Abstract
Fӧrster resonansenergiöverföring (FRET) -baserade studier har blivit allt vanligare i undersökningen av GPCR-signalering. Vår forskargrupp utvecklat en intra-molekylär FRET sensor för att detektera växelverkan mellan Ga-subenheter och GPCR i levande celler efter agoniststimulering. Här har vi detalj protokoll för att upptäcka förändringar i FRET mellan β 2 adrenoceptor och Gαs C-terminalen peptid vid behandling med 100 ^ M isoproterenol hydroklorid som tidigare kännetecknas en. Vår FRET sensor är en enda polypeptid som består i serie av en fullängds-GPCR, en FRET acceptorfluorofor (mCitrine), en ER / K SPASM (systematisk proteinaffinitetsstyrkan modulering) linker, en FRET donatorfluorofor (mCerulean), och en Ga-C terminala peptiden. Detta protokoll kommer förberedelse detalj cell, transfektion villkor, installation av utrustningen, genomförande analys och dataanalys. Denna experimentella designen upptäcker små lmAnges i FRET indikativ för protein-proteininteraktioner, och kan också användas för att jämföra styrkan hos interaktionen mellan ligander och GPCR-G-proteinpairings. För att öka signal-till-brus i våra mätningar kräver detta protokoll förhöjd precision i alla steg, och presenteras här för att möjliggöra reproducerbar utförande.
Introduction
G-proteinkopplade receptorer (GPCR) är sju-transmembranreceptorer. Det mänskliga genomet ensam innehåller cirka 800 gener som kodar för GPCR, som aktiveras av en mängd olika ligander inklusive ljus, luktämnen, hormoner, peptider, läkemedel och andra små molekyler. Nästan 30% av alla läkemedel som finns på marknaden mål GPCR eftersom de spelar en stor roll i många sjukdomstillstånd 2. Trots decennier av omfattande arbete på denna receptorfamilj, kvarstår betydande kvarstående frågor inom området, särskilt när det gäller de molekylära mekanismer som driver GPCR-effektor interaktioner. Hittills har endast en hög upplösning kristallstruktur publicerad, som ger insikt i växelverkan mellan β 2 adrenoceptor (β 2-AR) och Gs-protein 3. Tillsammans med omfattande forskning under de senaste tre decennierna, upprepar det en viss strukturell komponent som är avgörande i dettainteraktion: den Ga-subenheten C-terminalen. Denna struktur är viktigt för både G-proteinaktivering av GPCR 4 och G-protein val 5-6. Därför ger Ga C-terminalen en viktig länk mellan ligand stimulering av GPCR och selektiv G-proteinaktivering.
Forskning under det senaste decenniet visar att GPCR fylla en bred konforma landskap, med ligandbindande stabiliserande delmängder av GPCR konformationer. Medan flera tekniker, innefattande kristallografi, NMR och fluorescensspektroskopi, och masspektrometri är tillgängliga för att undersöka GPCR konformationell landskapet, det finns en brist på metoder för att belysa deras funktionella betydelse i effektor urval 7. Här, vi beskriva en Fӧrster resonansenergiöverföring (FRET) -baserad strategi för att detektera G-protein selektiv GPCR konformationer. FRET bygger på närhet och parallella orienteringen av två fluoroforer med överlappande emissions (donator) ennd excitation (acceptor) spektra 8. Som donator- och acceptor-fluoroforer komma närmare varandra som ett resultat av antingen konformationsförändring i proteinet, eller ett protein-proteininteraktion, ökar FRET mellan dem, och kan mätas med användning av en rad olika metoder 8. FRET-baserade biosensorer har använts i stor utsträckning i GPCR fält 9. De har använts för att sondera konformationsförändringar i GPCR genom att sätta in donator och acceptor i den tredje intracellulära slingan och GPCR C-terminalen; sensorer har utformats för att sondera GPCR och effektor-interaktioner genom separat märkning av GPCR och effektor (G proteinsubenheter / arrestiner) med en FRET-par 10; några sensorer känner även konformationsförändringar i G-protein 11. Dessa biosensorer har gjort det möjligt för fältet för att ställa en mängd av utestående frågor, inklusive strukturförändringar i GPCR och effektor, GPCR-effektor interaktions kinetik och allosteriska ligander 12. Vår gruppvar särskilt intresserad av att skapa en biosensor som kan detektera G-proteinspecifika GPCR konforma enligt agonistdrivna förhållanden. Denna biosensor bygger på en nyutvecklad teknik som heter Kramp (systematisk protein affinitet styrka modulering) 13. SPASM innebär tjudra samverkande proteindomäner med hjälp av en ER / K länk, som styr deras effektiva koncentrationer. Flankerar länk med en FRET par fluoroforer skapar ett verktyg som kan rapportera tillståndet för interaktionen mellan proteiner 12. Tidigare en spasm modul användes för att tjudra Ga C-terminalen till en GPCR och övervaka deras interaktioner med FRET fluoroforer, mCitrine (som avses i detta protokoll av dess allmänt kända varianten, gul fluorescerande protein (YFP), excitation / emissionstopp vid 490/525 nm) och mCerulean (som avses i detta protokoll av dess allmänt kända varianten Cyan fluorescerande protein (GFP), excitation / emissionstopp 430/475 nm). Från N- till C-terminal, thans genetiskt kodad enda polypeptid innehåller: en fullängds GPCR, FRET acceptor (mCitrine / YFP), 10 nm ER / K-linker, FRET donator (mCerulean / GFP), och Ga C-terminal peptid. I denna studie, är sensorer förkortat GPCR-linkerlängden-Ga-peptid. Alla komponenter är separerade av en ostrukturerad (Gly-Ser-Gly) 4-linker som möjliggör fri rotation av varje domän. Den detaljerade karakteriseringen av sådana sensorer som tidigare utfördes med användning av två prototypiska GPCR: β 2 AR och opsin en.
Denna sensor transfekterades transient in i HEK-293T-celler och fluorometer baserade levande cellförsök mått fluorescensspektra av FRET paret i godtyckliga enheter av räkningar per sekund (CPS) i närvaro eller frånvaro av ligand. Dessa mätningar används för att beräkna ett FRET förhållandet mellan fluoroforema (YFP max / GFP max). En förändring i FRET (ΔFRET) beräknas sedan genom att subtrahera medel FRET förhållandetav obehandlade prover från FRET förhållande av ligand-behandlade prov. ΔFRET kan jämföras över konstruktioner (β 2 AR-10 nm-Gαs peptid kontra p 2 AR-10 nm-no peptid). Här har vi detalj protokollet för att uttrycka dessa sensorer i levande HEK-293T-celler, övervaka deras uttryck, och installationen, genomförande och analys av fluorometern baserade levande cell FRET mätning för obehandlat kontra läkemedelsbehandlade villkor. Även om detta protokoll är specifik för β 2 -AR-10 nm-Gαs peptidsensor behandlades med 100 | iM isoproterenol bitartrat, kan det optimeras för olika GPCR-Ga-paren och ligander.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. DNA-framställning
- Design sensor konstruktioner med hjälp av en modulär kloningsschema. Vänligen referera till β 2 AR sensordesign i detalj tidigare en.
- Framställa DNA enligt kommersiell miniprep kit-protokollet och eluera i 2 mM Tris-HCl-lösning, pH 8, vid en koncentration ≥ 750 ng / | il, A 260 / A 280 av 1,7 till 1,9, A 260 / A 230 av 2,0 till 2,29.
2. Cell Culture Förberedelse
- Kultur HEK-293T-Flp-n-celler i DMEM innehållande 4,5 g / L D-glukos, kompletterat med 10% FBS (värmeinaktiverat) (volym / volym), 1% L-glutamin komplettera, 20 mM HEPES, pH 7,5 vid 37 ° C i fuktad atmosfär vid 5% CO2. Hantera celler i biologisk säkerhet huva för efterföljande steg.
- Låt cellerna att växa till ett sammanflytande monolager innan passage i sex brunnar. Tid för att uppnå konfluens beror på initial plätering densitet. Använd plattor somkomma till konfluens inom 1 - 2 dagar plätering för sex brunnar plätering. En sammanflytande 10 cm vävnadsodlingsbehandlade maträtt har celltäthet på cirka 4 x 10 6 celler / ml. Se figur 1 för bilden av cellodlingstillväxt.
- Tvätta cellerna med 10 ml PBS, och trypsinize med 0,25% trypsin (se diskussion, punkt 2). Plattan 8 x 10 5 celler / brunn i 2 ml medium i vävnadskultur-behandlade sex brunnar och gör det möjligt att vidhäfta under 16 - 20 timmar.
3. Transfektion Villkor
- Sprida transfektioner för konstruktioner som kan kräva olika lång tid för att uppnå optimal uttryck (mellan 20-36 timmar). Synkronisera förutsättningar för en enhetlig experiment tid. har också en otransfekterade kontrollbrunnen på motsvarande celldensitet som ska användas för bakgrundsbrus och spridning subtraktion under analysen.
- Ta transfektionsreagens till rumstemperatur: minskade serummedier, DNA, transfektion reagens.
- I enbiologisk säkerhet huva kombinera reagenser i ett sterilt mikrocentrifugrör i följande ordning: Blanda 2 mikrogram DNA med 100 fil minskade serum media. Spik 6 pl transfektionsreagens i media / DNA mix utan att vidröra ytan av blandningen eller sidan av röret. Inrätta en transfektion reaktion per brunn. Transfektion förhållanden kan optimeras (1-4 mikrogram av DNA, 3 - 6 pl transfektionsreagens) för att uppnå konsekvent uttrycksnivåer. Se tabell 1 för mer optimerade förhållanden.
- Inkubera blandningen vid RT i biologisk säkerhet huva för 15-30 min. Använd inte reaktion om de lämnas för att inkubera under mer än 30 min.
- Lägg reaktion på celler i ett droppvis sätt över bra och försiktigt skaka sex brunnar för att säkerställa noggrann blandning. Lägga en reaktion per brunn.
- Efter 20 timmar av uttryck, övervaka fluorescens med hjälp av vävnadsodling fluorescensmikroskop. Utvärdera befolkning uttryck med 10X objektiv och protein lokalisering i en cell vid 40X. obsErve för proteinuttryck på plasmamembranet (PM). Om väsentlig interna noteras övervaka transfektion tills signifikant uttryck detekteras vid PM.
4. Reagens och utrustning Förberedelse
- Förbered 100 mM läkemedelslager och förvara vid -80 ° C: isoproterenol bitartrat (100 mM i dH 2 O innehållande 300 mM askorbinsyra). Gör på is / i kylrum, och flash-frysning omedelbart. Portioner kan göras och användas upp till ett år.
- Förbered Cell Buffer (~ 2 ml / skick) och förvara i en 37 ° C vattenbad. Gör nytt varje dag. Referens Tabell 2 för cellbufferten beståndsdelar.
- Förbered Drug Buffer (10 ml) och förvara vid rumstemperatur. Referens Tabell 2 för drogBuffert beståndsdelar.
- Syra tvätta kyvetter med användning av koncentrerad HCl. Neutralisera med en svag bas (1 M KOH), och tvätta kyvetter med dH 2 O.
- Förbered arbetsstation runt fluorometer med fleralådor med 10, 200 och 1000 pl pipettspetsar, en timer in med en 10 min nedräkning, en lättillgänglig vakuumledning med tips för kyvett rengöring, grannlaga uppgift våtservetter, och sprutflaska med ultrarent H2O
- Värma externt vattenbad under fluorometer och värmeblocket till 37 ° C.
- Slå på fluorometer; set fluorescens insamlingsprogram för GFP insamling för att exciterings 430 nm, bandpass 8 nm; emissionsområdet 450 nm - 600 nm, bandpass 4 nm. För YFP samling endast sensorstyrning (se diskussion) set excitation till 490 nm, bandpass 8 nm, emissionsområdet 500-600 nm, bandpass 4 nm. inställningar GFP samling kommer att användas för att förvärva en FRET spektrum i detta experiment.
- Placera tolv 1,5 ml mikrocentrifugrör i värmeblock som visas i Figur 2 nedan. Dessa rör är hållare för cell alikvot rör (500 pl mikrocentrifugrör.) Placera en liten bit vävnad i hållare 1 och 7 för att dämpa kuvetterna placeras här.
Obs: Använd separata kyvetter för obehandlat skick och drog tillstånd för att förhindra korskontaminering.
Figur 2. mikrocentrifugrör Konfigurera och positionsreferens i värmeblock Kyvett för obehandlade prover är i position 1. cell alikvot rören är i positionerna 2 - 6. Kyvett för läkemedelsbehandlade prover är i position 7; cell alikvot rören är i positionerna 8 - 12. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Fyll hållare 2 - 6 och 8 - 12 med ~ 750 | il vatten för att skapa en mini 37 ° C vattenbad.
- Placera tio 500 pl mikrocentrifugrör för cell portioner i mini-vattenbad (hållare 2 - 6, 8 - 12). Varje rör kommer att vara en individuell upprepning av villkoret (5 untreated, 5 läkemedelsbehandlade).
- Övervaka celler för expression (se steg 3,6).
5. Experiment & datainsamling
Figur 3. Experimentell Schematisk. En detaljerad stegvis guide för experimentell inrättas och utförande. Klicka god här för att se en större version av denna siffra.
- Referens Figur 3 för experimentell schematiska. När cellerna är redo att skördas, baserat på proteinuttryck detekteras med fluorescensmikroskop (se diskussion, punkt 4): i biologisk säkerhet huva, försiktigt bort ~ 1 ml av media, resuspendera cellerna i deras kultur med en P1,000 och överföra resuspension in i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör.
Obs: Undvik att använda trypsin eftersom det kan smälta N-terminalen och /eller bindningsficka av GPCR-sensorn. - Räkna celler för att säkerställa korrekt celltätheten i resuspension. Optimera resuspension volym 4 x 10 6 celler / ml.
- Snurra cellerna i svängande hink centrifug vid rumstemperatur, 290 xg i 3 min. Avlägsna supernatanten efter centrifugering.
- GENTLY resuspendera cellerna i 1 ml cellbuffert (förvarades vid 37 ° C) och upprepar steg 5,3. Under andra spin, samla 100 mM drog lager alikvot från -80 ° C. Gör 1: 100 utspädning i Drug buffert för 1 mM arbetar lager och hålla vid RT.
- Efter den andra centrifugeringen, avlägsna supernatanten och försiktigt återsuspendera cellerna i 1 ml cellbuffert (4 x 10 6 celler / ml). Mät OD 600 av provet i spektrofotometern med hjälp av 1 ml av celler och 1 ml cellbufferten som en blank. Fördela celler i en engångsplast kyvett och överföra tillbaka till ett mikrocentrifugrör omedelbart efter spektrofotometri.
- För en kontroll otransfekterade cell skick spektrum, försiktigt resuspendera otransfekterade celler i en ml cellbuffert med P1,000 pipett, tillsätt 90 pl celler till kyvetten och förvärva FRET spektrum vid excitation 430 nm, bandpass 8 nm, emission 450-600 nm, bandpass 4 nm. Samla 3 - 5 upprepade spektra med färska 90 pl celler. Håll lager av celler vid 37 ° C mellan specifikationer, resuspendera försiktigt med P1,000 mellan varje prov prov, och skölj kyvett med ultrarent H2O mellan prover.
- För experimentella förhållanden, alikvot 90 pl av transfekterade celler till var och en av de 500 il rören i hållare 2 - 6, 8 - 12 i värmeblocket. Försiktigt resuspendera lager av celler med P1,000 pipett mellan varje portion.
- Efter celler alikvoteras, tillsätt 10 pl av drog buffert till rören 2-6 för obehandlade skick prover.
- Börja experiment genom tillsats av 10 pl 1 mM läkemedelslösning i röret 8, starta timern att nedräkningen från 10 min, och blanda försiktigt rör med P200 pipett. Stäng röret och retur till 37° C värmeblock.
- Omedelbart plocka upp röret 2, blanda försiktigt med P200 (använd en ny spets), tillsätt 90 pl av cellsuspensionen till obehandlat skick kyvett, och plats i fluorometer.
- Förvärva FRET spektrum vid excitation 430 nm, bandpass 8 nm, emission 450-600 nm, bandpass 4 nm.
- Vid 9 min - 10 sek, spik rör 9 med 10 pl 1 mM läkemedelslösning, blanda försiktigt med en P200 (använd ny spets) och avkastningen rör för att värma blocket.
- Upprepa steg från 5,10 till 5,11 med röret 3 och 5,12 med röret 10.
- Upprepa steg från 5,10 till 5,13 vid 1 min intervaller (08:10, 07:10, etc.) tills spektra samlas för alla obehandlade skick prover och läkemedel har lagts till alla läkemedel skick prover. Använd en ny spets för varje pipett steg för att förhindra korskontaminering.
- Vid 5 min - 10 sekunder, börjar blandningsröret 8 (läkemedel tillstånd) försiktigt med P200 pipett, tillsätt 90 pl av cellsuspensionen till separat kyvett för läkemedelsbehandlade provet och placera i fluorometer.
- förvärva FRET spektrum (se steg 5,11 för inställningar).
- Upprepa steg från 5,15 till 5,16 vid 1 min intervaller (04:10, 03:10, etc.) för kvarvarande läkemedels skick prover (rör 9 - 12).
- Efter experimentet avslutas, spara projektfiler, tvätta kyvetter med ultrarent H2O, och åter lager rör för nästa tillstånd. Var noga med att förhindra korskontaminering i tvättsteget. Ändra spetsen på H2O flaska samt på vakuumledningen i mellan tvättar.
6. Dataanalys
- Spara och exportera datafiler i SPC format som ska användas för analys. Analysprogram finns att ladda ned från Sivaramakrishnan Lab publikation webbplats.
- Skapa väg filer för analys programvara som inkluderar en analys program (v9, V15), otransfekterade prover filer (se steg 5,6 för otransfekterade samling cellspektrum), OUTPUT datafil, och kommaseparerade värden (CSV) filer för datainmatning.
- Ange följande informationi CSV-fil (se prov i tabell 3) och utse respektive villkor för varje prov, inklusive:
Filnamn - enskilda SPC graffiler
Receptor - nominerade som GPCR konstruktion testades (t.ex. Β2)
Binder - nominerade vilken peptid variant av konstruktionen testades (t.ex. S)
Agonist - utse obehandlade (N) eller läkemedelsbehandlade (D) förhållanden
Directory - vägen mapp där SPC filer sparas, vanligtvis organiseras efter datum
OD - inspelad optisk densitet av prov från spektrofotometer - Ange filnamn för otransfekterade prover (steg 5,6) för att subtrahera buffert och spridning buller från prover.
- Ange villkor i analysprogram.
- Kör program för att analysera prover inom enskilda förhållanden (V9) och över villkor (v15).
- Uteslut exempelfiler som är uppenbara avvikelser i datamängden, eller justera för subtraktion genom att öka eller minska OD-värde av indidubbla filer.
- Exportera data till utfil för tillgång till beräknad FRET nyckeltal (525 nm / 475 nm).
- Beräkna ΔFRET genom att subtrahera medel FRET förhållande för obehandlat tillstånd från de individuella FRET-förhållanden för behandlade (läkemedel) betingelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En generaliserad schematisk bild av experimentet inrättat och utförande är detaljerad i Figur 3.
För att detektera en FRET förändring i det smala dynamiska området för sensorn, är det viktigt att hålla sig till nyanserna i systemet följas. Cellernas kvalitet är viktigt att proteinuttryck samt konsekvens i provtagningen. Figur 1 funktioner bilder av odlade celler som växer på ett konsekvent monolager (10X) som är optimalt för sex brunnar plätering och transfektion Figur 1 (a) och celler som växer i hopklumpade mönster som leder till dendritiska former Figur 1 (b) som inte rekommenderas för konsekvent plätering. Transfektion villkor kan också optimeras för att uppnå reproducerbart uttryck. Flera villkor har optimerats för den rekommenderade transfektionsreagens användas här. Tabell 1 detaljer dessa villkor för minskade serummedier. DNA, och transfektion reagent-förhållanden.
När har samlat alla uppgifter och uppgifter i CSV-fil för analys (se exempel i tabell 3), de genererade resultaten kommer liknar spektra rådata FRET som visas i figur 4 (a) och den normaliserade, medelvärdet FRET spektra visas i Figur 4 (b). I fig 4 de röda spektra är de obehandlade proverna och det blå är de läkemedelsbehandlade proverna. Alla av Raw FRET-spektra i figur 4 (a) har tillräcklig signal-till-brusintervall för konsekvent dataanalys (dvs., Cps vid 450 nm jämfört med CPS vid 475 nm). Med detta intervall, de spektra är jämnare och vattentopp från provet (Raman-spets är vid 500 nm) är också minimal. Låga expressionsnivåer resulterar i en framstående vattentopp som stör dataanalys. Data normaliseras vid 475 nm, varvid CPS av detta värde till 1,0 (figur 4 (b)). I denna datauppsättning för β 2 AR-10 Nm-Gαs peptidsensor, finns det en betydande förändring i 525 nm läsa mellan obehandlade (röd) och behandlade (blå) prover. Den ΔFRET förändringen beräknas utifrån FRET nyckeltal (525 nm / 475 nm) av dessa dataset och är tillgängliga genom utdatafilen.
Om proteinuttryck är låg, det är dålig transfektionseffektivitet, eller låg celldensitet i kyvetten för fluorescensavläsning kan spektra visas bullrigare, såsom visas i figur 5. Jämfört med fig 4 (a) signal-till-brusområde för denna datauppsättningen är inte idealisk, vid ungefär 1,0 -. 1,6, med CPS max 4 x 10 5 Denna låga uttrycksnivå bidrar till den ojämna spektra ses i rådata Figur 5 (a), data är dock snäva och kunna vara normaliserad Figur 5 (b). Även om vatten toppar (~ 500 nm) inte rada upp helt mellan datauppsättningar Figur 5 (b) detta fdexperimentera fortfarande är användbart för analys. Figur 6 är representativ för ett experiment som är otillräcklig för analys. Medan signal-brus av provet är cirka 2-3 för behandlade (blå) och obehandlade (röd) prover, celltäthet i kyvetten över prov är för låg (450 nm värde av 1 x 10 5) Figur 6 ( a). Detta skapar ett problem i bakgrundssubtraktion och normalisering Figur 6 (b) och spektra inte justera. Subtraktion kan justeras för prover genom ökning eller minskning OD i tabell 3. Men även med låg celltäthet, vattentoppen (~ 500 nm) blir mycket större och bullrigare Figur 6 (c) och hämmar denna datamängd från vidare analys.
Figur 1. Exempel på odlade celltillväxt. Celler som växer i ett monoskikt (en) Är idealiska för jämn plätering och transfektion. Celler som verkar växa i klumpar eller med dendritiska mönster (b) får inte plattan konsekvent i sex-brunnar, kan visa dålig transfektion effektivitet, och kan skapa inkonsekvenser i amplitud av FRET spektrumet. Skalstreck = 100 nm. Klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Representativa Data Analysis för β 2 AR-10 nm-Gαs peptid ± Drug. Representativ bild av rådata (a) och normaliseras, i genomsnitt uppgifter (b) samlas in med β 2 AR-10 nm-Gαs peptidsensor med obehandlade (röd) prover och behandlade (blå) spel efter 5 minuters inkubation med 100 | iM isoproterenol bitartrat. GFP max emission vid 475 nm, YFP max emission vid 525 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Analys av dålig proteinuttryck med Raw och normaliserade data. Noisy rådata spektra (a) är ett resultat av låga uttrycksnivåer, låg celltäthet per prov, och / eller dålig transfektion effektivitet konstruktion. Denna datamängd är fortfarande tolka som normaliserad (b), även om det inte är idealiskt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. Analys av låg celltäthet i Fluorometer Kyvett med Raw och normaliserad datamängder. Den låga celltäthet per prov, sett i rådata (a) försvårar vatten / bakgrund subtraktion (b, c) och gör denna datauppsättning tolkningsbara. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Skick | 0,5x | 0,7x | 1x | 2x | 2x * |
| DNA | 1 ^ g | 1,4 | ig | 2 ^ g | 4 ^ g | 4 ^ g |
| Minskade serummedier | 100 ^ | 70 | il | 100 ^ | 100 ^ | 200 ^ |
| transfektionsreagens | 3 pl | 4,2 | il | 6 | il | 6 | il | 12 | il |
| * OBS: Rekommenderas för extremt svår konstruktion. Försiktighet måste iakttas, eftersom detta tillstånd inducerar hög celldöd. | |||||
Tabell 1. Transfektion förhållanden. Denna tabell innehåller optimerade betingelser av reagens för transfektioner i 2 ml brunnar i HEK-293T-celler genom att använda den rekommenderade transfektionsreagens.
| cell buffert | ||
| Volym | Reagens | kommentarer |
| 9 ml | ultraren DNas / RNas fritt vatten | |
| 1 ml | HBS (10x), pH 7,4, förvara vid 4 ° C: | |
| 200 mM HEPES | ||
| 50 mM KCl | ||
| 450 mM NaCl | ||
| 20 mM CaCl2 - H2O | ||
| 10 mM MgCl2 - H2O | ||
| 100 ^ | 20% D-glukos | |
| 15 ^ il | aprotinin (1 mg / ml i dH 2 O) | förhindra nedbrytning |
| 15 ^ il | leupeptin (1 mg / ml i dH 2 O) | förhindra nedbrytning |
| 100 ^ | askorbinsyra (100 mM i dH 2 O) * | stabilisera agonist |
| * Lägga omedelbart innan analysen | ||
| Drug buffert | ||
| Volym | Reagens | kommentarer |
| 9 ml | ultraren DNas / RNas fritt vatten | |
| 1 ml | HBS (10x), pH 7,4, förvara vid 4 ° C: | |
| 200 mM HEPES | ||
| 50 mM KCl | ||
| 450 mM NaCl | ||
| 20 mM CaCl2 - H2O | ||
| 10 mM MgCb <sub> 2 - H 2 O | ||
| 100 ^ | askorbinsyra (100 mM i dH 2 O) * | stabilisera agonist |
| * Lägga omedelbart innan analysen | ||
Tabell 2. Buffert beståndsdelar. Denna tabell beskrivs de reagenser som används för att göra både cellbufferten and Drug buffert för användning i experimentet. Gör båda buffertar färska varje dag av experimentet; lagra cellbuffert vid 37 ° C, och drog buffert vid rumstemperatur.
Tabell 3. Prov CSV-fil för analys. Detta prov datafil belyser posten som efter ett experiment. Flera försök kan föras in i samma CSV-fil och kan urskiljas under "Tillsats kolumnen om det behövs. Varjerad måste fyllas ut med följande information:
Filnamn - individuell SPC graffiler Receptor - nominerade som GPCR konstruktion testades (t.ex. Β2)
Binder - nominerade vilken peptid variant av konstruktionen testades (t.ex. S)
Agonist - utse obehandlade (N) eller läkemedelsbehandlade (D) förhållanden
Directory - vägen mapp där SPC filer sparas, vanligtvis organiseras efter datum
OD - inspelad optisk densitet av provet i spektrofotometer
Klicka här för att se en större version av denna tabell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den täta dynamiska omfånget av FRET mätningar i detta system förstärker behovet av känsliga kvalitetskontroll i varje steg av detta protokoll. De viktigaste åtgärder för att säkerställa en framgångsrik FRET experiment är en) cellodling, 2) transfektion 3) proteinuttryck och 4) i rätt tid, exakt samordning under exekvering analysen.
Cell hälsa och underhåll / bordläggningen kvalitet kan ha en betydande inverkan på signalbrus i experimentella system och dålig cell hälsa kan göra det omöjligt att upptäcka någon konsekvent förändring i FRET. Konservativt, celler är hälsosamma för cirka 20 passager, även om detta kan variera beroende på cellinje, hantering och odlingsbetingelser. När cellerna har svårt att växa som en sammanflytande monolager, eller börja växa konsekvent i mer dendritiska mönster (se figur 1 (b)), kommer experimentell bakgrundsljud påverkas negativt. Noggrann cell underhåll, inklusive rutin media förändringar och regelbundet ta bort icke-vidhäftande celler och skräp från underhållsplattor, kommer att öka kvaliteten på celler för sex brunnar plätering och transfektioner. Cellklumpar, vilket negativt påverkar transfektionseffektiviteten, effektivt kan separeras i enskilda celler genom trypsinering av underhållsplattor: behandla 10 cm sammanflytande rätter med 10 ml 0,25% trypsin under 30 sekunder, ta bort trypsin men lämna cirka 200 l, plats skålen i 37 ° C inkubator för 2-3 minuter. Celler lossnar maträtt mycket lätt och är mindre känsliga för klumpar.
Det är kritiskt att optimera transfektion steget för detta experiment. Sex-brunnar måste helst vara 60 - 80% sammanflytande för effektiv transfektion och optimal expression. Om för få celler har anslutit sig (<60%), vänta ca 2-6 timmar för att transfektera eller tills åtminstone 70% av cellerna följs. Sex-brunnar som är översammanflytande (> 80%) kommer också att minska transfektionseffektivitet. Transfektion vid lägrecell confluency ökar celldödstalen. DNA-koncentration och renhet är också kritisk (se steg 1,2). Med hjälp av låg koncentration och / eller dålig kvalitet DNA-preparat påverka negativt transfektionseffektivitet Transfektion förhållanden kan justeras per konstruktion, se tabell 1 för mer information.
Korrekt och konsekvent övervakning av proteinuttryck med hjälp av en vävnadskulturfluorescensmikroskop är ett viktigt steg i denna process. Även om detta steg är föremål för individuell bedömning, är det möjligt att använda andra tekniker, såsom mikroskopi, för att övervaka expression över tiden kvantitativt, även om de inte beskrivs i detalj här. För konstruktioner som vi har testat framgångsrikt i vårt system, tar uttryck cirka 18-36 timmar för att nå optimalt uttryck. I vår erfarenhet, konstruerar att displayen dålig uttryck under detta tidsfönster sällan förbättras efter 40 timmar. Konstruktionerna vi har publicerat med har inte visat tecken på degradation, men detta kan vara ett problem för vissa GPCR. I våra analyser är det möjligt att vid transfektion gånger nedbrytning sensorns 30 timmar. Sensor integritet kan testas med hjälp av YFP / GFP förhållanden: 525 nm läsning från YFP-excited (490 nm) spektrum, och 475 nm läsning från CFP-upphetsad (430 nm) spektrum. För inställningar, se steg 4.6. Rekommenderade YFP / GFP förhållanden är inom intervallet från 1,7 till 2,0, med ett idealiskt förhållande av 1,8. Detta värde är beroende av den ungefärliga två-faldigt större ljusstyrka för YFP relativt CFP14. En integrerad sensor med minimal nedbrytning skall därför innehålla båda fluoroforema och har YFP: GFP förhållande av ca 2: 1. Efter sensor kvalitet har bekräftats är det viktigt att bekräfta protein lokalisering och uttryck vid plasmamembranet. Betydande intracellulär expression kan vara ett resultat av antingen proteinnedbrytning, internalisering, eller pågående handel av proteinet. Monitor-konstruktioner över tiden för att se om uttrycket förstärks vid plasmamembranet. Nästa critical utmaning i expression är transfektionseffektivitet. Cirka 70% + transfektionseffektiviteten är nödvändig för adekvat signal-brus-detektering i denna fluorometer system. Om färre celler transfekteras, kan mängden signal-till-brus fortfarande vara detekterbara men kommer att vara mycket mindre konsekvent mellan prover i en FRET experiment. Detta kommer att hindra korrekt dataanalys inom den snäva dynamiska området för systemet. Uttrycksnivåer presenterar också en betydande hinder för att uppnå gott signal-till-brus under experimentet. För uttrycksnivåer detekterbara genom fluorometern, är tillräcklig för att detektera en förändring i FRET förhållandet av signalen mellan 475 nm och 450 nm (cellspridning) av 1,5, kommer emellertid att optimal expression har ett förhållande av ca 2.0+. För referens, är den β2-AR data som samlas in i en signal-till-brus-intervallet 4 x 10 5 CPS (450 nm) till 1 x 10 6 CPS (475 nm), signal-till-brusförhållande på 2,5. Detta förhållande kommer att bidra till att minska den mängd variability mellan prover, som också kan påverka dataanalys. Dessa uttrycksnivåer är också föremål för känslighet och optimal anpassning av fluorometern optik; andra system kan kräva olika parametrar för tillräcklig signal-till-brus-optimering.
Celler är extremt känsliga för tid och temperatur. När den experimentella proceduren har börjat, är skonsam hantering viktigt att undvika celldöd. Särskilda logistiska åtgärder kan vidtas för att påskynda processen och undvika tid misstag inklusive beredskap arbetsstationen, vilket gör att all utrustning fungerar, och planera ut målen för experimentet i förväg. Det är idealiskt att använda celler inom 30 minuter för skörd, och i vårt system, är detta protokoll utförs inom 20 minuter. När tekniken behärskas, särskilt transfektion optimering och fingerfärdighet av övningen själv, detta experiment kan användas för att jämföra olika konstruktioner mot varandra, generera dos-reResponse kurvor, och sensorn kan expanderas till fullängds-G-protein.
Även om FRET sensor som används här är en unik utveckling i GPCR FRET sensorer, är detta specifika experimentuppställning detaljerat som en väldefinierad analys för genomförandet av sensorn. Fluorometern baserad analys gör en stor population av celler som skall bedömas i varje experiment och inte är beroende av renat protein eller membran preps, därför att upprätthålla en in vivo miljö. Denna experimentella designen har också optimerats för att upptäcka mycket små förändringar som ses i systemet vid agoniststimulering av GPCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande intressen.
Acknowledgments
RUM har finansierats av American Heart Association Pre-doktorand (14PRE18560010). Forskningen har finansierats av American Heart Association Scientist Development Grant (13SDG14270009) & NIH (1DP2 CA186752-01 & 1-R01-GM-105.646 till 01-A1) SS
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B2-AR-10 nm-Gas peptide sensor | Addgene | 47438 | https://www.addgene.org/Sivaraj_Sivaramakrishnan/ |
| GeneJET Plasmid Miniprep Kit | Fermentas/Fisher Sci | FERK0503 | Elute in 2 mM Tris elution buffer |
| HEK-293T-Flp-n cells | Life Technologies | R78007 | |
| Trypsin (0.25%) | Life Technologies | 25200056 | |
| DMEM- high glucose | Life Technologies | 11960-044 | Warm in 37 °C water bath before use |
| FBS, certified, Heat inactivated, US origin | Life Technologies | 10082147 | |
| Glutamax I 100x | Life Technologies | 35050061 | |
| HEPES | Corning | MT25060CL | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | Reduced serum media; Bring to RT before use |
| XtremeGene HP transfection reagenet | Roche | 6366236001 | Highly recommended for its consistency. Bring to RT before use |
| FluoroMax 4 | Horiba | Use with FluorEssence V3.8 software | |
| 3-mm path length quartz cuvette | Starna | NC9729944(16.45F-Q-3/z8.5) | May require cuvette holder/adaptor for use in Fluorometer, available from Starna |
| Sc100-S3 Heated Circulating water bath pump | Fisher Scientific | 13-874-826 | Warm to 37 °C before use |
| Thermomixer Heat Block | Eppendorf | 22670000 | Warm to 37 °C before use |
| Ultrapure DNA/RNAse free water | Life Technologies | 10977015 | Use at RT |
| D(+)-glucose, anhydrous | Sigma | G5767 | |
| aprotinin from bovine lung | Sigma | A1153 | |
| leupeptin hemisulfate | EMD | 10-897 | |
| L-ascorbic acid, reagent grade | Sigma | A0278 | |
| (-)-isoproterenol (+)-bitartrate | Sigma | I2760 | Use fresh aliquot each experiment |
References
- Malik, R. U., et al. Detection of G Protein-selective G Protein-coupled Receptor (GPCR) Conformations in Live Cells. J. Biol. Chem. 288, 17167-17178 (2013).
- Oldham, W. M., Hamm, H. E. Heterotrimeric G protein activation by G-protein-coupled receptors. Nat. Rev. Mol. Cell Bio. 9, 60-71 (2008).
- Rasmussen, S. G., et al. Crystal structure of the β2 adrenergic receptor-Gs protein complex. Nature. 477, 549-555 (2011).
- Alexander, N. S., et al. Energetic analysis of the rhodopsin-G-protein complex links the α5 helix to GDP release. Nat. Struct. Mol. Biol. 21 (1), 56-63 (2014).
- Conklin, B. R., Farfel, Z., Lustig, K. D., Julius, D., Bourne, H. R. Substitution of three amino acids switches receptor specificity of Gqα to that of Giα. Nature. 363, 274-276 (1993).
- Conklin, B. R., et al. Carboxyl-Terminal Mutations of Gqα and Gsα That Alter the Fidelity of Receptor Activation. Mol. Pharmacol. 50, 855-890 (1996).
- Onaran, H. O., Costa, T. Where have all the active receptor states gone. Nat. Chem. Bio. 8, 674-677 (2012).
- Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M.
- Lohse, M. J., Nuber, S., Hoffman, C. Fluorescence/bioluminescence resonance energy transfer techniques to study G-protein-coupled receptor activation and signaling. Pharmacol Rev. 64 (2), 299-336 (2012).
- Vilardaga, J. P., Bünemann, M., Krasel, C., Castro, M., Lohse, M. J. Measurement of the millisecond activation switch of G protein-coupled receptors in living cells. Nat. Biotechnol. 21, 807-812 (2003).
- Bünemann, M., Frank, M., Lohse, M. J. Gi protein activation in intact cells involves subunit rearrangement rather than dissociation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (26), 16077-16082 (2003).
- Stumpf, A. D., Hoffman, C. Optical probes based on G protein-coupled receptors - added work or added value. Brit. J. Pharmacol. 173, 255-266 (2016).
- Sivaramakrishnan, S., Spudich, J. A. Systemic control of protein interaction using a modular ER/K α-helix linker. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108, 20467-20472 (2011).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat. Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
