Abstract
Fӧrster共鳴エネルギー移動（FRET）の研究はGPCRシグナル伝達の研究においてますます一般的になっているベース。我々の研究グループは、アゴニスト刺激の後に生細胞にGαサブユニットとのGPCRとの相互作用を検出するために、分子内FRETセンサーを開発しました。ここでは、詳細以前に1を特徴とするβ2アドレナリン受容体および100μM塩酸イソプロテレノールで処理するとのGαsC末端ペプチドとの間のFRETの変化を検出するためのプロトコル。私たちのFRETセンサーは、全長GPCR、FRETアクセプターフルオロフォア（mCitrine）の直列からなる単一のポリペプチドである、ER / K SPASM（系統的なタンパク質親和性の強度変調）リンカ、FRETドナーフルオロフォア（mCerulean）、およびGαC末端ペプチド。このプロトコルは、詳細細胞調製物、トランスフェクション条件、機器の設定、分析の実行、およびデータ解析します。この実験設計は、小さなCHを検出し、アンジェFRETにおけるタンパク質 - タンパク質相互作用を示し、また、リガンドとGPCR-Gタンパク質のペアの両端の相互作用の強さを比較するために使用することができます。我々の測定の信号対雑音比を向上させるために、このプロトコルは、すべてのステップで高め精度を必要とし、再現可能な実行を可能にするためにここに提示されています。
Introduction
Gタンパク質共役受容体（GPCR）は、7回膜貫通型受容体です。ヒトゲノムだけでは、光、臭気物質、ホルモン、ペプチド、薬物および他の小分子を含む種々のリガンドによって活性化されたGPCRをコードする約800の遺伝子が含まれています。市場ターゲットのGPCRで現在のすべての医薬品の約30％は、彼らは多くの疾患状態2に大きな役割を果たしているため。この受容体ファミリーで行わ広範な仕事の何十年にもかかわらず、特にGPCR-エフェクターの相互作用を駆動する分子メカニズムに関して、フィールドで大幅な未解決の問題が残っています。現在までに、唯一の高解像度の結晶構造は、β2アドレナリン受容体（β2 -AR）およびGタンパク質3との間の相互作用への洞察を提供し、公開されています。一緒に過去30年間で大規模な調査では、この中で重要である一つの特定の構造コンポーネントを繰り返します相互作用：GαサブユニットのC末端。この構造は、GPCR 4及びGタンパク質選択5-6によって、Gタンパク質活性化の両方のために重要です。したがって、GαC末端は、GPCRのリガンド刺激と選択的Gタンパク質活性化の間の重要なリンクを提供します。
過去10年間の研究では、GPCRは、GPCRの立体配座のリガンド結合安定化のサブセットで、広範なコンフォメーションの風景を取り込むことを示唆しています。結晶学、NMRおよび蛍光分光法、および質量分析を含むいくつかの技術は、GPCRの立体配座風景を調べるために利用可能であるが、エフェクターの選択7での機能的意義を解明するアプローチの不足があります。ここでは、Gタンパク質の選択的GPCRコンフォメーションを検出するFӧrster共鳴エネルギー移動（FRET）ベースのアプローチを概説します。 FRETは、発光（ドナー）Aを重複して2つのフルオロフォアの近接性と平行な向きに依存していますND励起（アクセプター）スペクトル8。ドナーおよびアクセプターフルオロフォアは、コンフォメーションのタンパク質の変化またはタンパク質-タンパク質相互作用のいずれかの結果として互いに近くに来るように、それらの間のFRETが増加し、方法8の範囲を使用して測定することができます。 FRETベースのバイオセンサーは、GPCRフィールド9で広く使用されています。これらは、第三の細胞内ループ、およびGPCRのC末端にドナーとアクセプターを挿入することによって、GPCRにおけるコンホメーション変化を調べるために使用されてきました。センサーは別々 FRET対10でGPCRおよびエフェクター（Gタンパク質サブユニット/アレスチン）を標識することにより、GPCRとエフェクターとの相互作用を調べるために設計されています。いくつかのセンサは、Gタンパク質11の立体構造変化を検出します。これらのバイオセンサーは、コンフォメーションGPCRの変化やエフェクター、GPCR-エフェクターの相互作用動態、およびアロステリックリガンド12を含む未解決の質問の多くを尋ねるために、フィールドを有効にしています。私たちのグループアゴニスト主導の条件の下でGタンパク質に特異的GPCRの立体構造を検出することができるバイオセンサーを作成する際に特に興味がありました。このバイオセンサーは、（系統的なタンパク質親和性の強度変調）13 SPASMという名前の最近開発された技術に依存しています。痙攣テザリングそれらの有効濃度を制御するER / Kのリンカーを用いて、タンパク質ドメインの相互作用を含みます。フルオロフォアのFRETペアを有するリンカーに隣接する蛋白質12との間の相互作用の状態を報告することができるツールを作成します。以前に1 SPASMモジュールはGPCRにGαC末端テザーとFRETフルオロフォアとの相互作用をモニターするために使用された、mCitrineは（その一般的に知られている変異体、黄色蛍光タンパク質（YFP）、励起/発光ピークにより、このプロトコルで言及します励起/発光ピーク475分の430 nm）を（その一般的に知られている変異体シアン蛍光タンパク質（CFPによりこのプロトコルで呼ばれる）525分の490 nm）をmCerulean。 N末端からC末端へ、T彼の遺伝的にコード化された単一のポリペプチドが含まれています：全長GPCRは、アクセプター（mCitrine / YFP）のFRET、10 nmのER / Kリンカ、FRETドナー（mCerulean / CFP）、およびGαC末端ペプチド。本研究では、センサは、GPCR-リンカー長-Gαペプチドと略記されています。すべてのコンポーネントは、各ドメインの自由な回転を可能にする非構造化（のGly-Serで-Glyを）4リンカーによって分離されています。このようなセンサの詳細な特徴は、以前に2原型のGPCRを用いて行った：2 -ARとオプシンβ1。
このセンサは、一過性リガンドの存在下または非存在下でのHEK-293T細胞毎秒カウントの任意の単位におけるFRETペアの蛍光ベースの生細胞実験測定蛍光スペクトル（CPS）にトランスフェクトします。これらの測定は、フルオロフォア（YFP 最大 / CFP 最大 ）の間のFRET比を計算するために使用されます。 FRETの変化（ΔFRET）を、平均FRET比を減算することによって計算されますリガンド処理されたサンプルのFRET比からの未処理のサンプル。 ΔFRETは（β2 -AR-10nmのペプチドなし対β2 -AR-10 NM-のGαsペプチド）の構築物間で比較することができます。ここでは、詳細、ライブHEK-293T細胞において、これらのセンサを表現し、その発現を監視し、設定、実行、および薬物処置条件に対する未処理のための蛍光ベースの生細胞のFRET測定の解析するためのプロトコル。このプロトコルは、100μMイソプロテレノール酒石酸水素で処理したβ2 -AR-10、NM-のGαsペプチドセンサに特異的であるが、異なるGPCR-Gαペアおよびリガンドのために最適化することができます。
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Protocol
1. DNAの準備
- 設計のセンサは、モジュール式クローニングスキームを用いて構築します。以前に1に詳述β2 -ARセンサ設計を参照してください。
- 1.9、260 / 2.0の230 - - 2.29、260 / 1.7の280を商業ミニプレップキットプロトコルに従ってDNAを調製し、濃度≥で、2 mMトリスHCl溶液、pHを8に750 ngの/μLを溶出します。
2.細胞培養の準備
- 培養HEK-293T-のFlp-nは37で、10％FBS（熱不活性化）（v / v）を、1％L-グルタミンサプリメント、20mMのHEPES、pH7.5で補充さ4.5グラム/ LのD-グルコースを含有するDMEM中の細胞5％CO 2の加湿雰囲気中でC°。後続のステップのための生物学的安全フード内で細胞を処理します。
- 細胞は6ウェルディッシュに継代する前に、コンフルエントな単層に成長することを可能にします。密集度を達成するための時間は、最初のプレーティング密度に依存します。そのプレートを使用6ウェルメッキにメッキの2日 - 1内の密集度に来ます。コンフルエント10cmの組織培養処理皿は、約4×10 6細胞/ mlの細胞密度を有します。細胞培養増殖の画像については、 図1を参照してください。
- 10ミリリットルのPBSで細胞を洗浄し、0.25％トリプシンでトリプシン処理（ディスカッション、第2項を参照してください）。組織培養処理6ウェルディッシュ中の培地2ml中のウェルプレート8×10 5細胞/ 16のために接着させる- 20時間。
3.トランスフェクション条件
- （ - 36〜20時間の間に）最適な発現を達成するために、時間の異なる量を必要とするかもしれない構築物についてトランスフェクションをずらします。統一された実験の時間のための条件を同期します。また、トランスフェクトしていない対照ウェルでの同等の細胞密度が分析中に、バックグラウンドノイズと散乱減算のために使用しなければなりません。
- 減少血清培地、DNA、トランスフェクション試薬：室温にトランスフェクション試薬を持参してください。
- で生物学的安全フードは次の順序で滅菌マイクロチューブに試薬を結合：100μlの低血清培地で2μgのDNAを混ぜます。混合物の表面またはチューブの側面に触れることなく、メディア/ DNA混合物へのトランスフェクション試薬の6μlのスパイク。ウェル当たり1トランスフェクション反応を設定します。一貫した発現レベルを達成するために（トランスフェクション試薬6μlの - - 3は、DNAの4μgの1）をトランスフェクション条件を最適化することができます。より最適化された比率については、 表1を参照してください。
- 30分 - 15のための生物学的安全フード内で室温で混合物をインキュベートします。放置すれば30分以上インキュベートし、反応を使用しないでください。
- 全体で十分に滴下様式で細胞への反応を加え、穏やかに完全な混合を確実にするために、6ウェルを振ります。ウェルあたり1の反応を追加します。
- 発現の20時間後、組織培養蛍光顕微鏡を用いて蛍光をモニターします。 40Xでの細胞内の10倍の対物レンズおよびタンパク質局在化と人口の発現を評価します。 OBS原形質膜（PM）におけるタンパク質の発現のためにerve。かなりの内在化が指摘されている場合は有意な発現がPMで検出されるまで、トランスフェクションを監視します。
4.試薬や機器の準備
- -80℃で100mMの薬物株式や店舗を準備します。イソプロテレノール酒石酸水素塩（300 mMのアスコルビン酸を含むのdH 2 O中の100mM）。直ちに低温室、およびフラッシュ凍結に/氷の上で行います。アリコートを作製し、1年まで使用することができます。
- セルバッファ（〜2ミリリットル/条件）を準備し、37℃の水浴中に保管してください。毎日新鮮ください。セルバッファの構成要素のための参考表2。
- 医薬品バッファ（10ミリリットル）を準備し、常温で保存。医薬品バッファ構成のためのリファレンス表2。
- 濃HClを用いて、酸洗浄キュベット。弱塩基（1 M KOH）で中和し、そして十分の dH 2 Oでキュベットを洗います
- いくつかで蛍光光度計の周りにワークステーションを準備10、200、1000μlのピペットチップ、超純H 2 Oで10分のカウントダウン、キュベット洗浄のためのヒント、繊細なタスクワイプでアクセス真空ライン、および噴霧ボトルに設定されたタイマーの箱
- 37°Cに蛍光光度計や熱ブロックの外部水浴を加熱します。
- 蛍光光度計をオンにします。 430nmで、帯域8nmのを励起するためにCFPコレクションの蛍光収集プログラムを設定します。放射範囲を450nm - 600nmで、帯域4nmで。 600nmで、帯域4nmの-のみセンサ制御などYFP収集のために（ 説明を参照）を490nm、バンドパス8nmで、照射範囲500に励起を設定します。 CFP収集設定は、この実験におけるFRETスペクトルを取得するために使用されます。
- 下の図2に示すように、ヒートブロックで12 1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブを置きます。これらの管は、細胞アリコート管用のホルダーです（500μlのマイクロ遠心チューブ。）ここに配置されたキュベットを緩和するホルダー1および図7に組織の小片を置きます。
注意：未処理の状態と交差汚染を防止するための薬剤の条件に対して個別のキュベットを使用してください。
図2. マイクロチューブを設定し、未処理試料のための熱ブロックキュベットにおける位置指令ポジション1です。細胞アリコート管は2位にある - 薬剤処理した試料6.キュベットは7位です。細胞アリコート管は位置にある8 - 12 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
- ミニ37℃の水浴を作成するための水〜750μlの12から6と8 - ホルダー2を入力します。
- ミニ水浴（ - 6、8から12ホルダー2）への細胞のアリコートのための10500μlをマイクロ遠心チューブを置きます。各チューブは、条件（5 untreateの個々の繰り返しになりますD、処理された5薬剤）。
- 発現のために細胞を監視する（ステップ3.6を参照してください）。
5.実験とデータ収集
図3.実験模式図。実験のセットアップおよび実行するための詳細な段階的なガイド。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
- 実験の模式のための参考図3。細胞は、蛍光顕微鏡で検出されたタンパク質の発現に基づいて、収穫する準備ができたときは（ディスカッション、第4項を参照してください）：生物学的安全フード内で、優しくP1,000とその文化の中で〜1メディアのミリリットル、再懸濁細胞を除去し、再懸濁を転送1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブに。
注：それはN末端を消化し、得るようなトリプシンを使用しないでください/またはGPCRセンサーの結合ポケット。 - 再懸濁に適切な細胞密度を確保するために、細胞を数えます。 4×10 6細胞/ mlのために再懸濁容積を最適化します。
- 3分間、室温で290×gでのスイングバケット遠心機で細胞をスピン。遠心分離後、上清を取り除きます。
- GENTLY（37℃で保存）1ミリリットルセルバッファに細胞を再懸濁し、ステップ5.3を繰り返します。第2のスピンの間、-80℃から100 mMの薬剤ストックのアリコートを収集します。 1 mMの作業ストックのための薬剤の緩衝液中で100倍希釈し、RTで続ける：1にします。
- 2回目の遠心分離後、セルバッファ（4×10 6細胞/ ml）の1ミリリットルで上清と穏やかに再懸濁細胞を除去します。ブランクとして、細胞の1ミリリットルとセルバッファの1ミリリットルを使用して、分光光度計のサンプルの測定のOD 600。使い捨てのプラスチック製キュベット内の細胞を分配し、すぐに分光光度法以下のマイクロ遠心チューブに戻って転送します。
- コントロールトランスフェクトされていないセルの場合リットル条件スペクトル、静かにキュベットに細胞の90μlを添加し、励起430 nmのバンドパス8nmで、放射450でFRETスペクトルを取得、P1,000のピペットで1ミリリットルセルバッファ内の非トランスフェクト細胞を再懸濁 - 600 nmのバンドパス4nmで。細胞の新鮮な90μlの5リピートスペクトル - 3を収集します。サンプル間の超純H 2 Oでキュベットを、スペックの間、37℃で細胞の株式を保持し、各試料アリコートの間P1,000で穏やかに再懸濁し、すすぎます。
- ヒートブロックで12から6、8 - 実験条件、保有者2の500μlの管のそれぞれに一定分量トランスフェクトされた細胞の90μLをください。静か各アリコート間P1,000ピペットを用いて細胞のストックを再懸濁します。
- 未処理の条件サンプルについて6 - 細胞は、等分された後、2をチューブに薬物緩衝液10μlを追加します。
- 、チューブ8内に1 mMの薬溶液10μlを添加することにより、実験を開始し、10分からカウントダウンするタイマーを開始し、優しくP200のピペットでチューブを混ぜます。 37に近い管とリターンCのヒートブロック°。
- すぐに、チューブ2をピックアップP200（新しいチップを使用）で軽く混ぜ、未処理状態のキュベットに細胞懸濁液90μlを添加し、蛍光光度計で場所。
- 600nmで、帯域を4nm - 励起430 nmのバンドパス8nmで、放射450でのFRETスペクトルを取得。
- 10秒、1 mMの薬物溶液の10μlのチューブ9スパイク、静かに（新しいチップを使用）P200と混合し、ヒートブロックにチューブを戻す - 9分で。
- チューブ10とチューブ3と5.12と5.11 - を繰り返して、5.10を繰り返します。
- スペクトルは、すべての未処理の状態のサンプルのために収集され、そして薬物はすべての薬物条件試料に添加されるまで、（ など 8時10分、7時10分）1分間隔で5.13 -を繰り返して、5.10を繰り返します。交差汚染を防止するために、各ピペットのステップのための新たなヒントを使用してください。
- 5分で - 10秒、蛍光光度計で薬剤処理した試料と場所のために別々のキュベットに細胞懸濁液90μlを添加、P200ピペットで穏やかにチューブ8（薬物条件）を混合始めます。
- Fを買収RETスペクトル（設定のためのステップ5.11を参照してください）。
- 残りの薬物条件サンプル（ - 12チューブ9）のための1分間隔（4時10分、午前3時10分など ）で5.16 -を繰り返して、5.15を繰り返します。
- 実験が終了した後、次の条件のために超純H 2 O、および再入荷チューブとキュベットを洗う徹底的に、プロジェクトファイルを保存します。洗浄ステップでクロスコンタミネーションを防ぐために注意してください。 H 2 Oのボトルにだけでなく、洗浄の間に真空ラインで先端を変更します。
6.データ解析
- 分析に使用されるSPC形式のデータファイルを保存してエクスポートします。解析プログラムはSivaramakrishnanラボ公開Webサイトからダウンロードできます。
- 分析プログラム（V9、V15）、トランスフェクトしていないサンプルファイル（非トランスフェクト細胞のスペクトル収集のためのステップ5.6を参照）、出力データファイル、およびデータ入力用のカンマ区切り値（CSV）ファイルを含む解析ソフトウェアのパスファイルを作成します。
- 次の情報を入力します。CSVファイルに含めて、各サンプルについて各条件（ 表3のサンプルを参照）と指定します。
ファイル名 - 個々のSPCグラフファイル
受容体- GPCR構築物は試験した指名（ 例えば、Β2）
バインダー-構造物のペプチド変異体を試験した指名（ 例えば 、S）
アゴニスト - （N）を、未処理の指定または薬物処置（D）条件
ディレクトリ - 通常、日付が主催SPCファイルが保存されているパスフォルダ、
OD - 分光光度計からのサンプルの記録光学密度 - サンプルからのバッファと散乱ノイズを減算するトランスフェクトしていないサンプル（ステップ5.6）のファイル名を入力します。
- 解析プログラムに条件を入力します。
- 個々の条件（V9）内の条件（V15）を横切ってサンプルを分析するために実行するプログラム。
- INDIVIのOD値を増加または減少させることによって、データセット内の見かけ上の外れ値であるサンプルファイルを除外、または減算を調整デュアルファイル。
- （525ナノメートル/ 475 nm）を算出したFRET比にアクセスするための出力ファイルにエクスポートしたデータを。
- 処理された（薬物）の条件のために、個々のFRET比から未処理の状態の平均FRET比を減算することによりΔFRETを計算します。
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Representative Results
実験の一般的な概略図が設定と実行は、図3に詳述されています。
センサの狭いダイナミックレンジのFRETの変化を検出するためには、に接着され、システムのニュアンスに付着することが重要です。細胞質は、タンパク質の発現と同様に、サンプリングの一貫性に不可欠である。 図1を 6ウェルメッキと凝集したパターンで成長しているトランスフェクション、図1（a）は 、細胞に最適な一貫性の単層（10X）に成長している培養細胞の画像を提供しています一貫性のメッキには推奨されない樹状形状図1（b）にまでそのリード。トランスフェクション条件はまた、再現可能な発現を達成するために最適化することができます。いくつかの条件は、ここで使用し、推奨トランスフェクション試薬用に最適化されている。 表1の詳細減少血清培地のためのこれらの条件は。 DNA、およびトランスフェクションレア紳士の比率。
一旦全てのデータが収集され、データを分析した（ 表3のサンプルを参照）CSVファイルに入力された、 図4に示した生FRETスペクトルデータに似ている生成された結果は、（a）及び正規化、平均FRETスペクトル図に示します図4（b）。 図4では赤いスペクトルは、未処理試料と青のある薬剤処理されたサンプルです。 図（a）は4で生FRETスペクトルのすべてが（ すなわち 、450nmでのCPSは、475 nmでのCPSと比較して）整合性のあるデータ分析のために十分な信号対雑音比の範囲を有します。この範囲では、スペクトルはより滑らかであり、サンプルからの水のピークは、（ラマンピークが500nmである）も最小です。低い発現レベルは、データ分析を妨害顕著水ピークをもたらします。データは（ 図4（b））は 1.0に、この値のCPSを設定し、475 nmで正規化されています。 β2 -ARについては、このデータセットでは-10 NM-のGαsペプチドセンサー、（赤）未処理および処理（青）のサンプル間の読み525 nmでの重要な変更があります。 ΔFRETの変化は、これらのデータ・セットのFRET比（525nmの/ 475 nm）でから計算し、出力ファイルを介してアクセス可能ですされています。
タンパク質の発現が低い場合、 図5に示すように、スペクトルは、騒々しい表示される。このため、図4（a）は信号対ノイズ範囲を図に比べて悪いトランスフェクション効率、または蛍光読取用キュベットの低い細胞密度があります。この低い発現レベルは、生データ図5に見られるギザギザのスペクトル（a）のに寄与し、しかしデータがタイトとなることが可能である4×10 5のCPS 最大で、1.6 -データセットは、約1.0理想的ではありません正規化された図5（b）に 。水ピーク（〜500 nm）は、データ・セットは、 図5（b）は、この元の図完全に間に並んでいませんが、perimentまだ分析のために使用可能である。 図6は、分析のために不十分である実験の代表です。一方、信号対雑音サンプルの約2 - 3処理用（青色）および未処理（赤色）のサンプル、サンプルを横切るキュベット中の細胞密度が低すぎる（1×10 5の450 nmの値）は、 図6（ A）。これは、バックグラウンド除去および正規化図6（b）及び整列しないスペクトルの問題を作成します。減算は、表3にODを増加または減少させることによってサンプルのために調整することができる。しかし、低細胞密度で、水ピーク（〜500 nm）は非常に大きく、騒々しい、図6（c）になり、さらなる分析から、このデータセットを阻害します。
培養細胞増殖の図1例。単層で増殖する細胞（A）一貫性のあるメッキおよびトランスフェクションに最適です。塊にまたは樹状パターンと一緒に成長するように見える細胞は、（b）は悪いトランスフェクション効率を表示することができ、FRETスペクトルの振幅の不整合を作成することができ、6ウェルに一貫プレートれない場合があります。スケールバー=100μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
β2 -AR-10nmののGαsペプチド±医薬品 については、図4の代表的なデータ解析 。生データの代表画像 （a）及び正規化、平均化データ（B）未処理（赤色）のサンプルと処理された（青色）とβ2 -AR-10、NM-のGαsペプチドセンサで収集の100μMのイソプロテレノール酒石酸水素で5分間のインキュベーション後amples。 475 nmで、525 nmのYFP の最大発光時CFP 最大発光 。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
生および正規化されたデータと悪いタンパク質発現の図5.分析。ノイズの多い生データスペクトルは、（a）は、低い発現レベル、サンプルあたりの低細胞密度、および/ または構造物の貧弱なトランスフェクション効率の結果です。 （b）は正規化として、それは理想的ではないが、このデータセットは、まだ解釈である。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
生と蛍光光度計キュベット中の低細胞密度の図6.解析と正規化されたデータを設定します。生データで見られるサンプルあたりの低細胞密度は、（a）は、水/背景差分（B、C）を複雑にし、このデータセットは解釈不可能になります。 してくださいこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| 調子 | 0.5倍 | 0.7X | 1倍 | 2倍 | 2倍* |
| DNA | 1μgの | 1.4μgの | 2μgの | 4μgの | 4μgの |
| 低血清培地 | 100μlの | 70μlの | 100μlの | 100μlの | 200μlの |
| トランスフェクション試薬 | 3μlの | 4.2μlの | 6μlの | 6μlの | 12μlの |
| *注：非常に困難な構造物にもおすすめ。この条件は、高い細胞死を誘導するよう注意は、注意しなければなりません。 | |||||
表1トランスフェクション条件。この表は、推奨されるトランスフェクション試薬を用いて、HEK-293T細胞を2mlのウェルにトランスフェクションのための試薬 の最適化された条件を含みます。
| セルバッファ | ||
| ボリューム | 試薬 | 注釈 |
| 9ミリリットル | 超純DNアーゼ/ RNアーゼを含まない水 | |
| 1ミリリットル | HBS（10倍）、pH7.4の、4°Cで保存： | |
| 200mMのHEPES | ||
| 50のKCl | ||
| 450 mMのNaClを | ||
| 20 mMのCaCl 2を- H 2 O | ||
| 10のMgCl 2 - H 2 O | ||
| 100μlの | 20％D-グルコース | |
| 15μlの | アプロチニン（ の dH 2 O中1mg / ml）を | 劣化を防ぎます |
| 15μlの | ロイペプチン（ の dH 2 O中1mg / ml）を | 劣化を防ぎます |
| 100μlの | アスコルビン酸（ の dH 2 O中の100mM）* | アゴニストを安定させます |
| *アッセイを開始する直前に追加 | ||
| 医薬品バッファ | ||
| ボリューム | 試薬 | 注釈 |
| 9ミリリットル | 超純DNアーゼ/ RNアーゼを含まない水 | |
| 1ミリリットル | HBS（10倍）、pH7.4の、4°Cで保存： | |
| 200mMのHEPES | ||
| 50のKCl | ||
| 450 mMのNaClを | ||
| 20 mMのCaCl 2を- H 2 O | ||
| 10のMgCl <サブ> 2 - H 2 O | ||
| 100μlの | アスコルビン酸（ の dH 2 O中の100mM）* | アゴニストを安定させます |
| *アッセイを開始する直前に追加 | ||
表2 のバッファ成分。このテーブルには、実験で使用するためのセルバッファ医薬品バッファの両方を作るために使用される試薬を詳しく説明します。新鮮な両方のバッファ実験のそれぞれの日を作ります。室温で37℃での店舗のセルバッファ、医薬品バッファ。
分析のための表3のサンプルCSVファイル。このサンプル・データ・ファイルは、1つの実験の後に設定されたエントリを強調表示します。複数の実験は、同じCSVファイルに入力することができ、必要に応じて「添加剤」列の下に識別することができます。各行は、次の情報を記入する必要があります。
ファイル名-個々のSPCグラフファイルの受容体-指名GPCR構築物が試験された（ 例えば 、Β2）
バインダー-構造物のペプチド変異体を試験した指名（ 例えば、S）
アゴニスト - （N）を、未処理の指定または薬物処置（D）条件
ディレクトリ - 通常、日付が主催SPCファイルが保存されているパスフォルダ、
OD - 分光光度計で試料の光学密度を記録しました
この表の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
このシステムにおけるFRET測定の緊密なダイナミックレンジは、このプロトコルのすべてのステップで敏感な品質管理の必要性を強調しています。成功したFRET実験を確保するために最も重要なステップは、アッセイの実行中に1）細胞培養、2）トランスフェクション3）タンパク質発現および4）タイムリー、正確なコーディネートです。
細胞の健康やメンテナンス/めっきの品質は、それが不可能FRETの任意の一貫した変化を検出するために作ることができる実験系と貧しい細胞の健康の信号対雑音に重大な影響を与える可能性があります。これは、細胞株、取り扱い、および培養条件に基づいて変化し得るが、保存的に、細胞は、約20継代のために健康です。細胞が困難コンフルエント単層として成長させる、またはそれ以上の樹状パターンに一貫して成長を開始する（（b）は、図1を参照）した後、実験的なバックグラウンドノイズが悪影響を受けます。ルーチンメディ含め慎重な細胞の維持、メンテナンスプレートから非接着細胞及び破片を除去し、定期的に変更とは、6ウェルめっき及びトランスフェクションのための細胞の質を高めます。悪トランスフェクション効率に影響を与える細胞塊は、効果的にメンテナンスプレートのトリプシン処理により個々の細胞に分離することができる：37で、場所皿を、30秒間、10ミリリットルの0.25％トリプシンで10センチメートルにコンフルエント料理を扱うトリプシンを除去するが、約200μLを残します3分- 2℃のインキュベーター°。細胞は、非常に簡単に料理をオフに来て、凝集を受けにくいでしょう。
この実験のためのトランスフェクション工程を最適化することが重要です。効率的なトランスフェクションし、最適な発現のために80％コンフルエント - シックスウェルは、理想的には60でなければなりません。トランスフェクションするために6時間、または細胞の少なくとも70％が接着されているまで - あまりにも少数の細胞が付着している場合（<60％）、約2を待ちます。過剰コンフルエントである六ウェル（> 80％）は、トランスフェクション効率を低下させます。下でトランスフェクション細胞集密度は、細胞死の速度を増加させます。 DNA濃度及び純度は（ステップ1.2参照）も重要です。低濃度および/ または低品質のDNA調製物を使用することで負、トランスフェクション条件は構造物ごとに調整することができ、トランスフェクション効率に影響を与える詳細については、 表1を参照してください。
組織培養蛍光顕微鏡を使用して、タンパク質発現の正確かつ一貫性の監視は、このプロセスにおける別の重要なステップです。このステップは、個々の判断の対象であるが、ここでは詳述しないが、定量的に経時的発現をモニターするために、例えば、顕微鏡検査などの他の技術を使用することが可能です。我々は我々のシステムで正常にテストした構築物について、式は最適な発現に達するのに約18から36時間かかります。我々の経験では、この時間帯に乏しい発現を示す構築物はめったに40時間後に改善していません。私たちが公開している構築物はdegradatioの兆候を示していませんnが、しかし、これはいくつかのGPCRのために問題になることがあります。我々のアッセイでは、センサの劣化は、30時間にわたって、トランスフェクションの時点で可能です。 YFP-励起（490 nm）のスペクトルからの読み取りは525nm、およびCFP-励起（430 nm）のスペクトルからの読み取り475 nmの：センサの整合性がYFP / CFP比を用いて試験することができます。設定については、ステップ4.6を参照してください。 1.8の理想的な比率で、2.0 - 推奨YFP / CFP比は1.7の範囲です。この値は、CFP14にYFPの相対おおよそ2倍大きい明るさに依存しています。最小限の劣化と一体のセンサは、したがって、両方のフルオロフォアを含み、YFPを持っています：約2のCFP比：1。センサの品質が確認された後は、原形質膜でのタンパク質の局在化および発現を確認することが重要です。重要な細胞内発現は、タンパク質分解、内在化、またはタンパク質の継続的な人身売買のいずれかの結果である可能性があります。モニタは、発現が原形質膜で強化されているかどうかを確認するために時間をかけて構築します。次のクリティカル式の中でiCalの課題は、トランスフェクション効率です。約70％+トランスフェクション効率は、この蛍光システムにおいて十分な信号対雑音の検出のために必要です。少数の細胞がトランスフェクトされた場合、信号対雑音の量は依然として検出可能であり得るが、1つのFRET実験におけるサンプル間のはるかに少ない一貫なります。これは、システムの狭いダイナミックレンジ内で正確なデータ解析の妨げになります。発現レベルは、また、実験中に十分な信号対雑音を達成するために多大な障害を提示します。蛍光光度計により検出可能な発現レベルについて、1.5の475 nmおよび450 nmの間の信号の比率（セル散乱）は、FRETの変化を検出するのに十分である、しかし、最適な発現は、約2.0+の比率を持つことになります。参考のために、β2-ARのデータが1×10 6 CPS（475 nm）で、2.5の信号対雑音比に4×10 5 CPS（450 nm）での信号対雑音範囲内で収集されます。この比率は、variabiの量を減らすのに役立ちますまた、データ解析に影響を与えることができ、サンプル間リティ。これらの発現レベルはまた、感度と蛍光光学系の最適なアラインメントの対象となっています。他のシステムは、十分な信号対雑音の最適化のための異なるパラメータを必要とし得ます。
細胞は、時間と温度に非常に敏感です。実験手順が開始されると、穏やかなハンドリングは、細胞死を回避することが不可欠です。具体的な物流施策は、プロセスを促進し、ワークステーションを準備するなど、タイムリーな間違いを避けるため、すべての機器が正常に機能し、事前に実験の目標を計画していることを確認することに注意することができます。収穫の30分以内に細胞を使用することが理想的であり、我々のシステムでは、このプロトコルは、20分以内に実行されます。技術が習得されると、具体的には、トランスフェクションの最適化と運動自体の手先の器用さ、この実験は、互いに対して種々の構築物を比較する用量再生成するために使用することができますsponse曲線、及びセンサは、全長Gタンパク質に拡張することができます。
ここで使用されるFRETセンサーは、GPCR FRETセンサーで独自の開発であるが、この特定の実験では、センサの実装のためのよく特徴付けられたアッセイとして詳述されています。蛍光ベースのアッセイは、細胞の大集団が各実験で評価されるため、 生体内環境を維持し、精製タンパク質または膜調製物に依存しないことができます。この実験設計はまた、GPCRのアゴニスト刺激時のシステムに見られる非常に小さな変化を検出するように最適化されています。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する利害を持っていないことを宣言します。
Acknowledgments
RUMは、米国心臓協会の事前の博士フェローシップ（14PRE18560010）によって賄われていました。研究は、米国心臓協会サイエンティスト開発グラント（13SDG14270009）＆SSにNIH（1DP2 CA186752-01＆1-R01-GM-105646から01-A1）によって賄われていました
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B2-AR-10 nm-Gas peptide sensor | Addgene | 47438 | https://www.addgene.org/Sivaraj_Sivaramakrishnan/ |
| GeneJET Plasmid Miniprep Kit | Fermentas/Fisher Sci | FERK0503 | Elute in 2 mM Tris elution buffer |
| HEK-293T-Flp-n cells | Life Technologies | R78007 | |
| Trypsin (0.25%) | Life Technologies | 25200056 | |
| DMEM- high glucose | Life Technologies | 11960-044 | Warm in 37 °C water bath before use |
| FBS, certified, Heat inactivated, US origin | Life Technologies | 10082147 | |
| Glutamax I 100x | Life Technologies | 35050061 | |
| HEPES | Corning | MT25060CL | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | Reduced serum media; Bring to RT before use |
| XtremeGene HP transfection reagenet | Roche | 6366236001 | Highly recommended for its consistency. Bring to RT before use |
| FluoroMax 4 | Horiba | Use with FluorEssence V3.8 software | |
| 3-mm path length quartz cuvette | Starna | NC9729944(16.45F-Q-3/z8.5) | May require cuvette holder/adaptor for use in Fluorometer, available from Starna |
| Sc100-S3 Heated Circulating water bath pump | Fisher Scientific | 13-874-826 | Warm to 37 °C before use |
| Thermomixer Heat Block | Eppendorf | 22670000 | Warm to 37 °C before use |
| Ultrapure DNA/RNAse free water | Life Technologies | 10977015 | Use at RT |
| D(+)-glucose, anhydrous | Sigma | G5767 | |
| aprotinin from bovine lung | Sigma | A1153 | |
| leupeptin hemisulfate | EMD | 10-897 | |
| L-ascorbic acid, reagent grade | Sigma | A0278 | |
| (-)-isoproterenol (+)-bitartrate | Sigma | I2760 | Use fresh aliquot each experiment |
References
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