Introduction
Difficile Clostridium הוא אחד הגורמים העיקריים של זיהומי שלשולים אנטיביוטיים הקשורים nosocomial 1. גראם חיובי זה חיידק אנאירובי מועבר באמצעות טופס הנבג שלה באמצעות מחזור הצואה-פה. בעשור האחרון, החדשה '' המגפה '' או '' hypervirulent '' זנים (למשל BI / NAP1 / 027) גרמו לעלייה דרסטית זיהומים חדשים ושיעורי תמותה בצפון אמריקה ובאירופה 2. C. difficile מחל -associated (CDAD) הנה דלקת מעי גסת סכנת חיים עם שיעורי תמותה גבוהים 3. הסימפטומים נעו בין שלשול 4 קוליטיס pseudomembranous 5 ואת megacolon הרעיל לעתים קרובות הקטלן 6.
טיפול CDAD קשה כמו הזנים האלימים הם multidrug עמיד ושיעור ההישנות גבוה 7. באותו טיפול רגע כולל את metronidazole אנטיביוטיקה, fidaxomicin או ונקומיצין, או repetitiבמקרי vely חוזרים השתלת חיידקים בצואה. אסטרטגיות טיפוליות חדשות נדרשות 8 בדחיפות. התקדמות מסוימת זו נרשמת Bezlotoxumab נוגדנים חד שבטיים טיפולית, מיקוד הרעלן difficile ג B 9, עברה בהצלחה לאחרונה שלב III של הניסויים הקליניים ואת הוגש לאישורו עם ה- FDA ו- EMA. בנוסף, אנטיביוטיקות חדשות נבדקות כרגע בשלבים שונים של ניסויים קליניים 10.
כדי לפתח טיפול יעיל מטרות טיפוליות חדשות חייבות להיות מזוהות. שהתגלו לאחרונה C. difficile פרוטאז פרולין-פרולין endopeptidase-1 (PPEP-1; CD2830 / Zmp1; EC 3.4.24.89) הוא יעד כזה מבטיח, כמו חוסר PPEP-1 זן נוק-אאוט פוחתת ארסיות של C . difficile in vivo 11. PPEP-1 הוא metalloprotease מופרש 12,13 ביקוע השני adhesins C. difficile ב C- הסופית שלהם 13 ובכך משחרר את bacter החסידIA מן האפיתל במעי האדם. לכן, הוא עוסק בשמירה על האיזון בין פנוטיפ הנייח ו ניע של difficile ג. כדי לפתח מעכבי סלקטיבית נגד PPEP-1 ו להבין איך היא מכירה מצעים שלה ידע אינטימי של מבנה תלת-ממדי שלו היא הכרחית. פתרנו את המבנה הגבישי הראשון של PPEP-1 לבד בקומפלקס עם פפטיד מצע 14. PPEP-1 הוא פרוטאז הראשון הידוע כי אג"ח המסלקת פפטיד סלקטיבי בין שתי שאריות פרולין 15. הוא נקשר המצע באופן פעמי מפותל ומייצב אותו דרך רשת אליפטיות-ארומטיים מורחבת של שאריות הממוקמות S-הלולאה המכסה את האתר הפעיל פרוטאז 14. מצב המצע מחייב זו הנו ייחודי PPEP-1 ולא נמצא פרוטאזות אדם עד כה. זה עושה את זה יעד תרופה הבטיח, ואת מחוץ יעד השפעות של מעכבים מאוד לא סבירים.
כדי לפתח מסך סלקטיבית Inh PPEP-1ibitors בעתיד כמות גדולה של חלבון טהור monodisperse PPEP-1 הוא זקוק. יתר על כן, על מנת לקבוע את המצב של עקדת המעכבים הראשונים, מבני שיתוף קריסטל עם PPEP-1 יצטרך להיקבע. בידיים שלנו PPEP-1 מייצר גבישים intergrown כל הזמן. לכן פתחנו הליך אופטימיזציה לייצר גבישים עקיפים באיכות יחידה של PPEP-1. בפרוטוקול זה אנו מתארים בפרוטרוט את הייצור, טיהור, פתרון התגבשות ומבנה PPEP-1 14. אנו משתמשים בביטוי תאי coli Escherichia של גרסה PPEP-1 חסרת רצף אות הפרשה, כרומטוגרפיה זיקת כרומטוגרפיה הדרת גודל עם הסרת תג הטיהור, ואחריו microseeding 16 אל תוך מרקע אופטימיזציה קביעת מבנה באמצעות פיזור יחיד גל אבץ האנומלי (אבץ-SAD) 17. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לקביעת ייצור ומבנה של חלבונים אחרים (למשל </ Em> metalloproteases) ובמיוחד עבור חלבונים לייצר גבישים intergrown. על פי בקשה, פלסמיד דנ"א של המבנה (pET28a-Nhis-rPPEP-1) ונתונים עקיפים יכולים להינתן למטרות חינוכיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Genes / Vectors / cell strains | |||
| pET28a vector | Merck-Millipore | 69864 | Thrombin cleavable N-terminal His-tag |
| E. coli strain BL21 (DE3) Star | ThermoFisher Scientific | C601003 | RNase H deficient |
| Codon-optimized gene (for E. coli) of PPEP-1 (CD630_28300) | Geneart (Thermo Fisher Scientific) | custom | amino acids 27-220 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Yeast extract | any | ||
| Tryptone | any | ||
| Antifoam B | Sigma-Aldrich | A5757 | aqueous-silicone emulsion |
| Agar | any | ||
| Kanamycin | any | ||
| IPTG | AppliChem | A1008 | |
| Tris-HCl | AppliChem | A1087 | Buffer grade |
| NaCl | any | Buffer grade | |
| DNaseI | AppliChem | A3778 | |
| Imidazole | AppliChem | A1073 | Buffer grade |
| Thrombin | Sigma-Aldrich | T4648 | |
| Ammonium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 215996 | |
| Glycerol 100% | any | purest grade | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| Liquid nitrogen | any | for storage and cryocooling of crystals | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment (general) | |||
| Shaking incubator | any | providing temperatures of 20 °C - 37 °C | |
| Glassware | any | baffled Erlenmeyer flasks (50 ml - 2.8 L) | |
| Centrifuge for large culture volumes | any | centrifuge for processing volumes up to 12 L | |
| Sonicator Vibra-Cell VCX500 | Sonics | SO-VCX500 | or any other sonicator / cell disruptor |
| Ultracentrifuge | any | centrifuge providing speeds up to 150,000 x g | |
| NiNTA Superflow resin | Qiagen | ||
| Empty Glass Econo-Column | Bio-Rad | 7371007 | or any other empty glass or plastic column |
| Size exclusion chromatography column HiLoad Superdex 200 16/600 | GE Healthcare | 28989335 | |
| Chromatography system Äkta Purifier | GE Healthcare | 28406264 | or any other chromatography system |
| Dialysis tubing Spectra/Por 3 | Spectrum Labs | 132724 | |
| Dialysis tubing closures | Spectrum Labs | 132738 | |
| Ultrafiltration units (concentrators) 10,000 NWCO | any | ||
| UV-Vis spectrophotometer | any | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment (crystallography) | |||
| Low volume pipette 0.1-10 µl | any | ||
| Positive displacement pipette Microman M10 | Gilson | F148501 | |
| Crystallization robot | any | ||
| 96-well crystallization plates TTP IQ with three protein wells | TTP | 4150-05810 | or any other 96-well crystallization plate |
| 24-well CombiClover Junior Plate | Jena Bioscience | EB-CJR | |
| Crystal Clear Sealing Tape | Hampton Research | HR3-511 | |
| Siliconized Glass Cover Slides | Hampton Research | HR3-225 | |
| Commercial crystallization screens: SaltRx, Index, PEG/Ion, Crystal | Hampton Research | diverse | |
| Commercial crystallization screens: Wizard, PACT++, JCSG++ | Jena Bioscience | diverse | |
| JBS Beads-for-Seeds | Jena Bioscience | CO-501 | |
| CrystalCap SPINE HT (nylon loops) | Hampton Research | diverse | loop sizes 0.025 mm - 0.5 mm |
| CrystalCap Vial | Hampton Research | HR4-904 | |
| Cryogenic Foam Dewar 800 ml | Hampton Research | HR4-673 | |
| Cryogenic Foam Dewar 2 L | Hampton Research | HR4-675 | |
| Vial Clamp, Straight | Hampton Research | HR4-670 | |
| CrystalWand Magnetic, Straight | Hampton Research | HR4-729 | |
| CryoCane 6 Vial Holder | Hampton Research | HR4-711 | |
| CryoSleeve | Hampton Research | HR4-708 | |
| CryoCane Color Coder - White | Hampton Research | HR4-713 | |
| Scalpel | any | ||
| Straight microforcep | any | for manipulation of sealing tape. etc. | |
| Acupuncture needle | any | e.g. from a pharmacy | |
| Stereo microscope | any | for inspection of crystallization plates and crystal mounting, magnification up to 160X |
References
- Bouza, E. Consequences of Clostridium difficile infection: understanding the healthcare burden. Clin Microbiol Infect. 18 (Suppl 6), 5-12 (2012).
- O'Connor, J. R., Johnson, S., Gerding, D. N. Clostridium difficile infection caused by the epidemic BI/NAP1/027 strain. Gastroenterology. 136 (6), 1913-1924 (2009).
- Mitchell, B. G., Gardner, A. Mortality and Clostridium difficile infection: a review. Antimicrob Resist Infect Control. 1 (1), (2012).
- George, W. L., Sutter, V. L., Finegold, S. M. Antimicrobial agent-induced diarrhea--a bacterial disease. J Infect Dis. 136 (6), 822-828 (1977).
- George, R. H., et al. Identification of Clostridium difficile as a cause of pseudomembranous colitis. Br Med J. 1 (6114), 695 (1978).
- Bartlett, J. G. Narrative review: the new epidemic of Clostridium difficile-associated enteric disease. Ann Intern Med. 145 (10), 758-764 (2006).
- Kelly, C. P., LaMont, J. T.
- Ünal, C. M., Steinert, M. Novel therapeutic strategies for Clostridium difficile infections. Expert Opin Ther Targets. 20 (3), 269-285 (2016).
- Kelly, C. P., et al. The Monoclonal Antibody, Bezlotoxumab Targeting C. difficile Toxin B Shows Efficacy in Preventing Recurrent C. difficile Infection (CDI) in Patients at High Risk of Recurrence or of CDI-Related Adverse Outcomes. Gastroenterology. 150 (4), S122 (2016).
- Tsutsumi, L. S., Owusu, Y. B., Hurdle, J. G., Sun, D. Progress in the discovery of treatments for C. difficile infection: A clinical and medicinal chemistry review. Curr Top Med Chem. 14 (1), 152-175 (2014).
- Hensbergen, P. J., et al. Clostridium difficile secreted Pro-Pro endopeptidase PPEP-1 (ZMP1/CD2830) modulates adhesion through cleavage of the collagen binding protein CD2831. FEBS Lett. 589 (24), 3952-3958 (2015).
- Cafardi, V., et al. Identification of a novel zinc metalloprotease through a global analysis of Clostridium difficile extracellular proteins. PLoS One. 8 (11), e81306 (2013).
- Hensbergen, P. J., et al. A novel secreted metalloprotease (CD2830) from Clostridium difficile cleaves specific proline sequences in LPXTG cell surface proteins. Mol Cell Proteomics. 13 (5), 1231-1244 (2014).
- Schacherl, M., Pichlo, C., Neundorf, I., Baumann, U. Structural Basis of Proline-Proline Peptide Bond Specificity of the Metalloprotease Zmp1 Implicated in Motility of Clostridium difficile. Structure. 23 (9), 1632-1642 (2015).
- Rawlings, N. D., Waller, M., Barrett, A. J., Bateman, A. MEROPS: the database of proteolytic enzymes, their substrates and inhibitors. Nucleic Acids Res. 42 (Release 10.0), D503-D509 (2014).
- Bergfors, T.
- Dauter, Z., Dauter, M., Dodson, E.
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Kabsch, W.
- Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66, 213-221 (2010).
- Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K.
- The PyMOL Molecular Graphics System. , Schrödinger, LLC. (2002).
- Pettersen, E. F., et al. UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis. J Comput Chem. 25 (13), 1605-1612 (2004).
- Wang, B. C. Resolution of phase ambiguity in macromolecular crystallography. Methods Enzymol. 115, 90-112 (1985).
- McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C., Read, R. J.
- Zwart, P. H., et al. Automated structure solution with the PHENIX suite. Methods Mol Biol. 426, 419-435 (2008).
- Zheng, H., Handing, K. B., Zimmerman, M. D., Shabalin, I. G., Almo, S. C., Minor, W. X-ray crystallography over the past decade for novel drug discovery - where are we heading next? Expert Opin Drug Discov. 10 (9), 975-989 (2015).
- Rubino, J. T., et al. Structural characterization of zinc-bound Zmp1, a zinc-dependent metalloprotease secreted by Clostridium difficile. J Biol Inorg Chem. 21 (2), 185-196 (2016).
- Carson, M., Johnson, D. H., McDonald, H., Brouillette, C., Delucas, L. J.
- Gasteiger, E., et al. Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server. The Proteomics Protocols Handbook. Walker, J. M. , Humana Press. 571-607 (2005).
- Dummler, A., Lawrence, A. M., de Marco, A. Simplified screening for the detection of soluble fusion constructs expressed in E. coli using a modular set of vectors. Microb Cell Fact. 4, 34 (2005).
- Stura, E. A., Wilson, I. A. Applications of the streak seeding technique in protein crystallization. J Crys Growth. 110 (1), 270-282 (1991).
