Produzione, Cristallizzazione e struttura Determinazione C. difficile PPEP-1 tramite Microseeding e Zinco-SAD

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di far crescere in modo efficiente cristalli di qualità di diffrazione su reticolo singolo della proteina ricombinante prolina prolina endopeptidasi-1, o rPPEP-1. Senza questo metodo, rPPEP-1 produce istantaneamente cristalli altamente interconnessi non adatti per l'analisi della diffrazione a raggi X. Il vantaggio principale di questa tecnica è che un elevato numero di cristalli ben ordinati e ben diffranti per la determinazione strutturale di rPPEP-1 può essere prodotto in un breve periodo di tempo e con un input di materiale limitato.

Questa procedura utilizza il metodo della microcittà e può essere adattata per ogni condizione di cristallizzazione iniziale di successo di rPPEP-1 e dei suoi complessi peptidici di substrato. Questo metodo può essere adattato per produrre cristalli ben ordinati di praticamente tutte le proteine che producono cristalli intercoltivati. Può anche essere utilizzato in esperimenti di cross-seeding, varianza proteica o in esperimenti di cocristallizzazione con piccole molecole.

La dimostrazione visiva della gestione dei metodi di cristallizzazione è fondamentale, poiché anche piccole variazioni possono avere un impatto significativo sulla qualità della diffrazione dei cristalli. Eseguire prove di cristallizzazione nel formato a goccia seduta utilizzando schermi standard disponibili in commercio e un robot di cristallizzazione. Innanzitutto, concentrare la proteina purificata a 12 milligrammi per millilitro utilizzando un dispositivo di ultrafiltrazione centrifuga a intervalli di cinque minuti a 4000 volte g e quattro gradi Celsius.

Mescolare le proteine dopo ogni intervallo per prevenire la precipitazione e l'aggravamento. Determinare la concentrazione proteica a 280 nanometri utilizzando il coefficiente di estinzione di 25.900 per centimetro molare. Dopo aver bilanciato la proteina a 20 gradi Celsius, eliminare tutte le particelle e la polvere mediante centrifugazione per 10 minuti a 16000 volte g e 20 gradi Celsius.

Per eseguire schermi di cristallo, utilizzare piastre di cristallizzazione preriempite sigillate e conservate a quattro gradi Celsius. Quando si impostano le prove, lavorare rapidamente, poiché i piccoli volumi si asciugano rapidamente. Se possibile, utilizzare anche una camera di umidità attorno al dock del robot.

Dopo aver bilanciato tutte le piastre di cristallizzazione a 20 gradi Celsius, impostare lo schermo pipettando il serbatoio dell'otorinolaringoiatria proteica nei sottopozzetti da due a quattro. Utilizzare un volume di goccia di 300 nanolitri. Utilizzare rapporti proteine/serbatoio di 200:100 per il sottopozzo due, 150:150 per il sottopozzo tre e 100:200 per il sottopozzo quattro.

Sigillare immediatamente il piatto e metterlo in una camera a 20 gradi centigradi. Ispezionare i vassoi dopo l'installazione ogni giorno durante la prima settimana e poi seguire con l'ispezione settimanale. Per una cocristallizzazione dei complessi peptidici rPPEP-1 del substrato, miscelare rPPEP-1 a 24 milligrammi per millilitro in un rapporto 1:1 con un eccesso di sette volte molare di soluzione peptidica in polvere liofilizzata solubilizzata in soluzione salina tamponata tris.

Dopo l'incubazione per 30 minuti a 20 gradi Celsius, eliminare tutte le particelle e la polvere mediante centrifugazione per 10 minuti a 16000 volte g e 20 gradi Celsius. Procedere con la cristallizzazione utilizzando la stessa procedura di microsemina della proteina rPPEP-1 non legata. Cristalli altamente intersecati di rPPEP-1 sono comparsi dopo due giorni in una condizione contenente 2,4 molari di fosfato di ammonio bibasico e 0,1 molari trisapseal pH 8,5.

Per ottimizzare la condizione iniziale, utilizzare un software per calcolare i volumi e lo schema di pipettaggio per ottenere due millilitri di ciascuna condizione che consente 10 schermate di ottimizzazione. Le condizioni includono da 1,8 a 2,55 molari di fosfato di ammonio bibasico in incrementi di 0,15 molari e 0,1 molari trisapseal con pH da 7,5 a 9,0 in incrementi di 0,5 unità di pH. Preparare una griglia comprendente 24 condizioni da soluzioni stock.

Utilizzare lo schema di pipettaggio per comporre le singole condizioni. Pipettare 200 microlitri di ogni soluzione di grigliatura nei pozzetti di una piastra a 24 pozzetti ed equilibrare la piastra a 20 gradi Celsius. Impostare manualmente la piastra di cristallizzazione.

Utilizzare un volume di gocce di tre microlitri e un rapporto proteine/serbatoio di 2:1, 1,5:1:5 e 1:2. In questo caso, utilizzare una pipetta a spostamento positivo per evitare la formazione di bolle d'aria. Sigillare immediatamente la piastra.

Quindi posizionare il piatto in una camera a 20 gradi Celsius. Dopo uno o quattro giorni, i cristalli altamente intercresciuti di rPPEP-1 compaiono nelle quattro condizioni contenenti 2,55 molari di fosfato di ammonio bibasico e 0,1 molari trisapseal con pH da 7,5 a 9,0, mentre nelle restanti 20 condizioni non si formano cristalli. Eseguire la procedura di microsemina per ottenere singoli cristalli di rPPEP-1 in queste condizioni.

Per preparare un ceppo di microsemi, scegli prima un singolo cristallo intercoltivato da una delle condizioni di successo. Quindi, trasferire 50 microlitri del rispettivo liquore madre in un tubo da 1,5 millilitri contenente una piccola perla di vetro altamente lucidata e un microlitro di liquore madre sul vetrino di copertura. Utilizzando un lubrificante di nylon montato, estrarre il cristallo e trasferirlo nella goccia sul vetrino di copertura.

Quindi trasferire il liquido contenente il cristallo nel tubo e vorticare ad alta velocità per 30 secondi, assicurandosi che la perla di vetro stia vorticando. Effettuare una diluizione 1:1000 del brodo di semi in un nuovo tubo da 1,5 millilitri contenente la stessa condizione appena preparata e agitare accuratamente per cinque secondi. Quindi, rimuovere il sigillo della piastra coprendo le 20 condizioni con gocce trasparenti.

Pipettare 0,5 microlitri di stock di semi nei pozzetti. Sigillare il piatto e metterlo in una camera a 20 gradi centigradi. Dopo l'applicazione di questa tecnica di microsemina, singoli cristalli di alta qualità di diffrazione appaiono da diverse ore a diversi giorni dopo l'installazione in varie condizioni, contenenti da 1,8 a 2,4 molari di fosfato ammonico e 0,1 molari tris pH da 7,5 a nove.

I cristalli crescono fino a una dimensione da 100 a 200 micron nella dimensione più grande. Scegli la dimensione ottimale dell'anello di nylon per la lunghezza massima dei cristalli scelti posizionando l'anello sul nastro sigillante appena sopra il cristallo e concentrandoti su e giù. L'accesso più lungo tipico dei cristalli rPPEP-1 è di circa 100-200 micron.

Preparare anche la criocondizione appropriata. Riempire i dewer di schiuma con azoto liquido. Quindi caricare la pinza per fiala con una fiala e preraffreddarla nel dewer di schiuma da 800 millilitri riempito di azoto liquido.

Posizionare un supporto per criocane contrassegnato con un identificatore adatto e una criomanica nel dewer di schiuma da due litri riempito di azoto liquido. Quindi caricare la bacchetta magnetica con l'anello di nylon montato della giusta misura. Quindi, tagliare il nastro sigillante sulla piastra di cristallizzazione con un bisturi affilato e rimuoverlo con una pinza.

Pipettare un microlitro di criocondizione sul vetrino di copertura. È particolarmente importante lavorare rapidamente in questa fase, poiché l'essiccazione del cristallo o del piccolo volume di criosoluzione nel circuito potrebbe portare a fluttuazioni della qualità del cristallo o addirittura a una completa perdita di diffrazione. Tutte le fasi di manipolazione dei cristalli devono essere eseguite sotto lo stereomicroscopio.

Se il cristallo si attacca alla superficie di plastica, staccarlo da terra deformando la plastica circostante con un ago per agopuntura. Rimuovere il cristallo dalla goccia pescandolo con l'anello di nylon montato. Trasferisci rapidamente il cristallo nella goccia di criocondizione e lascialo equilibrare per un secondo.

Quindi pesca il cristallo dalla goccia con l'anello di nylon montato il più rapidamente possibile. Immergere immediatamente e congelare il cristallo recuperato in azoto liquido. Quando l'azoto liquido attorno all'anello montato smette di bollire, posizionare l'anello nella fiala.

Posizionare la fiala sul supporto della criocane. Una volta caricato il supporto con sei fiale, posizionare una criomanica attorno al supporto. Conservare i cristalli in un serbatoio riempito con azoto liquido fino al momento dell'uso.

Per eseguire la raccolta dei dati, recuperare con cura il cristallo montato dal criocano utilizzando un morsetto e conservarlo in una ghiandola di schiuma per il trasporto. Spostare l'arresto del raggio e il rilevatore in posizione di parcheggio e spostare il criougello verso l'alto di alcuni millimetri. Montare la base del cryocap sulla testa del goniometro tenendo la base con le dita e rimuovendo rapidamente la fiala.

Quindi spostare l'ugello criogenico e l'arresto del raggio in posizione e centrare il cristallo. In ogni momento, fare attenzione a non toccare l'arresto del raggio o il rilevatore. Procedere con la raccolta del set di dati a 180 gradi con un angolo di oscillazione di 0,1 gradi, come mostrato di seguito.

Qui sono mostrati cristalli di rPPEP-1 altamente intercresciuti ottenuti dallo screening iniziale utilizzando schermi di cristallizzazione commerciali in 1,4 citrato di sodio tribasico diidrato, 0,1 molare HEPES sodico, pH 7,5. Qui sono mostrati cristalli ottenuti dallo screening iniziale con 60% di volume in volume tacsimato, pH 7,0, propano BIS-TRIS molare 0,1, pH 7,0. I cristalli sono apparsi anche in 2,4 molari di fosfato di ammonio bibasico, 0,1 molare tris, pH 8,5.

Dopo aver applicato la procedura di ottimizzazione della microsemina, i singoli cristalli sono stati contenuti in diverse condizioni, tra cui 2,1 molari di fosfato di ammonio bibasico, 0,1 molare tris, pH 8 e 2,25 molari di fosfato di ammonio bibasico, 0,1 molare tris, pH 8. I cristalli montati in anelli di nylon hanno una dimensione compresa tra 100 e 200 micron e sembrano avere un unico reticolo dall'ispezione microscopica. L'analisi della diffrazione dei raggi X mostra che questi cristalli mostrano effettivamente un singolo reticolo e diffrangono i raggi X a una risoluzione quasi atomica.

La risoluzione della struttura cristallina del complesso peptidico del substrato ricombinante di PPEP-1 fornisce informazioni sulla modalità di legame del substrato di PPEP-1. Il peptide del substrato potrebbe diffondersi nel gruppo di legame del substrato di PPEP-1 nella sua conferma aperta. Quindi, quando si verificherebbe la chiusura dell'anello, il substrato interagisce con PPEP-1 tramite legami idrogeno e l'esclusiva rete di catene laterali alifatico-aromatiche situata sull'S-loop.

Il substrato si lega in un'unica conformazione a doppia piega con pieghe al legame peptidico sfrigolante e al legame peptidico P2 prime a P3 prime. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come produrre cristalli diffranti a reticolo singolo di PPEP-1 ricombinante per studi strutturali. Approcci simili possono essere utilizzati con altre proteine, producendo cristalli altamente intercresciuti e un'ulteriore temperatura di incubazione variata e diluizione del C-stock.

Grazie alla sua versatilità e semplicità d'uso, questa semplice tecnica dovrebbe essere provata in ogni processo di ottimizzazione dei cristalli.