Name: Produzione, Cristallizzazione e struttura Determinazione C. difficile PPEP-1 tramite Microseeding e Zinco-SAD (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 34 s
Description: Scopri il metodo di microseeding per ottenere cristalli di alta qualità di PPEP-1 di Clostridium difficile. Questa tecnica consente la determinazione strutturale mediante diffrazione a raggi X per studi di biologia strutturale.

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Ringraziamo il personale del X06DA linea di luce alla sorgente Swiss Light, Paul-Scherrer-Institute, Villigen, Svizzera per il supporto durante la raccolta dei dati di sincrotrone. Siamo grati a Monika Gompert per un eccellente supporto tecnico. Il progetto è stato sostenuto dall&#39;Università di Colonia e concedere INST 216 / 682-1 FUGG dal Consiglio di ricerca tedesco. Una borsa di studio di dottorato presso la Graduate School Internazionale in Sviluppo salute e malattia a CP è riconosciuto. La ricerca che ha portato a questi risultati è stata finanziata dal Settimo Programma Quadro della Comunità Europea (FP7 / 2007-2013), contratto di sovvenzione n ° 283.570 (BioStruct-X).

<ol><li>Bouza, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consequences+of+Clostridium+difficile+infection%3A+understanding+the+healthcare+burden%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Infect%22%5BJournal%5D)">Consequences of Clostridium difficile infection: understanding the healthcare burden.</a> Clin Microbiol Infect. 18 (Suppl 6), 5-12 (2012).</li>
<li>O'Connor, J. R., Johnson, S., Gerding, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clostridium+difficile+infection+caused+by+the+epidemic+BI%2FNAP1%2F027+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Clostridium difficile infection caused by the epidemic BI/NAP1/027 strain.</a> Gastroenterology. 136 (6), 1913-1924 (2009).</li>
<li>Mitchell, B. G., Gardner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mortality+and+Clostridium+difficile+infection%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Resist+Infect+Control%22%5BJournal%5D)">Mortality and Clostridium difficile infection: a review.</a> Antimicrob Resist Infect Control. 1 (1), (2012).</li>
<li>George, W. L., Sutter, V. L., Finegold, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+agent-induced+diarrhea--a+bacterial+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial agent-induced diarrhea--a bacterial disease.</a> J Infect Dis. 136 (6), 822-828 (1977).</li>
<li>George, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Clostridium+difficile+as+a+cause+of+pseudomembranous+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Br+Med+J%22%5BJournal%5D)">Identification of Clostridium difficile as a cause of pseudomembranous colitis.</a> Br Med J. 1 (6114), 695(1978).</li>
<li>Bartlett, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Narrative+review%3A+the+new+epidemic+of+Clostridium+difficile-associated+enteric+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Intern+Med%22%5BJournal%5D)">Narrative review: the new epidemic of Clostridium difficile-associated enteric disease.</a> Ann Intern Med. 145 (10), 758-764 (2006).</li>
<li>Kelly, C. P., LaMont, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clostridium+difficile--more+difficult+than+ever%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Clostridium difficile--more difficult than ever.</a> N Engl J Med. 359 (18), 1932-1940 (2008).</li>
<li>Ünal, C. M., Steinert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+therapeutic+strategies+for+Clostridium+difficile+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Ther+Targets%22%5BJournal%5D)">Novel therapeutic strategies for Clostridium difficile infections.</a> Expert Opin Ther Targets. 20 (3), 269-285 (2016).</li>
<li>Kelly, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Monoclonal+Antibody%2C+Bezlotoxumab+Targeting+C.+difficile+Toxin+B+Shows+Efficacy+in+Preventing+Recurrent+C.+difficile+Infection+%28CDI%29+in+Patients+at+High+Risk+of+Recurrence+or+of+CDI-Related+Adverse+Outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">The Monoclonal Antibody, Bezlotoxumab Targeting C. difficile Toxin B Shows Efficacy in Preventing Recurrent C. difficile Infection (CDI) in Patients at High Risk of Recurrence or of CDI-Related Adverse Outcomes.</a> Gastroenterology. 150 (4), S122(2016).</li>
<li>Tsutsumi, L. S., Owusu, Y. B., Hurdle, J. G., Sun, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+the+discovery+of+treatments+for+C.+difficile+infection%3A+A+clinical+and+medicinal+chemistry+review%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Progress in the discovery of treatments for C. difficile infection: A clinical and medicinal chemistry review.</a> Curr Top Med Chem. 14 (1), 152-175 (2014).</li>
<li>Hensbergen, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clostridium+difficile+secreted+Pro-Pro+endopeptidase+PPEP-1+%28ZMP1%2FCD2830%29+modulates+adhesion+through+cleavage+of+the+collagen+binding+protein+CD2831%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Clostridium difficile secreted Pro-Pro endopeptidase PPEP-1 (ZMP1/CD2830) modulates adhesion through cleavage of the collagen binding protein CD2831.</a> FEBS Lett. 589 (24), 3952-3958 (2015).</li>
<li>Cafardi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+zinc+metalloprotease+through+a+global+analysis+of+Clostridium+difficile+extracellular+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel zinc metalloprotease through a global analysis of Clostridium difficile extracellular proteins.</a> PLoS One. 8 (11), e81306(2013).</li>
<li>Hensbergen, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+secreted+metalloprotease+%28CD2830%29+from+Clostridium+difficile+cleaves+specific+proline+sequences+in+LPXTG+cell+surface+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A novel secreted metalloprotease (CD2830) from Clostridium difficile cleaves specific proline sequences in LPXTG cell surface proteins.</a> Mol Cell Proteomics. 13 (5), 1231-1244 (2014).</li>
<li>Schacherl, M., Pichlo, C., Neundorf, I., Baumann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Basis+of+Proline-Proline+Peptide+Bond+Specificity+of+the+Metalloprotease+Zmp1+Implicated+in+Motility+of+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Structural Basis of Proline-Proline Peptide Bond Specificity of the Metalloprotease Zmp1 Implicated in Motility of Clostridium difficile.</a> Structure. 23 (9), 1632-1642 (2015).</li>
<li>Rawlings, N. D., Waller, M., Barrett, A. J., Bateman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MEROPS%3A+the+database+of+proteolytic+enzymes%2C+their+substrates+and+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">MEROPS: the database of proteolytic enzymes, their substrates and inhibitors.</a> Nucleic Acids Res. 42 (Release 10.0), D503-D509 (2014).</li>
<li>Bergfors, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeds+to+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Seeds to crystals.</a> J Struct Biol. 142 (1), 66-76 (2003).</li>
<li>Dauter, Z., Dauter, M., Dodson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jolly+SAD%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Jolly SAD.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 58 (Pt 3), 494-506 (2002).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XDS%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">XDS.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 2), 125-132 (2010).</li>
<li>Adams, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PHENIX%3A+a+comprehensive+Python-based+system+for+macromolecular+structure+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66, 213-221 (2010).</li>
<li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+and+development+of+Coot%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Features and development of Coot.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22The+PyMOL+Molecular+Graphics+System%22">The PyMOL Molecular Graphics System</a>. , Schrödinger, LLC. (2002).</li>
<li>Pettersen, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UCSF+Chimera--a+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comput+Chem%22%5BJournal%5D)">UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis.</a> J Comput Chem. 25 (13), 1605-1612 (2004).</li>
<li>Wang, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+of+phase+ambiguity+in+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Resolution of phase ambiguity in macromolecular crystallography.</a> Methods Enzymol. 115, 90-112 (1985).</li>
<li>McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C., Read, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phaser+crystallographic+software%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Phaser crystallographic software.</a> J Appl Crystallogr. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).</li>
<li>Zwart, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+structure+solution+with+the+PHENIX+suite%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Automated structure solution with the PHENIX suite.</a> Methods Mol Biol. 426, 419-435 (2008).</li>
<li>Zheng, H., Handing, K. B., Zimmerman, M. D., Shabalin, I. G., Almo, S. C., Minor, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+crystallography+over+the+past+decade+for+novel+drug+discovery+-+where+are+we+heading+next%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">X-ray crystallography over the past decade for novel drug discovery - where are we heading next?</a> Expert Opin Drug Discov. 10 (9), 975-989 (2015).</li>
<li>Rubino, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+characterization+of+zinc-bound+Zmp1%2C+a+zinc-dependent+metalloprotease+secreted+by+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Inorg+Chem%22%5BJournal%5D)">Structural characterization of zinc-bound Zmp1, a zinc-dependent metalloprotease secreted by Clostridium difficile.</a> J Biol Inorg Chem. 21 (2), 185-196 (2016).</li>
<li>Carson, M., Johnson, D. H., McDonald, H., Brouillette, C., Delucas, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((His-tag+impact+on+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">His-tag impact on structure.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 63 (Pt 3), 295-301 (2007).</li>
<li>Gasteiger, E., et al. Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGasteiger%2C+E+%22The+Proteomics+Protocols+Handbook%22">The Proteomics Protocols Handbook</a>. Walker, J. M. , Humana Press. 571-607 (2005).</li>
<li>Dummler, A., Lawrence, A. M., de Marco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+screening+for+the+detection+of+soluble+fusion+constructs+expressed+in+E.+coli+using+a+modular+set+of+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Cell+Fact%22%5BJournal%5D)">Simplified screening for the detection of soluble fusion constructs expressed in E. coli using a modular set of vectors.</a> Microb Cell Fact. 4, 34(2005).</li>
<li>Stura, E. A., Wilson, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+the+streak+seeding+technique+in+protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Crys+Growth%22%5BJournal%5D)">Applications of the streak seeding technique in protein crystallization.</a> J Crys Growth. 110 (1), 270-282 (1991).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Cristallografia a raggi X è ancora il metodo più veloce e più accurato per determinare tridimensionali strutture risoluzione quasi atomica delle proteine 28. Tuttavia, esso richiede la crescita di cristalli singoli ben ordinate. Questi sono spesso difficili da ottenere e stato cristallino è artificiale. Tuttavia, un confronto di strutture proteiche determinata mediante cristallografia a raggi X con quelle determinate con altri metodi, in particolare NMR, generalmente mostra un ottimo accordo. Nel caso di PPEP...

Clostridium difficile è una delle principali cause di infezioni nosocomiali diarrea associata agli antibiotici 1. Questo batterio anaerobico Gram-positivi si trasmette attraverso la sua forma di spore per via fecale-orale. Negli ultimi dieci anni, il nuovo &#39;&#39; epidemia &#39;&#39; o &#39;&#39; ipervirulento &#39;&#39; ceppi (ad es BI / NAP1 / 027) ha causato un drastico aumento delle nuove infezioni e il tasso di mortalità in Nord America e in Europa 2. C. malattia -associated difficile (CDAD) è un pericolo di vita infiammazione del colon con alti tassi di mortalità 3. I sintomi variano da diarrea 4 a colite pseudomembranosa 5 e il megacolon tossico spesso fatale 6. Il trattamento di CDAD è difficile in quanto i ceppi virulenti sono multi-resistente e il tasso di recidiva è alto 7. Al momento terapia include il metronidazolo antibiotici, fidaxomicina o vancomicina, o in repetitiVely casi ricorrenti di trapianto microbiota fecale. Nuove strategie terapeutiche sono urgentemente necessari 8. Alcuni progressi viene registrato come il anticorpo monoclonale terapeutico Bezlotoxumab, il targeting tossina di C. difficile B 9, ha recentemente superato con successo di fase III di sperimentazione clinica ed è stato depositato per l&#39;approvazione con la FDA ed EMA. Inoltre, nuovi antibiotici sono in fase di sperimentazione in questo momento nelle diverse fasi della sperimentazione clinica 10. Per sviluppare un trattamento efficace devono essere identificati nuovi bersagli terapeutici. La recente scoperta da C. difficile proteasi endopeptidasi-1 prolina-prolina (PPEP-1; CD2830 / Zmp1; EC 3.4.24.89) è un obiettivo così promettente, come la mancanza di PPEP-1 in un ceppo knock-out diminuisce la virulenza di C . difficile in vivo 11. PPEP-1 è una metalloproteasi secreta 12,13 fendendo due adesine C. difficile al loro C-terminale 13 liberando così il Bacter aderentiia dal epitelio intestinale umano. Pertanto, è coinvolto nel mantenere l&#39;equilibrio tra il fenotipo sessili e motilità di C. difficile. Per sviluppare inibitori selettivi contro PPEP-1 e per capire come riconosce i suoi substrati intima conoscenza della sua struttura tridimensionale è indispensabile. Abbiamo risolto la prima struttura cristallina di PPEP-1 solo e in complesso con un peptide substrato 14. PPEP-1 è la proteasi prima noto che selettivamente scinde i legami peptidici tra due residui di prolina 15. Si lega il substrato in doppio-piegato e stabilizza tramite una rete alifatico-aromatici estesa di residui ubicata nella S-ciclo che copre la proteasi sito attivo 14. Questa modalità substrato vincolante riservate PPEP-1 e non trovato in proteasi umane fino ad oggi. Questo lo rende un bersaglio promettente farmaco, e off-bersaglio effetti degli inibitori molto improbabili. Per sviluppare e schermo selettivo PPEP-1 inhibitors in futuro è necessario una grande quantità di puro e monodisperse PPEP-1 proteina. Inoltre, per determinare la modalità di legame dei primi inibitori, strutture co-cristalline con PPEP-1 dovrà essere determinato. Nelle nostre mani PPEP-1 produce costantemente cristalli intergrown. Così abbiamo sviluppato una procedura di ottimizzazione per produrre cristalli singoli di diffrazione qualità di PPEP-1. In questo protocollo si descrive in dettaglio la soluzione di produzione, purificazione, cristallizzazione e la struttura di PPEP-1 14. Usiamo espressione intracellulare in Escherichia coli di una variante PPEP-1 privo della sequenza segnale di secrezione, cromatografia di affinità e cromatografia ad esclusione sterica con la rimozione del tag purificazione, seguita da microseeding 16 in uno schermo ottimizzazione e determinazione della struttura tramite zinco singola lunghezza d&#39;onda di dispersione anomala (zinco-SAD) 17. Questo protocollo può essere adattato per la determinazione della struttura produttiva e di altre proteine (ad esempio &lt;/ Em&gt; metalloproteasi), in particolare per le proteine ​​che producono cristalli intergrown. Su richiesta, il plasmide DNA del costrutto (pET28a-NHIS-rPPEP-1) dati di diffrazione e può essere fornita per scopi didattici.

<table><tbody><tr><td>Genes / Vettori / ceppi cellulari</vettore strong></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pET28a</td><td>Merck-Millipore</td><td>69864</td><td>Thrombina clivable N-terminal His-tag<</td></tr><tr><td>em>E. coli ceppo BL21 (DE3) Star</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C601003</td> gene ottimizzato per il codone <td>carente di RNasi H</td></tr><tr><td>(per E. coli) di PPEP-1 (CD630_28300)</td><td>Geneart (Thermo Fisher Scientific)</td><td>aminoacidi personalizzati</td><td>27-220</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antischiuma B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5757</td><td>emulsione acquosa-siliconica</td></tr><tr><td>Agar</td><td>qualsiasi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kanamicina</td><td>qualsiasi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>AppliChem</td><td>A1008</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>AppliChem</td><td>A1087</td><td>Grado tampone</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>qualsiasi</td><td></td><td>grado tampone</td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>AppliChem</td><td>A3778</td><td></td></tr><tr><td>Imidazolo</td><td>AppliChem</td><td>A1073</td><td>Grado tampone</td></tr><tr><td>Trombina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4648</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di ammonio bibasico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>215996</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo 100%</td> di <td>qualsiasi</td><td></td><td>grado più puro</td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84097</td><td></td></tr><tr><td>Liquido azoto</td><td>qualsiasi</td><td></td><td>per lo stoccaggio e il crioraffreddamento dei cristalli</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Attrezzatura (generale)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubatore a scuotimento</td><td>qualsiasi</td><td></td><td>che fornisce temperature di 20 &deg; C - 37 &deg; C</td></tr><tr><td>Vetreria</td><td>qualsiasi</td><td></td><td>pallone di Erlenmeyer deflettore (50 ml - 2,8 L)</td></tr><tr><td>Centrifuga per grandi volumi di coltura</td><td>qualsiasi</td><td></td><td>centrifuga per la lavorazione di volumi fino a 12 L</td></tr><tr><td>Sonicatore Vibra-Cell VCX500</td><td>Sonics</td><td>SO-VCX500</td><td>o qualsiasi altro sonicatore / disgregatore cellulare</td></tr><tr><td>Ultracentrifuga</td><td>qualsiasi</td><td></td><td>centrifuga che fornisce velocità fino a 150.000 x g</td></tr><tr><td>Resina NiNTA Superflow</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vetro Vuoto Econo-Column</td><td>Bio-Rad</td><td>7371007</td><td>o qualsiasi altra colonna vuota in vetro o plastica</td></tr><tr><td>Colonna per cromatografia ad esclusione dimensionale HiLoad Superdex 200 16/600</td><td>GE Healthcare</td><td>28989335</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di cromatografia & Auml; kta Purifier</td><td>GE Healthcare</td><td>28406264</td><td>o qualsiasi altro sistema cromatografico</td></tr><tr><td>Tubi per dialisi Spectra/Por 3</td><td>Spectrum Labs</td><td>132724</td><td></td></tr><tr><td>Chiusure per tubi per dialisi</td><td>Spectrum Labs</td><td>132738</td><td></td></tr><tr><td>Unità di ultrafiltrazione (concentratori) 10.000 NWCO</td><td>qualsiasi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>spettrofotometro UV-Vis</td><td>qualsiasi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment (cristallografia)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetta a basso volume 0.1-10 &; l</td><td>qualsiasi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pipetta a spostamento positivo Microman M10</td><td>Gilson</td><td>F148501</td><td></td></tr><tr><td>Robot di cristallizzazione</td><td>qualsiasi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>piastra di cristallizzazione a 96 pozzetti TTP IQ con tre pozzetti proteici</td><td>TTP</td><td>4150-05810</td><td>o qualsiasi altra piastra di cristallizzazione a 96 pozzetti&nbsp;</td></tr><tr><td>Piastra CombiClover Junior a 24 pozzetti</td><td>Jena Bioscience</td><td>EB-CJR</td><td></td></tr><tr><td>Nastro sigillante cristallino</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-511</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini di copertura in vetro siliconato</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-225</td><td></td></tr><tr><td>Schermi di cristallizzazione commerciali: SaltRx, Index, PEG/Ion, Crystal</td><td>Hampton Research</td><td>diversi</td><td></td></tr><tr><td>Schermi di cristallizzazione commerciali: Wizard, PACT++, JCSG++</td><td>Jena Bioscience</td><td>diverse</td><td></td></tr><tr><td>JBS Beads-for-Seeds</td><td>Jena Bioscience</td><td>CO-501</td><td></td></tr><tr><td>CrystalCap SPINE HT (anelli di nylon)</td><td>Hampton Research</td><td>diverse</td><td>dimensioni dell'anello 0,025 mm - 0,5 mm</td></tr><tr><td>Fiala CrystalCap</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-904</td><td></td></tr><tr><td>Schiuma criogenica Dewar 800 ml</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-673</td><td></td></tr><tr><td>Schiuma criogenica Dewar 2 L</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-675</td><td></td></tr><tr><td>Morsetto per fiale, Dritto</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-670</td><td></td></tr><tr><td>CrystalWand Magnetico, Dritto</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-729</td><td></td></tr><tr><td>CryoCane 6 Supporto per fiale</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-711</td><td></td></tr><tr><td>CryoSleeve</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-708</td><td></td></tr><tr><td>CryoCane Color Coder - Bianco</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-713</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi</td><td>qualsiasi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropinza diritta</td><td>qualsiasi</td><td></td><td>per la manipolazione del nastro sigillante. ecc.</td></tr><tr><td>Ago per agopuntura</td><td>qualsiasi</td><td></td><td><>ad eses da una farmacia</td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>qualsiasi</td><td></td><td>per l'ispezione di piastre di cristallizzazione e montaggio del cristallo, ingrandimento fino a 160X</td></tr></tbody></table>

produzione, cristallizzazione e struttura determinazione<em&gt; c. difficile</em&gt; ppep-1 tramite microseeding e zinco-sad

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Sono necessarie nuove terapie per trattare le infezioni da Clostridium difficile che rappresentano una grave minaccia per la salute umana. La metalloproteasi PPEP-1 di C. difficile è un bersaglio per il futuro sviluppo di inibitori per ridurre la virulenza del patogeno. Per eseguire la caratterizzazione biofisica e strutturale, nonché lo screening degli inibitori, saranno necessarie grandi quantità di proteine pure e attive. Abbiamo sviluppato un protocollo per la produzione e la purificazione efficiente di PPEP-1 mediante l'uso di E. coli come ospite di espressione, che produce quantità e purezza sufficienti di proteine per la cristallizzazione e la determinazione della struttura. Inoltre, utilizzando la microsemina, i cristalli altamente intercresciuti di PPEP-1 possono essere coltivati fino a cristalli ben ordinati adatti per l'analisi della diffrazione dei raggi X. I metodi potrebbero anche essere utilizzati per produrre altre proteine ricombinanti e per studiare le strutture di altre proteine che producono cristalli intercoltivati.

rPPEP-1 è sovraespresso in molti ceppi di E. coli, con il più alto rendimento in E. coli BL21 (DE3) stella (Figura 1C). Dopo la prima fase di cromatografia di affinità NiNTA la 6xHis-tag può essere scisso con successo fuori dalla maggior parte delle proteine e nella seconda fase NiNTA proteina non digerita può essere completamente separato dal trombina digerito proteine (Figura 1D). Su un S200 16/600 colonna senza tag rPPEP-1 migra come...

Prolina-prolina endopeptidasi-1 (PPEP-1) è una metalloproteasi secreta e promettente bersaglio farmacologico del patogeno umano Clostridium difficile. Qui descriviamo tutti i metodi necessari per la produzione e la determinazione della struttura di questa proteina.

Produzione, Cristallizzazione e struttura Determinazione<em&gt; C. difficile</em&gt; PPEP-1 tramite Microseeding e Zinco-SAD

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di far crescere in modo efficiente cristalli di qualità di diffrazione su reticolo singolo della proteina ricombinante prolina prolina endopeptidasi-1, o rPPEP-1. Senza questo metodo, rPPEP-1 produce istantaneamente cristalli altamente interconnessi non adatti per l'analisi della diffrazione a raggi X. Il vantaggio principale di questa tecnica è che un elevato numero di cristalli ben ordinati e ben diffranti per la determinazione strutturale di rPPEP-1 può essere prodotto in un breve periodo di tempo e con un input di materiale limitato.Questa procedura utilizza il metodo della microcittà e può essere adattata per ogni condizione di cristallizzazione iniziale di successo di rPPEP-1 e dei suoi complessi peptidici di substrato. Questo metodo può essere adattato per produrre cristalli ben ordinati di praticamente tutte le proteine che producono cristalli intercoltivati. Può anche essere utilizzato in esperimenti di cross-seeding, varianza proteica o in esperimenti di cocristallizzazione con piccole molecole.La dimostrazione visiva della gestione dei metodi di cristallizzazione è fondamentale, poiché anche piccole variazioni possono ave

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Qui è descritta la procedura implementata nel gruppo membrana Caffrey Biologia Strutturale e Funzionale per impostare manualmente le prove di cristallizzazione delle proteine ​​di membrana in mesophases lipidico.

Cristallizzare proteine ​​di membrana per la determinazione della struttura utilizzando Mesophases lipidica

Structure-based drug design gioca un ruolo importante nello sviluppo di farmaci. Perseguire obiettivi multipli in parallelo aumenta notevolmente la probabilità di successo per la scoperta di lead. L'articolo che segue mette in evidenza come il Seattle Center Genomica strutturale di Malattie Infettive utilizza un approccio multi-obiettivo per la determinazione del gene-per-struttura della influenza PB2 A subunità.

Multi-target Parallel Processing Approccio per Gene-to-struttura Determinazione della polimerasi Influenza PB2 subunità

Fonte: Figueroa, D. M., et.al. Produzione e visualizzazione di sferoplasti e protoplasti batterici per caratterizzare la localizzazione di peptidi antimicrobici. J. Vis. Exp. (2018)Questo video mostra la produzione di sferoplasti di Escherichia coli inibendo prima la divisione cellulare per indurre la filamentazione, seguita dalla digestione enzimatica della parete cellulare. Il processo include l'aggiunta controllata di un agente chelante, la DNasi, e di uno stabilizzatore osmotico per...

Preparazione di E. coli Spheroplasts

Studi biofisici e biochimici delle interazioni tra membrane incorporate domini proteici affrontare molte sfide tecniche, di cui il primo è ottenere materiale idoneo di studio. Questo articolo descrive un protocollo per produrre e purificare disolfuro stabilizzate peptide transmembrana che sono adatti per l'analisi strutturale mediante risonanza soluzione magnetica nucleare (NMR) e altre applicazioni analitiche.

Produzione di disolfuro-stabilizzati peptide transmembrana per gli studi strutturali

β' le proteine della membrana esterna (OMP) svolgono molte funzioni all'interno delle membrane esterne di batteri Gram-negativi, mitocondri e cloroplasti. Qui, speriamo di alleviare un noto collo di bottiglia negli studi strutturali presentando protocolli per la produzione di OMP a β cilindri in quantità sufficienti per la determinazione della struttura mediante cristallografia a raggi X o spettroscopia NMR.

Da costrutti a cristalli - Verso Struttura Determinazione della β-canna esterna proteine ​​di membrana

È presentato un protocollo ottimizzato per l'esecuzione di un'ampia caratterizzazione biochimica e strutturale di una proteina carboidrato substrato da Streptococcus pneumoniae .

Caratterizzazione biochimica e strutturale del carboidrato trasporto substrato-proteina-SP0092

Qui presentiamo un protocollo per produrre gram-negativi Escherichia coli (Escherichia coli) Sferoplasti e Gram-positivo Bacillus megaterium (b. megaterium) protoplasti di visualizzare chiaramente e rapidamente caratterizzare interazioni del peptide-batteri. Questo fornisce un metodo sistematico per definire membrana localizzazione e dispostamento peptidi.

Produzione e visualizzazione di Sferoplasti batteriche e protoplasti di caratterizzare Peptide antimicrobico localizzazione

Descriviamo protocolli per la determinazione della struttura del dominio iKK-binding di NEMO dalla cristallografia a raggi X. I metodi includono l'espressione proteica, la purificazione e la caratterizzazione, nonché strategie per il successo dell'ottimizzazione dei cristalli e la determinazione della struttura della proteina nella sua forma non associata.

Produzione, cristallizzazione e determinazione della struttura del dominio iKK-binding di NEMO

Questo protocollo è stato sviluppato per studiare la transizione dimero-dodecamero di TmPep1050, un'amminopeptidasi M42, a livello strutturale. È una pipeline semplice che parte dalla purificazione delle proteine all'elaborazione dei dati a raggi X. La cristallogenesi, l'indicizzazione del set di dati e la sostituzione molecolare sono state enfatizzate attraverso un caso di studio, variante TmPep1050H60A H307A.

Cristallografia a raggi X per studiare la transizione di stato oligomerica della termotoga maritima M42 Aminopeptidasi TmPep1050

Viene descritto un dispositivo microfluidico versatile che consente la cristallizzazione di un enzima utilizzando il metodo di contro-diffusione, l'introduzione di un substrato nei cristalli mediante ammollo e la determinazione della struttura 3D del complesso enzima:substrato mediante un'analisi seriale dei cristalli all'interno del chip a temperatura ambiente.

Cristallizzazione e determinazione strutturale di un enzima:complesso di substrati mediante cristallografia seriale in un chip microfluidico versatile

La determinazione della struttura dei complessi macromolecolari utilizzando il crioEM è diventata di routine per alcune classi di proteine e complessi. Qui, questa pipeline è riassunta (preparazione del campione, screening, acquisizione ed elaborazione dei dati) e i lettori sono indirizzati verso ulteriori risorse dettagliate e variabili che possono essere modificate nel caso di campioni più impegnativi.

Microscopia crioelettronica a particella singola: dal campione alla struttura

Scopri il metodo di microseeding per ottenere cristalli di alta qualità di PPEP-1 di Clostridium difficile. Questa tecnica consente la determinazione strutturale mediante diffrazione a raggi X per studi di biologia strutturale.

Produzione, Cristallizzazione e struttura Determinazione

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