Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.
도파민 뉴런의 수상 돌기 수신 및 시냅스 입력, 지원 활동 전위 역 전파 및 신경 전달 물질 방출을 전달. 이러한 기본적인 기능을 이해하는 것은 이러한 신경 세포의 정보 전달을 밝혀됩니다. 수지상 패치 클램프 기록을 직접 돌기 및 기저 전압 관문 이온 채널의 전기적 특성을 검사 할 수있는 가능성을 제공한다. 그러나 이러한 미세 구조 때문에 작은 직경의 패치 피펫에 쉽게 액세스 할 수 없습니다. 이 보고서는 급성 조각에서 도파민 뉴런의 수상 돌기에서 안정적인 기록을 수집하는 단계별 절차를 설명합니다. 전기 생리 측정은 세포 형태의 사후 복구와 결합된다. 성공적인 실험은 조각, 솔루션과 피펫, 기록 된 구조와 접촉하는 광학 및 피펫의 안정성의 적절한 조정의 개선 준비에 의존하고 있습니다. 솜의 기본 원칙ATIC 패치 클램프 녹음 수상 돌기에 있지만 피펫의 완만 한 접근 방식으로 적용됩니다. 이러한 다양한 기술은 수상 돌기의 흥분 특성에 관한 다양한 질문을 해결하기 위해 구현 될 수있다.
신경 세포는 수상 돌기에 주로 시냅스 정보를받을 수 있습니다. 흥분성 및 활동 전위 (APS)를 출력 신호로 유발되는 통합 사이트로 세대의 사이트에서 확산 억제 시냅스 신호. 길에서 시냅스 전위는 수상 돌기의 구조와 수동 및 능동 막 특성 사이의 상호 작용 모두에 의해 영향을 받는다. 이러한 고도의 가변 파라미터의 조합은 1,2- 뉴런의 계산 능력을 넓힌다. 그러나, 수상 돌기의 직경이 작은 그러나 자신의 전기적 특성의 연구를 방해한다. 6, 7을 수상 돌기 – (3 μm의의 Ø 0.7) 패치 클램프 기술 (3)의 지속적인 개발은 지난 수십 년 동안 광학 4 조각 준비 5 방법의 정제는 매우 얇은에서 녹음을 사용할 수있다. 이러한 방법은 있었고, 여전히 대부분 다양한 O를 수상 돌기의 흥분을 검사하는 데 사용됩니다F 뉴런 (8). 직접 수상 기록은 기능적 특성 별개의 신경 세포 구획에서 이온 채널의 20 ~ 22의 분포 9-19과 차이점을 확인하는 것이 필수적이다. 이러한 데이터는 광학 및 전자 현미경 (23, 24)에 결합하여 면역 조직 화학 검출 이온 채널 분포의 필요한 보완. 듀얼 somatodendritic 녹음 상세한 패시브 케이블 모델, 활동 전위 9,13-15,21,22,25-27 뉴런의 somatodendritic 도메인 따라 시냅스 전위 13,16,18 확산의 전파를 탐색 수득 구현 된 28- (30)는 신경 세포 통합 (31)의 시간 분해능을 조사.
흑색질 (SN)는 이러한 이동의 제어, 보상 및 습관성 행동 부호화 여러 기능에 관여 중뇌에있는 영역이다. 특정에 의한 도파민의 감소SN에서 도파민 (DA) 신경 세포의 손실은 파킨슨 병 (32)을 앓고있는 환자에서 관찰 된 운동 장애와 관련된다. 도파민과 GABA 성 신경 세포 다음 흑색질 회로는 두 가지 종류의 세포로 구성되어있다. 흥미롭게도,이 신경 세포는 다른 신경 세포와 구별 몇 가지 특정 기능을 가지고 있습니다. DA 뉴런 및 일부 GABA 신경 세포의 큰 비율의 축삭은 돌기의 아버는 이종 (축삭 베어링 및 축삭-부족 수상 돌기) 25,26,33가 있음을 나타내는 수지상 사이트에서 유래. 소마로, 수상 돌기에서 시작하여 최종적으로 34 축삭하는 이러한 신경 세포의 형태는 정보 전달 동적 Cajal에 의해 방출 편광의 법을 따라하는 신경 세포의 전형적인 조직에 따라서 대조. DA 뉴런은 그 돌기 (35)로부터 도파민을 방출 붕괴 활성 36 NMDA 수용체 가소성 (37)를 생성하는 것으로 알려져있다. dissec이러한 현상의 기 그들이 시작하는 사이트에서 직접 녹음하지 않고 애매하다. 정확한 위치 및 이온 채널의 기능적 특성과 흑색질 신경 세포의 수지상 흥분과 정보 전달의 역할 사이의 관계에 대한 통찰력을 얻기 위해, 직접 수상 기록은 선택의 방법입니다.
이 보고서는 흑색질 신경 세포의 수상 돌기 및 대응하는 사후 biocytin 레이블에서 싱글 및 듀얼 패치 클램프 녹음을 얻을 수 있습니다 상세한 절차를 설명합니다. 체세포와 수지상 막 패치에 대한 기본 원칙은 매우 유사하다. 실질적으로하지만, 수지상 사이트에서 녹음 체세포 녹음에 비해 특정 최적화가 필요합니다. 성공적인 수상 기록은 슬라이스, 광학의 최적의 조절, 녹음의 패치 피펫과 안정성의 부드러운 접근 방식의 품질에 의존한다.
이 보고서는 듀얼 somatodendritic 전체 셀 녹음 및 지방 수상 기록을 구현하기위한 단계별 프로토콜을 설명합니다. 그것은 각각 시냅스 후 전위의 시간 경과에 이온 채널 (즉, I 높이)의 영향을 결정하고 흑색질 DA 뉴런의 somatodendritic 도메인 따라 이온 채널 (I 높이)의 분포를 매핑하는데 유용하다. 그 결과 전기 생리 측정은 세포 형태를 복구하기 위해 특별 조직 화학을 게시 결합된다. 절차는 흑색질에있는 DA 신경을 조사하기 위해 사용되었지만, 인접 흑색질 GABA 뉴런, 복측 피개 영역 DA 신경이나 중뇌 신경 대해 일반화 될 수있다. 모든 단계가 중요 수정없이 흑색질 신경 세포의 수상 돌기에 표현 된 다른 이온 채널을 검사 따라 할 수있다. 사후 시각화 축삭 베어링과 신경 세포에 특히 관련입니다이러한 흑색질 신경 세포 25, 26, 해마 oriens-alveus의의 interneurons 21 일부 CA1 피라미드 뉴런 (67) 등의 수상 돌기. 흥미롭게도,이 기능을 공유하는 신경 세포는 일반적으로 67 생각했던 것보다 더 일반적인 것 같다. 형태 학적 분석은 또한 전극과 축삭의 정확한 위치를 알 수있다. 후자의 면역 검출 68,69을 이용 축삭 초기 세그먼트 (전압 – 게이트 나 + 채널 또는 Ankyrin G)에서 발현 된 단백질의 라벨에 의해 최적화 될 수있다.
수지상 녹음 이후의 연결 라벨과 수집 된 데이터의 신뢰성은 변함없이 조각의 품질에 따라 달라집니다. 최대 노력이 필요하므로 조직 내 세포의 생존을 유지하기 위해 적용된다. 이는 슬라이스의 제조 건강한 동물 걸쳐 고품질 도구 및 시약 조직 빙냉 온도 충분한 산소 부드러운 핸들링 달성. 안정된 기록 조건 건강한 신경 세포의 선택에 의존한다. 전체 세포 모드에서, 직렬 저항은 처음에는 가능한 한 낮게하고, 실험 전반에 걸쳐 일정하게 유지한다. 녹음의 안정성은 드리프트과 진동없는 높은 품질의 조종에 더 의존한다. 피펫 홀더와의 연결을 확인하고 headstage하는 미세 조작기 케이블 슬랙 것을 제어하는 온도 스테이지 이동의 급격한 변화를 방지하여 머니퓰레이터의기구에 의하면 이러한 교란은 피펫 안정성을 최적화함으로써 감소 될 수있다. 이중 기록 들어 메틸 설페이트 13,15,21는 세포 내 용액에 포함되었지만, 글루코 9,14,25 대안으로 사용될 수있다. 그러나, 주요 음이온 (70, 71) 전위 막의 일부 전압 의존 전류 (72)를 변경할 수있다. 세포 내 용액은 ATP, GTP와 physiolo을 유지하기 크레아틴 인산 보충 할 수있다신경 학적 기능을합니다. 인스턴스가 압력 응용 프로그램을 배치 할뿐만 아니라, 피펫 용액에 형광 염료를 추가 (예를 들어, 알렉사 594 또는 Sulforhodamine 101 41)가 도움이 될 수있는 체세포 기록하는 동안 수상 돌기를 시각화 (참조 그림 7. 41) 또는 전기 자극을 피펫. 세포 부착 녹음 용 피펫 솔루션은 대형 I의 시간을 기록하는 높은 K + 농도와 더 나 +가 포함되어 있습니다. 주목할 나 + / K + 농도 비는 전류 진폭 (10), 전류 (11)의 반전 전위 I의 H (73)의 게이트에 영향을 미친다. 또한, 나는 시간은 외부 아웃 (10)를 사용하여 기록 할 수 있습니다. 그러나이 기록 구성에서, 채널에 근접하여 세포 내 환경을 교란 할 수있다. 따라서, I의 전압 – 의존적 활성화의 차이 <비교 전류가 세포 부착 된 패치 및 외부 아웃 (10)를 사용하여 얻은 경우 서브> 시간이 관찰된다. 뉴런의 붓기는 때때로 패치 클램프 녹음 중에 발생하고, 종종 솔루션의 구성에 솔루션을 39 또는 오류 인트라와 세포 사이의 물 품질이 낮은 강한 불균형 삼투압이나 pH를 같이 별개의 원인으로 발생한다. 전기 생리 레코딩의 품질 회수 뉴런의 형태의 품질에 대한 직접 입사있다. 세포 내 환경 (14)의 희석을 최소화하기 위해 세포 부착 녹음 후 – (참고 문헌에서 6,11로, 10 MΩ. 6) 및 하나의 체세포 녹음에 대한 높은 저항 체세포 피펫 듀얼 레코딩에 사용됩니다. 셀에 연결된 기록 다음 전체 세포 체세포 기록 따라서 짧은 (<10 분)로 유지된다. 체세포와 수지상 모두 피펫에서 외부 아웃 패치는 C의 적절한 폐쇄에 필수적이다엘 멤브레인 및 세포 형태의 이후의 복구. 세포의 구조뿐만 아니라, 신경 화학적 콘텐츠 기록 뉴런 59,74 대해 결정될 수있다. 예를 들어, 세포 내 단백질 티로신 수산화 효소는 DA 신경 (13)의 명확한 식별 immunolabeled 수있다.
DA 신경 주로 SN에 집중되어 것은 SN 존재 훨씬 낮은 밀도, compacta을 갈 거예요 그들이 GABA 뉴런 (75)의 높은 수와 혼합되어 reticulata을 갈 거예요. DA 신경 세포의 세포체는 GABA 뉴런보다 종종 더 큰 반면, IR-videomicroscopy 이러한 세포의 시각적 식별 불확실 부분적 유리체의 compacta의 불투명도에 의해 방해된다. 이러한 제한을 피하기 위해, DA 신경의 예비 선택은 뉴런 (DA 신경 대한 TH 65 DAT, GAD 특정 인구 형광 마커를 발현하는 형질 전환 마우스를 이용하여 용이하게 할 수있다GABA 신경 세포) 및 표면 형광 조명. 대안 적으로, 형광 염료가 덴 드라이트의 시각화를 용이하게하기 위해 체세포 전극 용액에 포함될 수있다. 형광 세포의 증가 된 해상도는 Nipkow 회전 디스크 공 촛점 14,22,30 또는 IR-DGC (6)에 결합 된 두 광자 현미경 (7)에 의해하게된다. 여러 장점 DIC 비교 DGC 관련이있다. DIC 프리즘이 필요하지 첫째, 상기 IR-DGC 화상은 형광 이미지 49,52,53,76와 중첩 될 수있다. 둘째, DGC는 photostimulation와 77 optogenetics 결합 할 수 있습니다.
슬라이스 제제의 단점은 신경 세포의 무결성을 보존한다. DA 신경 세 평면 공간 78,79 그들의 수지상 연장 따라서 수지상 실의 절단이 완전히 조각 (80)을 회피 할 수 없다. 슬라이스 방향의 선택 (관상 수평 파라) 시상 트레이드 오프입니다. 신경 분포 및 실험 설계의 기원은 슬라이스의 오른쪽 방향을 선택하기 위해 고려되어야한다.
직접 수지상 세포의 패치는 다른 구획 기능성 이온 채널의 분포를 매핑하는 데 사용되는 기술이다. 또한,이 기술은 채널 (20)의 기능성의 변화를 결정하도록 제공한다. 보완 이온 채널의 위치와 밀도는 광 및 전자 현미경 수준에서 면역 17,23을 이용하여 확인 될 수있다. 이 접근법은 또한 패치 피펫에 액세스 할 수없는 작은 구경 구조에서 채널 밀도를 결정할 수있는 가능성을 제공한다. 그러나 이들 채널은 패치 클램프 기술을 이용하여 기록 된 것과 비교하여 고유 한 기능 상태 (24) 또는 비활성화 될 수있다. 두 기술은 위치 및 속성의 전체 사진을 얻을하는 것이 필요하다특정 세포 영역 (17)의 이온 채널. 전압 감응 염료의 발전 전압 촬상 여러 위치 81에서 AP와 뉴런 EPSPS의 전파를 조사하는 데 사용되어왔다. 듀얼 패치 클램프 기록에 대한 대안으로서,이 방법은 심지어 패치 피펫에 액세스하지 않지만, 신호 평균화의 정확한 보정을 필요 얇은 돌기에 구현 될 수있다.
SN 및 복부 피개 영역에서 DA 뉴런 널리 생리 및 병리 생리 학적 맥락에서 체세포 녹음을 통해 조사하는 동안, 자신의 수상 돌기의 기능적 특성은 두 조건에 크게 알려지지 않은 남아있다. 수상 돌기에서 패치 성공 13,25,26으로 여러 그룹에 의해 흑색질 도파민 신경 세포에 대한 구현이 미세 세포 내 구조 8 고르기 속성을 해부하는 선택의 방법을 유지하고있다. 수지상 기록은 더 opportu을 제공NITY는 효율성과 시냅스 전달의 소성 및 수지상 흥분 82,83의 가소성을 자세히 조사합니다.
The authors have nothing to disclose.
나는 공 초점 현미경, 두 번째 Axopatch 200B 앰프의 선물 박사 자크 정해지다은 GIGA-영상과 조언에 대한 그의 지속적인 지원을위한 박사 빈센트 Seutin, 크리스 Gillissen과 우수한 기술 지원 로랑 Massotte, 박사 진 Defourny와 산드라 Ormenese 감사합니다 비판적 원고를 읽기 위해 공 초점 현미경 및 Imaris 소프트웨어 및 박사 스티븐 프리먼 공유를위한 플랫폼입니다. 이 작품은 벨기에 FRS에서 보조금에 의해 지원되었다 – FNRS (U.N002.13 및 T.N0015.13)와 벨기에 대학 재단의 지원 (Publié AVEC 르 콩쿠르 드 라 파운데이션 부문 Universitaire 드 벨기에 (프랑스어))를 발표했다.
Double-distillated water | Millipore | Super Q | Resistivity >14 MΩ cm, ideal 18.2 MΩ cm at 25°C, filtered (0.22 µm), https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Super-Q-Plus-Water-Purification-System,MM_NF-C1760 |
Microfilter candles | Robu | Porosity 3, 6 mm or 13 mm diameter | |
Tissue slicer with vibroprobe | Leica | VT1200 | cutting parameters: speed 0.07, amplitude 1.40 |
Tissue slicer | Dosaka | DTK-1000 | cutting parameters: speed 4, frequency 7 |
Razor blades | Gilette | Super Silver | |
Dissection tools | Braun, Aesculap | ||
Reserve chamber | Custom-made | ||
PP beckers | VWR | 213-1725 | 400 ml |
Syringe filter | Merk Millipore | Millex – GV 0,22 µm | |
Cyanoacrylate glue | UHU | "Sekunden Kleber" | liquid glue |
Recording chamber | Luigs & Neumann | Slice mini chamber | |
Horizontal pipette puller | Sutter Instruments | Brown-Flaming P-97 | |
Pipettes | Hilgenberg | 1807524 | 2 mm o.d./1 mm i.d. glass capilaries, ends firepolished, washed |
Dental wax | Coltène/Whaledent | orthodontic tray wax strips | |
Platinum grid | to anchor slices in the recording chamber, custom made with a platinum disk | ||
Microforge | Narishige | MF-830 | to fire-polish pipette tips |
Potassium methyl sulfate | MP Biomedicals | 215481 | |
Biocytin | Molecular probes | B1592 | |
Manometer | GREISINGER electronic | GDH 13 AN | |
Microscope | Zeiss | FS | |
Dodt Gradient Contrast | Luigs & Neumann | ||
Manipulators | Luigs & Neumann | LN Mini 25 | |
Frame grabber | The Imaging Source | DFG/USB2pro | |
Camera | DAGE-MTI | NC-70 | |
Condenser | Zeiss | high numerical aperture condenser working with oil | |
Objective | Zeiss | W Plan Apochromat 441470-9900 VIS-IR | 63x magnification, long-distance, high numerical aperture 1.0 water-immersion objective |
Fourfold-changer | Luigs & Neumann | between the camera and the microscope | |
Black & white video monitor | Sony | SSM-175CE | 16-inch, 850 TV lines, analog |
Sample Bottles, Amber Glass, with Cap | VWR | 215-2409 | to transfer slices from the setup to histology room |
The Axon Guide | Molecular Devices | Book | |
Stimfit | https://github.com/neurodroid/stimfit | Analysis of electrophysiological data | |
Paraformaldehyde | Sigma | 441244 | see SAFETY DATA SHEET and Dangerous Substances Directive (EU) before use |
Well cell culture plate | Greiner-Bio-One | 662160 | for the staining of fixed slices |
Triton X-100 | Merk | 108643 | see SAFETY DATA SHEET and Dangerous Substances Directive (EU) before use |
mouse anti-TH monoclonal primary | Immunostar | 22941 | working concentration: 1/1000 |
goat anti-mouse secondary antibody – Alexa Fluor 568 | Invitrogen – Thermo Fisher Scientific | A-11031 | working concentration: 1/500 |
Normal goat serum | Dako | X0907 | |
ProLong Diamond Antifade | Molecular Probes – Thermo Fisher Scientific | P36961 | |
Fluorescein Avidin DCS | Vector Lab | A-2011 | |
Confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
ImageJ | http://imagej.nih.gov/ij/ | ||
NeuronJ | http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/ | plugin for ImageJ | |
Imaris | http://www.bitplane.com | Reconstruction of biocytin filled neurons | |
Neuromantic | http://www.reading.ac.uk/neuromantic/ | Reconstruction of biocytin filled neurons | |
WinWCP | http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm | Analysis of electrophysiological data |