isolatie.
4. Elutie
- Pas het resterende volume op 100 pi met ijskoude bindingsbuffer 1x en verwarm de buis bij 70 ° C gedurende 3 min.
- Om cognate RNA-eiwitcomplexen isoleren voeg een ~ 30-nt DNA-oligonucleotide dat complementair is aan het 3'-sequentie grens van het RNA van belang en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur onder zacht schommelen (100 nM oligonucleotide is voldoende).
OPMERKING: De oligonucleotide antisense is met de nucleotide residuen naast de translatie start plaats van de PCE construct gebruikt als example in dit protocol. Geschikte sequentie complementariteit wordt gevormd door de ~ 40% GC-gehalte. Ontwerp de antisense oligonucleotide efficiënte hybridisatie aan de minimum complementaire gebied van het doel-RNA. - Voeg 5-10 eenheden RNase H aan de buis en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur om het RNA van de RNA splitsen: DNA hybride. Breng het supernatant in een steriele 1,7 ml microcentrifugebuis; dit monster bevat de gevangen RNP complexen van belang.
Opmerking: Afhankelijk van de toegankelijkheid van de verwante RNA, kunnen twee of meer ronden van RNase H behandeling nuttig zijn om het monster overvloed van de stroomafwaartse analyses toe. - Gebruik 20% van het eluaat in een Western blot voor bekende geassocieerde eiwitten en 20% van het eluaat voor RNA-isolatie gevolgd door RT qPCR. De resterende 60% kan worden gebruikt voor massaspectrometrie of eiwitcomponenten identificeren.
- Tegelijkertijd patiënt van een hoeveelheid van de gereserveerde cellysaat RNA isolatie en RT-PCR analyse. dit assessment geeft een indicatie van de verrijking van RNA in een RNP complex.
OPMERKING: Gebruik het geïsoleerde eiwitpreparaat in een controlegroep western blot om vast te stellen dat de RNase H splitsing was effectief in het vrijgeven van de RNP uit het immunuoprecipitated complex.
5. Eiwit Elektroforese en Western Blot Analyse
- Betreft ongeveer 10-20% van het totale monster aan SDS-PAGE en immunoblot analyse volgens standaard laboratoriumprotocol.
LET OP: Deze stap dient om IP-efficiëntie en specificiteit voorafgaand valideren aan downstream RNA-analyse. Het kan ook worden gebruikt om de eiwitsamenstelling van het geïsoleerde RNP complex beoordelen.
6. Collectie van de immunogeprecipiteerd RNA
OPMERKING: RNA-isolatie kan door Trizol methode of volgens de methode beschreven protocol.
- Resuspendeer de helft van het totale monster in 750 pl zuur guanidinium thiocyanaat reagens en incubeer bij kamertemperatuur temperature gedurende 5 minuten voor het extraheren van het RNA van de gevangen PCE-RNP-complexen.
- Voeg 200 pl chloroform aan de buis, schud krachtig gedurende 10 seconden, en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 3 min.
- Na centrifugatie bij 16.000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C, verzamel de waterfase opnieuw in buis en een gelijk volume isopropanol. Goed mengen en incuberen bij kamertemperatuur gedurende ten minste 10 min. Voeg 1 pl glycol blauw aan het monster en het op -20 ° C in de vriezer efficiënte precipitatie of verwerking op een later tijdstip.
- Centrifugeer de buis bij 16.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Verzamel zorgvuldig Verwijder de bovenstaande vloeistof teneinde de RNA pellet niet verstoren; het gebruik van een p-200 micropipet tip wordt aanbevolen om dit proces te vergemakkelijken.
- Voeg 500 pl 75% ethanol aan elke buis, vortex en gecentrifugeerd buizen bij 16.000 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Zorgvuldig te verzamelen en gooi het supernatant zoals in stap 6.4. Lucht-droog de pellet gedurende 2-3 min en resuspendeer in 100 gl RNase-vrij water.
LET OP: Wees niet te verlengen de tijd dat de pellet lucht droogt om een probleem met de resuspensie te voorkomen. - Breng 100 pl RNA monster een RNA clean-up kolom. Verwerken behulp protocol van de fabrikant. Elueer het RNA in 30 gl RNase-vrij water en bewaar bij -80 ° C maximaal 3 maanden.
LET OP: Deze geïsoleerde RNA is geschikt voor downstream-analyse door middel van RT-real-time PCR (qPCR), microarray en RNA sequencing. Afhankelijk van de overvloed van de RNP en de efficiëntie waarmee de RNP van belang wordt geïsoleerd, kan hetzelfde lysaat worden onderworpen aan twee of meer ronden van IP voldoende RNA toepasbaar voor de stroomafwaartse analyses genereren.
7. RNA reverse transcriptie en amplificatie van cDNA door PCR
- Het aldus geïsoleerde RNA transcriptie keren door een willekeurige primer met een hoogwaardige reverse transcriptase (RT) volgens de manufacturer's instructies.
- Om het RNA van belang te versterken, het ontwerpen van een gen-specifieke antisense primer binnen de RNase H splitsing volgorde. Met vergelijkbare hoeveelheden van de antisense oligonucleotide, een willekeurige primer of een oligo-dT primer (zie tabel Materials).
OPMERKING: De oligo-dT primer en poly-geadenyleerde mRNA leveren positieve controle reacties voor de RT-PCR reacties. - Reserve 5% van de RT-reactie (1 ui) van een preparatieve qPCR gedaan in combinatie met negatieve controle lysaat IP en positieve controle-DNA monsters de cutoff definiëren en produceren een standaardcurve. Als de CT waarde van de preparatieve qPCR ligt buiten het gebied van de standaardkromme Verdun de RT-reactie in stappen 1: 5 verdunningen en herhaal stap 7,2.
LET OP: Voor een RNA-sequencing en massaspectrometrie techniek, zie de aanvullende methode bestand. Klik hier to bekijk deze aanvullende methode bestand. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Voorafgaand RIP resultaten geïdentificeerd retrovirale gag RNA's en geselecteerde cellulaire RNA's die samen met neerslag DHX9 / RHA, waaronder HIV-1 6, JUND 6 en Hur (Fritz en Boris-Lawrie, niet gepubliceerd). De retrovirale 5 'UTR is aangetoond dat co-precipiteren met DHX9 / RHA in de kern en samen te isoleren in het cytoplasma op polyribosomen. Het is uniek gedefinieerd als de cis-werkende post-transcriptie controle element (PCE) 6. Om PCEgag RNA-RHA ribonucleoproteïne complexen (RNP's) gevormd in delende cellen te isoleren, voerden we FLAG-MS2 RNP immunoprecipitatie in getransfecteerde HEK293 cellysaten. De resultaten tonen efficiënte precipitatie van het FLAG-eiwit MS2. Met name DHX9 / RHA wordt geïdentificeerd binnen deze RNP complex en niet binnen het IgG isotype controle, noch binnen de negatieve controle HEK293 cellysaat (Figuur 2A). De matrix met de RNP's werd geïncubeerd met een complementair 30-nt oligonucleotide, en een RNase H klieving van de RNA-DNA-hybride werd uitgevoerd. Na RNase H digestie werden de eluaten geanalyseerd door Western blotting. De aangetoonde RNase H klieving van PCEgag RNA het RNA-DNA hybride positie bezit het RNP complex specifiek aan de 5 'UTR. De DHX9 / RHA-geassocieerde RNP's werden bepaald te worden verrijkt in de eluenten. Belangrijk is dat de FLAG-MS2-gebonden RNP bleef het antilichaam-geconjugeerde kralen (figuur 2B). De co-immunoprecipitatie van het MS2 stamlus bevattende retrovirale PCEgag RNA in cellen en in eluaten werd bevestigd met RT-PCR en qRTPCR (figuur 2C). De resultaten bevestigden een select associatie tussen DHX9 / RHA en het retrovirale 5 'UTR, die is genoemd als een unieke RNP belang gerichte translatie reguleren 6.
Figuur 1: RNP isolatie en verrijking van specifieke RNP's verbonden aan de 5 'UTR van PCEgag door RNase H klieving. Workflow met de stappen om een geselecteerd ribonucleoprotein vormde de novo in de cellen te isoleren, de collectie door oligonucleotide geleide RNaseH splitsing, en de downstream-analyse van RNA en eiwitten componenten. Samenvatting van affiniteitschromatografie met behulp van een hoge affiniteit interactie tussen multimeren voor de MS2 RNA stam-loop en de MS2 manteleiwit-FLAG-fusie-eiwit tot PCE RNA vast te leggen op FLAG kralen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Een PCEgag RNA met 6 MS2 RNA bindingsplaatsen werd gevangen genomen door een geïmmobiliseerd FLAG-tag MS2 manteleiwit, en specifieke RNP's in verband met de 5 'UTR warenuitgebracht door een oligonucleotide aangestuurde RNase H klieving. HEK293 cellen werden gecotransfecteerd met pAR200 (een plasmide dat het PCEgag en 6x MS2 lussen in de HIV intron) en een plasmide dat het FLAG-epitoop-gemerkte MS2 eiwit met een nucleaire lokalisatiesequentie (NLS). Cellen werden verzameld en het cytoplasma werd geïsoleerd op 48 uur na transfectie. De cytoplasmatische lysaten werden onderworpen aan immunoprecipitatie met ofwel FLAG antilichaam of een IgG-controle. (A) Het IP-efficiëntie werd bepaald door immunoblot met gebruikmaking van een anti-FLAG antilichaam. DHX9 / RHA een PCE bindend eiwit diende als een positieve controle; PCE-bevattende RNA immunogeprecipiteerd met het MS2-eiwit. Lanen 1-3: Ingang eiwitten die gebruikt worden voor IP. Lanen 4-5: FLAG IP van FLAG MS2 overexpressie lysaat en HEK293 cytoplasma cellysaat. Laan 6: IgG IP van FLAG MS2 overexpressie lysaat. Lanen 7-9: Flow-through van de IP-adressen. (B) 5 'UTR-gebonden RNP's werden verrijkt door RNase H splitsing. lanen 1-3: Eluaten van de 5 'UTR-gebonden eiwit door RNase H. Lanen 4-6: eiwitten gebonden aan antilichaam-geconjugeerde kralen. (C) Reverse transcriptase PCR en real-time kwantitatieve PCR van specifiek RNA gebonden verschillende fracties RNP's. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De RNP isolatie en verwante RNA identificatiestrategie hier beschreven selectieve middel van onderzoek van een specifiek RNA-eiwit interactie en ontdekken kandidaateiwitten co-regulering een bepaald RNP in cellen.
Het voordeel van het gebruik van oligonucleotide-gerichte RNase H klieving om RNP te isoleren is de mogelijkheid te vangen en specifiek wat de RNP-cis- werkende RNA-element over heterogene RNP stroomafwaarts gebonden aan het cis-werkende RNA-element plaats. Vanwege de overvloed van een verwante RNA in een bepaalde RNP is een kleine fractie van de verzamelde RNP geïsoleerd zonder RNase H splitsing, de belangrijkste nadeel van deze workflow is de schaarste van de verwante RNP. In onze ervaring, deze beperking noodzakelijk 5- tot 10-voudig meer uitgangsmateriaal dan conventionele RNA IP voor de detectie in gevoelige immunoblot en proteomics analyses. Een ander voordeel van het immobiliseren van het RNP is het gemak van het herhalen van de RNase H treatment en het verzamelen van extra eluaat. In onze ervaring, 2-4 rondes van RNase H behandeling waren aan te raden om extra eluaat te verzamelen.
In dit protocol worden verschillende technische problemen handhaven van de optimale temperatuur en zorgen voor steriele hantering van het reagens. Alle reagentia moeten RNase- en protease-vrij. De integriteit van het RNA monster een potentiële valkuil te overwegen als een RNA-eiwit interactie is niet detecteerbaar.
Deze techniek is een efficiënte lysis van de cellen om de RNP's in een geschikte hoeveelheid voor detectie. Terwijl een belangrijk voorbehoud onvolledig cellyse kan krachtiger behandelingen niet-specifieke interacties met RNA verhogen. Daarom moet de experimentele omstandigheden worden gemeten teneinde specifieke eiwit-RNA interacties verrijken. Echter kan het gebruik van hoge stringentie wassen belangrijk maar voorbijgaande interacties te elimineren. Daarom zijn de wasomstandigheden zijn een andere variabele consider in de specifieke vereisten van een bepaald experiment.
RIP efficiency is een krachtige techniek verwant RNA-eiwit partners isoleren, maar voorbijgaande of zwakke interacties die van fysiologisch belang zijn verloren tijdens het al dan wasstappen. Verknoping van het mRNP complex optie kunnen worden overwogen in een analyse. Bovendien moeten fysiologische groeiomstandigheden in gedachten worden gehouden bij de analyse regulerende RNP's, zoals het expressieniveau van het verwante RNA of RBP kan onderhevig zijn aan fysiologische fluctuaties onder bepaalde omstandigheden. Bovendien zal het type downstream analyse ook een rol spelen bij het kiezen van de lysis en wasomstandigheden tijdens de immunoprecipitatie.
Bovendien, de succesvolle immunoprecipitatie vereist dat het cellysaat significant verdund (ten minste 1: 1). 1 x wasbuffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,3, 3 mM MgCl2 en 150 mM NaCl) is gekozen verdunningsmiddel zijn samenstellinggeen invloed RNP integriteit oplosbaarheid oplossing of antilichaam-antigeen interacties.
En Tris, evenals enkele detergentia - voor downstream massaspectrometrie moeten monsters geen zouten zoals Na +, Cl zijn. Eventueel kunnen verbindingen-componenten van buffers-ionische verlaagd door dialyse of ionenuitwisseling filtratie, en in sommige gevallen vluchtige buffers zijn bruikbaar bij de laatste stappen. In gevallen waarin antiserum wordt gebruikt om een epitoop-gemerkt eiwit tot expressie gebracht door transfectie isoleren, dient Western blot validatie van het recombinante eiwit met het voorafgaand cellysaat worden uitgevoerd voor verdere analyse. Indien een epitooplabel wordt gebruikt (bijvoorbeeld FLAG, MYC, GFP, etc.), de blootstelling van het label is cruciaal voor het succes van de antilichaambinding stap. Vries-dooi monsters te worden vermeden.
De RIP techniek op grote schaal toegepast om verschillende mechanismen van post-transcriptionele gencontrole verhelderen10,25. Dit omvat de identificatie van nieuwe eiwit-mRNA, eiwit-microRNA en eiwit-eiwit interacties 10,25. Hier geven we een algemeen protocol voor de bepaling van RNP samenstelling in een celkweek. De werkwijze maakt de gerichte en genoom-brede evaluatie van kritische eiwit-RNA-interacties, alsook voor de vangst van zeldzame en / of transiënte RNP-complexen.
De toepassing van deze techniek heeft bijgedragen aan onze karakterisering van RNA's gebonden door DHX9 / RNA helicase A en hielp ons om de kritische post-transcriptionele regulatie van retrovirussen en de cellulaire proto-oncogenen JUND 6,26 en Hur (Fritz en Boris-Lawrie definiëren , ongepubliceerde gegevens). We verwachten dat de toepassing van deze techniek in toekomstige studies aan ons begrip van de mechanismen voor kritische gen, waaronder die gemedieerd door lange niet-coderende RNP-complexen bevorderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
De auteurs dankbaar steun van NIH P50GM103297, P30CA100730 en Comprehensive Cancer P01CA16058 erkennen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dynabeads Protein A | Invitrogen | 10002D | |
| Dynabeads Protein G | Invitrogen | 10004D | |
| Anti-FLAG antibody | Sigma | F3165 | |
| Anti-FLAG antibody | Sigma | F7425 | |
| Anti-RHA antibody | Vaxron | PA-001 | |
| TRizol LS reagent | Life technology | 10296-028 | |
| RNase H | Ambion | AM2292 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | BP1145-1 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP26184 | |
| RNaeasy clean-up column | Qiagen | 74204 | |
| Omniscript reverse transcriptase | Qiagen | 205113 | |
| RNase Out | Invitrogen | 10777-019 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 5056489001 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| NP-40 | Sigma | 98379 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | 17904 | |
| Random hexamer primers | Invitrogen | N8080127 | |
| Oligo-dT primers | Invitrogen | AM5730G | |
| PCR primers | IDT | Gene specific primers for PCR amplification | |
| Oligonucleotide for RNase H mediated cleavage | IDT | Anti-sense primer for target RNA | |
| Trypsin | Gibco Life technology | 25300-054 | |
| DMEM tissue culture medium | Gibco Life technology | 11965-092 | |
| Fetal bovine serum | Gibco Life technology | 10082-147 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S642-212 | |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | BP214 | |
| DTT | Fisher Scientific | R0862 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | BP220-212 | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 1620112 | |
| Magnetic stand | 1.7 ml micro-centrifuge tube holding | ||
| Laminar hood | For animal tissue culture | ||
| CO2 incubator | For animal tissue culture | ||
| Protein gel apparatus | Protein sample separation | ||
| Protein transfer apparatus | Protein sample transfer | ||
| Ready to use protein gels (4-15%) | Protein sample separation | ||
| Table top centrifuge | Pellet down the sample | ||
| Table top rotator | Mix the sample end to end | ||
| Vortex | Mix the samples |
References
- Bandziulis, R. J., Swanson, M. S., Dreyfuss, G. RNA-binding proteins as developmental regulators. Genes Dev. 3 (4), 431-437 (1989).
- Hogan, D. J., Riordan, D. P., Gerber, A. P., Herschlag, D., Brown, P. O. Diverse RNA-binding proteins interact with functionally related sets of RNAs, suggesting an extensive regulatory system. PLoS Biol. 6 (10), e255 (2008).
- Glisovic, T., Bachorik, J. L., Yong, J., Dreyfuss, G. RNA-binding proteins and post-transcriptional gene regulation. FEBS Lett. 582 (14), 1977-1986 (2008).
- Lunde, B. M., Moore, C., Varani, G. RNA-binding proteins: modular design for efficient function. Nat.Rev.Mol.Cell Biol. 8 (6), 479-490 (2007).
- Cochrane, A. W., McNally, M. T., Mouland, A. J. The retrovirus RNA trafficking granule: from birth to maturity. Retrovirology. 3, 18 (2006).
- Hartman, T. R., Qian, S., Bolinger, C., Fernandez, S., Schoenberg, D. R., Boris-Lawrie, K. RNA helicase A is necessary for translation of selected messenger RNAs. Nat.Struct.Mol.Biol. 13 (6), 509-516 (2006).
- Pullmann, R., et al. Analysis of turnover and translation regulatory RNA-binding protein expression through binding to cognate mRNAs. Mol.Cell.Biol. 27 (18), 6265-6278 (2007).
- Keene, J. D. RNA regulons: coordination of post-transcriptional events. Nat.Rev.Genet. 8 (7), 533-543 (2007).
- Moore, M. J. From birth to death: the complex lives of eukaryotic mRNAs. Science. 309 (5740), 1514-1518 (2005).
- Hassan, M. Q., Gordon, J. A., Lian, J. B., van Wijnen, A. J., Stein, J. L., Stein, G. S. Ribonucleoprotein immunoprecipitation (RNP-IP): a direct in vivo analysis of microRNA-targets. J.Cell.Biochem. 110 (4), 817-822 (2010).
- Selth, L. A., Close, P., Svejstrup, J. Q. Studying RNA-protein interactions in vivo by RNA immunoprecipitation. Methods Mol.Biol. 791, 253-264 (2011).
- Singh, D., Boeras, I., Singh, G., Boris-Lawrie, K. Isolation of Cognate Cellular and Viral Ribonucleoprotein Complexes of HIV-1 RNA Applicable to Proteomic Discovery and Molecular Investigations. Methods Mol.Biol. 1354, 133-146 (2016).
- Stake, M., et al. HIV-1 and two avian retroviral 5' untranslated regions bind orthologous human and chicken RNA binding proteins. Virology. 486, 307-320 (2015).
- Sung, F. L., et al. Genome-wide expression analysis using microarray identified complex signaling pathways modulated by hypoxia in nasopharyngeal carcinoma. Cancer Lett. 253 (1), 74-88 (2007).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat.Rev.Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
- Michlewski, G., Caceres, J. F.
- Tacheny, A., Dieu, M., Arnould, T., Renard, P. Mass spectrometry-based identification of proteins interacting with nucleic acids. J. Proteomics. 94, 89-109 (2013).
- Duan, R., Sharma, S., Xia, Q., Garber, K., Jin, P. Towards understanding RNA-mediated neurological disorders. J.Genet.Genomics. 41 (9), 473-484 (2014).
- Butsch, M., Hull, S., Wang, Y., Roberts, T. M., Boris-Lawrie, K. The 5' RNA terminus of spleen necrosis virus contains a novel posttranscriptional control element that facilitates human immunodeficiency virus Rev/RRE-independent Gag production. J. Virol. 73 (6), 4847-4855 (1999).
- Bolinger, C., et al. RNA helicase A interacts with divergent lymphotropic retroviruses and promotes translation of human T-cell leukemia virus type 1. Nucleic Acids Res. 35 (8), 2629-2642 (2007).
- Bolinger, C., Sharma, A., Singh, D., Yu, L., Boris-Lawrie, K. RNA helicase A modulates translation of HIV-1 and infectivity of progeny virions. Nucleic Acids Res. 38 (5), 1686-1696 (2010).
- Lee, T., et al. Suppression of the DHX9 helicase induces premature senescence in human diploid fibroblasts in a p53-dependent manner. J.Biol.Chem. 289 (33), 22798-22814 (2014).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal.Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Glenn, G. Preparation of protein samples for mass spectrometry and N-terminal sequencing. Methods Enzymol. 536, 27-44 (2014).
- Keene, J. D., Komisarow, J. M., Friedersdorf, M. B. RIP-Chip: the isolation and identification of mRNAs, microRNAs and protein components of ribonucleoprotein complexes from cell extracts. Nat.Protoc. 1 (1), 302-307 (2006).
- Ranji, A., Shkriabai, N., Kvaratskhelia, M., Musier-Forsyth, K., Boris-Lawrie, K. Features of double-stranded RNA-binding domains of RNA helicase A are necessary for selective recognition and translation of complex mRNAs. J.Biol.Chem. 286 (7), 5328-5337 (2011).
