Abstract
העברת אנרגית תהודת Fӧrster (סריג) מבוססת מחקרים הפכו נפוצים יותר ויותר בחקירת איתות GPCR. קבוצת המחקר שלנו יצרה חיישן סריג תוך מולקולרי כדי לזהות את האינטראקציה בין Gα יחידות משנה ו GPCRs בתאים חיים בעקבות גירוי אגוניסט. כאן, אנו בפירוט את הפרוטוקול לאיתור שינויים סריג בין קולטן β 2 -adrenergic ואת פפטיד C הסופית- Gαs על טיפול עם 100 מיקרומטר hydrochloride isoproterenol כפי שאפיינו 1. חיישן הסריג שלנו הוא פוליפפטיד יחיד המורכב סדרה של GPCR באורך מלא, fluorophore acceptor סריג (mCitrine), גידול ER / K עווית (אפנון כוח זיקת חלבון שיטתי) מקשר, fluorophore התורם סריג (mCerulean), וכן Gα C פפטיד -terminal. פרוטוקול זה התקנת פרט תא יהיה בהכנה, תנאי transfection, ציוד, ביצוע assay, וניתוח נתונים. עיצוב ניסיוני זה מזהה ch הקטןAnges ב הסריג מעיד על אינטראקציות בין חלבונים, והוא יכול לשמש גם כדי להשוות את עוצמת האינטראקציה ברחבי הליגנדים ואת זיווגי חלבון GPCR-G. כדי לשפר את האות לרעש במדידות שלנו, פרוטוקול זה דורש דיוק מוגבר בכל השלבים, והוא מוצג כאן כדי לאפשר ביצוע לשחזור.
Introduction
G המצומדים קולטנים (GPCRs) הם קולטנים שבע הטרנסממברני. גנום האדם לבדו מכיל כ 800 גנים המקודדים GPCRs, אשר מופעלים על ידי מגוון של הליגנדים כולל אור, ניחוחי, הורמונים, פפטידים, תרופות ומולקולות קטנות אחרות. קרוב ל -30% מכלל התרופות כיום על GPCRs היעד בשוק משום שהם ממלאים תפקיד גדול מצבי מחלה רב 2. למרות עשרות שנים של עבודה מטה מקיפה נעשתה על מש' קולטן זה, נותר שאלות מצטיינות משמעותיות בתחום, במיוחד לגבי המנגנונים המולקולריים לנהוג אינטראקציות מפעיל GPCR. נכון להיום, רק המבנה הגבישי ברזולוציה גבוהה אחד כבר פורסם, מתן תובנה אינטראקציה בין רצפטור β 2 -adrenergic (β 2 -AR) ואת חלבון G 3. יחד עם מחקר מקיף בשלושת העשורים האחרונים, זה חוזר על רכיב מבני ספציפי אחד כי הוא קריטי זהאינטראקציה: C- הסופי למקטע Gα. מבנה זה הוא חשוב עבור שתי הפעלת חלבון G על ידי מבחר חלבון GPCR 4 ו- G 5-6. לפיכך, הסופית- C Gα על זיקה מכרעת בין גירוי ליגנד של GPCR והפעלה G חלבון סלקטיבית.
מחקר בעשור האחרון מצביע על כך GPCRs לאכלס נוף קונפורמציה רחב, עם ייצוב תת-מחייב ליגנד של תצורות GPCR. בעוד מספר טכניקות, כוללים קריסטלוגרפיה, NMR ספקטרוסקופיה קרינה, ו ספקטרומטריית מסה זמינות לבחון את נוף קונפורמציה GPCR, יש מחסור של גישות להבהיר המשמעות התפקודית שלהם בבחירת מפעיל 7. הנה, הנה תיאור של העברת אנרגיה תהודה Fӧrster (סריג), גישה מבוססת על לזהות תצורות GPCR חלבון-סלקטיבית G. סריג מסתמך על הקרב וכיוון במקביל של שני fluorophores עם פליטת חופפים (תורם) אnd עירור (acceptor) ספקטרה 8. ככל fluorophores התורם acceptor להתקרב יחד כתוצאה משני של שינוי קונפורמציה בחלבון או אינטראקציה חלבון-חלבון, סריג ביניהם גדל, והוא יכול להימדד באמצעות מגוון של שיטות 8. חיישנים ביולוגיים מבוסס סריג להיות מועסקים בהרחבה בתחום GPCR 9. הם שמשו לחקר שינויים קונפורמציה של GPCR ידי החדרת תורם acceptor בלולאה התאית השלישית GPCR C- הסופית; חיישנים עוצבו כדי לחקור GPCR ואינטראקציות מפעיל ידי בנפרד תיוג GPCR ו מפעיל (יחידות משנה חלבון G / arrestins) עם זוג סריג 10; חיישנים מסוימים גם לזהות שינויי קונפורמציה חלבון G 11. חיישנים ביולוגיים אלה אפשרו בתחום לשאול המון שאלות מצטיינים כולל שינויים קונפורמציה GPCR ו מפעיל, קינטיקה אינטראקציה GPCR-מפעיל, ו ligands האלוסטריים 12. הקבוצה שלנוהתעניין במיוחד ביצירת biosensor שיכול לזהות תצורות GPCR חלבון ספציפי G בתנאים מונחה אגוניסט. Biosensor זה מסתמך על טכנולוגיה שפותחה לאחרונה בשם עווית (אפנון כוח זיקת חלבון שיטתי) 13. עווית כרוכה תחומי חלבון אינטראקצית קשירה באמצעות מקשר ER / K, שולטת הריכוזית היעילה שלהם. איגוף ומקשר עם זוג fluorophores סריג יוצר כלי שיכול ולדווח על המצב של יחסי הגומלין בין חלבוני 12. בעבר 1 מודול התכווצות שימש לקשור את C- הסופית Gα על GPCR ולפקח הגומלין שלהם עם fluorophores סריג, mCitrine (המכונה בפרוטוקול זה על ידי גרסה שלה הידוע בכינויו, חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP), עירור / פליטה לשיא 490/525 ננומטר) mCerulean (המכונה בפרוטוקול זה על ידי חלבון ציאן פלורסנט וריאנט שלו הידוע בכינויו (CFP), עירור / פליטה השיא 430/475 ננומטר). מאת N- כדי C- סופי, tפוליפפטיד היחיד שלו המקודד גנטי מכיל: באורך מלא GPCR, סריג acceptor (mCitrine / YFP), 10 ננומטר ER / מקשר K, תורם סריג (mCerulean / CFP), ואת פפטיד הסופית- C Gα. במחקר זה, חיישנים מקוצרים כמו פפטיד GPCR המקשר אורך-Gα. כל הרכיבים מופרדים על ידי מקשר בלתי מובנה (גלאי-שיר-גלאי) 4 המאפשר סיבוב חופשי של כל תחום. האפיון המפורט של חיישנים כאלה בוצע בעבר בעזרת שתי GPCRs אבטיפוס: β 2 -AR ו opsin 1.
חיישן זה הוא transfected זמני לתאי HEK-293T, ספקטרום קרינת מידת ניסויי תא חי מבוסס fluorometer של זוג הסריג ביחידות כלשהן של ספירה לשנייה (CPS) בנוכחות או בהעדר ליגנד. מדידות אלה משמשים לחישוב יחס סריג בין fluorophores (YFP מקסימום / מקס CFP). שינוי סריג (ΔFRET) לאחר מכן מחושב על ידי הפחתת יחס סריג הממוצעשל דגימות מטופל מייחס הסריג של דגימות מטופלים ליגנד. ΔFRET ניתן להשוות ברחבי בונה (β 2 -AR-10 ננומטר-Gαs פפטיד לעומת בטא 2 -AR-10 ננומטר-אף פפטיד). כאן, אנו בפירוט את הפרוטוקול להביע חיישנים אלה בתאי HEK-293T חיים, לפקח הביטוי שלהם, ואת ההתקנה, ביצוע, והניתוח של התא החי מבוסס fluorometer סריג מדידת מטופל מול תנאי מטופלים בתרופה. בעוד פרוטוקול זה הוא ספציפי עבור חיישן פפטיד β 2 -AR-10 ננומטר-Gαs שטופלו 100 מיקרומטר bitartrate isoproterenol, זה יכול להיות מותאם במיוחד בזוגות הליגנדים GPCR-Gα שונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. DNA כן
- חיישן עיצוב בונה באמצעות ערכת שיבוט מודולרי. נא להפנות את עיצוב חיישן β 2 -AR כמפורט לעיל 1.
- הכן את ה- DNA על פי פרוטוקול ערכת miniprep מסחריים elute ב 2 mM Tris-HCl פתרון, pH 8, ב ≥ ריכוז 750 ng / μl, 260/280 של 1.7 - 1.9, 260 / A 230 של 2.0 - 2.29.
2. תא הכנת תרבות
- תרבות תאים HEK-293T-FLP-n ב DMEM המכיל 4.5 גר '/ ל D- גלוקוז, בתוספת 10% FBS (חום מומת) (v / v), 1% תוספת L- גלוטמין, 20 HEPES מ"מ, pH 7.5 ב 37 ° C באווירה humidified ב 5% CO 2. לטפל בתאים במנדף בטיחות ביולוגית על הצעדים הבאים.
- אפשר לתאים לגדול כדי בשכבה ומחוברת לפני passaging לתוך מנות שש היטב. זמן להשיג confluency תלוי צפיפות ציפוי ראשונית. צלחות השתמשולבוא confluency בתוך 1 - 2 ימים של ציפוי עבור שש גם ציפוי. A 10 ס"מ רקמה ומחוברות תרבות שטופלו יש צלחת צפיפות התאים של כ 4 x 10 6 תאים / מ"ל. ראה איור 1 עבור תמונה של צמיחת תרבית תאים.
- שטפו תאים עם 10 מ"ל PBS, trypsinize עם טריפסין 0.25% (ראה דיון, פסקה 2). פלייט 8 x 10 5 תאים / גם ב 2 מ"ל של התקשורת ברקמות תרבות שטופלו שש מנות היטב ולאפשר לדבוק עבור 16 - 20 שעות.
3. תנאי Transfection
- להתנודד transfections עבור מבנים אשר יחייבו כמויות שונות של זמן כדי להשיג ביטוי אופטימלי (בין 20 - 36 שעות). סנכרון תנאים במשך זמן ניסוי אחיד. כמו כן יש פקד untransfected היטב צפיפות התאים שווה לשמש רעשי רקע וחיסור פיזור במהלך ניתוח.
- תביאו ריאגנטים transfection לטמפרטורת החדר: מדיה סרום מופחת, DNA, מגיב transfection.
- במכסה מנוע בטיחות ביולוגי לשלב חומרים כימיים בתוך שפופרת microcentrifuge סטרילי לפי הסדר הבא: לערבב DNA 2 מיקרוגרם עם 100 μl מדיה סרום מופחתים. ספייק 6 μl של מגיב transfection לתוך תמהיל המדיה / DNA בלי לגעת פני השטח של תערובת או בצד של הצינור. הגדרת תגובת transfection אחד לכל טוב. תנאי transfection יכולים להיות מותאמים (1 - 4 מיקרוגרם של ה- DNA, 3 - 6 μl של מגיב transfection) להשיג רמות ביטוי עקביות. ראה טבלת מס '1 עבור יחסים מותאמים יותר.
- דגירת תערובת על RT במנדף בטיחות ביולוגי במשך 15 - 30 דקות. אין להשתמש תגובה אם נותר כדי לדגור במשך יותר מ -30 דקות.
- הוספת תגובה לתאים באופן טיפה חכמה על פני היטב ובעדינות לנער שש היטב כדי להבטיח ערבוב יסודי. הוספת תגובה אחת לכל טוב.
- לאחר 20 שעות של ביטוי, קרינה לפקח באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בתרבית רקמה. להעריך ביטוי אוכלוסייה עם 10X לוקליזציה אובייקטיבית חלבון בתא ב 40X. observe לביטוי חלבון הממברנה (PM). אם הפנמה משמעותית יצוין, לפקח transfection עד ביטוי משמעותי מזוהה ב PM.
4. מגיב והכנת הציוד
- הכן 100 מניות התרופות מ"מ ולאחסן ב -80 ° C: bitartrate isoproterenol (100 מ"מ ב DH 2 O המכיל 300 חומצה אסקורבית מ"מ). הפוך על הקרח / בחדר קר, להקפיא פלאש מיד. Aliquots יכול להתבצע ומשומשים עד שנה.
- הכן תא הצפת (~ 2 מ"ל / מצב) ולאחסן באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. הפוך טרי כל יום. טבלת עזר 2 עבור מרכיבי הצפת תא.
- הכן הצפת והתרופות האמריקני (10 מ"ל) ולאחסן בטמפרטורת החדר. טבלת 2 קוד עבור מרכיבי הצפה ותרופות.
- חומצה לשטוף cuvettes באמצעות HCl מרוכזת. לנטרל עם בסיס חלש (1 M KOH), וביסודיות לשטוף cuvettes עם DH 2 O.
- הכן עבודה לתחנה בסביבות fluorometer עם כמהקופסאות של 10, 200, ו -1,000 טיפים פיפטה μl, טיימר להגדיר עם ספירה לאחור 10 דקות, קו ואקום נגיש עם טיפים לניקוי קובט, מגבונים משימה עדינה, ואת בקבוק להשפריץ עם ultrapure H 2 O.
- מחממים באמבט מים חיצוני עבור בלוק fluorometer וחום עד 37 ° C.
- הפעל fluorometer; להגדיר תוכנית איסוף הקרינה לאיסוף CFP כדי עירור 430 ננומטר, bandpass 8 ננומטר; פליטת טווח 450 ננומטר - 600 ננומטר, bandpass 4 ננומטר. לקבלת אוסף YFP רק כשליטה חיישן (ראה דיון) עירור סט ל -490 ננומטר, bandpass 8 ננומטר, טווח פליטה 500 - 600 ננומטר, bandpass 4 ננומטר. הגדרות אוסף CFP ישמש לרכישת ספקטרום סריג בניסוי הזה.
- מניחים עשר 1.5 מ"ל צינורות microcentrifuge בבלוק חום כפי שמוצג באיור 2 להלן. צינורות אלה הם בעלי צינורות התא aliquot (500 μl צינורות microcentrifuge.) מניח חתיכה קטנה של רקמת מחזיקי 1 ו -7 לרכך את cuvettes הנכתב כאן.
הערה: השתמש cuvettes נפרד עבור מצב לא מטופל ומצבו התרופה כדי למנוע זיהום צולב.
Tube איור 2. Microcentrifuge הגדרה והפנית עמדה בבלוק חום קובט עבור דגימות מטופל נמצא במצב 1.; צינורות התא aliquot נמצאים בעמדות 2 - 6. קובט עבור דגימות סמי מטופלים נמצאים בעמדה 7; צינורות תא aliquot נמצאים בעמדות 8 - 12. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
- מלאו בעלי 2 - 6 ו 8 - 12 עם ~ 750 μl של מים כדי ליצור C אמבט מים מיני 37 מעלות.
- מניחים עשר 500 צינורות microcentrifuge μl עבור aliquots התא לתוך אמבטיות מיני-מים (בעלי 2 - 6, 8 - 12). כל שפופרת תהיה חוזרות פרט של המצב (5 untreateד, 5 סמים מטופלים).
- צג התאים לביטוי (ראה שלב 3.6).
ניסוי 5. & איסוף נתונים
איור 3. ניסיונותיי סכמטי. מדריך צעד חכם מפורט הניסיון להגדיר וביצוע. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
- הפניה איור 3 עבור סכמטי ניסיוני. כאשר התאים מוכנים להיות שנקטפו, מבוסס על ביטוי חלבון מזוהה עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי (ראה דיון, פסקה 4): במנדף בטיחות ביולוגית, הסר בעדינות ~ 1 מ"ל של התקשורת, תאים resuspend בתרבות שלהם עם P1,000 ולהעביר resuspension לתוך צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge.
הערה: הימנע משימוש טריפסין כפי שהוא עשוי לעכל את N- הסופית ו /או מחייב בכיס של החיישן GPCR. - ספירת תאים על מנת להבטיח צפיפות תאים נאה resuspension. מטב נפח resuspension עבור 4 x 10 6 תאים / מ"ל.
- ספין תאי צנטריפוגות דלי מתנדנד בטמפרטורת חדר, 290 XG במשך 3 דקות. הסר supernatant לאחר צנטריפוגה.
- בעדינות resuspend תאי 1 מיליליטר תא הצפה (מאוחסנת על 37 מעלות צלזיוס) וחזור על שלב 5.3. במהלך ספין השני, לאסוף aliquot המניות התרופה 100 מ"מ מ -80 מעלות צלזיוס. הפוך 1: 100 דילול ב הצפת והתרופות 1 מ"מ המניות לעבוד ולשמור ב RT.
- לאחר צנטריפוגה השני, להסיר supernatant ותאי resuspend בעדינות 1 מ"ל של תא הצפת (4 x 10 6 תאים / מ"ל). OD מדוד 600 של המדגם בשנת ספקטרופוטומטר באמצעות 1 מ"ל של תאים 1 מ"ל של תא הצפת בתור ריק. לוותר תאי קובט פלסטיק חד פעמי ולהעביר בחזרה אל צינור microcentrifuge מייד לאחר spectrophotometry.
- במשך cel מלא untransfectedספקטרום מצב l, בעדינות resuspend תאים untransfected ב 1 מ"ל תא הצפת עם P1,000 pipet, להוסיף 90 μl של תאים כדי קובט ולרכוש ספקטרום סריג ב ננומטר עירור 430, bandpass 8 ננומטר, פליטת 450 - 600 ננומטר, bandpass 4 ננומטר. אסוף 3 - 5 ספקטרה חוזרים עם 90 μl הטרי של תאים. לשמור על מלאי של התאים ב 37 ° C בין המשקפיים, resuspend בעדינות עם P1,000 בין כל aliquot מדגם, ולשטוף קובט עם ultrapure H 2 O בין דגימות.
- לקבלת תנאי ניסוי, aliquot 90 μl של תאי transfected לכל אחד 500 צינורות μl בבעלים 2 - 6, 8 - 12 בבלוק החום. בעדינות resuspend המניות של תאים עם pipet P1,000 בין כל aliquot.
- לאחר התאים aliquoted, להוסיף 10 μl של הצפת והתרופות לצינורות 2 - 6 עבור דגימות מצב לא מטופל.
- בגין הניסוי על ידי הוספת 10 μl של פתרון התרופה 1 מ"מ לתוך צינור 8, להפעיל את הטיימר כדי ספירה לאחור מ 10 דק ', ו לערבב בעדינות צינור עם pipet P200. צינור והחזר קרוב 37° גוש חום C.
- מיד להרים שפופרת 2, ומערבבים בעדינות עם P200 (השתמש טיפ חדש), להוסיף 90 μl של ההשעיה התא קובט מצב לא מטופל, ומניחים fluorometer.
- רוכשת ספקטרום סריג ב ננומטר עירור 430, bandpass 8 ננומטר, פליטת 450 - 600 ננומטר, bandpass 4 ננומטר.
- בשעה 9 דק '- 10 שניות, ספייק צינור 9 עם 10 μl של פתרון התרופה 1 מ"מ, לערבב בעדינות עם P200 (השתמש טיפ חדש), ולחזור צינור לחמם גוש.
- חזור על שלבים 5.10 - 5.11 עם צינור 3 ו 5.12 עם צינור 10.
- חזור על שלבי 5.10 - 5.13 ב 1 במרווחי דקות (08:10, 07:10, וכו ') עד ספקטרה נאסף עבור כל דגימות המצב לא המטופל, ואת התרופה נוספה לכל דגימות מצב סמים. השתמש טיפ טרי לכל שלב pipet כדי למנוע זיהום צולב.
- בשעה 5 דק '- 10 שניות, להתחיל ערבוב צינור 8 (מצב סמים) בעדינות עם pipet P200, להוסיף 90 μl של ההשעיה התא קובט נפרד עבור מדגם סמים מטופלים ומניחים fluorometer.
- רוכשת Fספקטרום RET (ראה שלב 5.11 עבור הגדרות).
- חזור על שלבי 5.15 - 5.16 ב 1 במרווחי דקות (04:10, 03:10, וכו ') עבור דגימות מצב תרופה נותרות (צינורות 9 - 12).
- לאחר הניסוי נגמר, לשמור קבצי פרויקט, ביסודיות לשטוף cuvettes עם ultrapure H 2 O, ו מחדש מניות צינורות עבור התנאי הבא. תשמור על עצמך כדי למנוע זיהום צולב בשלב לשטוף. שנה את הטיפ על בקבוק O H 2 וכן על קו הוואקום בין השוטף.
6. ניתוח נתונים
- שמור וקבצי נתוני יצוא SPC לפרמט כדי לשמש לניתוח. תוכניות ניתוח זמינות להורדה מאתר האינטרנט של פרסום מעבדת Sivaramakrishnan.
- יצירת קבצי נתיב עבור תוכנת ניתוח הכוללים תוכניות הניתוח (v9, v15), קבצי דגימות untransfected (ראה שלב 5.6 לאיסוף ספקטרום תא untransfected), קובץ נתוני תפוקה, ו ערכים מופרדים בפסיקים (CSV) קבצים עבור הזנת נתונים.
- זן המידע הבאלתוך קובץ CSV (ראה מדגם בטבלה 3) ולקבוע תנאים שמתאימים לכל מדגם, כולל:
שם קובץ - קבצי גרף SPC פרט
קולטן - המיועד אשר מבנה GPCR נבדק (למשל, Β2)
בינדר - מיועד אשר גרסת פפטיד של המבנה נבדקה (למשל, S)
אגוניסט - לייעד מטופל (N) או טיפול תרופתי (ד) תנאים
מדריך - את נתיב התיקייה שבה הקבצים SPC נשמרים, בדרך כלל מאורגן לפי תאריך
OD - רשם צפיפות אופטית של מדגם מתוך ספקטרופוטומטר - זן שמות קבצים עבור דגימות untransfected (שלב 5.6) כדי להפחית חיץ ורעש פיזור ממדגמים.
- זן תנאי לתוך תכנית ניתוח.
- תוכניות הפעלה לנתח דגימות בתוך תנאי פרט (v9) ועל פני תנאים (v15).
- אל תכלול קבצים מדגמים שהן חריגות לכאורה בערכת הנתונים, או להתאים עבור חיסור ידי הגדלה או הקטנת ערך OD של indiviקבצים כפולים.
- נתוני יצוא לקובץ פלט עבור גישה מחושבת סריג יחסי (525 ננומטר / 475 ננומטר).
- חישוב ΔFRET על ידי הפחתת יחס הסריג הממוצע עבור מצב לא מטופל מן יחסי סריג פרט תנאי מטופלים (סמים).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
סכימטי כללי של הגדרת הניסוי וביצוע מפורט באיור 3.
כדי להבחין בשינוי סריג בטווח הדינמי הצר של החיישן, זה קריטי לדבוק הניואנסים של המערכת להיות דבק. איכות תא קיימת הכרח ביטוי חלבון וכן עקביות דגימה. איור 1 תכונות תמונות של תאים בתרבית גדלו בשכבה עקבית (10X) כי הוא אופטימלי עבור שש גם ציפוי ו transfection איור 1 (א) ותאים הגדלים בדפוסים בכבדות להוביל כי לצורות הדנדריטים איור 1 (ב) אשר אינו מומלץ ציפוי עקבי. תנאי transfection יכולים גם להיות מותאמים על מנת להשיג ביטוי לשחזור. כמה תנאים ממוטבים עבור מגיב transfection מומלץ להשתמש כאן. טבלה 1 פרטים תנאים אלה עבור מדיה סרום מופחת. DNA, rea transfectionיחסי גנט.
לאחר שכל הנתונים נאספו נתונים נכנסו לתוך קובץ CSV לניתוח (ראה מדגם בטבלה 3), התוצאות שנוצרו תידמנה נתוני ספקטרום סריג הגלם שמוצגים באיור 4 (א) ואת המנורמל, ממוצע סריג ספקטרה שמוצגות באיור 4 (ב). באיור 4 בספקטרום האדום הם דגימות המטופל והכחול הם דגימות מטופלים בתרופה. כל ספקטרום סריג הגלם באיור 4 (א) יש טווח אות לרעש מספיק לניתוח נתונים עקבי (כלומר., CPS ב 450 ננומטר לעומת CPS ב 475 ננומטר). עם מגוון זה, ספקטרה הם חלקה ופסגת המים מן המדגם (שיא ראמאן נמצא במרחק של 500 ננומטר) היא גם מינימאלית. רמות ביטוי נמוכות לגרום לשיא מים בולט מפריע ניתוח נתונים. נתונים מנורמלים ב 475 ננומטר, קביעת CPS בערך זה על מנת 1.0 (איור 4 (ב)). במערך הנתונים הזה עבור -AR β 2-10 חיישן פפטיד ננומטר-Gαs, יש שינוי משמעותי בבית 525 ננומטר קריאה בין מטופל (אדום) והתייחסו (כחול) דגימות. שינוי ΔFRET מחושב יחס הסריג (525 ננומטר / 475 ננומטר) של ערכות נתונים אלה והם נגישים דרך קובץ הפלט.
אם ביטוי חלבון נמוך, יש יעילויות transfection עניות, או צפיפות תאים נמוכה ב קובט לקריאת קרינה, ספקטרה עשוי להופיע רועש, כפי שמוצג באיור 5. לעומת איור 4 (א) בטווח אות לרעש לכך ערכת נתונים אינה אידיאלית, בערך בשעה 1.0 -. 1.6, עם מקסימום CPS של 4 x 10 5 רמת ביטוי נמוכה זו תורמת ספקטרה משונן לראות באיור נתונים הגולמיים 5 (א), אולם הנתונים הם חזקים ומסוגל להיות איור 5 מנורמל (ב). למרות פסגות המים (~ 500 ננומטר) אינו מתאים באופן מוחלט בין ערכות נתוני איור 5 (ב) לשעבר זהperiment הוא עדיין אפשרי לניתוח. איור 6 הוא נציג של ניסוי אינו מספק לניתוח. בעוד האות לרעש של המדגם הוא כ 2 - 3 עבור מטופלים (כחול) ואינו מטופלים (אדום) דגימות, צפיפות תאי קובט ברחבי דגימות נמוכה מדי (450 ננומטר ערך של 1 x 10 5) איור 6 ( א). זה יוצר בעיה חיסור ונורמליזציה רקע איור 6 (ב) ואת ספקטרום לא ליישר. חיסור יכול להיות מותאם עבור דגימות ידי הגדלה או הקטנת OD בטבלה 3. עם זאת, אפילו עם צפיפות תאים נמוכה, שיא המים (~ 500 ננומטר) הופך להיות הרבה יותר גדול, רועש יותר איור 6 (ג) ומעכב מערך נתונים זה בניתוחים נוספים.
איור 1. דוגמא צמיחת תאים בתרבית. תאים גדלים בשכבה (א) הם אידיאליים עבור ציפוי transfection עקבי. תאים שנראים צומחים באשכולות או עם דפוסים הדנדריטים (ב) לא יכולים בבייסבול בשש-בארות, עשויים להציג יעילות transfection עניה, ועלולים ליצור חוסר עקביות משרעת של ספקטרום הסריג. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. נציג ניתוח נתונים עבור β 2 -AR-10 ננומטר-Gαs פפטיד ± והתרופות. התמונה נציג נתונים גולמיים (א) ו- מנורמל, בממוצע נתונים (ב) שנאספו עם β 2 -AR-10 חיישן פפטיד ננומטר-Gαs עם מטופל (אדום) דגימות ומטופל (כחול) s amples לאחר דגירה 5 דקות עם bitartrate isoproterenol 100 מיקרומטר. פליטת מקסימום CFP ב 475 ננומטר, פליטת מקסימום YFP ב 525 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5. ניתוח של ביטוי חלבון מסכן עם גלם מנורמל נתונים. ספקטרה נתונים הגולמי הרועש (א) הוא תוצאה של רמות ביטוי נמוכות, צפיפות תאים נמוכה לדגימה, ו / או יעילות transfection העניה של מבנה. סט נתונים זה עדיין וניתן לפרשנות כמו מנורמל (ב), אם כי זה לא אידיאלי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
= "1"> 
איור 6. ניתוח של צפיפות תאים נמוכה ב fluorometer קובט עם גלם מנורמל מערכי נתונים. צפיפות התאים הנמוכה לדגימה, לראות נתונים גולמיים (א) מסבך רקע חיסור מים / (b, c) והופך את הנתונים האלה להגדיר uninterpretable. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| מַצָב | 0.5x | 0.7x | 1x | 2x | 2x * |
| DNA | 1 מיקרוגרם | 1.4 מיקרוגרם | 2 מיקרוגרם | 4 מיקרוגרם | 4 מיקרוגרם |
| תקשורת בסרום מופחתת | 100 μl | 70 μl | 100 μl | 100 μl | 200 μl |
| מגיב transfection | 3 μl | 4.2 μl | 6 μl | 6 μl | 12 μl |
| * הערה: מומלץ לבנות קשות באופן יוצא מן הכלל. זהירות יש לנקוט, כמו המצב הזה גורם מוות של תאים גבוה. | |||||
שולחן לוח 1. תנאי Transfection. זה כולל את התנאים אופטימיזציה של ריאגנטים עבור transfections לתוך 2 מיליליטר בארות של תאי HEK-293T באמצעות מגיב transfection המומלץ.
| תא הצפה | ||
| כֶּרֶך | מֵגִיב | תגובות |
| 9 מ"ל | מי ultrapure DNase / RNase חינם | |
| 1 מ"ל | HBS (10x), pH 7.4, ולאחסן ב 4 ° C: | |
| 200 מ"מ HEPES | ||
| 50 מ"מ KCl | ||
| 450 מ"מ NaCl | ||
| 20 מ"מ CaCl 2 - H 2 O | ||
| 10 מ"מ MgCl 2 - H 2 O | ||
| 100 μl | 20% D- גלוקוז | |
| 15 μl | aprotinin (1 מ"ג / מ"ל ב DH 2 O) | למנוע שפלה |
| 15 μl | leupeptin (1 מ"ג / מ"ל ב DH 2 O) | למנוע שפלה |
| 100 μl | חומצה אסקורבית (100 מ"מ ב DH 2 O) * | לייצב אגוניסט |
| * להוסיף מיד לפני תחילת assay | ||
| מאגר תרופות | ||
| כֶּרֶך | מֵגִיב | תגובות |
| 9 מ"ל | מי ultrapure DNase / RNase חינם | |
| 1 מ"ל | HBS (10x), pH 7.4, ולאחסן ב 4 ° C: | |
| 200 מ"מ HEPES | ||
| 50 מ"מ KCl | ||
| 450 מ"מ NaCl | ||
| 20 מ"מ CaCl 2 - H 2 O | ||
| 10 מ"מ MgCl <sub> 2 - H 2 O | ||
| 100 μl | חומצה אסקורבית (100 מ"מ ב DH 2 O) * | לייצב אגוניסט |
| * להוסיף מיד לפני תחילת assay | ||
מרכיבי טבלה 2. הצפה. טבלה זו מפרטת את החומרים כימיים המשמשים כדי להפוך את שני תא ההצפה ותרופות הצפת לשימוש בניסוי. הפוך שני מאגרים טריים כל יום של הניסוי; סלולרית בחנות הצפה על 37 מעלות צלזיוס, ותרופות מאגר בטמפרטורת חדר.
קובץ CSV לדוגמא לוח 3. עבור ניתוח. מדגם זה קובץ נתונים מדגיש את הכניסה להגדיר לאחר ניסוי אחד. ניתן להזין ניסויים מרובים לתוך אותו קובץ CSV וניתן להבחין מתחת לעמודה 'האפס' במידת הצורך. כל אחדבשורה יש למלא את הפרטים הבאים:
שם קובץ - קולטן קבצי SPC גרף פרט - מיועד אשר מבנה GPCR נבדק (למשל, Β2)
בינדר - מיועד אשר גרסת פפטיד של המבנה נבדקה (למשל, S)
אגוניסט - לייעד מטופל (N) או טיפול תרופתי (ד) תנאים
מדריך - את נתיב התיקייה שבה הקבצים SPC נשמרים, בדרך כלל מאורגן לפי תאריך
OD - רשם צפיפות אופטית של מדגם ספקטרופוטומטר
אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של השולחן הזה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הטווח הדינמי החזק של מדידות סריג במערכת זו מחזק את הצורך של בקרת איכות רגישה בכל שלב של פרוטוקול זה. השלבים החשובים ביותר כדי להבטיח ניסוי סריג מוצלח הם 1) culturing תא, 2) transfection 3) ביטוי חלבון ו -4) בזמן, תיאום מדויק במהלך ביצוע assay.
Cell בריאות ואיכות תחזוקה / ציפוי יכולות להיות השפעה משמעותית על אות לרעש של המערכת הניסיונית ובריאות תא עניה יכולים לעשות את זה בלתי אפשרי לזהות כל שינוי עקבי סריג. שמרני, תאים בריאים כ 20 קטעים, אם כי זה עשוי להשתנות בהתאם שורת תאים, טיפול, ואת תנאי תרבות. לאחר תאים מתקשים וגדל ככל בשכבה ומחוברת, או להתחיל לצמוח באופן עקבי יותר דפוסי הדנדריטים (ראה איור 1 (ב)), רעשי רקע ניסיוני יושפעו לרעה. תחזוקת תא זהירות, כולל Medi שגרתיתשינויים והסרה לא חסידי תאים ופסולת בקביעות מצלחות תחזוקה, ישפרו את איכות התאים במשך שש גם ציפוי ו transfections. גושי תאים, אשר להשפיע לרעה על יעילות transfection, ניתן להפריד ביעילות לתוך תאים בודדים ידי trypsinization של צלחות תחזוקה: לטיפול 10 ס"מ מנות ומחוברות עם 10 מ"ל של 0.25% טריפסין למשך 30 שניות, להסיר טריפסין אך להשאיר כ 200 μl, צלחת מקום 37 ° C חממה עבור 2 - 3 דקות. התאים יבואו ממני המנה מאוד בקלות והם פחות רגישים clumping.
זה קריטי כדי לייעל את הצעד transfection לצורך הניסוי הזה. שש בארות אידיאליות חייבות להיות 60 - 80% ומחוברות עבור transfection היעיל ביטוי אופטימלי. אם תאים מעט מדי דבק (<60%), לחכות כ 2 - 6 שעות כדי transfect, או לפחות עד 70% של תאים הם דבקו. ששת בארות כי הם מעל ומחוברות (> 80%) גם תפחית את יעילות transfection. Transfecting בבית התחתוןתא confluency מגביר את קצב בתא הנידונים למוות. הריכוז הטוהר DNA הוא גם קריטיים (ראה שלב 1.2). באמצעות ריכוז נמוך ו / או תכשירים DNA באיכות ירודה להשפיע לרעה תנאים Transfection transfection יעילות יכול להיות מותאם לכל לבנות, עיין בטבלה 1 לקבלת מידע נוסף.
ניטור מדויק ועקבי של ביטוי חלבון באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי רקמות תרבות הוא עוד צעד מכריע בתהליך זה. למרות צעד זה נתון שיקול דעת, אפשר להשתמש בטכניקות אחרות, כגון מיקרוסקופיה, לפקח ביטוי לאורך זמן כמותית, למרות שהם אינם מפורטים כאן. עבור בונה בדקנו בהצלחה במערכת שלנו, הביטוי מקבל כ 18-36 שעות כדי להגיע ביטוי אופטימלי. מניסיוננו, בונה כי ביטוי עני התצוגה במהלך חלון זמן זה רק לעתים נדירות לשפר לאחר 40 שעות. הקונסטרוקציות שפרסמנו עם לא הראה סימנים של degradation, אולם זה עשוי להיות בעיה עבור חלק GPCRs. המבחנים שלנו, שפלת חיישן אפשרית בזמני transfection למעלה מ -30 שעות. שלמות חיישן ניתן לבדוק באמצעות יחסי YFP / CFP: 525 ננומטר קורא מהספקטרום YFP-נרגש (490 ננומטר), ו 475 ננומטר קריאה נרגשת CFP (430 ננומטר) הספקטרום. עבור הגדרות, ראה שלב 4.6. יחסי YFP / CFP מומלצים הם בטווח של 1.7 - 2.0, עם יחס אידיאלי של 1.8. ערך זה תלוי בהיר יותר כפול משוער של יחסי YFP כדי CFP14. חיישן נפרד עם השפלה מינימלית ולכן יכיל שני fluorophores ויש YFP: יחס CFP של כ 2: 1. לאחר איכות חיישן אושרה חשוב לאשר לוקליזציה חלבון וביטוי על קרום התא. ביטוי תאיים משמעותי יכול להיות תוצאה של פירוק חלבונים או, הפנמה, או סחר מתמשך של החלבון. צג בונה לאורך זמן כדי לראות אם הביטוי הוא משופר על קרום התא. Crit הבאהאתגר iCal בביטוי הוא יעילות transfection. כ -70% + יעילות transfection הכרחית לגילוי אות לרעש נאות במערכת fluorometer זה. אם פחות תאים הם transfected, כמות אות לרעש, עדיין עשויה להיות לזיהוי אבל תהיה הרבה פחות עקבי בין דגימות בניסוי אחד סריג. זה יפריע ניתוח נתונים מדויק בתוך הטווח הדינמי הצר של המערכת. רמות הביטוי גם להציג משוכה משמעותית להשגת אות לרעש מספיק במהלך הניסוי. עבור רמות ביטוי לזהות על ידי fluorometer, היחס בין אות בין 475 ננומטר ו -450 ננומטר (פיזור תא) של 1.5 מספיקה לאיתור שינוי הסריג, אולם ביטוי אופטימלי יקבל יחס של כ 2.0+. לקבלת התייחסות, נתוני AR β2 נאסף במגוון אות לרעש של 4 x 10 5 CPS (450 ננומטר) ל -1 x 10 6 CPS (475 ננומטר), יחס אות לרעש של 2.5. יחס זה יעזור להפחית את כמות variability בין דגימות, אשר יכול גם להשפיע ניתוח נתונים. רמות הביטוי אלה כפופים גם את הרגישות ויישור אופטימלי של אופטיקה fluorometer; מערכות מסוימות עשויות לדרוש פרמטרים שונים לאופטימיזציה אות לרעש נאותה.
תאים רגישים במיוחד זמן וטמפרטורה. לאחר הליך הניסוי החל, הטיפול עדין חיוני כדי למנוע מוות של תאים. ניתן לנקוט אמצעים לוגיסטיים ספציפיים כדי לזרז את התהליך ולמנוע טעויות בזמן כולל הכנת תחנת העבודה, כדי לוודא את כל הציוד פועל כהלכה, ותכנון את מטרות הניסוי מראש. הוא אידיאלי לשימוש תאים בתוך 30 דקות של קציר, ו במערכת שלנו, פרוטוקול זה מבוצע בתוך 20 דקות. לאחר הטכניקה שולטת, אופטימיזציה transfection במיוחד ואת המיומנות הידנית של התרגיל עצמו, בניסוי זה יכול לשמש כדי להשוות בונה שונה אחד נגד שני, ליצור מנה-מחדשsponse עקומה, ואת החיישן ניתן להרחיב לחלבון G באורך מלא.
למרות החיישן סריג משמש כאן הוא פיתוח ייחודי חיישנים סריג GPCR, הגדרת הניסוי הספציפי הזה מפורט כמו assay היטב מאופיין ליישום של החיישן. את assay מבוסס fluorometer מאפשר אוכלוסייה גדולה של תאים תוערך כל ניסוי ואינו מסתמכת על preps חלבון או קרום המטוהר, ולכן שמירה על סביבת vivo. עיצוב ניסיוני זה גם בצורה מיטבית כדי לזהות שינויים קטנים מאוד לראות במערכת על גירוי אגוניסט של GPCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים מתחרים.
Acknowledgments
רום מומן על ידי הקרן איגוד הלב האמריקני קדם דוקטורט (14PRE18560010). המחקר מומן על ידי מענק פיתוח American Heart Association המדען (13SDG14270009) & NIH (1DP2 CA186752-01 & 1-R01-GM-105,646-01-A1) ל SS
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B2-AR-10 nm-Gas peptide sensor | Addgene | 47438 | https://www.addgene.org/Sivaraj_Sivaramakrishnan/ |
| GeneJET Plasmid Miniprep Kit | Fermentas/Fisher Sci | FERK0503 | Elute in 2 mM Tris elution buffer |
| HEK-293T-Flp-n cells | Life Technologies | R78007 | |
| Trypsin (0.25%) | Life Technologies | 25200056 | |
| DMEM- high glucose | Life Technologies | 11960-044 | Warm in 37 °C water bath before use |
| FBS, certified, Heat inactivated, US origin | Life Technologies | 10082147 | |
| Glutamax I 100x | Life Technologies | 35050061 | |
| HEPES | Corning | MT25060CL | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | Reduced serum media; Bring to RT before use |
| XtremeGene HP transfection reagenet | Roche | 6366236001 | Highly recommended for its consistency. Bring to RT before use |
| FluoroMax 4 | Horiba | Use with FluorEssence V3.8 software | |
| 3-mm path length quartz cuvette | Starna | NC9729944(16.45F-Q-3/z8.5) | May require cuvette holder/adaptor for use in Fluorometer, available from Starna |
| Sc100-S3 Heated Circulating water bath pump | Fisher Scientific | 13-874-826 | Warm to 37 °C before use |
| Thermomixer Heat Block | Eppendorf | 22670000 | Warm to 37 °C before use |
| Ultrapure DNA/RNAse free water | Life Technologies | 10977015 | Use at RT |
| D(+)-glucose, anhydrous | Sigma | G5767 | |
| aprotinin from bovine lung | Sigma | A1153 | |
| leupeptin hemisulfate | EMD | 10-897 | |
| L-ascorbic acid, reagent grade | Sigma | A0278 | |
| (-)-isoproterenol (+)-bitartrate | Sigma | I2760 | Use fresh aliquot each experiment |
References
- Malik, R. U., et al. Detection of G Protein-selective G Protein-coupled Receptor (GPCR) Conformations in Live Cells. J. Biol. Chem. 288, 17167-17178 (2013).
- Oldham, W. M., Hamm, H. E. Heterotrimeric G protein activation by G-protein-coupled receptors. Nat. Rev. Mol. Cell Bio. 9, 60-71 (2008).
- Rasmussen, S. G., et al. Crystal structure of the β2 adrenergic receptor-Gs protein complex. Nature. 477, 549-555 (2011).
- Alexander, N. S., et al. Energetic analysis of the rhodopsin-G-protein complex links the α5 helix to GDP release. Nat. Struct. Mol. Biol. 21 (1), 56-63 (2014).
- Conklin, B. R., Farfel, Z., Lustig, K. D., Julius, D., Bourne, H. R. Substitution of three amino acids switches receptor specificity of Gqα to that of Giα. Nature. 363, 274-276 (1993).
- Conklin, B. R., et al. Carboxyl-Terminal Mutations of Gqα and Gsα That Alter the Fidelity of Receptor Activation. Mol. Pharmacol. 50, 855-890 (1996).
- Onaran, H. O., Costa, T. Where have all the active receptor states gone. Nat. Chem. Bio. 8, 674-677 (2012).
- Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M.
- Lohse, M. J., Nuber, S., Hoffman, C. Fluorescence/bioluminescence resonance energy transfer techniques to study G-protein-coupled receptor activation and signaling. Pharmacol Rev. 64 (2), 299-336 (2012).
- Vilardaga, J. P., Bünemann, M., Krasel, C., Castro, M., Lohse, M. J. Measurement of the millisecond activation switch of G protein-coupled receptors in living cells. Nat. Biotechnol. 21, 807-812 (2003).
- Bünemann, M., Frank, M., Lohse, M. J. Gi protein activation in intact cells involves subunit rearrangement rather than dissociation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (26), 16077-16082 (2003).
- Stumpf, A. D., Hoffman, C. Optical probes based on G protein-coupled receptors - added work or added value. Brit. J. Pharmacol. 173, 255-266 (2016).
- Sivaramakrishnan, S., Spudich, J. A. Systemic control of protein interaction using a modular ER/K α-helix linker. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108, 20467-20472 (2011).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat. Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
