Introduction
Post-transkripsjonell genekspresjon reguleres nøyaktig, som begynner med DNA-transkripsjon i kjernen. Kontrollert av RNA bindende proteiner (RBPs), mRNA biogenesis og metabolisme forekommer i svært dynamiske ribonucleoprotein partikler (RNPs), som førsteamanuensis og dissosierer med et substrat forløper mRNA under utviklingen av RNA metabolisme 1-3. Dynamiske endringer i RNP komponentene påvirker post-transcriptional skjebnen til et mRNA og gi kvalitetssikring under behandlingen av primære transkripsjoner, deres kjernefysisk trafficking og lokalisering, deres aktivitet som mRNA maler for oversettelse, og eventuell omsetning av modne mRNA.
Tallrike proteiner er betegnet som RBPs i kraft av sine konserverte aminosyrer domener, herunder RNA gjenkjennelse motiv (RRM), den dobbelt-trådet RNA-bindende domene (RBD), og strekninger av basiske rester (for eksempel, arginin, lysin og glycin) 4. RBPs er rutinemessigisolert av immunoutfellingsstudier strategier og er skjermet for å identifisere sine beslektede RNA. Noen RBPs co-regulere pre-mRNA som er funksjonelt-relatert, utpekt som RNA regulons 5-8. Disse RBPs, deres beslektede mRNA, og noen ganger ikke-kodende RNA, danner katalytiske RNPs som varierer i sammensetning; deres egenart er på grunn av ulike kombinasjoner av tilknyttede faktorer, så vel som til den timelige sekvens, plassering, og varigheten av deres samhandling 9.
RNA immunoprecipitation (RIP) er en kraftfull teknikk for å isolere RNPs fra celler og for å identifisere tilhørende utskrifter ved hjelp av sekvensanalyse 10-13. Flytting fra kandidat til genom-wide screening er mulig gjennom RIP kombinert med en microarray analyse 14 eller high-throughput sekvensering (RNAseq) 15. Likeledes kan ko-utfelling av proteiner bli identifisert ved massespektrometri, hvis de er tilstrekkelig mange og kan skilles fra den ko-utfelling av antistoff 16,17. Her tar vi metoden for isolering av RNP komponenter av et spesifikt beslektet RNA fra dyrkede humane celler, selv om tilnærmingen er modifiserbar for løselige lysater av planteceller, sopp, virus og bakterier. Nedstrøms analyser av materialet inkluderer kandidat identifisering og validering av immunoblot, massespektrometri, biokjemiske enzymatisk analyse, RT-qPCR, mikromatriser, og RNAseq, som oppsummert i figur 1.
Med den grunnleggende rolle RNPs i å kontrollere genekspresjon på det post-transkripsjonelle nivå, til endringer i ekspresjonen av komponent RBPs eller deres tilgjengeligheten beslektede RNA kan være skadelig for cellen og er forbundet med flere typer lidelser, inkludert nevrologiske sykdommer 18. DHX9 / RNA helicase A (RHF) er nødvendig for oversettelse av utvalgte mRNA av cellulære og retrovirale opprinnelse 6. Disse beslektede RNA vise strukturelt-relaterte cis-virkende elementer innen sitt5 'UTR, som er utpekt som den post-transkripsjonen kontroll element (PCE) 19. RHA-PCE aktivitet er nødvendig for effektiv cap-avhengig translasjon av mange retrovirus, inkludert HIV-1, og av vekst regulatoriske gener, inkludert JUND 6,20,21. Kodet av et essensielt gen (dhx9), er RHA avgjørende for celleproliferasjon og dens nedregulering eliminerer cellelevedyktighet 22. Den molekylære analyser av RHA-PCE RNPs er et viktig skritt for å forstå hvorfor RHA-PCE aktivitet er nødvendig for å kontrollere cellevekst.
Den nøyaktige karakterisering av RHA-PCE RNP komponenter ved steady state eller ved fysiologisk forstyrrelse av cellen krever selektiv berikelse og fangst av RHA-PCE RNPs i tilstrekkelig mengde for nedstrøms analyse. Her ble det retrovirale PCEgag RNA merket med 6 kopier av cis-virkende RNA bindingssete for MS2-kappeprotein (CP) innenfor den åpne leserammen. MS2 kappeprotein ble exogenously co-uttrykkes med PCEgag RNA ved plasmid transfeksjon å lette RNP forsamlingen i voksende celler. RNPs inneholder MS2 kappeproteinet med beslektet MS2-merket PCEgag RNA ble immunopresipitert fra celleekstrakt og fanget på magnetiske kuler (figur 2a). For selektivt å fange opp de RNP komponentene bundet til PCE, ble den immobiliserte RNP inkubert med et oligonukleotid komplementære til sekvenser distale til den PCE, danner en RNA-DNA-hybrid som er substratet for RNase H-aktivitet. Siden PCE er plassert i 5'-terminalen til den 5 'utranslaterte region, oligonukleotidet var komplementære med RNA-sekvenser som grenser til den retrovirale translasjonsstartsetet (gag startkodonet). RNase H spaltning nær gag startkodonet utgitt 5'-UTR-komplekset fra den immobiliserte RNP, som ble oppsamlet som elueringsmiddel. Deretter ble prøven bedømt ved hjelp av RT-PCR for å bekrefte fangst av PCEgag og ved SDS-PAGE og immunoblot for å bekrefte capture av målet MS2-kappeproteinet. En validering av PCE-assosierte RNA-bindende protein, DHX9 / RNA helikase A, ble deretter utført.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
| buffer~~POS=TRUNC Komposisjoner |
| Wash Buffer: |
| 50 mM Tris-HCl, pH 7.4 |
| 150 mM NaCl |
| 3 mM MgCl2 |
| Lav Salt Buffer: |
| 20 mM Tris-HCl, pH 7.5 |
| 10 mM NaCl |
| 3 mM MgCl2 |
| 2 mM DTT |
| 1x proteasehemmer cocktail EDTA-fri |
| RNase Out 5 ul / ml (RNase inhibitor) |
| Cytoplasmatiske Lysis Buffer: |
| 0,2 M sukrose |
| 1,2% Triton X-100 |
| NETN-150 Wash Buffer: |
| 20 mM Tris-HCl, pH 7.4 |
| 150 mmNaCl |
| 0,5% NP-40 |
| 3 mM MgCl2 |
| 10% Glycerol |
| Binding Buffer: |
| 10 mM HEPES pH 7.6 |
| 40 mM KCl |
| 3 mM MgCl2 |
| 2 mM DTT |
| 5% glycerol |
Tabell 2: bufferblandinger.
1. Fremstilling av cellene og affinitetsmatriksen
- Kultur en cellelinje av interesse for sub-konfluens (80%) i en 10 cm plate. Bruk 10 cm plater for uavhengige immunoutfellinger (IP) av en FLAG-merket NLS-MS2 kappeprotein. Utfør IP ved hjelp av antisera til FLAG-epitop tag. Når uttrykker FLAG-merket MS2 kappeprotein plasmid, transfektere celler 24-48 timer i forkant av høst 20.
MERK: En bestemt RNP kan bli beriket fra kjernekraft eller cytoplasmaic lysatene eller en biokjemisk-fraksjonert forberedelse, for eksempel brøkdeler av et sukrose gradient. Det anbefales å høste lysat fra ikke-transfekterte celler i parallell for å innføre en ytterligere negativ kontroll. - Overfør 60 mL per IP protein G magnetiske kuler slurry til et 1,7 ml mikrosentrifugerør.
- Plasser røret på en magnet stativ for mikrosentrifugerør for å skille kulene fra lagerløsningen.
- Fjern lagringsløsningen ved forsiktig å trekke den opp med en mikropipette.
- Fjerne røret fra magneten stativet.
- Vask og likevekt perlene med 600 ul (10 ganger den anvendte volumet av perler) av 1x vaskebuffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 3 mM MgCl2, og 150 mM NaCl) og ende-over-ende-rotasjon i tre min ved romtemperatur.
- Plasser røret på magneten stativet og fjerne vaskebufferen.
- Tilsett 10 volumer (600 ul) i 1 x vaskebuffer, og immunoutfelling FLAG antistoff til den ekvilibrerte protein G magnetiske kuler (i henhold til den mengde som anbefales av produsenten for en immunpresipitering) og rotert ende-over-ende ved romtemperatur i minst 30 minutter for å konjugere antistoffet immunoutfelling. Bruke den tilsvarende isotype IgG som et passende antistoff negativ kontroll.
- Plasser røret på magneten stativet for å samle kulene og for å fjerne supernatanten.
- Fjerne røret fra magneten stativet og vaske antistoff-konjugerte perler med 10 volumer (600 ul) i 1 x vaskebuffer, og rotasjon i 3 minutter ved romtemperatur. Gjenta dette trinnet to ganger.
- Plasser røret på magneten stativet og fjerne vaskebufferen.
2. Høsting av RNPs
MERK: Klargjør RNPs under inkubasjonstid etter trinn 1.8.
- Fjerne kulturmedium fra cellene ved aspirasjon og vaske cellene to ganger med 1-5 ml iskald 1x fosfat-bufret saltvann (PBS). Bruk en celle skrape for å løsne våt,adherente celler før innsamling ved sentrifugering ved 226 x g i 4 minutter ved 4 ° C.
- Legg 375 mL iskald, lav-salt-buffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 3 mM MgCl2; 10 mM NaCl; 2 mM DTT, 1 x protease-inhibitor cocktail, EDTA-fri, og 5 ul / ml RNase inhibitor) til cellepelleten og tillate svelling ved å plassere den på is i 5 min.
MERK: Skredder volumet av lav-salt-buffer i henhold til størrelsen av cellepelleten. For 1.2 x 10 6 celler fra en 10 cm plate, 375 ul av bufferen er tilstrekkelig. - Å samle den cytoplasmatiske cellelysat, tilsett 125 mL av iskald lysebuffer (0,2 M sukrose / 1,2% Triton X-100), og deretter utføre 10 slag med en Dounce homogenisator som var forhånds kjølt i en isen bøtte.
MERK: For å samle inn det totale celleekstrakt, er standard RIPA lysebuffer anbefalt for oppløsende nukleoplasma / kromatin. - Spin i en mikro i full fart (16000 xg) i 1 min; dette vil fjerne supernatanten av rusk ennd kjerner.
- Overfør supernatanten til et nytt 1,7 ml mikrosentrifugerør som har vært på is. Bestemme den totale proteinkonsentrasjon ved en standard laboratorium-metode foretrekkes, slik som Bradford-analysen 23. Reservere en alikvot på minst 10% for en Western blot-analyse, som skal brukes som en inngang kontroll. Bruk høstet cellelysat umiddelbart for immunoprecipitation eller lagre det ved -80 ° C for fremtidig analyse.
MERK: I vår erfaring, kan disse prøvene lagres og brukes flere måneder senere for immunpresipitasjonsanalyse uten kompromiss av integritet.
3. Immunpresipitasjon
- Legge til den ønskede volum av innhøstet cellelysat, basert på proteinkonsentrasjonen bestemt i trinn 2.5, til målet antistoff-konjugerte perler. Ved hjelp av 1 x vaskebuffer, bringe det totale volum opp til 600 pl og rotere end-over-end i 90 minutter ved romtemperatur.
MERK: Denne tidsperioden er tilstrekkelig til å generereen robust isolering av høy-affinitets-RNP komplekser samtidig minimere ikke-spesifikk binding. Fortynn alternative RNP kilder, slik som brøkdeler av en sukrosegradient, minst 1: 1 med 1 x vaskebuffer, og deretter inkubere dem med tidligere fremstilte kule-antistoffkomplekser, som nevnt ovenfor. - Etter 90 min inkubasjon plassere IP rør på magneten stativet for å samle perlene. Forbeholder supernatanten som gjennomstrømnings.
MERK: Denne første gjennomstrømnings er en viktig kontrollprøve for å måle IP effektivitet. En immunoblot-analyse vil gi en indikasjon på IP-effektivitet, så vel som spesifisiteten av de undersøkte interaksjoner. Det anbefales å holde denne supernatant for nedstrøms analyse. - Vask RNP-bundet, antistoff-konjugerte perler med 10 volumer (600 ul) av iskald NETN-150 vaskebuffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,4; 150 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 0,5% NP40, og 10% glycerol) under rotasjon i 3 minutter ved romtemperatur. Gjenta trinn 3 ganger.
MERK: Denne bufferen er forskjellig fra den lyseringsbuffer og effektivt reduserer svake eller ikke-spesifikke assosiasjoner. - Etter den siste vask, resuspender den immobiliserte RNP kompleksene i 60 mL iskald 1 x bindingsbuffer (10 mM HEPES, pH 7,6, 40 mM KCI, 3 mM MgCl2, 5% glycerol, og 2 mM DTT) og reserve 10% av de immobiliserte kompleks perler for Western blot og 20% for RNA-isolering.
4. Elution
- Juster det resterende volumet til 100 pl med iskald 1 x bindingsbuffer og oppvarme røret ved 70 ° C i 3 minutter.
- For å isolere beslektede RNA-proteinkomplekser, legge til en ~ 30-nt DNA-oligonukleotid som er komplementært til 3'-sekvensen grensen for RNA av interesse, og inkuber i 30 minutter ved romtemperatur med forsiktig gynge (100 nM av oligonukleotid er tilstrekkelig).
MERK: Oligonukleotidet er antisense til den nukleotidrester ved siden av translasjonsstart-området av PCE konstruksjonen anvendes som en example i denne protokollen. Passende sekvens komplementaritet er levert av ~ 40% GC-innhold. Utforme den antisense-oligonukleotid for effektiv hybridisering til den komplementære regionen minimum av target RNA. - Legg 5-10 enheter av RNase H til røret og inkuber ved værelsestemperatur i 1 time for å spalte RNA av RNA: DNA hybrid. Overfør supernatanten til et sterilt 1,7 ml mikrosentrifugerør; denne prøven inneholder de fangede RNP komplekser av interesse.
MERK: Avhengig av tilgjengeligheten av beslektet RNA, kan to eller flere runder med RNase H behandling kan være nyttig for å øke prøven mengde til nedstrøms analysene. - Bruke 20% av eluatet i en Western blot for kjente assosierte proteiner og 20% av eluatet for RNA isolering, etterfulgt av RT qPCR. De resterende 60% kan anvendes for massespektrometri eller for å identifisere proteinkomponenter.
- Parallelt underkaste en prøve av den reserverte cellelysat til RNA isolering og RT-PCR-analyse. dette assevurdering gir en indikasjon på anrikning av RNA i en RNP kompleks.
MERK: Bruk isolerte protein forberedelse i en kontroll western blot for å forsikre seg om at RNase H cleavage var effektive i å slippe RNP fra immunuoprecipitated komplekset.
5. Protein elektroforese og Western Blot analyse
- Gjenstand omtrent 10-20% av den totale prøve til SDS-PAGE og immunoblot-analyse i henhold til standard laboratorie-protokoll.
MERK: Dette trinnet tjener til å validere IP effektivitet og spesifisitet før nedstrøms RNA-analyse. Den kan også brukes til å vurdere det proteinsammensetningen av det isolerte RNP-kompleks.
6. Samling av immunopresipitert RNA
MERK: RNA isolering kan utføres ved Trizol-metoden eller ved å følge den beskrevne protokoll.
- Resuspender halvparten av det totale utvalget i 750 mL av syre guanidiumtiocyanat reagent og ruge på plass temperature i 5 min før utpakking av RNA fra de fangede PCE-RNP komplekser.
- Tilsett 200 ul av kloroform til røret, ristes kraftig i 10 sekunder, og inkuber ved værelsestemperatur i 3 min.
- Etter sentrifugering ved 16 000 xg i 15 min ved 4 ° C, samler den vandige fase inn i på nytt rør og tilsett et likt volum isopropanol. Bland godt og inkuber ved værelsestemperatur i minst 10 min. Tilsett 1 pl av glykol blå til prøven og lagre det ved -20 ° C i fryseren for effektiv utfelling eller behandling på et senere tidspunkt.
- Sentrifuger røret ved 16.000 xg i 10 min ved 4 ° C. Samle forsiktig opp og kast supernatanten, slik som å ikke forstyrre RNA pellet; anvendelse av en mikropipette spissen p-200 anbefales for å forenkle denne prosessen.
- Legge til 500 ul av 75% ethanol til hvert rør, vortex, og sentrifuger rørene ved 16.000 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Samle forsiktig opp og kast supernatanten som i trinn 6.4. Luft-tørke pellet i 2-3 min og resuspendert i 100 ul RNase-fritt vann.
MERK: Ikke forlenge tiden de pellets luft-tørker for å unngå et problem med resuspensjon. - Anvende 100 ul RNA prøven til et RNA clean-up-kolonne. Behandle det ved hjelp av produsentens protokoll. Eluer RNA i 30 ul RNase-fritt vann og oppbevares ved -80 ° C i inntil 3 måneder.
MERK: Dette isolerte RNA er egnet for nedstrøms analyse ved RT-realtime PCR (qPCR), microarray, og RNA sekvensering. Avhengig av overflod av RNP og den effektivitet med hvilken den RNP av interesse er isolert, kan den samme lysat underkastes to eller flere runder med IP for å generere tilstrekkelig RNA anvendelig for nedstrøms analysene.
7. RNA Reverse Transcription og Amplification av cDNA ved PCR
- Utsette den isolerte RNA til revers transkripsjon av et tilfeldig primer med en høy kvalitet revers transkriptase (RT), i henhold til manufacturer instruksjoner.
- For å forsterke den RNA av interesse, å utforme en gen-spesifikk antisense-primer innenfor RNase H spaltning sekvens. Bruk lignende mengder av antisense-oligonukleotid, en tilfeldig primer, eller en oligo-dT-primer (se Materialer tabell).
MERK: oligo-dT primer og polyadenylert mRNA gi positive kontrollreaksjoner for RT-PCR reaksjoner. - Reserve 5% av RT-reaksjonen (1 ul) for en preparativ qPCR utført i tandem med negativ-kontroll lysat IP og positive kontroll DNA-prøver for å definere cutoff og frembringe en standardkurve. Når CT-verdien av preparativ qPCR er utenfor området av standardkurven, fortynne RT-reaksjonen i etterfølgende 1: 5 fortynninger og gjenta trinn 7.2.
MERK: For en RNA sekvensering og massespektrometri teknikk, se Utfyllende Method filen. Vennligst klikk her to se denne tilleggs Method fil. (Høyreklikk for å laste ned.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tidligere RIP resultater identifisert retrovirale gag RNA og valgt cellulære RNA at samtidig fallet med DHX9 / RHA, inkludert HIV-1 6, Jund 6 og Hur (Fritz og Boris-Lawrie, upublisert). Den retrovirale 5 'UTR er vist å co-felle ut med DHX9 / RHA i kjernen og å co-isolere i cytoplasma på polyribosomes. Det er unikt definert som cis -acting post-transkripsjonen kontroll element (PCE) 6. For å isolere PCEgag RNA-RHA ribonucleoprotein komplekser (RNPs) dannet i prolifererende celler, utførte vi FLAG-MS2 RNP immunoprecipitation i transfekterte HEK293 cellelysater. Resultatene viser effektiv utfelling av FLAG-MS2 protein. Spesielt, er DHX9 / RHA identifisert innen denne RNP-kompleks og ikke innenfor IgG-isotype kontroll, eller i løpet av den negative kontroll-HEK293 cellelysat (figur 2A). Den matrise som inneholder RNPs ble inkubert med en komplementær 30-nt oligonukleotid, og deretter en RNase H spalting av RNA-DNA-hybrid ble utført. Ved RNase H fordøyelse, ble eluatene analysert ved Western blotting. Den viste RNase H kløyving av RNA PCEgag ved RNA-DNA-hybrid stilling frigjøres den RNP-kompleks spesifikt bundet til 5'-UTR. De DHX9 / RHA-forbundet RNPs var fast bestemt på å bli beriket i utvasking. Viktigere, forble de FLAG-MS2-bundet RNPs med antistoff-konjugert perler (figur 2B). Den ko-immunutfelling av MS2 stammesløyfe inneholdende retrovirale PCEgag RNA i celler og i elueringsmidler ble bekreftet ved RT-PCR og qRTPCR (figur 2C). Resultatene bekreftet en utvalgt forening mellom DHX9 / RHA og retroviral 5 'UTR, som har blitt fremhevet som en unik RNP viktig for målrettet oversettelse kontroll 6.
Figur 1: RNP isolasjon og berikelse av spesifikke RNPs forbundet med 5 'UTR av PCEgag av RNase H cleavage. Arbeidsflyt viser fremgangsmåten for å isolere en valgt ribonucleoprotein dannet de novo i cellene, sin samling av oligonukleotid-guidet RNaseH cleavage, og nedstrøms analyse av RNA og proteinkomponenter. Oppsummering av affinitetskromatografi ved hjelp av et høy-affinitet interaksjon mellom multimerer for MS2 RNA stilk-løkke og MS2-kappeprotein-FLAG fusjonsprotein for å fange opp PCE RNA på FLAG perler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: En PCEgag RNA inneholder 6 MS2 RNA bindingssteder ble tatt til fange av en immobilisert FLAG-merket MS2 kappeprotein, og bestemte RNPs forbundet med 5 'UTR varutgitt av oligonukleotid-rettet RNase H cleavage. HEK293-celler ble ko-transfektert med pAR200 (et plasmid inneholdende PCEgag og 6x MS2 løkker i HIV intron) og et plasmid som uttrykker en FLAG-epitop-tagget MS2-protein med en kjernelokaliseringssekvens (NLS). Celler ble samlet og cytoplasma ble isolert ved 48 timer etter transfeksjon. De cytoplasmatiske lysater ble underkastet immunoutfelling med enten FLAG-antistoff eller et IgG-kontroll. (A) IP effektivitet ble bestemt ved immunoblot ved anvendelse av en anti-FLAG-antistoff. DHX9 / RHA, en PCE bindende protein, servert som en positiv kontroll; PCE-holdig RNA immunoutfelt med MS2 protein. Lanes 1-3: Input proteiner som brukes for IP. Lanes 4-5: FLAG IP av FLAG MS2 overexpressed lysat og HEK293 cytoplasmatiske cellelysat. Lane 6: IgG IP av FLAG MS2 overexpressed lysat. Lanes 7-9: Gjennomstrømning av IP-adresser. (B) 5 'UTR-bundet RNPs ble beriket av RNase H cleavage. Lanes 1-3: Eluater av 5'-UTR-bundet protein ved RNase H. baner 4-6: proteiner bundet til antistoff-konjugerte perler. (C) Revers transkriptase-PCR og real-time kvantitativ PCR av RNA spesifikt bundet til forskjellige fraksjoner av RNPs. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
RNP isolasjon og beslektet RNA identifikasjon strategi er beskrevet her er en selektiv måte å undersøke et spesifikt RNA-protein interaksjon og oppdage kandidat proteiner co-regulere en spesifikk RNP i cellene.
Fordelen ved å bruke oligonukleotid-rettede RNase H spaltning for å isolere RNPs er evnen til å registrere og analysere spesifikt RNP cis-virkende RNA elementet over heterogene RNPs bundet nedstrøms til cis-virkende element RNA av interesse. På grunn av at overflod av en beslektet RNA i en gitt RNP er en liten brøkdel av de innsamlede RNPs isolert uten RNase H spalting, den store ulempe for denne arbeidsflyten er knapphet på beslektet RNP. I vår erfaring, denne begrensningen nødvendig 5- til 10 ganger mer utgangsmaterialet enn konvensjonell RNA IP for deteksjon i sensitive immunoblot og proteomikk analyser. En annen fordel som tilbys av immobilisere RNP er bekvemmeligheten av å gjenta RNase H treling og samle ekstra eluatet. I vår erfaring, 2-4 runder med RNase H behandling var tilrådelig å innhente ytterligere eluat.
I denne protokollen blir viktigste tekniske problemer å opprettholde den optimale temperatur og sikre steril håndtering av reagenser. Alle reagenser skal være RNase- og protease-fri. Integriteten av RNA-prøven er en potensiell fallgruve for å vurdere om et RNA-proteininteraksjon er ikke påvisbar.
Denne teknikken forutsetter effektiv lysering av cellene for å få tilgang til RNPs i en passende mengde for deteksjon. Mens en viktig påminnelse er ufullstendig cellelyse, kan kraftige behandlinger øke uspesifikke interaksjoner med RNA. Derfor bør de eksperimentelle betingelser måles for å berike spesifikke protein-RNA-interaksjoner. Imidlertid kan bruk av høy-stringens vasker eliminere viktige ennå forbigående interaksjoner. Derfor vaske forholdene er en annen variabel til atskilligeer i de spesifikke kravene til en bestemt eksperiment.
RIP effektivitet er en kraftfull teknikk for å isolere beslektet RNA-protein partnere, men noen forbigående eller svake interaksjoner som er av fysiologiske betydning er tapt i løpet av de bindende eller vasketrinn. Cross-linking av mRNP komplekset er et alternativ å vurdere i en analyse. Videre bør fysiologiske vekstbetingelser tas i betraktning under analysen regulerende RNPs, som ekspresjonsnivået av den beslektede RNA eller RBP kan bli utsatt for fysiologiske svingninger under visse forhold. Videre vil typen av nedstrøms analyse også spille en rolle i å velge lysis og vaskebetingelser i løpet av immunpresipitering.
I tillegg krever den vellykkede immunoutfelling at cellelysatet bli vesentlig fortynnet (minst 1: 1). 1x vaskebuffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,3, 3 mM MgCl2, og 150 mM NaCl) er den valgte fortynningsmiddel, som dets sammensetningpåvirker ikke RNP integritet, oppløselighet løsning, eller antistoff-antigen-vekselvirkninger.
For nedstrøms massespektrometri, bør prøvene være fri for salter, inkludert Na +, Cl -, og Tris, samt noen vaskemidler. Om nødvendig kan forbindelsene-komponenter av buffere-ioniske reduseres ved dialyse eller ionisk utveksling filtrering, og i noen tilfeller, flyktige buffere er nyttige i de siste trinnene. I tilfeller hvor antiserum brukes til å isolere en epitop-tagget proteinet uttrykt ved transfeksjon, bør Western blot validering av det rekombinante protein ved hjelp av innledende cellelysat bli utført før ytterligere analyse. I tilfelle en epitop taggen brukes (dvs. FLAG, MYC, GFP, etc.), er eksponeringen av koden avgjørende for å lykkes i den antistoffbinding trinn. Fryse-tine av prøver bør unngås.
RIP teknikken har vært mye brukt for å belyse ulike mekanismer for post-transcriptional gene kontroll10,25. Dette inkluderer identifikasjon av nytt protein-mRNA, protein-mikroRNA, og protein-protein interaksjoner 10,25. Her gir vi en omfattende protokoll for bestemmelse av RNP preparat i en cellekultur. Vår metode gjør det mulig for den målrettede og genom-wide vurdering av kritiske protein-RNA vekselvirkninger, så vel som for fangst av sjeldne og / eller forbigående RNP komplekser.
Anvendelsen av denne teknikken har bidratt til vår karakterisering av RNA bundet av DHX9 / RNA helicase A og hjalp oss å definere kritiske post-transcriptional regulering av retrovirus og de cellulære proto-onkogener JUND 6,26 og Hur (Fritz og Boris-Lawrie , upubliserte data). Vi forventer at anvendelsen av denne teknikken i fremtidige studier for å øke vår forståelse av de kritiske mekanismer for genet kontroll, inkludert de mediert av lange ikke-kodende RNP komplekser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke for støtten ved NIH P50GM103297, P30CA100730 og Comprehensive Cancer P01CA16058.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dynabeads Protein A | Invitrogen | 10002D | |
| Dynabeads Protein G | Invitrogen | 10004D | |
| Anti-FLAG antibody | Sigma | F3165 | |
| Anti-FLAG antibody | Sigma | F7425 | |
| Anti-RHA antibody | Vaxron | PA-001 | |
| TRizol LS reagent | Life technology | 10296-028 | |
| RNase H | Ambion | AM2292 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | BP1145-1 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP26184 | |
| RNaeasy clean-up column | Qiagen | 74204 | |
| Omniscript reverse transcriptase | Qiagen | 205113 | |
| RNase Out | Invitrogen | 10777-019 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 5056489001 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| NP-40 | Sigma | 98379 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | 17904 | |
| Random hexamer primers | Invitrogen | N8080127 | |
| Oligo-dT primers | Invitrogen | AM5730G | |
| PCR primers | IDT | Gene specific primers for PCR amplification | |
| Oligonucleotide for RNase H mediated cleavage | IDT | Anti-sense primer for target RNA | |
| Trypsin | Gibco Life technology | 25300-054 | |
| DMEM tissue culture medium | Gibco Life technology | 11965-092 | |
| Fetal bovine serum | Gibco Life technology | 10082-147 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S642-212 | |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | BP214 | |
| DTT | Fisher Scientific | R0862 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | BP220-212 | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 1620112 | |
| Magnetic stand | 1.7 ml micro-centrifuge tube holding | ||
| Laminar hood | For animal tissue culture | ||
| CO2 incubator | For animal tissue culture | ||
| Protein gel apparatus | Protein sample separation | ||
| Protein transfer apparatus | Protein sample transfer | ||
| Ready to use protein gels (4-15%) | Protein sample separation | ||
| Table top centrifuge | Pellet down the sample | ||
| Table top rotator | Mix the sample end to end | ||
| Vortex | Mix the samples |
References
- Bandziulis, R. J., Swanson, M. S., Dreyfuss, G. RNA-binding proteins as developmental regulators. Genes Dev. 3 (4), 431-437 (1989).
- Hogan, D. J., Riordan, D. P., Gerber, A. P., Herschlag, D., Brown, P. O. Diverse RNA-binding proteins interact with functionally related sets of RNAs, suggesting an extensive regulatory system. PLoS Biol. 6 (10), e255 (2008).
- Glisovic, T., Bachorik, J. L., Yong, J., Dreyfuss, G. RNA-binding proteins and post-transcriptional gene regulation. FEBS Lett. 582 (14), 1977-1986 (2008).
- Lunde, B. M., Moore, C., Varani, G. RNA-binding proteins: modular design for efficient function. Nat.Rev.Mol.Cell Biol. 8 (6), 479-490 (2007).
- Cochrane, A. W., McNally, M. T., Mouland, A. J. The retrovirus RNA trafficking granule: from birth to maturity. Retrovirology. 3, 18 (2006).
- Hartman, T. R., Qian, S., Bolinger, C., Fernandez, S., Schoenberg, D. R., Boris-Lawrie, K. RNA helicase A is necessary for translation of selected messenger RNAs. Nat.Struct.Mol.Biol. 13 (6), 509-516 (2006).
- Pullmann, R., et al. Analysis of turnover and translation regulatory RNA-binding protein expression through binding to cognate mRNAs. Mol.Cell.Biol. 27 (18), 6265-6278 (2007).
- Keene, J. D. RNA regulons: coordination of post-transcriptional events. Nat.Rev.Genet. 8 (7), 533-543 (2007).
- Moore, M. J. From birth to death: the complex lives of eukaryotic mRNAs. Science. 309 (5740), 1514-1518 (2005).
- Hassan, M. Q., Gordon, J. A., Lian, J. B., van Wijnen, A. J., Stein, J. L., Stein, G. S. Ribonucleoprotein immunoprecipitation (RNP-IP): a direct in vivo analysis of microRNA-targets. J.Cell.Biochem. 110 (4), 817-822 (2010).
- Selth, L. A., Close, P., Svejstrup, J. Q. Studying RNA-protein interactions in vivo by RNA immunoprecipitation. Methods Mol.Biol. 791, 253-264 (2011).
- Singh, D., Boeras, I., Singh, G., Boris-Lawrie, K. Isolation of Cognate Cellular and Viral Ribonucleoprotein Complexes of HIV-1 RNA Applicable to Proteomic Discovery and Molecular Investigations. Methods Mol.Biol. 1354, 133-146 (2016).
- Stake, M., et al. HIV-1 and two avian retroviral 5' untranslated regions bind orthologous human and chicken RNA binding proteins. Virology. 486, 307-320 (2015).
- Sung, F. L., et al. Genome-wide expression analysis using microarray identified complex signaling pathways modulated by hypoxia in nasopharyngeal carcinoma. Cancer Lett. 253 (1), 74-88 (2007).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat.Rev.Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
- Michlewski, G., Caceres, J. F.
- Tacheny, A., Dieu, M., Arnould, T., Renard, P. Mass spectrometry-based identification of proteins interacting with nucleic acids. J. Proteomics. 94, 89-109 (2013).
- Duan, R., Sharma, S., Xia, Q., Garber, K., Jin, P. Towards understanding RNA-mediated neurological disorders. J.Genet.Genomics. 41 (9), 473-484 (2014).
- Butsch, M., Hull, S., Wang, Y., Roberts, T. M., Boris-Lawrie, K. The 5' RNA terminus of spleen necrosis virus contains a novel posttranscriptional control element that facilitates human immunodeficiency virus Rev/RRE-independent Gag production. J. Virol. 73 (6), 4847-4855 (1999).
- Bolinger, C., et al. RNA helicase A interacts with divergent lymphotropic retroviruses and promotes translation of human T-cell leukemia virus type 1. Nucleic Acids Res. 35 (8), 2629-2642 (2007).
- Bolinger, C., Sharma, A., Singh, D., Yu, L., Boris-Lawrie, K. RNA helicase A modulates translation of HIV-1 and infectivity of progeny virions. Nucleic Acids Res. 38 (5), 1686-1696 (2010).
- Lee, T., et al. Suppression of the DHX9 helicase induces premature senescence in human diploid fibroblasts in a p53-dependent manner. J.Biol.Chem. 289 (33), 22798-22814 (2014).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal.Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Glenn, G. Preparation of protein samples for mass spectrometry and N-terminal sequencing. Methods Enzymol. 536, 27-44 (2014).
- Keene, J. D., Komisarow, J. M., Friedersdorf, M. B. RIP-Chip: the isolation and identification of mRNAs, microRNAs and protein components of ribonucleoprotein complexes from cell extracts. Nat.Protoc. 1 (1), 302-307 (2006).
- Ranji, A., Shkriabai, N., Kvaratskhelia, M., Musier-Forsyth, K., Boris-Lawrie, K. Features of double-stranded RNA-binding domains of RNA helicase A are necessary for selective recognition and translation of complex mRNAs. J.Biol.Chem. 286 (7), 5328-5337 (2011).
