Introduction
a expressão do gene pós-transcrição é regulada com precisão, começando com a transcrição do DNA no núcleo. Controlada pela ligação RNA proteínas (RBPs), mRNA biogênese e metabolismo ocorrem em partículas de ribonucleoproteínas altamente dinâmicos (RNPs), que se associam e dissociam com um mRNA precursor do substrato durante a progressão da RNA metabolismo 1-3. mudanças dinâmicas em componentes RNP afetar o destino pós-transcricional de um mRNA e fornecer garantia de qualidade durante o processamento de transcritos primários, seu tráfico nuclear e localização, a sua actividade como modelos de mRNA para a tradução, ea eventual volume de negócios de mRNAs maduros.
Numerosas proteínas são designadas como RBPs em virtude dos seus domínios de aminoácidos conservados, incluindo o motivo de reconhecimento de ARN (RRM), a cadeia dupla de ARN domínio de ligação (RBD), e trechos de resíduos básicos (por exemplo, arginina, lisina e glicina) 4. RBPs são rotineiramenteisolado por estratégias de imunoprecipitação e são selecionados para identificar os RNAs cognatos. Alguns RBPs co-regular pré-ARNm que estão relacionadas funcionalmente-, designados como regulons ARN 5-8. Estes RBPs, seus mRNAs cognatos, e às vezes RNA não-codificante, formar RNPs catalíticos que variam em composição; a sua singularidade se deve a várias combinações de factores associados, bem como a sequência temporal, localização, e a duração das suas interacções 9.
Imunoprecipitação ARN (RIP) é uma técnica poderosa para isolar RNP de células e para identificar transcritos associados utilizando análise da sequência 10-13. Mover-se de candidato a genoma-wide rastreio é viável através de RIP combinada com uma análise de microarray 14 ou sequenciamento de alto rendimento (RNA-Seq) 15. Do mesmo modo, as proteínas co-precipitação pode ser identificado por espectrometria de massa, se eles são suficientemente abundante e separável a partir do anticorpo de co-precipitante 16,17. Aqui, nos dirigimos a metodologia para o isolamento de componentes de RNP de um ARN cognato específico a partir de células humanas de cultura, embora a abordagem é alterável para lisados solúveis das células vegetais, fungos, vírus e bactérias. Análises a jusante do material incluem a identificação de candidatos e validação por imunotransferência, espectrometria de massa, ensaio enzimático bioquímica, RT-qPCR, microarray, e RNA-Seq, conforme resumido na Figura 1.
Dado o papel fundamental da RNP para controlar a expressão do gene ao nível pós-transcricional, alterações na expressão de RBPs componentes ou a sua acessibilidade às cognato RNAs pode ser prejudicial para a célula e está associada com vários tipos de afecções, incluindo a doença neurológica 18. DHX9 / RNA helicase A (RHA) é necessário para a tradução de mRNAs selecionados de origens celulares e retrovirais 6. Estes RNAs cognatos exibem elementos de actuação cis-estruturalmente relacionados dentro do seuUTR 5 ', que é designado como o elemento de controlo pós-transcricional (PCE) 19. Actividade RHA-PCE é necessário para a tradução eficiente dependente da tampa de diversos retrovirus, incluindo o HIV-1, e de genes reguladores do crescimento, incluindo Jund 6,20,21. Codificada por um gene essencial (dhx9), RHA é essencial para a proliferação celular e a sua infra-regulação elimina a viabilidade das células 22. A análise molecular de RHA-PCE RNP é um passo essencial para entender por que a atividade RHA-PCE é necessário controlar a proliferação celular.
A caracterização precisa dos componentes RNP RHA-PCE no estado estacionário, ou mediante perturbação fisiológica da célula requer o enriquecimento selectivo e captura das RNPs RHA-PCE em abundância suficiente para a análise a jusante. Aqui, o RNA retroviral PCEgag foi etiquetado com 6 cópias do local de ligação de ARN de actuação cis para a proteína de revestimento de MS2 (CP) dentro do enquadramento de leitura aberto. A proteína de revestimento de MS2 foi exogenously co-expressa com PCEgag ARN por transfecção do plasmídeo para facilitar a montagem RNP em células em crescimento. RNP contendo a proteína de revestimento de MS2 ARN com PCEgag cognato MS2-tagged foram imunoprecipitadas a partir do extracto celular e capturada em esférulas magnéticas (Figura 2A). Para capturar selectivamente os componentes ligados ao RNP PCE, a RNP imobilizado foi incubado com um oligonucleótido complementar a sequências distais ao PCE, formando um híbrido de ARN-ADN que é o substrato para a actividade de RNase H. Desde PCE é posicionado no 'terminal do 5' não traduzida a 5 região, o oligonucleótido é complementar às sequências de ARN adjacentes ao sítio de iniciação da tradução retroviral (gag codão de iniciação). Clivagem com ribonuclease H perto do início da mordaça codão libertado complexo UTR a 5 'a partir do RNP imobilizada, que foi recolhido como o eluente. Em seguida, a amostra foi avaliada por RT-PCR para confirmar a captura de PCEgag e por SDS-PAGE e imunotransf erência para confirmar a capture da proteína de revestimento alvo MS2. A validação da proteína de ligação a ARN-associado PCE, DHX9 / ARN helicase A, foi então realizada.
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Protocol
| tampão composições |
| Tampão de Lavagem: |
| mM de Tris-HCl a 50, pH 7,4 |
| 150 mM de NaCl |
| MgCl2 3 mM |
| Tampão de baixo teor de sal: |
| mM de Tris-HCl a 20, pH 7,5 |
| 10 mM de NaCl |
| MgCl2 3 mM |
| 2 mM de DTT |
| 1x cocktail inibidor de protease livre EDTA- |
| RNase Out 5 ul / ml (inibidor de RNase) |
| Citoplasmático de tampão de lise: |
| 0,2 M de sacarose |
| 1,2% de Triton X-100 |
| NETN-150 Tampão de Lavagem: |
| mM de Tris-HCl a 20, pH 7,4 |
| 150 mMNaCl |
| 0,5% de NP-40 |
| MgCl2 3 mM |
| 10% de Glicerol |
| Tampão de Ligação: |
| HEPES 10 mM, pH 7,6 |
| KCl 40 mM |
| MgCl2 3 mM |
| 2 mM de DTT |
| 5% de glicerol |
Tabela 2: Composições de memória intermédia.
1. Preparação de células e com a matriz de afinidade
- A cultura de uma linha celular de interesse à sub-confluência (80%) numa placa de 10 cm. Utilizar placas de 10 cm para imunoprecipi independentes (IP) de uma proteína de revestimento de MS2-NLS marcado com FLAG. Execute o IP utilizando anti-soros para a marca de epitopo-FLAG. Ao expressar o MS2 plasmídeo proteína de revestimento marcado com FLAG, as células transfectar 24-48 h antes da colheita 20.
NOTA: A RNP particular pode ser enriquecida a partir nuclear ou citoplasmaOs lisados de IC ou uma preparação bioquimicamente fraccionadas, tais como fracções de gradiente de sacarose. Recomenda-se a colheita do ligado de células não transfectadas em paralelo para instituir um controlo negativo adicional. - Transferir 60 uL por IP de proteína G suspensão esférulas magnéticas para um tubo de microcentrífuga de 1,7 ml.
- Colocar o tubo em uma cremalheira íman para tubos de microcentrífuga para separar os grânulos a partir da solução de armazenamento.
- Retirar a solução de armazenamento, chamando-o cuidadosamente com uma micropipeta.
- Retire o tubo do rack ímã.
- Lavagem e equilibrar as contas com 600 ul (10 vezes o volume utilizado de esferas) de 1x tampão de lavagem (Tris-HCl a 20, pH 7,4; MgCl2 3 mM, e NaCl 150 mM) e-sobre-extremidade final da rotação durante 3 min à temperatura ambiente.
- Colocar o tubo na cremalheira ímã e remova o tampão de lavagem.
- Adicionar 10 volumes (600 ul) de tampão de lavagem 1x e anticorpo FLAG imunoprecipitar ao pr equilibradaotein G esferas magnéticas (de acordo com a quantidade recomendada pelo fabricante para uma imunoprecipitação) e rodar para a sobre-extremidade final à temperatura ambiente durante pelo menos 30 min para conjugar o anticorpo imunoprecipitação. Utilizar a IgG de isotipo correspondente como um controlo negativo de anticorpo adequado.
- Colocar o tubo na cremalheira íman para recolher as esferas e para remover o sobrenadante.
- Remover o tubo a partir da cremalheira íman e lavar as esferas de anticorpo conjugado com 10 volumes (600 L) de tampão de lavagem 1x e rotação durante 3 min, à temperatura ambiente. Repita esta etapa duas vezes.
- Colocar o tubo na cremalheira ímã e remova o tampão de lavagem.
2. A colheita da RNP
Nota: Preparar a RNP durante o tempo de incubação após o passo 1.8.
- Remover o meio de cultura das células por aspiração e lavar as células duas vezes com 1-5 ml de gelo-frio 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS). Use um raspador de células para desalojar molhado,células aderentes antes da colheita por centrifugação a 226 xg durante 4 min a 4 ° C.
- Adicionar 375 ul de gelado, tampão de baixo teor salino (Tris-HCl a 20, pH 7,5; 3 mM de MgCl2; 10 mM de NaCl; 2 mM de DTT; 1x cocktail inibidor de protease, isento de EDTA; e 5 ul / ml Inibidor de RNase) para o sedimento celular e permitir inchaço, colocando-o em gelo durante 5 min.
NOTA: Tailor o volume de tampão de baixo teor salino de acordo com o tamanho do agregado de células. Para 1,2 x 10 6 células de uma placa de 10 cm, 375 ul de tampão é suficiente. - Para recolher o lisado celular citoplasmática, adicionar 125 ul de tampão de lise arrefecido com gelo (sacarose 0,2 M / 1,2% de Triton X-100), e, em seguida, executar 10 pancadas com um homogeneizador de Dounce que foi pré-arrefecido num balde de gelo.
NOTA: Para recolher o extracto celular total, tampão de lise RIPA padrão é recomendada para solubilizar o nucleoplasma / cromatina. - Rotação numa microcentrífuga a velocidade máxima (16000 xg) durante 1 min; isso vai limpar o sobrenadante de detritos de umanúcleos nd.
- Transferir o sobrenadante para um novo tubo de microcentrifugação de 1,7 mL que foi em gelo. Determinar a concentração de proteína total através de uma norma, o método preferido em laboratório, tais como o Ensaio de Bradford 23. Reserva-se uma alíquota de pelo menos 10% para uma análise de transferência de Western, para ser usado como um controle de entrada. Use o ligado de células colhidas imediatamente para imunoprecipitação ou armazená-lo a -80 ° C para análise futura.
NOTA: Em nossa experiência, estas amostras podem ser armazenados e utilizados vários meses mais tarde para análise de imunoprecipitação, sem um compromisso de integridade.
3. Immunoprecipitation
- Adicionar o volume desejado do lisado de células colhida, com base na concentração de proteína foi determinada na etapa 2.5, com as esferas de anticorpo conjugado alvo. Usando 1X tampão de lavagem, levar o volume total até 600 uL e girar extremidade-sobre-extremidade durante 90 minutos a temperatura ambiente.
NOTA: Este período de tempo é suficiente para gerarum isolamento sólido de complexos de RNP de afinidade elevada, minimizando a ligação não específica. Diluir RNP fontes alternativas, tais como as fracções de gradiente de sacarose, de pelo menos 1: 1 com tampão de lavagem 1x e, em seguida, incuba-los com complexos de anticorpo-grânulo previamente preparados, como mencionado acima. - Após 90 minutos de incubação, colocar o tubo IP na prateleira ímã para recolher as contas. Reservar o sobrenadante como por escoamento.
NOTA: Este primeiro flow-through é uma amostra de controlo importante para medir a eficiência IP. Um ensaio de imunotransferência irá fornecer uma indicação da eficiência de IP, bem como a especificidade das interacções investigados. Recomenda-se manter este sobrenadante para análise a jusante. - Lavar as, esferas de anticorpo conjugado ligado a RNP com 10 volumes (600 L) de NETN-150 tampão de lavagem arrefecido com gelo (Tris-HCl a 20, pH 7,4; NaCl 150 mM; MgCl2 3 mM; NP40 a 0,5%; e glicerol a 10%), sob rotação durante 3 min, à temperatura ambiente. Repita o passo 3 vezes.
NOTA: Este tampão difere do tampão de lise e reduz eficazmente associações fracas ou não-específicas. - Após a lavagem final, ressuspender os complexos RNP imobilizada em 60 ul de tampão gelado 1x de ligação (HEPES 10 mM, pH 7,6; KCl 40 mM; MgCl2 3 mM; glicerol a 5%, e 2 mM de DTT) e de reserva de 10% dos grânulos complexos imobilizados por Western blot e 20% para o isolamento de ARN.
4. eluição
- Ajustar o volume remanescente para 100 ul com tampão de ligação arrefecido com gelo 1x e aquecer o tubo a 70 ° C durante 3 min.
- Para isolar complexos de ARN-proteína cognatos, adicionar um oligonucleótido de ADN de ~ 30 nt que é complementar ao contorno da sequência 3 'do ARN de interesse e incuba-se durante 30 min à temperatura ambiente com agitação suave (100 nM de oligonucleótido é suficiente).
NOTA: O oligonucleótido é anti-sentido para os resíduos de nucleótidos adjacentes, para o início da tradução do local da construção PCE usados como um example neste protocolo. complementaridade sequência apropriada é fornecido pelo teor de GC ~ 40%. Desenhar o oligonucleótido anti-sentido para a hibridação eficaz para a região mínima complementar do RNA alvo. - Adicionar 5-10 unidades de ARNase H para o tubo e incubar à temperatura ambiente durante 1 h para clivar o ARN do ARN: ADN híbrido. Transferir o sobrenadante para um tubo de microcentrifugação esterilizado de 1,7 mL; Este exemplo contém os complexos RNP capturados de interesse.
NOTA: Dependendo da acessibilidade do ARN cognato, dois ou mais ciclos de tratamento com RNase H podem ser úteis para aumentar a abundância da amostra para as análises a jusante. - Usar 20% do eluato de uma transferência de Western de proteínas associadas conhecidas e 20% do eluído para isolamento do ARN seguida por RT qPCR. Os restantes 60% pode ser usado para a espectrometria de massa para identificar ou componentes proteicos.
- Em paralelo, submeter-se uma alíquota do lisado celular reservada para isolamento de ARN e a análise de RT-PCR. este assessment fornece uma indicação do enriquecimento de ARN dentro de um complexo de RNP.
NOTA: Utilize a preparação proteína isolada em um western blot controle para verificar que a clivagem RNase H foi eficaz na liberação da RNP do complexo immunuoprecipitated.
5. Proteína Análise Eletroforese e Western Blot
- Objecto de aproximadamente 10-20% do total da amostra de SDS-PAGE e análise de imunotransf erência de acordo com protocolo padrão de laboratório.
NOTA: Este passo serve para validar a eficiência e especificidade de IP antes da análise do RNA a jusante. Ele também pode ser usado para avaliar a composição de proteína do complexo RNP isolado.
6. Coleta do RNA imunoprecipitadas
NOTA: O isolamento de RNA pode ser feito pelo método de Trizol ou seguindo o protocolo descrito.
- Ressuspender metade do total da amostra em 750 ul de reagente de ácido tiocianato de guanidina e incubar a sala temperatura durante 5 minutos antes da extracção do ARN a partir dos complexos de RNP PCE-capturados.
- Adicionar 200 ul de clorofórmio a de o tubo, agitar vigorosamente durante 10 segundos, e incubar à temperatura ambiente durante 3 min.
- Após centrifugação a 16000 xg durante 15 min a 4 ° C, recolher a fase aquosa para um tubo novo e adicionar um volume igual de isopropanol. Misturar bem e incubar à temperatura ambiente durante pelo menos 10 min. Adicionar 1 ml de azul-glicol para a amostra e armazená-lo a -20 ° C no congelador por precipitação ou de processamento eficiente em uma data futura.
- Centrifuga-se o tubo a 16.000 xg durante 10 min a 4 ° C. Cuidadosamente recolher e descartar o sobrenadante, de modo a não perturbar o sedimento de ARN; a utilização de uma ponta de micropipeta P-200 é recomendado para facilitar este processo.
- Adicionar 500 ul de etanol a 75% a cada tubo, vórtice, e centrifugar os tubos a 16.000 xg durante 5 min a 4 ° C. Cuidadosamente recolher e descartar o sobrenadante como no passo 6.4. Ar-secar o sedimento durante 2-3 min e ressuspender em 100 mL de água isenta de RNase.
NOTA: Não prolongar o tempo o ar-pelota seca, a fim de evitar um problema com a ressuspensão. - Adicionar 100 ul de amostra de ARN a uma coluna de ARN de limpeza. Processá-lo usando o protocolo do fabricante. Eluir o RNA em 30 mL de água livre de RNase e armazenar a -80 ° C por até 3 meses.
NOTA: Este RNA isolado é adequado para análise de jusante por RT-PCR em tempo real (qPCR), microarray, e seqüenciamento RNA. Dependendo da abundância do RNP e a eficiência com a qual a RNP de interesse é isolado, o mesmo lisado pode ser submetido a dois ou mais ciclos de IP para gerar ARN suficiente aplicável para as análises a jusante.
A transcrição reversa de ARN e 7. A amplificação do ADNc por PCR
- Submeter o ARN isolado a transcrição reversa por um iniciador aleatório com uma transcriptase reversa de alta qualidade (RT), de acordo com a manufainstruções do cturer.
- Para amplificar o ARN de interesse, conceber um iniciador anti-sentido específico para o gene dentro da sequência de clivagem com ribonuclease H. Use quantidades semelhantes de o oligonucleótido anti-sentido, um iniciador aleatório, ou um iniciador oligo-dT (Ver Tabela Materiais).
NOTA: O iniciador oligo-dT e o ARNm poli-adenilada proporcionar reacções de controlo positivo para as reacções de RT-PCR. - Reserva 5% da reacção de RT (1 ul) para um qPCR preparativa feito em conjunto com o controlo negativo lisado-IP e amostras de DNA de controlo positivo para definir o ponto de corte e produzir uma curva padrão. Se o valor CT do qPCR preparativa está além do alcance da curva padrão, diluir a reacção RT no consecutivos 1: diluições 5 e repita o passo 7.2.
NOTA: Para um seqüenciamento RNA e técnica de espectrometria de massa, consulte o arquivo método complementar. Por favor clique aqui to ver este arquivo método complementar. (Botão direito do mouse para baixar).
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Representative Results
Resultados RIP anteriores identificaram RNAs gag retrovirais e selecionados RNAs celulares que co-precipitado com DHX9 / RHA, incluindo HIV-1 6, Jund 6 e Hur (Fritz e Boris-Lawrie, não publicado). O retroviral 5 'UTR foi demonstrada para co-precipitar com DHX9 / RHA no núcleo e para a co-isolar no citoplasma em polirribossomas. Ela é definida exclusivamente como a cis actuando elemento de controlo pós-transcricional (PCE) 6. Para isolar os complexos de ribonucleoproteína PCEgag ARN-RHA (RNPs) formados nas células em proliferação, foi realizada FLAG-MS2 RNP imunoprecipitação em lisados de células HEK293 transfectadas. Os resultados mostram precipitação eficiente da proteína FLAG-MS2. Notavelmente, DHX9 / RHA é identificado dentro deste complexo RNP e não dentro do controle isotipo IgG, nem dentro do lisado de células-controle negativo HEK293 (Figura 2A). A matriz contendo o RNP foi incubada com um complementar 30-nt oligonucleótido, e, em seguida, foi realizada uma clivagem com ribonuclease H do híbrido de ARN-ADN. Após a digestão com RNase H, os eluatos foram analisados por transferência de Western. A demonstrado clivagem com ribonuclease H do ARN PCEgag na posição do híbrido de ARN-ADN libertado do complexo RNP especificamente ligado a UTR 5 '. Os RNPs DHX9 / RHA-associados estavam determinados a ser enriquecido nos eluentes. Mais importante, os RNPs FLAG-MS2-ligadas manteve-se com as esferas de anticorpo conjugado (Figura 2B). A co-imunoprecipitação da estrutura haste-laçada MS2 retroviral contendo ARN PCEgag em células e em eluentes foi validado por RT-PCR e qRTPCR (Figura 2C). Os resultados confirmaram uma associação selecionar entre DHX9 / RHA eo retroviral 5 'UTR, que tem se destacado como um RNP original importante para o controle de tradução alvejado 6.
Figura 1: RNP isolamento e o enriquecimento de RNP específicas associadas com o 5 'UTR de PCEgag por clivagem com ribonuclease H. Fluxo de trabalho que mostra os passos para isolar uma ribonucleoproteína seleccionado formado de novo em células, a sua recolha por ARNaseH clivagem guiada por oligonucleótidos, e a análise de componentes a jusante de RNA e de proteínas. Resumo da cromatografia de afinidade utilizando uma interação de alta afinidade entre multímeros para a haste de laço RNA MS2 e a proteína de fusão-FLAG proteína de revestimento de MS2 para capturar RNA PCE em grânulos bandeira. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Um ARN PCEgag contendo 6 locais de ligação de ARN MS2 foi capturado por uma proteína de revestimento de MS2 marcado com FLAG imobilizada, e RNP específicas associadas com o 5 'UTR eramlibertado por clivagem com ribonuclease H dirigida por oligonucleótidos. As células HEK293 foram co-transfectadas com pAR200 (um plasmídeo contendo o PCEgag e 6x MS2 laços na intrão VIH) e um plasmídeo que expressa a proteína marcada com epitopo FLAG MS2 com um sinal de localização nuclear (NLS). As células foram recolhidas e o citoplasma foi isolado em 48 h pós-transfecção. Os lisados citoplasmáticos foram sujeitos a imunoprecipitação com anticorpo FLAG ou um controlo de IgG. (A) A eficiência de PI foi determinada por imunotransf erência usando um anticorpo anti-FLAG. DHX9 / RHA, uma proteína de ligação de PCE, serviu como um controlo positivo; ARN contendo PCE imunoprecipitada com a proteína MS2. Lanes 1-3: proteínas entrada usada para IP. Lanes 4-5: FLAG IP do FLAG MS2 overexpressed lisado e HEK293 ligado celular citoplasmática. Pista 6: IgG IP do FLAG MS2 overexpressed lisado. Lanes 7-9: Fluxo através dos IPs. (B) RNPs 5 'UTR-ligadas foram enriquecidos por clivagem com ribonuclease H. As pistas 1-3: Os eluatos de proteína ligada a UTR 5 'pela ARNase H. Pistas 4-6: proteínas ligadas a esferas de anticorpo conjugado. (C) A PCR transcriptase reversa e PCR em tempo real quantitativa de ARN específico ligado a diferentes fracções de RNP. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O isolamento RNP e estratégia de identificação RNA cognate aqui descrito é um meio seletivo de investigar a interacção RNA-proteína específica e de descobrir proteínas candidatas co-regulação de um RNP específica em células.
A vantagem de utilizar clivagem com ribonuclease H dirigida por oligonucleótidos para isolar RNP é a capacidade para capturar e analisar especificamente o elemento que actua em cis de ARN RNP sobre RNP heterogéneos ligados a jusante do elemento de ARN actuam em cis de interesse. Porque a abundância de um ARN cognato em um determinado RNP é uma fracção menor das RNPs recolhidos isoladas sem clivagem com ribonuclease H, a grande desvantagem para este fluxo de trabalho é a escassez do RNP cognato. Em nossa experiência, essa limitação necessitou de 5 a 10 vezes mais material de partida de IP RNA convencional para detecção no immunoblot sensível e proteômica analisa. Uma outra vantagem proporcionada por imobilização do RNP é a conveniência de repetir a ARNase H Treatment e coleta de fluido adicional. Em nossa experiência, 2-4 rodadas de tratamento RNase H foram aconselhável recolher fluido adicional.
Neste protocolo, as preocupações principais técnicas são mantendo a temperatura óptima e garantindo o manuseio estéril dos reagentes. Todos os reagentes devem ser RNase- e livre de protease. A integridade da amostra de ARN é uma armadilha potencial para se considerar uma interacção RNA-proteína não é detectável.
Esta técnica requer a lise eficaz das células para acessar os RNPs em uma quantidade adequada para a detecção. Enquanto uma observação importante é a lise celular incompleta, tratamentos vigorosos podem aumentar as interacções não específicas com o RNA. Portanto, as condições experimentais deve ser medido de forma a enriquecer as interacções proteína-ARN específicas. No entanto, a utilização de lavagens de elevado rigor pode eliminar interacções importantes ainda transientes. Portanto, as condições de lavagem são outra variável para consideER nas necessidades específicas de uma experiência em particular.
eficiência PIR é uma técnica poderosa para isolar parceiros de ARN-proteína cognatos, mas algumas interacções transientes ou fracos que são de importância fisiológica são perdidas durante os passos de ligação ou de lavagem. A ligação cruzada do complexo mRNP é uma opção a ser considerada na análise. Além disso, as condições de crescimento fisiológicos devem ser mantidos em mente ao analisar RNPs reguladoras, como a nível do RNA cognate expressão ou RBP pode estar sujeito a flutuações fisiológicas sob certas condições. Além disso, o tipo de análise a jusante também desempenhar um papel na selecção das condições de lise e de lavagem durante a imunoprecipitação.
Além disso, a imunoprecipitação bem sucedida requer que o lisado celular ser diluído de forma significativa (pelo menos, 1: 1). 1X tampão de lavagem (Tris-HCl a 20, pH 7,3; MgCl2 3 mM, e NaCl 150 mM) é o diluente seleccionado, como a sua composiçãonão afecta a integridade da RNP, solução solubilidade, ou interacções anticorpo-antigénio.
Para a espectrometria de massa a jusante, as amostras devem estar livres de sais, incluindo Na +, Cl -, e Tris, bem como alguns detergentes. Se necessário, os componentes de tampões-iónicos os compostos podem ser reduzidos por diálise ou filtração troca iónica, e, em alguns casos, tampões voláteis são úteis nos passos finais. Nos casos em que o anti-soro é usado para isolar uma proteína marcada com epitopo expressa através de transfecção, a validação Western blot da proteína recombinante utilizando lisado celular inicial deve ser executado antes de posterior análise. No caso de um marcador de epítopo é utilizado (isto é, FLAG, MYC, GFP, etc.), a exposição da etiqueta é crucial para o sucesso do passo de ligação do anticorpo. Congelamento e descongelamento das amostras deve ser evitada.
A técnica PIR tem sido amplamente utilizado para elucidar diversos mecanismos de controlo do gene da pós-transcricional10,25. Isto inclui a identificação de novas proteínas de ARNm, proteína-microARN, e interacções proteína-proteína 10,25. Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado para a determinação da composição de RNP dentro de uma cultura de células. O nosso método permite a avaliação do alvo e em todo o genoma de interacções críticas proteína-ARN, assim como para a captura dos complexos de RNP raras e / ou transientes.
A aplicação desta técnica tem contribuído para a nossa caracterização de RNAs ligados por DHX9 / RNA helicase A e nos ajudou a definir a regulação pós-transcricional crítica de retrovírus e os proto-oncogenes celulares Jund 6,26 e Hur (Fritz e Boris-Lawrie , dados não publicados). Esperamos que a aplicação desta técnica em estudos futuros para promover nossa compreensão dos mecanismos críticos para o controle de gene, incluindo aquelas mediadas por complexos longos não-codificantes RNP.
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Acknowledgments
Os autores agradecem o apoio pelo NIH P50GM103297, P30CA100730 e Comprehensive Cancer P01CA16058.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dynabeads Protein A | Invitrogen | 10002D | |
| Dynabeads Protein G | Invitrogen | 10004D | |
| Anti-FLAG antibody | Sigma | F3165 | |
| Anti-FLAG antibody | Sigma | F7425 | |
| Anti-RHA antibody | Vaxron | PA-001 | |
| TRizol LS reagent | Life technology | 10296-028 | |
| RNase H | Ambion | AM2292 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | BP1145-1 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP26184 | |
| RNaeasy clean-up column | Qiagen | 74204 | |
| Omniscript reverse transcriptase | Qiagen | 205113 | |
| RNase Out | Invitrogen | 10777-019 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 5056489001 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| NP-40 | Sigma | 98379 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | 17904 | |
| Random hexamer primers | Invitrogen | N8080127 | |
| Oligo-dT primers | Invitrogen | AM5730G | |
| PCR primers | IDT | Gene specific primers for PCR amplification | |
| Oligonucleotide for RNase H mediated cleavage | IDT | Anti-sense primer for target RNA | |
| Trypsin | Gibco Life technology | 25300-054 | |
| DMEM tissue culture medium | Gibco Life technology | 11965-092 | |
| Fetal bovine serum | Gibco Life technology | 10082-147 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S642-212 | |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | BP214 | |
| DTT | Fisher Scientific | R0862 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | BP220-212 | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 1620112 | |
| Magnetic stand | 1.7 ml micro-centrifuge tube holding | ||
| Laminar hood | For animal tissue culture | ||
| CO2 incubator | For animal tissue culture | ||
| Protein gel apparatus | Protein sample separation | ||
| Protein transfer apparatus | Protein sample transfer | ||
| Ready to use protein gels (4-15%) | Protein sample separation | ||
| Table top centrifuge | Pellet down the sample | ||
| Table top rotator | Mix the sample end to end | ||
| Vortex | Mix the samples |
References
- Bandziulis, R. J., Swanson, M. S., Dreyfuss, G. RNA-binding proteins as developmental regulators. Genes Dev. 3 (4), 431-437 (1989).
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