Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.
Les dendrites des neurones dopaminergiques reçoivent et transmettent entrée synaptique, le soutien potentiel d'action back-propagation et la libération de neurotransmetteurs. La compréhension de ces fonctions fondamentales fera la lumière sur le transfert de l'information dans ces neurones. patch-clamp enregistrements dendritiques offrent la possibilité d'examiner directement les propriétés électriques des dendrites et des canaux voltage-dépendants sous-jacents ion. Cependant, ces structures fines ne sont pas facilement accessibles aux pipettes de patch en raison de leur petit diamètre. Ce rapport décrit une procédure étape par étape pour recueillir des enregistrements stables et fiables des dendrites des neurones dopaminergiques dans des tranches aiguës. Mesures électrophysiologiques sont combinées avec la récupération post hoc de la morphologie cellulaire. Des expériences réussies reposent sur l'amélioration de la préparation des tranches, des solutions et des pipettes, le réglage adéquat de l'optique et de la stabilité de la pipette en contact avec la structure enregistrée. principes standard de somatique enregistrement patch-clamp sont appliqués à dendrites, mais avec une approche plus douce de la pipette. Ces techniques polyvalentes peuvent être mises en œuvre pour répondre à diverses questions concernant les propriétés excitables de dendrites.
Les neurones reçoivent des informations synaptique principalement sur leurs dendrites. Excitateurs synaptiques et des signaux inhibiteurs répartis sur leur site de production au site d'intégration, où les potentiels d'action (PA) sont évoqués en tant que signal de sortie. Sur leur chemin, les potentiels synaptiques sont influencées à la fois par la structure de dendrites et l'interaction entre les propriétés des membranes passives et actives. La combinaison de ces paramètres très variables élargit la puissance de calcul des neurones 1,2. Cependant, le faible diamètre des dendrites entrave mais l'étude de leurs propriétés électriques. Le développement continu de la technique patch-clamp 3, l'optique 4 et le perfectionnement des méthodes de préparation de tranches 5 au cours des dernières décennies ont permis à des enregistrements de très mince (0,7 à 3 pm Ø) dendrites 6,7. Ces méthodes ont été, et sont encore largement utilisés pour examiner l'excitabilité des dendrites dans une variété oneurones f 8. Enregistrements dendritiques directs sont essentiels pour déterminer la distribution 9-19 et les différences dans les propriétés fonctionnelles 20-22 des canaux ioniques dans des compartiments neuronaux distincts. Ces données sont le complément nécessaire des distributions de canaux ioniques détectés par immunohistochimie combinée à la lumière et microscopie électronique 23,24. Enregistrements doubles somatodendritiques ont été mis en œuvre pour explorer la propagation des potentiels d'action 9,13-15,21,22,25-27 et la propagation des potentiels synaptiques 13,16,18 le long du domaine somato de neurones, obtenir des modèles passifs détaillés de câble 28- 30 et enquêter sur la résolution temporelle de l' intégration neuronale 31.
Le substantia nigra (SN) est une région située dans le mésencéphale impliqué dans plusieurs fonctions telles que le contrôle du mouvement, le codage de la récompense et les comportements habituels. La diminution de la dopamine en raison de la spécifiquela perte de dopaminergiques (DA) dans les neurones du SN est associée à des troubles moteurs observés chez les patients atteints de la maladie de Parkinson 32. Le circuit nigrale se compose de deux principaux types de cellules: les neurones dopaminergiques et GABAergiques. Fait intéressant, ces neurones présentent plusieurs caractéristiques qui les distinguent des autres neurones. L'axone d'une proportion importante de neurones dopaminergiques et certains neurones GABA provient d'un site dendritique indiquant que l'arbre dendritique est hétérogène (axones et dendrites portant axonales dépourvue) 25,26,33. La morphologie de ces neurones contraste donc avec l'organisation typique des neurones dans lesquels le transfert d'information suit la loi de polarisation dynamique émise par Cajal: à partir de dendrites, de soma et enfin à AXON 34. Les neurones dopaminergiques sont également connus pour libérer de la dopamine à partir de leurs dendrites 35, génèrent une activité d'éclatement 36 et 37 plasticité du récepteur NMDA. La dissectiontion de ces phénomènes est insaisissable sans enregistrements directs à partir du site où ils sont initiés. Afin de mieux comprendre la relation entre l'emplacement précis et les propriétés fonctionnelles des canaux ioniques et leur rôle dans le transfert de l'excitabilité et de l'information dendritique dans les neurones de la substance noire, les enregistrements dendritiques directs sont la méthode de choix.
Ce rapport décrit une procédure détaillée qui peut être utilisé pour obtenir des enregistrements de patch-clamp simple et double de dendrites des neurones de la substance noire et le biocytin étiquetage correspondant post hoc. Les principes de base pour patcher le somatique et la membrane dendritique sont très similaires. Pratiquement cependant, les enregistrements à partir de sites dendritiques nécessitent une optimisation spécifique par rapport aux enregistrements somatiques. enregistrements dendritiques succès reposent sur la qualité des tranches, l'ajustement optimal de l'optique, l'approche douce de la pipette de patch et de la stabilité des enregistrements.
Ce rapport décrit un protocole étape par étape pour mettre en œuvre deux enregistrements de cellules entières somatodendritiques et enregistrements dendritiques locaux. Il est utile pour déterminer l'influence des canaux ioniques ( par exemple, I h) sur le décours temporel des potentiels post – synaptiques et la cartographie de la répartition du canal ionique (I h) le long du domaine somato des neurones dopaminergiques de la substance noire, respectivement. Résultant des mesures électrophysiologiques sont combinés pour poster histochimie hoc pour récupérer la morphologie des cellules. La procédure a été utilisée pour étudier les neurones dopaminergiques situés dans la substantia nigra, mais peut être généralisé pour les neurones voisins nigrales GABA, aire tegmentale ventrale neurones DA ou d'autres neurones du mésencéphale. Toutes les étapes peuvent également être suivies pour examiner d' autres canaux ioniques exprimés dans les dendrites des neurones de la substance noire , sans modifications importantes. Visualisation post hoc est particulièrement pertinente pour les neurones avec axone portantdendrites, tels que les neurones de la substance noire 25,26, hippocampiques interneurones oriens-alveus 21 ou certains neurones pyramidaux CA1 67. Fait intéressant, les neurones partageant cette caractéristique semble être plus fréquente qu'on ne le pensait généralement 67. L'analyse morphologique révèle aussi la position précise des électrodes et axone. La détection de ce dernier peut être optimisée par le marquage des protéines exprimées dans le segment initial de l' axone (canaux voltage-gated Na + ou ankyrine G) en utilisant l' immunohistochimie 68,69.
La fiabilité des données recueillies avec des enregistrements dendritiques et l'étiquetage neuronale ultérieure dépend toujours de la qualité de coupe. par conséquent, l'effort maximum a besoin d'être appliqué à préserver la viabilité des cellules dans le tissu. Ceci est réalisé avec une manipulation douce des animaux sains, des outils et des réactifs de haute qualité, une oxygénation suffisante des températures de tissus et de glace-froid tout au long de la préparation de tranches. des conditions d'enregistrement stables reposent sur la sélection des neurones sains. Dans le mode de cellule entière, la résistance série doit initialement être aussi faible que possible et maintenue constante pendant toute l'expérience. La stabilité des enregistrements dépend en outre des manipulateurs de haute qualité dépourvus de dérive et les vibrations. Ces perturbations peuvent être réduites par l'optimisation de la stabilité de la pipette: vérifier la connexion au porte-pipette et headstage, en contrôlant que les câbles sont micromanipulateur mou, évitant ainsi des changements soudains de température ou de mouvement de la scène et le contrôle du mécanisme du manipulateur. Pour deux enregistrements, méthylsulfate 13,15,21 a été inclus dans la solution intracellulaire, mais gluconate 9,14,25 peut aussi être employé. Cependant, l'anion principal peut modifier le potentiel de membrane et 70,71 des courants dépendant de la tension 72. Solution intracellulaire peut être complétée avec de l'ATP, GTP et de préserver la phosphocréatine physiologiques fonctions des neurones. En outre, l' ajout d' un colorant fluorescent dans la solution de pipette (par exemple, Alexa 594 , ou sulforhodamine 101 41) pour visualiser les dendrites lors d' un enregistrement somatique peut être utile , par exemple , de placer une application de pression (figure 7 dans la réf. 41) ou une stimulation électrique pipette. La solution de la pipette pour l' enregistrement cellule attachée contient une concentration élevée en K + et sans Na + pour enregistrer un grand I h. Il convient de noter le rapport Na + / K + de concentration influe sur l'amplitude de courant 10, le potentiel d'inversion du courant 11 et de l'ouverture de porte de 73 I h. Alternativement, I h peuvent également être enregistrées à l' aide à l' extérieur-outs 10. Dans cette configuration d'enregistrement cependant, le milieu intracellulaire dans la proximité des canaux peut être perturbée. Par conséquent, les différences de l'activation dépendant de la tension de I <sub> h est observée lorsque les courants de comparaison obtenus en utilisant des correctifs attachés aux cellules et à l' extérieur-outs 10. Gonflement des neurones est parfois rencontré pendant l' enregistrement patch-clamp, et résulte souvent de causes distinctes telles que la faible qualité de l'eau, fort déséquilibre de l'osmolarité ou le pH entre les solutions 39 ou des erreurs intra- et extracellulaire dans la composition des solutions. La qualité des enregistrements électrophysiologiques a une incidence directe sur la qualité de la morphologie des neurones récupérés. Pipette à haute résistance somatiques sont utilisés pour les enregistrements doubles (6 – 10 MQ, comme dans les références 6,11.) Et pour les enregistrements somatiques isolés après des enregistrements attachés aux cellules afin de minimiser la dilution du milieu intracellulaire 14. L'enregistrement somatique de cellules entières après l'enregistrement cellule attachée est donc maintenu court (<10 min). Outside-out patches à la fois du somatiques et dendritiques pipettes sont essentiels pour la bonne fermeture de la cell membrane et la récupération subséquente de la morphologie cellulaire. En plus de la structure de la cellule, le contenu neurochimique peut être déterminé pour les neurones enregistrés 59,74. Par exemple, la protéine tyrosine hydroxylase intracellulaire peut être immunomarquées pour l' identification univoque des neurones dopaminergiques 13.
Neurones dopaminergiques sont principalement concentrés dans le SN pars compacta, avec une densité beaucoup plus faible présente dans le SN pars reticulata, où ils sont mélangés avec un plus grand nombre de neurones GABA 75. Tandis que le corps cellulaire des neurones dopaminergiques est souvent supérieure à celle des neurones GABA, l'identification visuelle de ces cellules avec l'IR-vidéomicroscopie est incertain et partiellement entravé par l'opacité des pars compacta. Afin de contourner ces limitations, la pré-sélection des neurones dopaminergiques peut être facilitée par l'utilisation de souris transgéniques exprimant un marqueur fluorescent dans une population spécifique de neurones (TH 65 ou DAT pour les neurones dopaminergiques, GADpour les neurones GABA) et l'éclairage du épifluorescence. En variante, un colorant fluorescent peut être inclus dans la solution de l'électrode somatique pour faciliter la visualisation des dendrites. Augmentation de la résolution de la cellule fluorescente est amené par Nipkow disque rotatif confocal 14,22,30 ou microscopie à deux photons 7 combinée à l' IR-DGC 6. Plusieurs avantages sont liés à DGC par rapport à une CIVD. Tout d' abord, sous forme de prismes DIC ne sont pas nécessaires, l'image IR-DGC peut être recouverte d'une 49,52,53,76 d'image de fluorescence. Deuxièmement, DGC peut être combiné avec photostimulation et optogénétique 77.
Un inconvénient de la préparation de tranche est la préservation de l'intégrité des neurones. DA neurones étendent leurs dendrites dans les trois plans de l' espace 78,79 et donc troncature du compartiment dendritique ne peuvent pas être complètement évités en tranches 80. Le choix de l'orientation des tranches (coronale, horizontal ou parasagittal) est un compromis. L'origine de l'innervation et la conception expérimentale doit être considérée pour sélectionner la bonne orientation des tranches.
rapiéçage dendritique directe est la technique utilisée pour cartographier la répartition des canaux ioniques fonctionnels dans les différents compartiments de cellules. En outre, cette technique permet de déterminer la variabilité des propriétés fonctionnelles des canaux 20. En complément de l'emplacement et de la densité des canaux ioniques peuvent être déterminés par immunohistochimie à la lumière et microscopie électronique à des niveaux 17,23. Cette approche offre également la possibilité de déterminer la densité de canal dans les petites structures de calibre qui sont inaccessibles aux pipettes de patch. Cependant , ces canaux peuvent être dans un état fonctionnel distinct 24 ou même inactifs par rapport à ceux enregistrés en utilisant des techniques de patch-clamp. Les deux techniques sont donc nécessaires pour obtenir une image complète de l'emplacement et les propriétés decanaux ioniques dans une région cellulaire spécifique 17. Avec le développement des colorants sensibles à la tension, l' imagerie de tension a été utilisée pour examiner la propagation des PA et des EPSP dans les neurones à plusieurs endroits 81. Comme une alternative à deux enregistrements de patch-clamp, cette approche peut même être mis en œuvre pour dendrites minces qui ne sont pas accessibles aux pipettes de patch, mais nécessitent un étalonnage précis du signal et la moyenne.
Alors que les neurones dopaminergiques dans le SN et l'aire tegmentale ventrale sont largement étudiés par l'intermédiaire des enregistrements somatiques dans le contexte physiologique et physiopathologique, les propriétés fonctionnelles de leurs dendrites reste largement inconnue dans les deux conditions. Patcher de dendrites a été mis en place pour les neurones dopaminergiques de la substance noire par plusieurs groupes avec succès 13,25,26 et reste la méthode de choix pour disséquer les propriétés excitables de ces structures subcellulaires fines 8. les enregistrements fournissent une nouvelle dendritique Opportunité de scruter l'efficacité et la plasticité de la transmission synaptique et la plasticité de l' excitabilité dendritique 82,83.
The authors have nothing to disclose.
Je remercie le Dr Vincent Seutin pour son soutien constant, Christelle Gillissen et Laurent Massotte pour une excellente assistance technique, les Drs Jean Defourny et Sandra Ormenese pour des conseils avec le microscope confocal, le Dr Jacques Destiné pour le don du second amplificateur Axopatch 200B, le GIGA-Imagerie plate-forme pour le partage du microscope confocal et le logiciel Imaris et le Dr Stephen Freeman pour la lecture critique du manuscrit. Ce travail a été soutenu par des subventions du FRS – FNRS belges (U.N002.13 et T.N0015.13) et publié avec le soutien de la Fondation Universitaire de Belgique (Publié with the concours de la Fondation Universitaire de Belgique).
Double-distillated water | Millipore | Super Q | Resistivity >14 MΩ cm, ideal 18.2 MΩ cm at 25°C, filtered (0.22 µm), https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Super-Q-Plus-Water-Purification-System,MM_NF-C1760 |
Microfilter candles | Robu | Porosity 3, 6 mm or 13 mm diameter | |
Tissue slicer with vibroprobe | Leica | VT1200 | cutting parameters: speed 0.07, amplitude 1.40 |
Tissue slicer | Dosaka | DTK-1000 | cutting parameters: speed 4, frequency 7 |
Razor blades | Gilette | Super Silver | |
Dissection tools | Braun, Aesculap | ||
Reserve chamber | Custom-made | ||
PP beckers | VWR | 213-1725 | 400 ml |
Syringe filter | Merk Millipore | Millex – GV 0,22 µm | |
Cyanoacrylate glue | UHU | "Sekunden Kleber" | liquid glue |
Recording chamber | Luigs & Neumann | Slice mini chamber | |
Horizontal pipette puller | Sutter Instruments | Brown-Flaming P-97 | |
Pipettes | Hilgenberg | 1807524 | 2 mm o.d./1 mm i.d. glass capilaries, ends firepolished, washed |
Dental wax | Coltène/Whaledent | orthodontic tray wax strips | |
Platinum grid | to anchor slices in the recording chamber, custom made with a platinum disk | ||
Microforge | Narishige | MF-830 | to fire-polish pipette tips |
Potassium methyl sulfate | MP Biomedicals | 215481 | |
Biocytin | Molecular probes | B1592 | |
Manometer | GREISINGER electronic | GDH 13 AN | |
Microscope | Zeiss | FS | |
Dodt Gradient Contrast | Luigs & Neumann | ||
Manipulators | Luigs & Neumann | LN Mini 25 | |
Frame grabber | The Imaging Source | DFG/USB2pro | |
Camera | DAGE-MTI | NC-70 | |
Condenser | Zeiss | high numerical aperture condenser working with oil | |
Objective | Zeiss | W Plan Apochromat 441470-9900 VIS-IR | 63x magnification, long-distance, high numerical aperture 1.0 water-immersion objective |
Fourfold-changer | Luigs & Neumann | between the camera and the microscope | |
Black & white video monitor | Sony | SSM-175CE | 16-inch, 850 TV lines, analog |
Sample Bottles, Amber Glass, with Cap | VWR | 215-2409 | to transfer slices from the setup to histology room |
The Axon Guide | Molecular Devices | Book | |
Stimfit | https://github.com/neurodroid/stimfit | Analysis of electrophysiological data | |
Paraformaldehyde | Sigma | 441244 | see SAFETY DATA SHEET and Dangerous Substances Directive (EU) before use |
Well cell culture plate | Greiner-Bio-One | 662160 | for the staining of fixed slices |
Triton X-100 | Merk | 108643 | see SAFETY DATA SHEET and Dangerous Substances Directive (EU) before use |
mouse anti-TH monoclonal primary | Immunostar | 22941 | working concentration: 1/1000 |
goat anti-mouse secondary antibody – Alexa Fluor 568 | Invitrogen – Thermo Fisher Scientific | A-11031 | working concentration: 1/500 |
Normal goat serum | Dako | X0907 | |
ProLong Diamond Antifade | Molecular Probes – Thermo Fisher Scientific | P36961 | |
Fluorescein Avidin DCS | Vector Lab | A-2011 | |
Confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
ImageJ | http://imagej.nih.gov/ij/ | ||
NeuronJ | http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/ | plugin for ImageJ | |
Imaris | http://www.bitplane.com | Reconstruction of biocytin filled neurons | |
Neuromantic | http://www.reading.ac.uk/neuromantic/ | Reconstruction of biocytin filled neurons | |
WinWCP | http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm | Analysis of electrophysiological data |