Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

उत्पादन, क्रिस्टलीकरण और की संरचना निर्धारण Published: December 30, 2016 doi: 10.3791/55022
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Institute of Biochemistry, University of Cologne

Introduction

क्लोस्ट्रीडियम बेलगाम nosocomial एंटीबायोटिक जुड़े दस्त के संक्रमण 1 के प्रमुख कारणों में से एक है। इस ग्राम पॉजिटिव अवायवीय जीवाणु मल-मौखिक मार्ग के माध्यम से अपने बीजाणु फार्म के माध्यम से फैलता है। पिछले दशक में, नए '' महामारी '' या '' hypervirulent '' उपभेदों (जैसे बीआई / NAP1 / 027) उत्तरी अमेरिका और यूरोप में 2 नए संक्रमणों और मृत्यु दर में भारी वृद्धि के कारण होता है। सी बेलगाम -associated रोग (CDAD) उच्च मृत्यु दर 3 के साथ एक जीवन धमकी पेट के सूजन है। लक्षण दस्त 4 से 5 pseudomembranous कोलाइटिस और अक्सर घातक जहरीले मेगाकॉलोन 6 को लेकर।

CDAD का उपचार मुश्किल है के रूप में ज़हरीले उपभेदों बहुऔषध प्रतिरोधी रहे हैं और पुनरावृत्ति दर ऊंची 7 है। पल चिकित्सा एंटीबायोटिक दवाओं metronidazole, fidaxomicin या vancomycin, या repetiti में शामिलvely आवर्तक मामलों मल माइक्रोबायोटा प्रत्यारोपण। नई चिकित्सकीय रणनीतियों तत्काल 8 की जरूरत है। कुछ प्रगति चिकित्सीय मोनोक्लोनल एंटीबॉडी Bezlotoxumab रूप में दर्ज है, को निशाना सी बेलगाम विष बी 9, हाल ही में सफलतापूर्वक तीसरे चरण नैदानिक परीक्षण पारित किया है और एफडीए और ईएमए के साथ अनुमोदन के लिए दायर किया गया था। इसके अतिरिक्त, नई एंटीबायोटिक दवाओं के क्लिनिकल परीक्षण 10 के विभिन्न चरणों में इस समय परीक्षण किया जा रहा है।

प्रभावी उपचार नई चिकित्सकीय लक्ष्यों की पहचान की जानी चाहिए विकसित करने के लिए। (; CD2830 / Zmp1; PPEP -1 ईसी 3.4.24.89) ने हाल ही में सी बेलगाम प्रोटीज प्रोलाइन प्रोलाइन endopeptidase -1 की खोज की इस तरह के एक होनहार लक्ष्य है, एक नाक आउट तनाव में PPEP -1 की कमी के रूप में सी की डाह कम हो जाती है । विवो 11 में बेलगाम। PPEP-1 एक secreted Metalloprotease 12,13 उनकी सी टर्मिनस पर दो सी बेलगाम adhesins cleaving है 13 इस प्रकार पक्षपाती Bacter रिहामानव आंत उपकला से आइए। इसलिए, यह सी बेलगाम के बिना डंठल और गतिशील phenotype के बीच संतुलन बनाए रखने में शामिल है। PPEP -1 के खिलाफ चयनात्मक अवरोधकों को विकसित करने और समझने के लिए कि यह कैसे अपनी substrates पहचानता अपने तीन आयामी संरचना के गहन ज्ञान अपरिहार्य है। हम एक सब्सट्रेट पेप्टाइड के साथ 14 PPEP -1 अकेले और परिसर में की पहली क्रिस्टल संरचना हल कर दिया है। PPEP -1 पहली ज्ञात प्रोटीज है कि दो प्रोलाइन अवशेषों 15 के बीच चुनिंदा cleaves पेप्टाइड बांडों। यह एक डबल kinked ढंग से सब्सट्रेट बांध और एस-पाश है कि प्रोटीज सक्रिय साइट 14 कवर में स्थित अवशेषों की एक विस्तारित स्निग्ध खुशबूदार नेटवर्क के माध्यम से इसे स्थिर। इस सब्सट्रेट बाध्यकारी मोड PPEP-1 के लिए अद्वितीय है और आज तक मानव proteases में नहीं मिला। यह यह एक आशाजनक दवा लक्ष्य बनाता है, और बंद लक्ष्य अवरोधकों बहुत संभावना नहीं के प्रभाव।

विकसित और स्क्रीन चयनात्मक PPEP -1 INH करने के लिएibitors भविष्य में शुद्ध और monodisperse PPEP -1 प्रोटीन की एक बड़ी राशि की जरूरत है। इसके अलावा, PPEP-1 के साथ पहली निरोधक, सह-क्रिस्टल संरचनाओं के बंधन से निर्धारित करना होगा की विधा निर्धारित करने के लिए। हमारे हाथ में PPEP -1 लगातार intergrown क्रिस्टल पैदा करता है। इस प्रकार हम एक अनुकूलन प्रक्रिया PPEP -1 के एकल विवर्तन गुणवत्ता वाले क्रिस्टल का उत्पादन करने के लिए विकसित किया है। इस प्रोटोकॉल में हम विस्तार से PPEP-1 14 के उत्पादन, शुद्धि, क्रिस्टलीकरण और संरचना समाधान का वर्णन है। हम स्राव संकेत अनुक्रम, आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी और शुद्धि टैग को हटाने के साथ आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी कमी एक PPEP -1 संस्करण की कोलाई में intracellular अभिव्यक्ति का उपयोग, जस्ता एकल तरंगदैर्ध्य विषम फैलाव के माध्यम से एक अनुकूलन स्क्रीन और संरचना निर्धारण में 16 microseeding द्वारा पीछा किया (जस्ता-एसएडी) 17। इस प्रोटोकॉल अन्य प्रोटीन के उत्पादन और संरचना निर्धारण के लिए अनुकूलित किया जा सकता है (जैसे </ Em> metalloproteases) और intergrown क्रिस्टल का उत्पादन प्रोटीन के लिए विशेष रूप से। अनुरोध पर, निर्माण की प्लास्मिड डीएनए (pET28a-Nhis-rPPEP -1) और विवर्तन डेटा शैक्षिक उद्देश्यों के लिए ही प्रदान की जा सकती है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. क्लोनिंग और डिजाइन का निर्माण

  1. संकेत पेप्टाइड बिना सी बेलगाम PPEP -1 के (ई कोलाई के लिए) कोडोन अनुकूलित अनुक्रम क्लोन [अमीनो एसिड 27-220, इसके बाद पुनः संयोजक PPEP -1 नाम दिया (rPPEP -1) 11] Nde मैं का उपयोग कर pET28a वेक्टर में और Xho मैं प्रतिबंध साइटों 3'अंत (जिसके परिणामस्वरूप वेक्टर pET28a-Nhis-rPPEP -1) पर रोक के कोडोन के साथ (चित्रा 1)। यह एक थ्रोम्बिन दरार साइट शुद्धि के दौरान टैग हटाने के लिए अनुमति देता है (चित्रा 1) के साथ एक एन टर्मिनली 6xHis टैग प्रोटीन (Nhis-rPPEP -1) पैदा करता है। प्लाज्मिड चयन के लिए एक केनामाइसिन प्रतिरोध कैसेट में शामिल है। क्लोनिंग के लिए इस्तेमाल किया प्राइमरों कहीं और 14 में वर्णित हैं।

आकृति 1
चित्रा 1: निर्माण pET28a-Nhis-rPPEP -1 और एसडीएस पृष्ठ Expre के विश्लेषण के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्वssion और सभी शुद्धि चरणों। (ए) Nhis-rPPEP -1 के वेक्टर नक्शा मैं PlasMapper के साथ बनाई गई Nde मैं / Xho का उपयोग कर pET28a वेक्टर में क्लोन। (बी) Nhis-rPPEP -1 निर्माण (ऊपरी पैनल) की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व और एन टर्मिनस (कम पैनल) पर जिसके परिणामस्वरूप अतिरिक्त GSHM-अनुक्रम के साथ 6xHis-टैग की थ्रोम्बिन-दरार के बाद अंतिम निर्माण। 4 घंटा और नमूनों की (डी) सभी शुद्धि कदम (: आणविक वजन मार्कर एम) में से 37 डिग्री सेल्सियस पर BL21 (DE3) स्टार में अभिव्यक्ति की एसडीएस पृष्ठ विश्लेषण (सी)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

2. अभिव्यक्ति और rPPEP -1 की शुद्धि

  1. Nhis-rPPEP -1 की अभिव्यक्ति
    1. अप करें और आटोक्लेव पौंड (Lysogeny शोरबा) मध्यम (10 जी / एल tryptone, 5 ग्राम / एल खमीर निकालने, 10 ग्राम / एल सोडियम क्लोराइड, adjuसेंट NaOH के साथ 7.5 पीएच)। केनामाइसिन सल्फेट (50 माइक्रोग्राम / एमएल) बस से पहले उपयोग (पौंड / कान मध्यम) के साथ पूरक।
    2. पौंड / कान माध्यम में तब्दील हौसले ई कोलाई से एक 200 मिलीलीटर रातोंरात संस्कृति टीका लगाना। 220 rpm पर झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर के लिए आगे बढ़ें।
    3. अगली सुबह, रात संस्कृति के आयुध डिपो के 600 (600 एनएम तरंगदैर्ध्य पर ऑप्टिकल घनत्व) की जाँच करें। टीका लगाना दो 2.8 एल चकित एक आयुध डिपो के 600 0.1 के लिए रात में संस्कृति के साथ 1 एल पौंड / कान मध्यम प्रत्येक युक्त बोतल। अत्यधिक फोम गठन को रोकने के जलीय-सिलिकॉन पायस के तीन बूंदों के साथ अनुपूरक। आयुध डिपो के 600 0.6 तक पहुँच जाता है जब तक 180 rpm पर मिलाते हुए 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को विकसित।
    4. (600 आयुध डिपो में एक संस्कृति से 1 मिलीलीटर के बराबर = 1) एसडीएस पृष्ठ विश्लेषण के लिए एक पूर्व प्रेरण नमूना ले लो; Nhis-rPPEP -1 की अभिव्यक्ति के लिए प्रेरित करने के लिए 0.5 मिमी अंतिम एकाग्रता के लिए IPTG जोड़ें। 4 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस / 180 rpm पर बढ़ती जारी है।
    5. एक 10x di में 600 आयुध डिपो का निर्धारण करते हैंlution और (600 आयुध डिपो = 1 पर एक संस्कृति से 1 मिलीलीटर के बराबर) एक फसल नमूना ले।
    6. 7000 XG पर 20 मिनट और 4 डिग्री सेल्सियस के लिए centrifugation द्वारा कोशिकाओं को ले लीजिए। एक 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब और हस्तांतरण: (20 मिमी Tris एचसीएल, पीएच 7.5, 200 मिमी NaCl Tris बफर खारा) टीबीएस बफर 40 मिलीलीटर में संस्कृति का 1 एल से अवशिष्ट लेग माध्यम resuspend सेल छर्रों को दूर करने के लिए। -80 डिग्री सेल्सियस उपयोग करें जब तक 10,000 XG पर 10 मिनट और 4 डिग्री सेल्सियस और दुकान के लिए centrifugation द्वारा कोशिकाओं को ले लीजिए। एसडीएस पृष्ठ 18 के माध्यम से अभिव्यक्ति (कुल lysates और घुलनशील अंशों) का विश्लेषण।
  2. Untagged rPPEP -1 की शुद्धि
    1. एसडीएस पृष्ठ विश्लेषण के लिए प्रत्येक कदम शुद्धि के 50 μl नमूने ले लो। टीबीएस बफर में संस्कृति का 1 एल 10 माइक्रोग्राम / एमएल DNaseI के साथ पूरक से सेल गोली Resuspend। प्रति कोशिकाओं की जी टीबीएस / DNaseI के 5 मिलीलीटर का प्रयोग करें।
      1. Lyse बर्फ / 15 मिनट (2 सेकंड ठहराव के साथ 2 सेकंड दालों) के लिए 30% आयाम का उपयोग कर पानी पर sonication द्वारा कोशिकाओं। centr से मलबे को हटानेultracentrifuge एक ट्यूब के लिए 10,000 XG पर 10 मिनट और 4 डिग्री सेल्सियस और हस्तांतरण सतह पर तैरनेवाला के लिए ifugation। 165,000 XG और 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए एक ultracentrifuge में lysate साफ़।
    2. 4-6 डिग्री सेल्सियस पर काम करते हैं। एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप या क्रोमैटोग्राफी प्रणाली का प्रयोग टीबीएस बफर 10 मिमी imidazole पीएच 7.5 के साथ पूरक के साथ एक गिलास कॉलम में निकल nitrilotriacetic एसिड (NiNTA) राल के 2 मिलीलीटर संतुलित करना। वैकल्पिक रूप से, गुरुत्वाकर्षण प्रवाह का उपयोग करें।
      1. 10 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता के लिए 1 एम imidazole पीएच 7.5 के साथ मंजूरी दे दी lysate समायोजित करें। स्तंभ के लिए lysate लागू करें और टीबीएस बफर 10 मिमी और 30 मिमी imidazole, क्रमशः के साथ पूरक के साथ चरणबद्ध धोने, 280 पर यूवी अवशोषण एनएम आधारभूत तक पहुँच गया है जब तक।
      2. टीबीएस बफर प्लस 250 मिमी imidazole के साथ प्रोटीन Elute। 10 मिमी imidazole के साथ पूरक टीबीएस करने के लिए स्तंभ पुन: संतुलित करना और रात में दुकान।
    3. विलुप्त होने coeffi का उपयोग करके प्रोटीन एकाग्रता या तो 280 एनएम पर निर्धारित बनाने के लिएके दक्ष 25,900 एम -1 -1 सेमी या किसी अन्य विधि (जैसे ब्रैडफोर्ड विधि 19) द्वारा। प्रोटीन की मिलीग्राम प्रति थ्रोम्बिन की 2 यूनिटों जोड़ें और टीबीएस की एक 50x मात्रा (NiNTA क्षालन मात्रा के 50x) के खिलाफ 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर प्रोटीन समाधान dialyze।
      नोट: imidazole 280 एनएम पर दृढ़ता से अवशोषित कर लेता है, के रूप में प्रोटीन एकाग्रता के निर्धारण के लिए सही खाली रखना।
    4. equilibrated NiNTA राल से अधिक प्रोटीन समाधान दर्रा uncleaved प्रोटीन को हटाने के लिए। अगला, सभी cleaved प्रोटीन ठीक करने के लिए स्तंभ के लिए लागू टीबीएस का एक ही मात्रा 10 मिमी imidazole के साथ पूरक। कॉलम को साफ करने के लिए, 250 मिमी imidazole साथ सभी शेष प्रोटीन elute। एसडीएस पृष्ठ (चित्रा 1) के माध्यम से नमूनों का विश्लेषण।
    5. 4000 XG और 4 डिग्री सेल्सियस एक केन्द्रापसारक ultrafiltration इकाई का उपयोग करने पर 10 मिनट के अंतराल में 4 मिलीलीटर के लिए प्रोटीन समाधान ध्यान लगाओ। वर्षा और एकत्रीकरण को रोकने के लिए प्रत्येक अंतराल के बाद अपना ध्यान केंद्रित प्रोटीन मिश्रण। इस कदम के कभार परLy कुछ वर्षा मिक्सिंग प्रक्रिया के बावजूद rPPEP-1 के लिए मनाया जाता है।
      1. 4-6 डिग्री सेल्सियस पर (टीबीएस बफर में) एक पूर्व equilibrated आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी स्तंभ के लिए ध्यान केंद्रित प्रोटीन को लागू करें। टीबीएस बफर के साथ स्तंभ Elute, 1 मिलीलीटर भिन्न और विषय एसडीएस पृष्ठ विश्लेषण करने के लिए हर दूसरे अंश के 5 μl इकट्ठा। rPPEP-1 एक भी चोटी एक मोनोमर (चित्रा 2) के लिए इसी में elutes। कभी कभी बड़ा आणविक वजन में एक नाबालिग चोटी मनाया (अग्रिम चोटी), कि प्रोटीन का एक डिमर से मेल खाती है। उपज संस्कृति के प्रति एल शुद्ध प्रोटीन का लगभग 50 मिलीग्राम होना चाहिए। एसडीएस पृष्ठ 18 के माध्यम से सभी के नमूने (चित्रा 2) का विश्लेषण।

चित्र 2
चित्रा 2: rPPEP -1 के प्रतिनिधि आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी और एसडीएस पृष्ठ विश्लेषण। आकार अपवर्जन chromatogram (A280; शुद्ध untagged rPPEP -1 के 280 एनएम पर absorbance) 6 डिग्री सेल्सियस पर एक (16/600) Tris एचसीएल, पीएच 7.5, 200 मिमी NaCl में स्तंभ का उपयोग। क्षालन मात्रा के आधार पर, एक 22 केडीए प्रोटीन के लिए उम्मीद के रूप में rPPEP -1 migrates, सुझाव है कि यह मुख्य रूप से मोनोमेरिक है। शायद ही कभी एक नाबालिग अग्रिम चोटी है कि एक डिमर से मेल खाती है प्रकट होता है। (इनसेट) आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी से अंशों की एसडीएस पृष्ठ विश्लेषण (एम; आणविक वजन मार्कर)। हर दूसरे अंश लागू किया जाता है। मुख्य rPPEP -1 बैंड नीचे बेहोश बैंड कभी कभी मामूली दोष होने वाली के अनुरूप हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

3. क्रिस्टलीकरण और क्रिस्टल अनुकूलन Microseeding का प्रयोग

नोट: rPPEP -1 की स्थिति से क्रिस्टलीकृत कि लगातार अत्यधिक intergrown क्रिस्टल एक्स-रे विवर्तन विश्लेषण के लिए उपयुक्त नहीं उपज (चित्रा 3)। इसलिए, एक अनुकूलन रणनीति (चित्रा 4) उच्च गुणवत्ता वाले क्रिस्टल (चित्रा 5) प्राप्त करने के लिए विकसित किया गया था।

  1. RPPEP -1 की प्रारंभिक जांच वाणिज्यिक स्क्रीन का उपयोग
    नोट: मानक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध स्क्रीन और एक crystallization रोबोट का उपयोग कर बैठे बूंद प्रारूप में crystallization परीक्षण बाहर ले।
    1. / एमएल 4000 XG और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के अंतराल में एक केन्द्रापसारक ultrafiltration डिवाइस का उपयोग करने के लिए 12 मिलीग्राम शुद्ध प्रोटीन ध्यान लगाओ। वर्षा और एकत्रीकरण को रोकने के लिए प्रत्येक अंतराल के बाद अपना ध्यान केंद्रित प्रोटीन मिश्रण। 25,900 एम -1 सेमी -1 के विलुप्त होने के गुणांक का या किसी अन्य विधि (जैसे ब्रैडफोर्ड विधि) द्वारा 280 एनएम पर प्रोटीन एकाग्रता या तो निर्धारित करते हैं। 20 डिग्री सेल्सियस के लिए प्रोटीन संतुलित करना। 16,000 XG पर 10 मिनट और 20 डिग्री सेल्सियस के लिए centrifugation द्वारा दूर स्पष्ट सभी कणों और धूल।
    2. तो पहले से ही पहले से भरे क्रिस्टलीकरण प्लेटों SE उपयोगAled और 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत या हर क्रिस्टलीकरण हालत के 70 μl के साथ प्लेटों के जलाशय कुओं भरें। 20 डिग्री सेल्सियस के लिए सभी क्रिस्टलीकरण प्लेटों संतुलित करना। जल्दी से काम करते हैं, के रूप में छोटे संस्करणों जल्दी बाहर सूखी। रोबोट की गोदी के चारों ओर एक आर्द्रता चैम्बर का प्रयोग करें यदि संभव हो तो।
      नोट: SaltRx, सूचकांक, खूंटी / आयन, क्रिस्टल, जादूगर, संधि ++, JCSG ++: एक मानक प्रक्रिया के रूप में निम्नलिखित स्क्रीन का उपयोग करें।
    3. subwells 2-4 में प्रोटीन और जलाशय pipetting द्वारा स्क्रीन सेट करें। 200: 100 (subwell 2), 150: 150 (subwell 3) और 100: 200 (subwell 4) (एनएल में): ड्रॉप मात्रा 300 nl और अनुपात (जलाशय प्रोटीन) है। इसके तत्काल बाद 20 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट और एक कक्ष में जगह दिलाई।
    4. सेट-अप के बाद तुरंत ट्रे का निरीक्षण किया, और फिर पहले सप्ताह साप्ताहिक निरीक्षण के द्वारा पीछा के दौरान हर दिन का निरीक्षण किया।
  2. Ligands के साथ rPPEP -1 के सह-क्रिस्टलीकरण
    1. सब्सट्रेट पेप्टाइड rPPEP -1 परिसरों के सह क्रिस्टलीकरण के लिए मिश्रण rPPEP -124 मिलीग्राम / एक 1 में मिलीलीटर: 1 अनुपात (वी / वी) पेप्टाइड समाधान (एसी EVNPPVPD-राष्ट्रीय राजमार्ग 2) lyophilized पाउडर टीबीएस बफर में solubilized) की एक 7 गुना दाढ़ अतिरिक्त है, जो 12 के अंतिम एकाग्रता दे देंगे साथ मिलीग्राम / एमएल आर-PPEP -1 प्रोटीन और PPEP-1 से अधिक पेप्टाइड की एक 7 गुना दाढ़ अतिरिक्त। 20 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेते हैं और दूर 16,000 XG और 20 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए centrifugation द्वारा सभी कणों और धूल साफ है। क्रिस्टलीकरण के रूप में अपार आर-PPEP -1 प्रोटीन के लिए वर्णित microseeding प्रक्रिया का उपयोग कर के साथ आगे बढ़ें।

चित्र तीन
चित्रा 3: प्रारंभिक स्क्रीन से प्रतिनिधि क्रिस्टल। rPPEP-1 12 मिलीग्राम से Intergrown क्रिस्टल / एमएल हालत में हो। (ए) क्रिस्टल स्क्रीन मैं / 38 (1.4 एम सोडियम साइट्रेट निर्जलीकरण tribasic, 0.1 एम HEPES सोडियम पीएच 7.5, 200 nl: 100 NL)। (बी) SaltRx स्क्रीन / 52 (2.4 मीटर अमोनियम फॉस्फेट डीआईबीएएसआईसी, 0.1 एम Tris पीएच 8.5; 100 nl: 200 NL) और (सी) (200 nl: 100 NL)। (डी) SaltRx स्क्रीन / 96 (60% वी / वी Tacsimate पीएच 7.0, 0.1 एम बीआईएस-TRIS प्रोपेन पीएच 7.0, 200 nl: 100 NL)। स्केल बार = 0.2 मिमी। मात्रा अनुपात हमेशा प्रोटीन हैं: जलाशय। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: rPPEP -1 क्रिस्टलीकरण के लिए अनुकूलन प्रक्रिया। rPPEP-1 से प्रारंभिक क्रिस्टल कम विवर्तन गुणवत्ता की 12 मिलीग्राम / एमएल और कई lattices (intergrown) के साथ एक 24-हालत अनुकूलन स्क्रीन में reproduced किया गया। फिर, केवल intergrown क्रिस्टल 2.55 एम अमोनियम फॉस्फेट द्विक्षारकीय युक्त परिस्थितियों में मनाया गया। एक बीज शेयर एक भी intergrown क्रिस्टल से तैयार किया गया था और 1 पतला: एक ही Condit में 1,000आयन (microseeding)। पतला स्टॉक बीज के 0.5 μl की एक मात्रा शेष स्पष्ट बूंदों में जोड़ा गया है और एकल क्रिस्टल में लगभग सभी शर्तों बढ़ी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. Microseeding का उपयोग कर क्रिस्टल अनुकूलन
    नोट: rPPEP -1 के अति intergrown क्रिस्टल एक शर्त 2.4 मीटर अमोनियम फॉस्फेट द्विक्षारकीय, 0.1 एम Tris एचसीएल, पीएच 8.5 (SaltRx स्क्रीन, हालत E4, सभी तीन subwells) (चित्रा 3) युक्त में दो दिनों के बाद दिखाई देते हैं। प्रारंभिक स्थिति microseeding के साथ संयुक्त चारों ओर एक ग्रिड स्क्रीन का उपयोग कर एक अनुकूलन प्रक्रिया (चित्रा 4) लागू किया गया था।
    1. 2.55 एम अमोनियम फॉस्फेट द्विक्षारकीय (0.15 मीटर के चरणों में) और 0.1 एम Tris एचसीएल पीएच 7.5-9.0 appropri से (0.5 पीएच इकाइयों के चरणों में) - एक ग्रिड स्क्रीन (चित्रा 4) 1.8 के साथ 24 की स्थिति शामिल तैयारखाया शेयर समाधान (4 एम अमोनियम फॉस्फेट और 1 एम Tris buffers)।
      नोट: हर हालत यह है कि 10 अनुकूलन स्क्रीन प्रदर्शन करने के लिए अनुमति देता है के 2 मिलीलीटर मात्रा में प्राप्त करने के लिए और pipetting योजना की गणना करने के मेक तश्तरी (http://hamptonresearch.com/make_tray.aspx) का प्रयोग करें। 4 एम अमोनियम फॉस्फेट शेयर समाधान तैयार करने के लिए मुश्किल है। पूरी तरह से पानी में पाउडर भंग करने के लिए सरगर्मी के दौरान समाधान हीट।
    2. पिपेट 24 अच्छी तरह से थाली के कुओं में हर ग्रिड स्क्रीन समाधान के 200 μl और 20 डिग्री सेल्सियस पर संतुलित करना।
    3. मैन्युअल क्रिस्टलीकरण प्लेट की स्थापना की। (Μl में) 2: 1, 1.5: 1.5 और 1 (: जलाशय प्रोटीन) 2 बूंद मात्रा 3 μl और अनुपात है। इधर, एक सकारात्मक विस्थापन पिपेट का उपयोग हवा बुलबुला गठन से बचने के लिए। इसके तत्काल बाद 20 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट और एक कक्ष में जगह दिलाई। हवा बुलबुला गठन से बचें।
      नोट: एक से चार दिनों के बाद अत्यधिक intergrown क्रिस्टल 2.55 एम अमोनियम फोटो युक्त चार की स्थिति में दिखाई देते हैंsphate द्विक्षारकीय और 0.1 एम Tris एचसीएल पीएच 7.5 - 9.0 (चित्रा 4)। कोई क्रिस्टल शेष 20 2.55 एम नीचे अमोनियम फॉस्फेट सांद्रता के साथ की स्थिति microseeding प्रक्रिया इन परिस्थितियों में rPPEP -1 के एकल क्रिस्टल प्राप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है में बनते हैं।
    4. 2.55 एम अमोनियम फॉस्फेट द्विक्षारकीय और 0.1 एम Tris एचसीएल पीएच 8.0 या 8.5 के साथ दो शर्तों में से एक से एक भी intergrown क्रिस्टल फसल कटाई से एक microseed शेयर तैयार करें। क्रिस्टल प्लास्टिक सतह से जुड़ी हो सकती है। एक एक्यूपंक्चर सुई के साथ आसपास के प्लास्टिक की सावधानी से विरूपण क्रिस्टल को अलग करने में मदद करता है।
      1. स्थानांतरण एक छोटे से अत्यधिक पॉलिश गिलास मनका युक्त एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में संबंधित मां शराब के 50 μl (मोती के लिए-बीज)। एक घुड़सवार नायलॉन लूप का प्रयोग एक गिलास को कवर स्लाइड पर रखा मां शराब की 1 μl में क्रिस्टल हस्तांतरण।
      2. 30 सेकंड के लिए उच्च गति पर तरल ट्यूब और भंवर में क्रिस्टल युक्त स्थानांतरण। एक 1 करें:एक नया 1.5 मिलीलीटर 5 सेकंड के लिए अच्छी तरह से एक ही हौसले से तैयार की हालत और भंवर युक्त ट्यूब में बीज शेयर के 1,000 कमजोर पड़ने।
        नोट: बीज कंपनियों के शेयरों ° बाद में उपयोग के लिए सी -80 पर संग्रहित किया जा सकता है।
    5. कुओं में: (1,000 कमजोर पड़ने 1) स्पष्ट बूँदें और पिपेट बीज शेयर के 0.5 μl के साथ 20 की स्थिति को कवर प्लेट की मुहर निकालें। 20 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट और एक कक्ष में जगह सील। उच्च गुणवत्ता विवर्तन के एकल क्रिस्टल 2-7 दिनों (चित्रा 5) में दिखाई देते हैं।

चित्रा 5
चित्रा 5: अनुकूलन स्क्रीन से प्रतिनिधि क्रिस्टल। 12 मिलीग्राम पर rPPEP -1 से एकल क्रिस्टल / एमएल वरीयता प्राप्त 1: 1,000 कमजोर पड़ने बीज शेयर निम्न परिस्थितियों में उगाया: (ए) 2.1 मीटर अमोनियम फॉस्फेट द्विक्षारकीय, 0.1 एम Tris पीएच 7.5; 1.5 μl: 1.5 μl; (बी) 2.1 मीटर अमोनियम फॉस्फेट द्विक्षारकीय, 0.1 एम Tris पीएच 7.5; 2 μl: 1 μl; (सी) 2.25 एम अमोनियम फॉस्फेट द्विक्षारकीय, 0.1 एम Tris पीएच 8; 2 μl: 1 μl; (डी) 2.1 मीटर अमोनियम फॉस्फेट द्विक्षारकीय, 0.1 एम Tris पीएच 8; 1 μl: 2 μl। (ई) 0.1-0.2 माइक्रोन नायलॉन पाश में रखा क्रिस्टल, 2.1 मीटर अमोनियम फॉस्फेट द्विक्षारकीय में हो, 0.1 एम Tris पीएच 8 (2 μl: 1 μl) और क्रायो संरक्षित 2.1 मीटर अमोनियम फॉस्फेट द्विक्षारकीय में, 0.1 एम Tris पीएच 8, 20% ग्लिसरॉल। स्केल पट्टी (ई) में = 0.2 मिमी। खंड राशन हमेशा प्रोटीन हैं: जलाशय। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

4. क्रिस्टल बढ़ते और डेटा संग्रह

ध्यान दें: प्राप्त करने के लिए विवर्तन डेटा क्रिस्टल की सबसे अच्छी गुणवत्ता उनकी गुणवत्ता और आकार के चरम पर मुहिम शुरू की जानी चाहिए। क्रिस्टल तरल नाइट्रोजन में संग्रहित किया जा सकता जब तक कि वे गिरफ्तारीई 100 लालकृष्ण इसलिए कम से एक्स-रे विवर्तन विश्लेषण के अधीन, हालत से जो वे आरंभ क्रायो की स्थिति को समायोजित किया जाना चाहिए। rPPEP -1 क्रिस्टल क्रायो संरक्षित या तो 20% या 30% ग्लिसरॉल सुक्रोज (क्रायो protectant द्वारा हालत में पानी के प्रतिस्थापन) के अलावा द्वारा हो सकता है।

  1. क्रिस्टल बढ़ते
    नोट: सभी क्रिस्टल हेरफेर कदम stereomicroscope के तहत किया जाना चाहिए।
    1. चुने हुए क्रिस्टल की अधिकतम लंबाई के लिए नायलॉन पाश का इष्टतम आकार चुनें। RPPEP -1 क्रिस्टल के ठेठ सबसे लंबे समय तक अक्ष के बारे में 100-200 माइक्रोन (चित्रा 5) है। एक कवर स्लाइड और उचित क्रायो हालत तैयार (जैसे 2.1 मीटर अमोनियम फॉस्फेट द्विक्षारकीय, 0.1 एम Tris, पीएच 8.0, 20% ग्लिसरॉल)।
      1. तरल नाइट्रोजन के साथ फोम Dewars भरें, एक शीशी के साथ शीशी दबाना लोड और यह तरल नाइट्रोजन से भरे 800 मिलीलीटर फोम देवर में पूर्व शांत। एक क्रायो आस्तीन और एक क्रायो गन्ना धारक एक उपयुक्त पहचानकर्ता के साथ चिह्नित जगहतरल नाइट्रोजन से भरे 2 एल फोम देवर में। एक घुड़सवार नायलॉन पाश के साथ चुंबकीय छड़ी लोड।
        नोट: सुरक्षात्मक कपड़े (Eyeshield / चश्मा, दस्ताने) पहनने के लिए जब तरल नाइट्रोजन के साथ काम कर रहे हैं। गर्म वस्तुओं तरल नाइट्रोजन में डूब फैल उत्पादन हो सकता है।
    2. एक तेज छुरी के साथ टेप सील खोलने के लिए और संदंश के साथ इसे हटाने कट। पिपेट (अच्छी तरह से एक ही थाली पर एक खाली में वैकल्पिक रूप से या) और घुड़सवार नायलॉन पाश (चित्रा 5) के साथ यह मछली पकड़ने से बूंद से क्रिस्टल को दूर कवर स्लाइड पर क्रायो हालत के 1 μl। संलग्न क्रिस्टल आसानी से एक एक्यूपंक्चर सुई के साथ आसपास के प्लास्टिक विरूपण द्वारा जमीन से अलग किया जा सकता है।
      1. जल्दी क्रायो हालत के ड्रॉप करने के लिए क्रिस्टल हस्तांतरण और यह 1 सेकंड के लिए संतुलित करते हैं। तरल नाइट्रोजन में संभव है और फ़ैसला फ्रीज के रूप में के रूप में जल्दी बाहर क्रिस्टल मछली।
      2. जब घुड़सवार पाश के आसपास तरल नाइट्रोजन उबलते बंद हो जाता है, शीशी में पाश जगह है।क्रायो गन्ना धारक पर शीशी में रखें और जब 6 शीशियों के साथ भरी हुई धारक के चारों ओर एक क्रायो आस्तीन जगह है। उपयोग करें जब तक तरल नाइट्रोजन से भरे टैंक में क्रिस्टल स्टोर।
  2. डेटा संग्रहण
    नोट: डेटा संग्रह, यदि उपलब्ध हो या घर diffractometer पर बाहर किया जा सकता है, एक सिंक्रोटॉन beamline पर। rPPEP -1 डेटा स्विस प्रकाश स्रोत, पॉल-शेर्रर-संस्थान, Villigen, स्विट्जरलैंड के beamline X06DA पर एकत्र किए गए थे के लिए एक संकर फोटॉन गिनती डिटेक्टर का उपयोग। मूल डेटा और सभी फ़ाइलों संरचना निर्धारण में इस्तेमाल अनुरोध पर उपलब्ध कराई जा सकती है।
    1. 1.282 एक (9667 कीव), जो तत्व जिंक की विशेषता एक्स-रे अवशोषण बढ़त ऊर्जा (चोटी) है करने के लिए बीम की तरंग दैर्ध्य सेट करें। rPPEP -1 एक Metalloprotease कि सक्रिय साइट में अणु प्रति एक जस्ता शामिल है।
    2. प्रत्येक directio में 270 डिग्री की कुल के लिए 10 डिग्री wedges में उलटा-बीम मोड में 100 कश्मीर पर डेटा इकट्ठाएन। जोखिम समय छवि प्रति 0.1 डिग्री रोटेशन के साथ 0.1 सेकंड है। 14% (0.14) के लिए संचरण सेट करें।
    3. एक ही क्रिस्टलीकरण हालत से होने वाले एक दूसरे क्रिस्टल से एक देशी उच्च संकल्प डाटासेट इकट्ठा करने के लिए 1.00 एक (12398 कीव) करने के लिए बीम की तरंग दैर्ध्य की स्थापना की। डेटा 100 लालकृष्ण में जोखिम समय छवि प्रति 0.1 डिग्री रोटेशन के साथ 0.1 सेकंड है लीजिए। 70% (0.7) के लिए संचरण सेट करें।

5. जिंक-शिरोमणि अकाली दल के माध्यम से संरचना निर्धारण

नोट: आदेश rPPEP -1 की संरचना निर्धारित करने के लिए जस्ता-शिरोमणि अकाली दल के कुछ बुनियादी क्रिस्टेलोग्राफिक ज्ञान की जरूरत है और साथ ही सॉफ्टवेयर संकुल XDS 20, Phenix 21 और कार्यक्रम कूट 22 के माध्यम से है। संरचनाओं के दृश्य के लिए कार्यक्रम PyMOL 23 या 24 कल्पना की जरूरत है। तरंग दैर्ध्य तत्व जिंक अवशोषण के किनारे पर पीक करने के लिए इसी पर एकत्र डेटा एकल तरंगदैर्ध्य विषम disp के लिए इस्तेमाल किया जा सकताersion (एसएडी) 25 चरण की जानकारी है कि सभी प्रोटीन परमाणुओं के लिए बढ़ाया जा सकता है प्राप्त करने के लिए।

  1. डाटा प्रासेसिंग
    1. दो चोटी डेटासेट (सामान्य और उलटा) P2 1 2 1 2 1 (अंतरिक्ष समूह 19) अंतरिक्ष समूह में सॉफ्टवेयर XDS (वैकल्पिक रूप से iMosflm या HKL3000) का उपयोग Friedel के साथियों (विषम डेटा) को अलग करने की प्रक्रिया। इकाई सेल मानकों ए, बी, सी (ए) के आसपास होना चाहिए = 43.17, 71.68, 117.70 और α = β = γ (°) = 90. यह दो HKL-फ़ाइलें (प्रतिबिंब फ़ाइलें) देता है।
    2. फ़ाइल CORRECT.LP का निरीक्षण किया। संकल्प, जिसमें सीसी 1/2 कम से कम 50% है अप करने के लिए डेटा का उपयोग करें। एक साथ दोनों स्केल डेटासेट / प्रतिबिंब फ़ाइलें (HKL फ़ाइलें) X स्केल का उपयोग कर। फ़ाइल XSCALE.LP का निरीक्षण किया। चेक कितनी दूर विषम संकेत फैली (SigAno) और एक विषम सह-संबंध के बारे में 30% है, जो यहां इस्तेमाल किया 1.67 एक करने के लिए एकत्र आंकड़ों के मामले में 2 एक है (Anomal Corr) के साथ संकल्प ध्यान दें। यह हैविषम Phenix AutoSol में इस्तेमाल संकेत के लिए संकल्प कट ऑफ।
    3. XDSCONV 5% की एक आर मुक्त सबसेट बनाने और विषम डेटा (FRIEDEL'S_LAW = false) रखने का उपयोग कर (, नाम, उदाहरण के लिए, peak_anom.mtz) एक CCP4 प्रारूप प्रतिबिंब फ़ाइल में (बढ़ाया) HKL-फ़ाइल में परिवर्तित। कार्यक्रम mtzdmp इकाई सेल मानकों, अंतरिक्ष समूह और आर मुक्त सबसेट के अस्तित्व (लेबल FreeRflag) और विषम डेटा निरीक्षण के साथ स्थिरता के लिए MTZ-फ़ाइल की जाँच करें (Dano / SIGDANO लेबल)। एक बाद में मंच पर शोधन के लिए, यह भी विषम डेटा निकालने के बिना XDSCONV के साथ एक अतिरिक्त MTZ-फ़ाइल तैयार (नाम, उदाहरण के लिए, peak_native.mtz के लिए FRIEDEL'S_LAW = सच)।
  2. बुनियाद समाधान (चरण निर्धारण)
    1. प्रतिबिंब फ़ाइल peak_anom.mtz का उपयोग कर Phenix AutoSol चलाएँ। डेटा प्रकार के रूप में शिरोमणि अकाली दल / पागल चोटी का चयन करें और 2 जस्ता साइटों का चयन (वहाँ के रूप में प्रति इकाई विषम दो अणु होते हैं)। या तो अधिक सटीक अनुभव चुनेंच '/ एफ' 'मानकों (beamline पर एक प्रतिदीप्ति स्कैन में निर्धारित) या theotetical मूल्यों च' = -8.245 और च '' = 3.887 के लिए मानसिक मूल्यों। इसके अलावा FASTA सघन प्रोटीन के अमीनो एसिड अनुक्रम युक्त फ़ाइल लोड।
    2. एक विषम संबंध के बारे में 30% (5.1.2 में निर्धारित) के (Anomal Corr) के साथ समाधान करने के लिए संकल्प सीमा निर्धारित करें, इस मामले में 2 और "autobuild मॉडल" विकल्प का चयन करें। इलेक्ट्रॉन घनत्व में दो जस्ता साइटों Phenix HySS (Phenix AutoSol पाइप लाइन का हिस्सा) के द्वारा पाया पूरे प्रोटीन के लिए चरणों deduced किया जा सकता है और मॉडल बनाया (Phenix संकल्प द्वारा) के चरणों का उपयोग करना। सबसे अच्छा मॉडल कहा जाता है "overall_best.pdb" है।
  3. मॉडल निर्माण, शोधन और मान्यता
    1. विकल्प "autobuild मॉडल" स्वचालित रूप से rPPEP -1 मॉडल की सबसे निर्माण करने के लिए का चयन करें। 1.0 σ समोच्च स्तर पर इलेक्ट्रॉन घनत्व का निरीक्षण कार्यक्रम का उपयोग करएम कूट (चित्रा 6)। यह संयोजी और मॉडल के परमाणुओं के आसपास होना चाहिए। आदर्श रूप में भी कुछ पानी के अणुओं (बेहतर 2.5 एक से एक प्रस्ताव पर) मॉडल में बनाया जाना चाहिए। थोक पानी (अणुओं के बीच अंतरिक्ष) कोई घनत्व को शामिल करना चाहिए।
    2. अगर पूरे मॉडल पूर्ण (इलेक्ट्रॉन घनत्व में निर्मित सभी एमिनो एसिड) है की जाँच करें। यदि नहीं, तो स्वयं उन्हें कूट द्वारा प्रदान की गई उपकरण का उपयोग कर निर्माण। 5 शोधन के साथ Phenix परिष्कृत के चलने का दौर चल रहा द्वारा संरचना को परिष्कृत प्रत्येक overall_best.pdb मॉडल फ़ाइल, peak_native.mtz प्रतिबिंब फ़ाइल और FASTA अनुक्रम फ़ाइल का उपयोग दौर; और कूट में मैनुअल मॉडल निर्माण।
    3. कूट में संबंधित उपकरणों के साथ संरचनात्मक मॉडल की गुणवत्ता मान्य।

चित्रा 6
चित्रा 6: प्रायोगिक इलेक्ट्रॉन घनत्व नक्शा और rPPEP -1 के मॉडल के बादPhenix Autosol चलाते हैं। 1.0 σ का एक समोच्च स्तर के कार्यक्रम कूट में दिखाया गया है पर नीले रंग में इलेक्ट्रॉन घनत्व। इस प्रारंभिक नक्शे में इलेक्ट्रॉन घनत्व अच्छी तरह से हल हो गई है और मॉडल इलेक्ट्रॉन घनत्व में निर्माण। जूम में अवशेष His142 और Glu189, साथ ही एक पानी के अणु से पता चलता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

आण्विक रिप्लेसमेंट के माध्यम से उच्च संकल्प के लिए 6. संरचना निर्धारण

नोट: आदेश rPPEP-1 एक देशी डाटासेट के बारे में उच्च संकल्प संरचनात्मक जानकारी प्राप्त करने के लिए एकत्र किया जाता है। फिर एक आणविक प्रतिस्थापन सॉफ्टवेयर Phaser 26,27 (Phenix सॉफ्टवेयर पैकेज के भीतर) का उपयोग प्रक्रिया संरचना जस्ता-शिरोमणि अकाली दल के एक मॉडल के रूप में के माध्यम से निर्धारित का उपयोग कर कार्यरत है। जब rPPEP -1 के ढांचे छोटे अणुओं के साथ complexed सुलझाने यह प्रक्रिया भी बाद में इस्तेमाल किया जा सकता है।

  1. (1.4 एक करने के लिए इस मामले में) उच्च संकल्प के साथ एक क्रिस्टल संरचना प्राप्त करने के लिए देशी डाटासेट अंतरिक्ष समूह P2 1 2 1 2 1 (अंतरिक्ष समूह 19) में सॉफ्टवेयर XDS (वैकल्पिक रूप से iMosflm या HKL3000) का उपयोग प्रक्रिया। इकाई सेल मानकों ए, बी, सी (ए) के आसपास होना चाहिए = 43.17, 71.77, 117.80 और α = β = γ (°) = 90. यह एक HKL-फ़ाइलें (प्रतिबिंब फ़ाइल) देता है।
  2. फ़ाइल CORRECT.LP का निरीक्षण किया। संकल्प, जिसमें सीसी 1/2 कम से कम 50% है अप करने के लिए डेटा का उपयोग करें। HKL-फाइल एक CCP4 प्रारूप प्रतिबिंब फ़ाइल में (नाम, उदाहरण के लिए, native.mtz) XDSCONV 5% की एक आर मुक्त सबसेट बनाने का उपयोग कर कन्वर्ट। कार्यक्रम mtzdmp इकाई सेल मानकों, अंतरिक्ष समूह और आर मुक्त सबसेट (लेबल FreeRflag) के अस्तित्व को निरीक्षण के साथ स्थिरता के लिए MTZ-फ़ाइल की जाँच करें।
  3. PDB फ़ाइल पहले से निर्धारित overall_best.pdb से मॉडल युक्त तैयार है और सभी पानी के अणुओं और सभी ligands हटाने के लिए (यानी। जस्ता परमाणु)। इसके अलावा FASTA सघन प्रोटीन के अमीनो एसिड अनुक्रम युक्त फ़ाइल लोड। प्रतिबिंब फ़ाइल native.mtz का उपयोग कर Phenix में Phaser चलाएँ। प्रति इकाई विषम दो अणुओं की खोज करें।
  4. मॉडल (नाम native_phaser.1.pdb) और कूट में इलेक्ट्रॉन घनत्व नक्शा निरीक्षण; सफल संरचना समाधान (यहां 10.2 8 से बड़ा TFZ-अंक) के बाद। बनाएँ और 5 शोधन के साथ Phenix परिष्कृत के चलने का दौर चल रहा द्वारा संरचना को निखारने प्रत्येक native_phaser.1.pdb मॉडल फ़ाइल, native.mtz प्रतिबिंब फ़ाइल और FASTA अनुक्रम फ़ाइल का उपयोग दौर; और कूट में मैनुअल मॉडल निर्माण।
  5. कूट में संबंधित उपकरणों के साथ संरचनात्मक मॉडल की गुणवत्ता मान्य।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

rPPEP -1 ई कोलाई BL21 (DE3) स्टार (चित्रा 1 सी) में सबसे अधिक उपज के साथ कई ई कोलाई उपभेदों में overexpressed है। पहले NiNTA आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी कदम के बाद 6xHis टैग सफलतापूर्वक प्रोटीन की सबसे अधिक से बंद cleaved जा सकता है और दूसरी NiNTA कदम में पचाया प्रोटीन पूरी तरह से थ्रोम्बिन पचा प्रोटीन (चित्रा -1) से अलग किया जा सकता है। एक S200 16/600 स्तंभ untagged rPPEP -1 कभी सबसे शायद dimeric प्रजातियों (2A चित्रा) के लिए इसी अग्रिम के साथ मोनोमर के रूप में migrates पर। प्रोटीन शुद्ध (चित्रा 2 बी) है और उपज ई कोलाई संस्कृति का 1 एल से लगभग 50 मिलीग्राम प्रोटीन होता है। rPPEP-1, विभिन्न स्थितियों (चित्रा 3) में क्रिस्टलीकृत अक्सर फॉस्फेट युक्त। क्रिस्टल अत्यधिक सभी परिस्थितियों में intergrown कर रहे हैं, तो क्रिस्टल अनुकूलन प्रदर्शन किया जा रहा था। चित्रा 4 schem दर्शाया गया हैअनुकूलन प्रक्रिया के ई हालत वाणिज्यिक स्क्रीन SaltRx इ 4 (52) (चित्रा 3 बी-सी) से होने वाले क्रिस्टल के लिए प्रदर्शन किया। फिर intergrown क्रिस्टल कुओं ए 6-डी 6 (चित्रा 4) में दिखाई दिया। एक microseed शेयर अनुकूलन स्क्रीन की हालत C6 (2.55 एम अमोनियम फॉस्फेट द्विक्षारकीय, 0.1 एम Tris पीएच 8.5) में उगाया क्रिस्टल से तैयार किया है और 1 पतला था: मां शराब में 1,000। दो से सात दिन के अन्य शेष 20 की स्थिति में पतला स्टॉक बीज बोने के साथ स्पष्ट बूंदों के साथ उच्च गुणवत्ता विवर्तन की बड़ी एकल जाली क्रिस्टल सबसे बूंदों में (चित्रा 5) के बाद मनाया गया। 1.67 एक संकल्प के लिए नायलॉन छोरों (चित्रा 5E) विवर्तन डेटा में क्रिस्टल के बढ़ते के बाद, के माध्यम से जस्ता-शिरोमणि अकाली दल (तालिका 1) संरचना निर्धारण के लिए एकत्र किए गए एक विषम संकेत 2 एक को विस्तार देने के साथ। इसके अतिरिक्त, 1.4 एक संकल्प के मूल निवासी विवर्तन डेटा एक hig के निर्धारण के लिए एकत्र किए गए थेएच-संकल्प संरचना (1 टेबल)। RPPEP -1 के क्रिस्टल संरचना हल किया जा सकता है (चित्रा 6) और आर करने के लिए परिष्कृत मूल संरचना के मॉडल / 1.4 एक प्रस्ताव पर 0.156 / 0.182 से मुक्त कारकों आर (पीडीबी आईडी: 5A0P) 14 (आगे शोधन के लिए सांख्यिकी तालिका देखें 1)।

संरचना / डाटासेट शिखर Zn-शिरोमणि अकाली दल जन्म का
डेटा संग्रहण
अंतरिक्ष समूह P2 1 2 1 2 1 P2 1 2 1 2 1
ए, बी, सी (एक) 43.17, 71.68, 117.70 43.17, 71.77, 117.80
α, β, γ (°) 90, 90, 90 90, 90, 90
वेवलेंथ (एक) 1.28254 1
संकल्प (एक) 45.5-1.67 (1.72-1.67) 45.5-1.40 (1.49-1.40)
टिप्पणियों की संख्या 779717 (34025) 310074 (45851)
अद्वितीय प्रतिबिंब की संख्या 80960 (5597) 71874 (11172)
बहुलता 9.6 (6.1) 4.3 (4.1)
संपूर्णता (%) 99.2 (93.0) 98.2 (95.6)
Rmerge (%) 6.8 (56.5) 5.2 (52.6)
<मैं / σ (मैं)> 21.86 (2.81) 15.66 (2.48)
सीसी (1/2) (%) 100 (85.1) 99.9 (85.5)
शोधन के आँकड़े
आर डब्ल्यूOrk / आर मुक्त d (%) 15.60 / 18.17
गैर-एच प्रोटीन परमाणुओं की संख्या 3109
पानी के अणुओं की संख्या 532
आयनों / भारी परमाणुओं की संख्या 2 Zn
अन्य अणुओं की संख्या -
टीएलएस समूहों की संख्या / चेन 9
रूट मतलब वर्ग विचलन
बंधन लंबाई (एक) 0.006
बॉन्ड कोण (°) 1.022
औसत B कारक (ए 2)
सभी प्रोटीन परमाणुओं 16.12
पानी 29.74
अन्य परमाणुओं 10.12
रामचंद्रन साजिश ई (%)
किसी का अधिक पक्ष लेना 98.72
इसके अतिरिक्त अनुमति 1.28
की अनुमति नहीं 0
PDB प्रविष्टि 5a0p

तालिका 1: डेटा संग्रह और शोधन के आँकड़े।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी अभी भी प्रोटीन 28 के तीन आयामी पास परमाणु संकल्प संरचनाओं का निर्धारण करने के लिए सबसे तेज और सबसे सही तरीका है। हालांकि, यह भी आदेश दिया एकल क्रिस्टल के विकास की आवश्यकता है। ये अक्सर पाने के लिए मुश्किल हो जाता है और क्रिस्टलीय राज्य कृत्रिम है। हालांकि, अन्य तरीकों, द्वारा निर्धारित उन लोगों के साथ एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी द्वारा निर्धारित प्रोटीन संरचनाओं की तुलना में विशेष रूप से एनएमआर, आम तौर पर एक बहुत अच्छा समझौते से पता चलता। PPEP -1 के मामले में, एक एनएमआर संरचना हमारे क्रिस्टल संरचना के साथ 14 हाल ही में 29 शो उत्कृष्ट समझौते प्रकाशित, एस-पाश की गतिशीलता भी शामिल है।

इस प्रोटोकॉल के उत्पादन और संरचनात्मक अध्ययन और untagged rPPEP -1 के क्रिस्टलीकरण और संरचना निर्धारण के लिए एन टर्मिनली उनकी टैग rPPEP -1 प्रोटीन की शुद्धि का वर्णन है। एकल क्रिस्टल इस मामले में विकसित करने के लिए मुश्किल थे और एक विशेष microseeding प्रक्रिया की आवश्यकता है। टी मेंवह अनुभाग निम्नलिखित हम PPEP-1 के लिए परिणामों पर चर्चा और संकेत मिलता है कि कैसे प्रोटोकॉल उत्पादन और किसी भी अन्य प्रोटीन के क्रिस्टलीकरण के लिए अनुकूलित किया जा सकता होगा।

निर्माण डिजाइन और अभिव्यक्ति पर बदलाव

के रूप में क्रिस्टलीकरण के लिए यह क्रिस्टलीकरण सफलता और प्रोटीन संरचना 30 पर इसके संभावित प्रभाव के कारण थ्रोम्बिन से उनकी टैग को दूर करने को पचाने के लिए बेहतर है rPPEP-1 एक एन टर्मिनली उनकी टैग संस्करण (चित्रा 1 ए) के रूप में व्यक्त किया जाता है। अन्य प्रोटीन के लिए यह भी एक सी टर्मिनली उनकी टैग संस्करण का परीक्षण करने के लिए उचित हो सकता है या छोड़ने के लिए एन टर्मिनल (जैसे, वेक्टर pET22b और 3 'अंत में बंद कोडोन के बिना एक रिवर्स प्राइमर ही प्रतिबंध साइटों का उपयोग कर क्लोन) उनकी टैग, uncleaved कुछ मामलों में के रूप में एक टैग क्रिस्टलीकरण के दौरान मदद कर सकता है। rPPEP -1 उपज और एक सी टर्मिनली उनकी टैग निर्माण की स्थिरता के लिए अवर था। इसके अतिरिक्त, सबसे अच्छा एस के लिए एक प्रारंभिक परीक्षणoluble प्रोटीन अभिव्यक्ति निम्न ई कोलाई उपभेदों में शामिल किया जाना चाहिए: BL21 (DE3), BL21 (DE3) pLysS या Lemo21 (DE3), BL21 (DE3) कोडोन प्लस RIPL या Rosetta 2 (DE3), BL21 (DE3) स्टार और C41 (DE3) तीन अलग-अलग तापमान / ऊष्मायन समय पर (37 डिग्री सेल्सियस, 30 डिग्री सेल्सियस पर 5 घंटा और रात में 20 डिग्री सेल्सियस पर 3-4 घंटा)। क्लोनिंग से पहले, ब्याज की प्रोटीन की दरार को रोकने के लिए ExPASy PeptideCutter उपकरण 31 का उपयोग करके एक आंतरिक थ्रोम्बिन दरार साइट के अस्तित्व के लिए जाँच करें। वैकल्पिक रूप से, वहाँ उपलब्ध वैक्टर HRV3C के लिए एक दरार साइट प्रदान कर रहे हैं (यानी EMBL के PETM -14 32) या TEV प्रोटीज (यानी EMBL के PETM -11)।

प्रोटीन शुद्धि

के लिए rPPEP -1 का निर्माण सेल बर्फ / पानी पर sonication के माध्यम से किया जाता है। अधिक संवेदनशील प्रोटीन है कि कुल या एक सेल disruptor उपयोग किया जा सकता है शामिल एक अधिक "कोमल" सेल विधि वेग जाते हैं के लिएघ। पहले centrifugation कदम के बाद अघुलनशील प्रोटीन की बड़ी मात्रा में है, जो जब इस तरह के रासायनिक सेल के रूप में सेल पद्धति का उपयोग करके पता लगाया नहीं कर रहे हैं के लिए जाँच करें। rPPEP -1 की शुद्धि के लिए आमतौर पर NiNTA राल के 2 मिलीलीटर इस्तेमाल किया गया। पर कैसे बड़े चुना राल के प्रोटीन बाध्यकारी क्षमता है निर्माता के निर्देशों पढ़ें और तदनुसार समायोजित करें। RPPEP -1, जहां राल का केवल 1 मिलीलीटर इस्तेमाल किया गया था, प्रोटीन की एक बहुत स्तंभ के लिए बाध्य नहीं किया गया था और प्रवाह के माध्यम से (चित्रा -1) में पाया गया था की पहली शुद्धिकरण में। दूसरी ओर बहुत ज्यादा राल का उपयोग कर शुद्ध प्रोटीन की शुद्धता कम हो सकता है पर। NiNTA मैट्रिक्स के लिए इस्तेमाल किया उनकी टैग निर्माण के बंधन आत्मीयता को imidazole एकाग्रता को समायोजित करें। एक stepwise कपड़े धोने की प्रक्रिया यहाँ पसंद किया जाता है (यानी 10 मिमी, 30 मिमी, 50 मिमी, 70 मिमी imidazole), जिसमें A280 नजर रखी है और प्रत्येक चरण के दौरान आधारभूत तक पहुँचने के लिए अनुमति दी है। उस रास्ते में कोई प्रोटीन खो दिया है, भले ही वह एक के दौरान elute होगा(50 या 70 मिमी पर उदाहरण के लिए) उच्च imidazole धोने कदम। के मामले में Nhis-rPPEP -1 प्रोटीन कुछ पहले से ही 30 मिमी imidazole पर elutes है, लेकिन यह स्पष्ट नहीं है कि प्रोटीन प्रजातियों में से किस तरह का यह प्रतिनिधित्व करता है। कुछ प्रोटीन वेग / कुल जब imidazole dialyzed या प्रोटीन समाधान से बाहर पतला है। ऐसे मामलों में 150 मिमी तक क्षालन बफर में imidazole की एकाग्रता और उच्च imidazole सांद्रता के लिए जोखिम के समय, जैसे कम करने के लिए एक बीकर imidazole बिना बफर के एक 5-10 गुना मात्रा युक्त की तुलना में क्षालन द्वारा imidazole की एकाग्रता में कमी योजना बनाई क्षालन मात्रा। 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर प्रोटीन की मिलीग्राम प्रति 2 इकाइयों थ्रोम्बिन साथ Nhis-rPPEP -1 ऊष्मायन के लिए लगभग 100% करने के लिए उनकी टैग फोड़ना करने के लिए पर्याप्त हैं। 20 डिग्री सेल्सियस के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर मिलीग्राम प्रोटीन प्रति 1-10 इकाइयों का उपयोग करके ब्याज की प्रोटीन के लिए थ्रोम्बिन की राशि को समायोजित करें। जब प्रोटीन ध्यान केंद्रित कर 5-10 मिनट के अंतराल में एक केन्द्रापसारक ultrafiltration इकाई को थामने का उपयोग करते हुए और पी मिश्रणrotein concentrator में इमारत एकाग्रता ढाल homogenize करने के लिए। अन्यथा अत्यधिक ध्यान केंद्रित प्रोटीन / वेग कुल सकता है।

crystallization

rPPEP -1 लगातार अत्यधिक intergrown क्रिस्टल (एकल क्रिस्टल, एक दूसरे के शीर्ष पर बढ़ती इस प्रकार कई क्रिस्टल lattices वाले) है कि एक्स-रे विवर्तन विश्लेषण के लिए उपयुक्त नहीं हैं पैदा करता है। स्पष्टीकरण हो सकता है कि बहुत सारे nucleation घटनाओं चरण आरेख (चित्रा 7) के केंद्रक क्षेत्र में हो रही हैं।

चित्रा 7
चित्रा 7: एक प्रोटीन क्रिस्टलीकरण प्रयोग के चरण आरेख। क्रिस्टल केवल फार्म कर सकते हैं, जब प्रोटीन supersaturated है। Nucleation nucleation क्षेत्र और metastable क्षेत्र में क्रिस्टल विकास में जगह लेता है। जब एक प्रोटीन undersaturated है, ड्रॉप साफ रहेगा।

<पी वर्ग = "jove_content"> प्रोटीन या तेज़ सांद्रता कम करने के रूप में तो rPPEP -1 का कोई nucleation स्थिति में सुधार नहीं करता है अब और नहीं मनाया जाता है और बूंदों स्पष्ट रहो। Microseeding पसंद की विधि था, के रूप में छोटे नाभिक metastable क्षेत्र है, जिसमें rPPEP -1 क्रिस्टल अंततः बढ़ने (चित्रा 7) में सीधे लाया जाता है। नई में से अधिकांश एक ही रास्ता है कि मूल हालत (2.4 मीटर अमोनियम फॉस्फेट द्विक्षारकीय, 0.1 एम Tris पीएच 8.5) की स्थिति सी 5 (चित्रा 4) (बल्कि पीएच और तेज़ एकाग्रता के उच्च अंत) पर स्थित है में अनुकूलन स्क्रीन डिजाइन करके स्थिति एक उच्च प्रवृत्ति के साथ कम अतिसंतृप्ति के साथ एक शर्त के अनुरूप metastable जोन 16 (चित्रा 7) के एक हिस्से का प्रतिनिधित्व करने के लिए। इस प्रकार, नाभिक कि बोने के दौरान में लाया जाता है संभावित बड़े एकल क्रिस्टल करने के लिए विकसित कर सकते हैं। कि प्रक्रिया (राशि और नवगठित क्रिस्टल का आकार) का अनुकूलन करने के लिए मूल बीज शेयर 10 पतला किया जा सकता -5 के लिए। यहां बीज कंपनियों के शेयरों के कई dilutions बड़ी एकल क्रिस्टल के उत्पादन के लिए सबसे अच्छा बीज कमजोर पड़ने का निर्धारण करने के लिए परीक्षण किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से लकीर एक जानवर गलमुच्छा या पूंछ के बाल (खरगोश, बिल्ली, चिनचिला या घोड़े) का उपयोग कर बोने 33 नियोजित किया जा सकता है।

प्रक्रिया सह-मणिभ उत्पाद-पेप्टाइड्स और rPPEP -1 के सब्सट्रेट-पेप्टाइड्स इस्तेमाल किया जा सकता है। अनुकूलन की प्रक्रिया में 250: अंतरिक्ष समूह P2 1 में क्रिस्टल 1.25 अप करने के लिए diffracting बीज कंपनियों के शेयरों से प्राप्त किया गया 1 पतला। क्रिस्टल बढ़ने में दो अंतरिक्ष समूहों P2 1 2 1 2 1 (अनबाउंड प्रोटीन) और p2 1 (जटिल संरचना) है, जबकि अनुकूलन प्रक्रिया के अमोनियम फॉस्फेट स्क्रीन के अंदर बहुत ही इसी तरह की स्थिति से होने वाले। क्रिस्टल पैकिंग दोनों आर-PPEP -1 क्रिस्टल रूपों, मुख्यतः सभी छोटे अणुओं और पेप्टाइड्स सक्रिय साइट की Unprimed पक्ष के समाधान में पाया के कारण अकेले soake हो सकता हैक्रिस्टल में घ। अणु के इस पक्ष क्रिस्टल में विलायक वर्तमान से पहुँचा जा सकता है। हालांकि दोनों उप साइटों या primed पक्ष को संबोधित अणुओं केवल rPPEP-1 के साथ सह-सघन होने के लिए, एस-पाश खोलने के रूप में की जरूरत है उन्हें सक्रिय साइट में समायोजित करने की आवश्यकता होगी। एक तथ्य यह भी है कि 3 अवशेषों को सब्सट्रेट पेप्टाइड्स की लंबाई सीमा - इसके अतिरिक्त, rPPEP -1 सब्सट्रेट बाध्यकारी S3'site (इस क्षेत्र में क्रिस्टल संपर्कों को बढ़ावा देने) के पास साइट से बाहर निकलने पर पड़ोसी अणुओं से संपर्क किया है इन दो रूपों में क्रिस्टल primed की ओर।

क्रिस्टल बढ़ते और क्रायो संरक्षण

प्रोटीन क्रिस्टल के बढ़ते एक तरीका है कि stereomicroscope के तहत हेरफेर में कुछ कौशल की आवश्यकता है और इस तरह कुछ अभ्यास की जरूरत है। क्रिस्टल पृष्ठभूमि के लिए योगदान देता है कि चारों ओर विलायक से अधिक को रोकने के लिए नायलॉन पाश (या पसंद के अन्य पाश, जैसे litholoop) की अधिकतम लंबाई चुनेंडी बिखरने और इस प्रकार विवर्तन डेटा के शोर अनुपात करने के लिए एक कम संकेत। इष्टतम पाश आकार / लंबाई भी क्रिस्टल क्रिस्टल पाश के माध्यम से पर्ची नहीं करता है के रूप में आसान के मछली पकड़ने के लिए बनाता है। rPPEP -1 क्रिस्टल, जिसके बारे में 100-200 माइक्रोन सबसे लंबे समय तक आयाम में हैं, 0.1-0.2 मिमी आकार की नायलॉन छोरों चुने गए हैं। क्रायो protectant भी डेटा की गुणवत्ता की बिगड़ती में योगदान कर सकते हैं, जब क्रायो हालत के लिए स्थानांतरित कर के रूप में क्रिस्टल एक आसमाटिक सदमे आ सकती है। इस बाधा हो सकती है या यहां तक ​​कि क्रिस्टल के भीतरी आदेश को नष्ट कर। ध्यान के प्रकार और क्रायो protectant की एकाग्रता का चयन करें। rPPEP -1 क्रिस्टल क्रायो संरक्षित या तो 20% या 30% ग्लिसरॉल सुक्रोज के साथ थे। एक और ligand के साथ rPPEP-1 के एक सब्सट्रेट पेप्टाइड जटिल या एक जटिल crystallizing, सूक्रोज क्रायो protectant के रूप में चुना जाना चाहिए तो ग्लिसरॉल rPPEP-1 14 के सब्सट्रेट-बाध्यकारी साइट की primed साइट को बांधता है।

संरचना निर्धारण

AutoSol समाधान 49.2 ± 18.4 की एक Bayes-सीसी, 0.41 की एक FOM (योग्यता का आंकड़ा), 0.17 की एक तिरछा और 0.85 की एक संबंध आरएमएस प्राप्त की। मॉडल नक्शा सह-संबंध 0.86 और आर / आर मुक्त कारकों 0.21 / 0.24 कर रहे हैं। इन सभी मापदंडों एक सफल संरचना समाधान का संकेत मिलता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

हम विकिरण डेटा संग्रह के दौरान स्विस प्रकाश स्रोत, पॉल-शेर्रर-संस्थान, Villigen, स्विट्जरलैंड समर्थन के लिए कम से beamline X06DA पर कर्मचारियों को धन्यवाद। हम उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए मोनिका Gompert के आभारी हैं। परियोजना कोलोन विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित और अनुदान जर्मन अनुसंधान परिषद से INST 216 / 682-1 FUGG था। सीपी को विकास स्वास्थ्य और रोग में इंटरनेशनल ग्रेजुएट स्कूल से पीएचडी फैलोशिप स्वीकार किया है। अनुसंधान इन परिणामों के लिए अग्रणी अनुदान समझौते नं 283570 (BioStruct-एक्स) के तहत यूरोपीय समुदाय के सातवें फ्रेमवर्क कार्यक्रम (FP7 / 2007-2013) से धन प्राप्त हुआ है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Genes / Vectors / cell strains
pET28a vector Merck-Millipore 69864 Thrombin cleavable N-terminal His-tag
E. coli strain BL21 (DE3) Star ThermoFisher Scientific C601003 RNase H deficient
Codon-optimized gene (for E. coli) of PPEP-1 (CD630_28300) Geneart (Thermo Fisher Scientific) custom amino acids 27-220
Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
Yeast extract any
Tryptone any
Antifoam B Sigma-Aldrich A5757 aqueous-silicone emulsion
Agar any
Kanamycin any
IPTG AppliChem A1008
Tris-HCl AppliChem A1087 Buffer grade
NaCl any Buffer grade
DNaseI AppliChem A3778
Imidazole AppliChem A1073 Buffer grade
Thrombin Sigma-Aldrich T4648
Ammonium phosphate dibasic Sigma-Aldrich 215996
Glycerol 100% any purest grade
Sucrose Sigma-Aldrich 84097
Liquid nitrogen any for storage and cryocooling of crystals
Name Company Catalog Number Comments
Equipment (general)
Shaking incubator any providing temperatures of 20 °C - 37 °C
Glassware any baffled Erlenmeyer flasks (50 ml - 2.8 L)
Centrifuge for large culture volumes any centrifuge for processing volumes up to 12 L
Sonicator Vibra-Cell VCX500 Sonics SO-VCX500 or any other sonicator / cell disruptor
Ultracentrifuge any centrifuge providing speeds up to 150,000 x g
NiNTA Superflow resin Qiagen
Empty Glass Econo-Column Bio-Rad 7371007 or any other empty glass or plastic column
Size exclusion chromatography column HiLoad Superdex 200 16/600 GE Healthcare 28989335
Chromatography system Äkta Purifier GE Healthcare 28406264 or any other chromatography system
Dialysis tubing Spectra/Por 3 Spectrum Labs 132724
Dialysis tubing closures Spectrum Labs 132738
Ultrafiltration units (concentrators) 10,000 NWCO any
UV-Vis spectrophotometer any
Name Company Catalog Number Comments
Equipment (crystallography)
Low volume pipette 0.1-10 µl any
Positive displacement pipette Microman M10 Gilson F148501
Crystallization robot any
96-well crystallization plates TTP IQ with three protein wells TTP 4150-05810 or any other 96-well crystallization plate 
24-well CombiClover Junior Plate Jena Bioscience EB-CJR
Crystal Clear Sealing Tape Hampton Research HR3-511
Siliconized Glass Cover Slides Hampton Research HR3-225
Commercial crystallization screens: SaltRx, Index, PEG/Ion, Crystal Hampton Research diverse
Commercial crystallization screens: Wizard, PACT++, JCSG++ Jena Bioscience diverse
JBS Beads-for-Seeds Jena Bioscience CO-501
CrystalCap SPINE HT (nylon loops) Hampton Research diverse loop sizes 0.025 mm - 0.5 mm
CrystalCap Vial Hampton Research HR4-904
Cryogenic Foam Dewar 800 ml Hampton Research HR4-673
Cryogenic Foam Dewar 2 L Hampton Research HR4-675
Vial Clamp, Straight Hampton Research HR4-670
CrystalWand Magnetic, Straight Hampton Research HR4-729
CryoCane 6 Vial Holder Hampton Research HR4-711
CryoSleeve Hampton Research HR4-708
CryoCane Color Coder - White Hampton Research HR4-713
Scalpel any
Straight microforcep any for manipulation of sealing tape. etc.
Acupuncture needle any e.g. from a pharmacy
Stereo microscope any for inspection of crystallization plates and crystal mounting, magnification up to 160X

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bouza, E. Consequences of Clostridium difficile infection: understanding the healthcare burden. Clin Microbiol Infect. 18 (Suppl 6), 5-12 (2012).
  2. O'Connor, J. R., Johnson, S., Gerding, D. N. Clostridium difficile infection caused by the epidemic BI/NAP1/027 strain. Gastroenterology. 136 (6), 1913-1924 (2009).
  3. Mitchell, B. G., Gardner, A. Mortality and Clostridium difficile infection: a review. Antimicrob Resist Infect Control. 1 (1), (2012).
  4. George, W. L., Sutter, V. L., Finegold, S. M. Antimicrobial agent-induced diarrhea--a bacterial disease. J Infect Dis. 136 (6), 822-828 (1977).
  5. George, R. H., et al. Identification of Clostridium difficile as a cause of pseudomembranous colitis. Br Med J. 1 (6114), 695 (1978).
  6. Bartlett, J. G. Narrative review: the new epidemic of Clostridium difficile-associated enteric disease. Ann Intern Med. 145 (10), 758-764 (2006).
  7. Kelly, C. P., LaMont, J. T. Clostridium difficile--more difficult than ever. N Engl J Med. 359 (18), 1932-1940 (2008).
  8. Ünal, C. M., Steinert, M. Novel therapeutic strategies for Clostridium difficile infections. Expert Opin Ther Targets. 20 (3), 269-285 (2016).
  9. Kelly, C. P., et al. The Monoclonal Antibody, Bezlotoxumab Targeting C. difficile Toxin B Shows Efficacy in Preventing Recurrent C. difficile Infection (CDI) in Patients at High Risk of Recurrence or of CDI-Related Adverse Outcomes. Gastroenterology. 150 (4), S122 (2016).
  10. Tsutsumi, L. S., Owusu, Y. B., Hurdle, J. G., Sun, D. Progress in the discovery of treatments for C. difficile infection: A clinical and medicinal chemistry review. Curr Top Med Chem. 14 (1), 152-175 (2014).
  11. Hensbergen, P. J., et al. Clostridium difficile secreted Pro-Pro endopeptidase PPEP-1 (ZMP1/CD2830) modulates adhesion through cleavage of the collagen binding protein CD2831. FEBS Lett. 589 (24), 3952-3958 (2015).
  12. Cafardi, V., et al. Identification of a novel zinc metalloprotease through a global analysis of Clostridium difficile extracellular proteins. PLoS One. 8 (11), e81306 (2013).
  13. Hensbergen, P. J., et al. A novel secreted metalloprotease (CD2830) from Clostridium difficile cleaves specific proline sequences in LPXTG cell surface proteins. Mol Cell Proteomics. 13 (5), 1231-1244 (2014).
  14. Schacherl, M., Pichlo, C., Neundorf, I., Baumann, U. Structural Basis of Proline-Proline Peptide Bond Specificity of the Metalloprotease Zmp1 Implicated in Motility of Clostridium difficile. Structure. 23 (9), 1632-1642 (2015).
  15. Rawlings, N. D., Waller, M., Barrett, A. J., Bateman, A. MEROPS: the database of proteolytic enzymes, their substrates and inhibitors. Nucleic Acids Res. 42 (Release 10.0), D503-D509 (2014).
  16. Bergfors, T. Seeds to crystals. J Struct Biol. 142 (1), 66-76 (2003).
  17. Dauter, Z., Dauter, M., Dodson, E. Jolly SAD. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 58 (Pt 3), 494-506 (2002).
  18. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  19. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  20. Kabsch, W. XDS. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 2), 125-132 (2010).
  21. Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66, 213-221 (2010).
  22. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).
  23. The PyMOL Molecular Graphics System. , Schrödinger, LLC. (2002).
  24. Pettersen, E. F., et al. UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis. J Comput Chem. 25 (13), 1605-1612 (2004).
  25. Wang, B. C. Resolution of phase ambiguity in macromolecular crystallography. Methods Enzymol. 115, 90-112 (1985).
  26. McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C., Read, R. J. Phaser crystallographic software. J Appl Crystallogr. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).
  27. Zwart, P. H., et al. Automated structure solution with the PHENIX suite. Methods Mol Biol. 426, 419-435 (2008).
  28. Zheng, H., Handing, K. B., Zimmerman, M. D., Shabalin, I. G., Almo, S. C., Minor, W. X-ray crystallography over the past decade for novel drug discovery - where are we heading next? Expert Opin Drug Discov. 10 (9), 975-989 (2015).
  29. Rubino, J. T., et al. Structural characterization of zinc-bound Zmp1, a zinc-dependent metalloprotease secreted by Clostridium difficile. J Biol Inorg Chem. 21 (2), 185-196 (2016).
  30. Carson, M., Johnson, D. H., McDonald, H., Brouillette, C., Delucas, L. J. His-tag impact on structure. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 63 (Pt 3), 295-301 (2007).
  31. Gasteiger, E., et al. Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server. The Proteomics Protocols Handbook. Walker, J. M. , Humana Press. 571-607 (2005).
  32. Dummler, A., Lawrence, A. M., de Marco, A. Simplified screening for the detection of soluble fusion constructs expressed in E. coli using a modular set of vectors. Microb Cell Fact. 4, 34 (2005).
  33. Stura, E. A., Wilson, I. A. Applications of the streak seeding technique in protein crystallization. J Crys Growth. 110 (1), 270-282 (1991).

Tags

जैव रसायन अंक 118 Metalloprotease डाह कारक प्रोलाइन प्रोलाइन पेप्टाइड बंधन पुनः संयोजक प्रोटीन, Intergrown क्रिस्टल microseeding अनुकूलन अवरोध स्क्रीनिंग क्रिस्टल संरचना
उत्पादन, क्रिस्टलीकरण और की संरचना निर्धारण<em&gt; सी। बेलगाम</em&gt; PPEP -1 Microseeding और जिंक-शिरोमणि अकाली दल के माध्यम से
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pichlo, C., Montada, A. A.,… More

Pichlo, C., Montada, A. A., Schacherl, M., Baumann, U. Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD. J. Vis. Exp. (118), e55022, doi:10.3791/55022 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter