Produktion, Kristallisering och strukturbestämning av Published: December 30, 2016 doi: 10.3791/55022

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Christian Pichlo¹, Angelika A. Montada¹, Magdalena Schacherl¹, Ulrich Baumann¹

¹Institute of Biochemistry, University of Cologne

Introduction

Clostridium difficile är en av de viktigaste orsakerna till sjukhus antibiotika-associerad diarré infektioner ^1. Detta grampositiva anaeroba bakterien överförs genom sitt spor form via fekal-oralt. Under det senaste decenniet, nya "" epidemi " 'eller' 'hypervirulent' 'stammar (t.ex. BI / NAP1 / 027) orsakade en drastisk ökning av nya infektioner och dödligheten i Nordamerika och Europa ^2. C. difficile -associated sjukdom (CDAD) är en livshotande kolon inflammation med hög dödlighet ^3. Symptomen varierar från diarré ⁴ till pseudomembranös kolit ⁵ och ofta dödlig toxisk megakolon ^6.

Behandling av CDAD är svårt eftersom de virulenta stammar är multiresistenta och återfallsfrekvensen är hög ^7. Just nu terapi inkluderar antibiotika metronidazol, fidaxomicin eller vankomycin, eller i repetitidevis återkommande fall fekal mikrobiota transplantation. Nya behandlingsstrategier finns ett stort behov ^8. Vissa framsteg registreras som den terapeutiska monoklonala antikroppen Bezlotoxumab, med inriktning på C. difficile toxin B ^9, har nyligen klarat kliniska fas III-studier och ansökt om godkännande hos FDA och EMA. Dessutom är nya antibiotika testas just nu i olika stadier av kliniska prövningar ^10.

Att utveckla effektiv behandling nya terapeutiska mål måste identifieras. Den nyupptäckta C. difficile proteas prolin-prolin endopeptidas-1 (PPEP-1, CD2830 / Zmp1, EC 3.4.24.89) är en sådan lovande mål, eftersom bristen på PPEP-1 i en knock-out-stammen minskar virulens hos C . difficile in vivo ^11. PPEP-1 är ett utsöndrat metalloproteas ^12,13 klyva två C. difficile adhesiner vid sina C-terminus ¹³ därmed frigör vidhäftande bacterbl.a. från den mänskliga tarmen epitel. Därför är det involverat i att upprätthålla balansen mellan fastsittande och rörliga fenotyp av C. difficile. Att utveckla selektiva hämmare mot PPEP-1 och för att förstå hur den känner igen sina substrat ingående kunskap om dess tredimensionella strukturen oumbärlig. Vi har löst den första kristallstrukturen för PPEP-1 ensamma och i komplex med en substratpeptid ^14. PPEP-1 är den första kända proteas som selektivt klyver peptidbindningar mellan två prolinrester ^15. Det binder substratet i en dubbel-kinked sätt och stabiliserar den via en utsträckt alifatisk-aromatisk nätverk av rester belägna i S-slinga som täcker proteaset aktiva stället ^14. Detta substrat-bindningssätt är unikt för PPEP-1 och inte återfinns i humana proteaser hittills. Detta gör det till ett lovande läkemedelsmål och off-target effekterna av inhibitorer mycket osannolikt.

Att utveckla och skärm selektiv PPEP-1 invibitors i framtiden behövs en stor mängd av rent och monodispersa PPEP-1-proteinet. Vidare, för att bestämma läget av bindning av första inhibitorer, co-kristallstrukturer med PPEP-1 kommer att behöva bestämmas. I våra händer PPEP-1 producerar ständigt sammanväxta kristaller. Således har vi utvecklat en optimeringsprocedur för att producera enskilda diffraktion kvalitet kristaller av PPEP-1. I detta protokoll beskriver vi i detalj produktion, rening, kristallisation och struktur lösning av PPEP-en ^14. Vi använder intracellulär uttryck i Escherichia coli av en PPEP-1-varianten saknar sekretionssignalsekvens, affinitetskromatografi och gelkromatografi med borttagning av reningsmarkör, följt av microseeding ¹⁶ till en optimering skärm och strukturbestämning via zink enda våglängd avvikande dispersion (zink-SAD) ^17. Detta protokoll kan anpassas för produktion och strukturbestämning av andra proteiner (t.ex. </ Em> metalloproteaser), särskilt för proteiner som producerar sammanväxta kristaller. På begäran, plasmid DNA från konstruktionen (pET28a-NHis-rPPEP-1) och diffraktion uppgifter kan tillhandahållas för utbildningsändamål.

Protocol

1. Kloning och Construct Design

1. Klona kodon-optimerad sekvens (för E. coli) av C. difficile PPEP-1 utan signalpeptiden [aminosyrorna 27-220, heter hädanefter rekombinant PPEP-1 (rPPEP-1) ^11] i pET28a vektor med hjälp av Ndel och Xhol-restriktionsställen (figur 1) med ett stoppkodon vid 3'-änden (resulterande vektorn pET28a-NHis-rPPEP-1). Detta ger en N-terminalt 6 x His-märkt protein (NHis-rPPEP-1) med ett trombinklyvningsställe som tillåter avlägsnande av taggen under rening (figur 1). Plasmiden innehåller en kanamycinresistens kassett för selektion. De primrar som användes för kloning beskrivs på annan plats ^14.

Figur 1: Schematisk representation av konstruktion av pET28a-NHis-rPPEP-1 och SDS-PAGE-analys av expression och alla reningssteg. (A) Vector karta över NHis-rPPEP-1 klonad in pET28a vektor med hjälp av Ndel / Xhol skapade med PlasMapper. (B) Schematisk representation av NHis-rPPEP-1-konstruktionen (övre panel) och den slutliga konstruktionen efter trombin-klyvning av 6xHis-tag med den resulterande ytterligare GSHM-sekvensen vid N-terminalen (lägre panelen). SDS-PAGE-analys (C) av uttrycket i BL21 (DE3) Star vid 37 ° C under 4 h och (D) av prover från alla reningssteg (M: molekylviktsmarkör). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

2. Expression och rening av rPPEP-1

1. Expression av NHis-rPPEP-1
   1. Smink och autoklav LB (lysogeni buljong) medium (10 g / L trypton, 5 g / L jästextrakt, 10 g / L NaCl, justerbast till pH 7,5 med NaOH). Komplettera med kanamycinsulfat (50 | ig / ml) omedelbart före användning (LB / Kan-medium).
   2. Inokulera en 200 ml övernattskultur från nyligen transformerade E. coli i LB / Kan-medium. Växa över natten vid 37 ° C med skakning vid 220 rpm.
   3. På nästa morgon, ta OD ₆₀₀ (optisk densitet vid 600 nm våglängd) av övernattskulturen. Ympa två 2,8 L förbryllad kolvar innehållande en L LB / Kan-medium vardera med nattskultur till en OD ₆₀₀ på 0,1. Komplettera med tre droppar av vattenbaserad silikonemulsion för att förhindra överdriven skumbildning. Odla cellerna vid 37 ° C skakning vid 180 rpm till dess att OD ₆₀₀ når 0,6.
   4. Ta en pre-induktion prov för SDS-PAGE-analys (ekvivalent av 1 ml från en kultur vid OD ₆₀₀ = 1); lägga IPTG till 0,5 mM slutlig koncentration för att inducera uttryck av NHis-rPPEP-1. Fortsätta växa vid 37 ° C / 180 rpm under 4 timmar.
   5. Bestäm OD ₆₀₀ i en 10x dilution och ta en skörd prov (ekvivalent på 1 ml från en kultur vid OD ₆₀₀ = 1).
   6. Samla cellerna genom centrifugering under 20 min vid 7000 xg och 4 ° C. För att avlägsna kvarvarande LB-medium resuspendera cellpelletar från en L av kultur i 40 ml TBS-buffert (Tris-buffrad saltlösning: 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 200 mM NaCl) och överför till en 50 ml centrifugrör. Samla cellerna genom centrifugering under 10 min vid 10000 xg och 4 ° C och förvara vid -80 ° C fram till användning. Analysera uttryck (totalt lysat och lösliga fraktioner) via SDS-PAGE ^18.
2. Rening av omärkta rPPEP-1
   1. Ta 50 ul prover av varje reningssteg för SDS-PAGE-analys. Resuspendera cellpelleten från 1 L av kulturen i TBS-buffert kompletterad med 10 | ig / ml DNasI. Använd 5 ml TBS / DNasI per g celler.
      1. Lyserar cellerna genom sonikering på is / vatten med användning av 30% amplitud under 15 min (2 sec pulser med 2 sek paus). Ta bort skräp från centrifugation under 10 min vid 10000 xg och 4 ° C och avsättning supernatanten till ett ultracentrifugrör. Klart lysat i en ultracentrifug under 30 minuter vid 165.000 xg och 4 ° C.
   2. Arbetet vid 4-6 ° C. Användning av en peristaltisk pump eller kromatografisystem jämvikta 2 ml av nickel-nitrilotriättiksyra (NiNTA) harts i en glaskolonn med TBS-buffert kompletterad med 10 mM imidazol pH 7,5. Alternativt kan du använda gravitationsflöde.
      1. Justera klarnat lysat med 1 M imidazol pH 7,5 till en slutlig koncentration av 10 mM. Applicera lysatet till kolonnen och tvätta stegvis med TBS-buffert som kompletterats med 10 mM och 30 mM imidazol, respektive, till dess att UV-absorption vid 280 nm har nått baslinjen.
      2. Eluera proteinet med TBS buffert plus 250 mM imidazol. Åter jämvikt kolumnen till TBS kompletterat med 10 mM imidazol och lagra över natten.
   3. Bestämma proteinkoncentrationen antingen vid 280 nm genom att använda utsläckningen coeffitivt av 25.900 M ^-1 cm ^-1 eller genom någon annan metod (t.ex. Bradford-metoden ^19). Tillsätt 2 enheter trombin per mg protein och dialysera proteinlösningen över natten vid 4 ° C mot en 50x volym av TBS (50x i NiNTA elueringsvolymen).
      OBS: Ta rätt ämne för bestämning av proteinkoncentration, som imidazol absorberar starkt vid 280 nm.
   4. Passera proteinlösningen över jämviktad NiNTA harts för att avlägsna ospaltat protein. Därefter tillämpa samma volym TBS kompletterat med 10 mM imidazol till kolonnen för att återställa alla kluvna protein. För att rengöra kolonnen, eluera alla återstående protein med 250 mM imidazol. Analysera prov via SDS-PAGE (figur 1).
   5. Koncentrera proteinlösningen till 4 ml i 10 min intervaller vid 4000 xg och 4 ° C med användning av en centrifugal ultrafiltreringsenhet. Blanda koncentrera proteinet efter varje intervall för att förhindra utfällning och aggregation. I detta steg tillfälligly viss utfällning observeras för rPPEP-1 trots blandningsförfarandet.
      1. Applicera den koncentrerade proteinet till en i förväg jämviktad storleksuteslutande kromatografi-kolonn (i TBS-buffert) vid 4-6 ° C. Eluera kolonnen med TBS-buffert, samla fraktioner om 1 ml och föremål 5 | il av varje andra fraktionen för SDS-PAGE-analys. rPPEP-1 eluerar i en enda topp motsvarande en monomer (fig 2). Ibland en mindre topp vid större molekylvikt observeras (fronting topp), som motsvarar en dimer av proteinet. Utbytet bör vara cirka 50 mg rent protein per liter kultur. Analysera alla prover via SDS-PAGE ¹⁸ (figur 2).

Figur 2: Representant storleksuteslutande kromatografi och SDS-PAGE-analys av rPPEP-1. Storlek utanförskap kromatogram (A280; absorbans vid 280 nm) för renad omärkt rPPEP-1 med användning av en (16/600) kolonn i Tris-HCl, pH 7,5, 200 mM NaCl vid 6 ° C. Baserat på elueringsvolymen, rPPEP-1 migrerar som förväntat för ett protein 22 kd, vilket tyder på att det är övervägande mono. Sällan en mindre fronting topp uppträder som motsvarar en dimer. (Infälld) SDS-PAGE-analys av fraktionerna från storleksuteslutande kromatografi (M; molekylviktsmarkör). Varannan fraktion appliceras. De svaga band under huvud rPPEP-1 band motsvarar ibland förekommer mindre föroreningar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

3. Kristallisering och Crystal optimering Använda Microseeding

OBS: rPPEP-1 kristalliserar ur förhållanden som ständigt producera mycket sammanväxta kristaller som inte är lämpliga för röntgendiffraktion analys (Figur 3). Därför var en optimering strategi (Figur 4) utvecklats för att med hög kvalitet kristaller (Figur 5).

1. Initial screening av rPPEP-1 med användning av kommersiella skärmar
   OBS: Genomför kristallisering prövningar i sittande droppe format med standard kommersiellt tillgängliga skärmar och en kristallisationsrobot.
   1. Koncentrera det renade proteinet till 12 mg / ml med användning av en centrifugal-ultrafiltreringsanordning i 5 minuters intervall vid 4000 xg och 4 ° C. Blanda koncentrera proteinet efter varje intervall för att förhindra utfällning och aggregation. Bestämma proteinkoncentrationen antingen vid 280 nm genom att använda extinktionskoefficienten av 25.900 M ^-1 cm ^-1 eller genom någon annan metod (t.ex. Bradford-metoden). Jämvikta proteinet till 20 ° C. Rensa bort alla partiklar och damm genom centrifugering under 10 min vid 16000 x g och 20 ° C.
   2. Antingen använda redan förfyllda kristallisaplattor SEAled och lagrades vid 4 ° C eller fylla behållaren brunnarna i plattorna med 70 | il av varje kristallisationstillstånd. Jämvikt alla kristallisaplattor till 20 ° C. Arbeta snabbt, eftersom de små volymer snabbt torka ut. Använda en fuktkammare runt dockan av roboten, om möjligt.
      OBS: Använd följande skärmar som ett standardförfarande: SaltRx, Index, PEG / Ion, Crystal, Wizard, PACT ++, JCSG ++.
   3. Ställ in skärmen genom att pipettera protein och reservoaren in subwells 2-4. Droppvolymen är 300 nl och förhållandena (protein: reservoar) är 200: 100 (subwell 2), 150: 150 (subwell 3) och 100: 200 (subwell 4) (i NL). Omedelbart försegla plattan och lägg i en kammare vid 20 ° C.
   4. Inspektera brickor omedelbart efter set-up, och sedan inspektera varje dag under den första veckan, följt av veckovisa inspektioner.
2. Sam-kristallisation av rPPEP-1 med ligander
   1. För samtidig kristallisering av substratpeptid-rPPEP-1-komplex blanda rPPEP-1vid 24 mg / ml i en 1: 1-förhållande (vol / vol) med en 7-faldigt molärt överskott av peptidlösning (Ac-EVNPPVPD-NH ₂₎ lyofiliserat pulver lösliggjordes i TBS-buffert), vilket kommer att ge en slutlig koncentration av 12 mg / ml r-PPEP-1-protein och en 7-faldigt molärt överskott av peptid över PPEP-1. Inkubera i 30 min vid 20 ° C och rensa bort alla partiklar och damm genom centrifugering under 10 min vid 16000 x g och 20 ° C. Fortsätta med kristallisation med användning av microseeding förfarande som beskrivits för den obundna r-PPEP-1-proteinet.

Figur 3: representativa kristaller från första skärmar. Sammanväxta kristaller från rPPEP-1 vid 12 mg / ml odlades i skick. (A) Crystal skärm I / 38 (1,4 M natriumcitrat tribasiskt torka, 0,1 M HEPES natrium pH 7,5; 200 nl: 100 NL). (B) SaltRx skärm / 52 (2,4 M ammoniumfosfat DIBASIC, 0,1 M Tris, pH 8,5; 100 nl: 200 nl) och (C) (200 nl: 100 nl). (D) SaltRx skärm / 96 (60% volym / volym Tacsimate pH 7,0, 0,1 M bis-Tris propån pH 7,0; 200 nl: 100 nl). Skala bar = 0,2 mm. Volymförhållanden är alltid protein: reservoar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4: Optimering förfarande för rPPEP-en kristallisation. Initiala kristaller från rPPEP-1 vid 12 mg / ml låg diffraktion kvalitet och med flera gitter (sammanväxt) reproducerades i en 24-condition optimering skärmen. Återigen var det bara sammanväxta kristaller observerats under förhållanden som innehåller 2,55 M ammoniumfosfat dibasisk. En startkultur framställdes från en enda sammanväxt kristall och späddes 1: 1000 i samma conditjon (microseeding). En volym av 0,5 pl av den utspädda fröunderlag sattes till de återstående klara droppar och enkristaller ökade i nästan alla förhållanden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

3. Kristall optimeringen med hjälp microseeding
   OBS: Mycket sammanväxta kristaller av rPPEP-1 visas efter två dagar i ett tillstånd innehållande 2,4 M ammoniumfosfat dibasisk, 0,1 M Tris-HCl, pH 8,5 (SaltRx skärm, tillstånd E4, alla tre subwells) (Figur 3). En optimeringsprocedur med användning av ett rutnät skärm runt det initiala tillståndet i kombination med microseeding applicerades (Figur 4).
   1. Förbered en gallerskärm (Figur 4) bestående av 24 förhållanden med 1,8-2,55 M ammoniumfosfat dibasisk (i steg om 0,15 M) och 0,1 M Tris-HCI pH 7,5 till 9,0 (i steg om 0,5 pH-enheter) från lämpåt stamlösningar (4 M ammoniumfosfat och 1 M Tris buffertar).
      OBS: Använd Make magasin applet (http://hamptonresearch.com/make_tray.aspx) för att beräkna volymer och pipetteringssystemet för att erhålla 2 ml av varje villkor som gör det möjligt att utföra 10 optimerings skärmar. 4 M ammoniumfosfat stamlösning är svårt att förbereda sig. Värm lösningen under omrörning till fullständig upplösning av pulvret i vatten.
   2. Pipettera 200 | il av varje skärmgallret lösning i brunnarna på en 24-brunnars platta och jämvikt vid 20 ° C.
   3. Manuellt ställa in kristalliseplattan. Droppvolymen är 3 | il och förhållandena (protein: reservoar) är 2: 1, 1,5: 1,5 och 1: 2 (i | j, l). Här kan du använda en förträngnings pipett för att undvika luftbubbelbildning. Omedelbart försegla plattan och lägg i en kammare vid 20 ° C. Undvik luftbubbelbildning.
      OBS: Efter en till fyra dagar mycket sammanväxta kristaller visas i de fyra villkoren som innehåller 2,55 M ammonium phofosfat dibasisk och 0,1 M Tris-HCl pH 7,5 till 9,0 (figur 4). Inga kristaller bildas i de återstående 20 betingelser med ammonium-fosfatkoncentrationer under 2,55 M. microseeding procedur används för att erhålla enkristaller av rPPEP-1 under dessa förhållanden.
   4. Förbered en microseed lager genom att skörda en enda sammanväxt kristall från en av de två villkor med 2,55 M ammoniumfosfat dibasisk och 0,1 M Tris-HCI pH 8,0 eller 8,5. Kristallerna kan fästas till plastytan. Noggrann deformering av omgivande plast med en akupunkturnål hjälper till att lösgöra kristallerna.
      1. Överför 50 ul av den respektive moderluten till ett 1,5 ml rör innehållande en liten högpolerat glaspärla (pärlor-for-frön). Med användning av ett monterat nylonslinga överföra kristallen i 1 pl av moderluten placeras på en glaslocket.
      2. Överför vätskan innehållande kristallen in i röret och virvla vid hög hastighet under 30 sek. Gör en 1:1000 spädning av startkultur i en ny 1,5 ml rör innehållande samma nyberedda skick och vortexa grundligt i 5 sekunder.
         OBS: Fröer lager kan förvaras vid -80 ° C för senare användning.
   5. Avlägsna förseglingen av plattan som täcker de 20 villkor med tydliga droppar och pipett 0,5 mikroliter av fröunderlag (1: 1000 utspädning) i brunnarna. Förslut plattan och placera det i en kammare vid 20 ° C. Enkristaller av hög diffraktion kvalitet visas i 2-7 dagar (Figur 5).

Figur 5: representativa kristaller från optimering skärmen. Enkristaller från rPPEP-1 vid 12 mg / ml ympad med 1: 1000-spädning fröunderlag odlas i följande förhållanden: (A) 2,1 M ammoniumfosfat dibasisk, 0,1 M Tris pH 7,5; 1,5 pl: 1,5 pl; (B) 2,1 M ammoniumfosfat dibasisk, 0,1 M Tris pH 7,5; 2 ^: 1 ^ il; (C) 2,25 M ammoniumfosfat dibasisk, 0,1 M Tris pH 8; 2 ^: 1 ^ il; (D) 2,1 M ammoniumfosfat dibasisk, 0,1 M Tris pH 8; 1 | il: 2 | il. (E) Monterad kristall i 0,1-0,2 um nylonslinga, som odlas i 2,1 M ammoniumfosfat dibasisk, 0,1 M Tris pH 8 (2 pl: 1 l) och Cryo-skyddad 2,1 M ammoniumfosfat dibasisk, 0,1 M Tris pH 8, 20% glycerol. Skala bar = 0,2 mm (AD). Volym ranson är alltid protein: reservoar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

4. Crystal Montering och datainsamling

OBS: För att få bästa kvalitet på diffraktion uppgifter kristaller ska monteras på toppen av deras kvalitet och storlek. Kristaller kan lagras i flytande kväve tills de are utsattes för röntgendiffraktion analys vid 100 K. Därför måste tillstånd som de har sitt ursprung anpassas till Cryo-förhållanden. rPPEP-1-kristaller kan vara Cryo-skyddas genom tillsats av antingen 20% glycerol eller 30% sackaros (ersättning av vatten i det skick av kryo-skyddande medel).

1. kristall montering
   OBS: Alla kristall manipulationssteg bör utföras under stereomikroskop.
   1. Välja den optimala storleken av nylon slinga för den maximala längden av de valda kristaller. Den typiska längsta axel rPPEP-1-kristaller är ca 100 till 200 | j, m (Figur 5). Förbered en täck- och lämplig Cryo-tillstånd (t ex 2,1 M ammoniumfosfat dibasisk, 0,1 M Tris, pH 8,0, 20% glycerol).
      1. Fyll skum Dewars med flytande kväve, ladda flaskan klämma med en flaska och pre-låt det svalna i flytande kväve fylld 800 ml skum Dewar. Placera en kryo hylsa och en Cryo käpphållare märkt med en lämplig identifierarei flytande kväve fylld 2 L skum Dewar. Fyll magnetstaven med en monterad nylonslinga.
         OBS: Använd skyddskläder (Eyeshield / glasögon, handskar) vid arbete med flytande kväve. Varma föremål störtade ner i flytande kväve kan ge spill.
   2. Skär öppna förseglingstejpen med en vass skalpell och ta bort det med pincett. Pipett 1 pl av Cryo-condition på locket slide (eller alternativt i en tom brunn på samma platta) och ta bort kristallen från droppe fiske den med den monterade nylonslinga (Figur 5). Bifogade kristaller lätt kan tas loss från marken genom att deformera den omgivande plast med en akupunkturnål.
      1. Snabbt överföra kristallen till droppe kryo-tillstånd och låt den stabilisera sig en sekund. Fiska kristallen ut så snabbt som möjligt och dopp-frysning i flytande kväve.
      2. När det flytande kvävet runt den monterade slingan slutar koka, placera slingan i flaskan.Placera flaskan på Cryo käpphållare och när den är lastad med 6 flaskor placera en kryo hylsa runt hållaren. Lagra kristallerna i en tank fylld med flytande kväve fram till användning.
2. Datainsamling
   OBS: Datainsamling kan utföras hemma diffraktometer, om sådana finns, eller på en synkrotron beamline. För rPPEP-1 uppgifterna samlades in vid beamline X06DA av den schweiziska ljuskälla, Paul-Scherrer-institutet, Villigen, Schweiz med hjälp av en hybrid fotonräknande detektor. De ursprungliga uppgifterna och alla filer som används i strukturbestämning kan lämnas på begäran.
   1. Inrättat våglängden för strålen till 1,282 Å (9667 keV), som är den karakteristiska röntgen absorptionskantenergin (topp) av elementet zink. rPPEP-1 är ett metalloproteas som innehåller en enda zink per molekyl i det aktiva stället.
   2. Samla in data vid 100 K i den omvända-strålläge i 10 ° kilar för totalt 270 ° i varje direction. Exponeringstiden är 0,1 sekunder med 0,1 ° rotation per bild. Ställ in överföring till 14% (0,14).
   3. Att samla in en nativ högupplösande dataset från en andra kristall som härrör från samma kristallisationstillstånd som inrättats våglängden av strålen till 1,00 Å (12398 keV). Samla in data vid 100 K. Exponeringstiden är 0,1 sekunder med 0,1 ° rotation per bild. Ställ in överföring till 70% (0,7).

5. Struktur Fastställande via zink-ED

OBS: För att bestämma strukturen av rPPEP-en via zink-SAD vissa grundläggande kristallo kunskap behövs samt programvarupaket XDS ^20, Phenix ²¹ och program Sothöna ^22. För visualisering av strukturer behövs programmet PyMOL ²³ eller Chimera ^24. Uppgifter som samlats in vid den våglängd som motsvarar toppen vid absorptionen kanten av elementet zink kan användas för enkel våglängd avvikande dispersion (SAD) ²⁵ för att erhålla fasinformation som kan förlängas med alla proteinatomer.

1. Databehandling
   1. Bearbeta de två topp dataset (normala och inverterade) med hjälp av programvaran XDS (alternativt iMosflm eller HKL3000) i rymdgruppen P2 ₁ 2 ₁ 2 ₁ (rymdgrupp 19) separerar Friedel kamrater (avvikande data). Enhetscellparametrarna bör vara runt a, b, c (Å) = 43,17, 71,68, 117,70 och α = β = γ (°) = 90. Detta ger två HST-filer (reflektion filer).
   2. Inspektera filen CORRECT.LP. Använd data upp till resolution i vilken CC _1/2 är åtminstone 50%. Skala ihop båda uppsättningarna uppgifter / reflektions filer (HST-filer) med XSCALE. Inspektera filen XSCALE.LP. Kontrollera hur långt onormal signal sträcker (SigAno) och notera upplösning med en avvikande korrelation (Anomal Corr) på ca 30%, vilket är 2 A i fråga om de uppgifter som används här samlats till 1,67 Å. Det här ärupplösning cut-off för onormal signal som används i Phenix Autosol.
   3. Konvertera (skalad) HKL-fil till en CCP4-format reflektion fil (som heter t ex peak_anom.mtz) med hjälp av XDSCONV skapa en R _fri delmängd av 5% och hålla onormala data (FRIEDEL'S_LAW = FALSKT). Kontrollera mtz-filen för överensstämmelse med programmet mtzdmp inspektera cellparametrar, rymdgruppen och förekomsten av R _fri delmängd (etikett FreeRflag) och avvikande uppgifter (etiketter DANO / SIGDANO). Förbered också en ytterligare mtz-fil med XDSCONV utan att extrahera de anomala data (FRIEDEL'S_LAW = TRUE; namnges, exempelvis peak_native.mtz) för förfining i ett senare skede.
2. Understruktur lösning (fasbestämning)
   1. Kör Phenix Autosol använder reflektionsfilen peak_anom.mtz. Välj SAD / MAD topp som datatyp och välja 2 zinkplatser (eftersom det finns två molekyler per asymmetrisk enhet). Välj antingen mer exakt experimentala värden för f '/ f' 'parametrar (bestämda i en fluorescensavsökning vid strålröret) eller theotetical värden f = -8,245 och f' = 3,887. Också ladda FASTA fil som innehåller aminosyrasekvensen av den kristalliserade proteinet.
   2. Ställ in upplösningen gräns för upplösning med en avvikande korrelation (Anomal Corr) på ca 30% (bestämd i 5.1.2), i detta fall två Å och välj "automatkompileringssystemet modellen" alternativet. Med hjälp av faserna för de två zinkplatser har hittats av Phenix Hyss (del av Phenix Autosol rörledningen) faserna för hela proteinet kan härledas och modellen byggdes (genom Phenix RESOLVE) i elektrontätheten. Den bästa modellen kallas "overall_best.pdb".
3. Modellbygge, förfining och validering
   1. Välj alternativet "automatkompileringssystemet modell" för att bygga de flesta av rPPEP-en modell automatiskt. Inspektera elektrontätheten på 1,0 σ kontur nivån med program Coot (Figur 6). Det bör vara bind och omgivande atomerna i modellen. Helst också vissa vattenmolekyler bör byggas in i modellen (vid en upplösning bättre än 2,5 Å). Bulk vatten (utrymmet mellan molekylerna) bör innehålla någon densitet.
   2. Kontrollera om hela modellen är avslutad (alla aminosyror som är inbyggda i elektrondensitet). Om inte, bygga dem manuellt med hjälp av verktyg som tillhandahålls av sothöna. Förfina strukturen genom att köra iterativa omgångar Phenix Noggrannare med 5 förfining rundor varje användning av overall_best.pdb modell fil, peak_native.mtz eftertanke filen och FASTA sekvensfilen; och manuell modellbygge i sothöna.
   3. Validera kvaliteten på den strukturella modellen med de respektive verktygen i Sothöna.

Figur 6: Experimentell elektrondensitetskarta och modell av rPPEP-1 efterPhenix Autosol köras. Elektrondensitet i blått på en kontur nivå på 1,0 σ visas i programmet Sothöna. I denna första karta elektrontätheten är snyggt löst och modellen bygger i elektrontätheten. Zooma in visar resterna His142 och Glu189, samt en vattenmolekyl. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

6. strukturbestämning för högupplöst via molekylär ersättning

NOTERA: För att erhålla hög upplösning strukturell information om rPPEP-1 ett nativt dataset uppsamlas. Då en molekylär ersättningsproceduren med hjälp av programmet Phaser ^26,27 (i Phenix programvarupaketet) utnyttjas genom att använda struktur bestäms via zink-SAD som en modell. Detta förfarande kan också användas senare vid lösning strukturer av rPPEP-1 komplexbundna med små molekyler.

1. För att erhålla en kristallstruktur med högre upplösning (i detta fall upp till 1,4 Å) bearbeta infödda dataset använder programmet XDS (alternativt iMosflm eller HKL3000) i rymdgruppen P2 ₁ 2 ₁ 2 ₁ (rymdgrupp 19). Enhetscellparametrarna bör vara runt a, b, c (Å) = 43,17, 71,77, 117,80 och α = β = γ (°) = 90. Detta ger en HST-filer (reflektion fil).
2. Inspektera filen CORRECT.LP. Använd data upp till resolution i vilken CC _1/2 är åtminstone 50%. Konvertera HKL-filen till en CCP4-format reflektion fil (som heter t ex native.mtz) med hjälp av XDSCONV skapa en R _fri delmängd av 5%. Kontrollera mtz-filen för överensstämmelse med programmet mtzdmp inspektera cellparametrar, rymdgruppen och förekomsten av R _fri delmängd (etikett FreeRflag).
3. Förbered PDB-fil som innehåller modellen från overall_best.pdb bestämdes tidigare och ta bort alla vattenmolekyler och alla ligander (dvs.. zinkatomen). Också ladda FASTA fil som innehåller aminosyrasekvensen av den kristalliserade proteinet. Kör Phaser i Phenix med hjälp av reflektionsfilen native.mtz. Sök efter två molekyler per asymmetrisk enhet.
4. Efter lyckad struktur lösning (TFZ-poäng större än 8, här 10,2) inspektera modellen (som heter native_phaser.1.pdb) och elektrontäthetskartan i sothöna. Bygg och förfina strukturen genom att köra iterativa omgångar Phenix Noggrannare med 5 förfining rundor varje användning av native_phaser.1.pdb modell fil, native.mtz reflektionsfilen och FASTA sekvensfilen; och manuell modellbygge i sothöna.
5. Validera kvaliteten på den strukturella modellen med de respektive verktygen i Sothöna.

Representative Results

rPPEP-1 är överuttryckt i flera E. coli-stammar, med det högsta utbytet i E. coli BL21 (DE3) Star (Figur 1C). Efter den första NiNTA affinitetskromatografisteg den 6xHis-tag med framgång kan avspjälkas från det mesta av proteinet och i det andra NiNTA steget osmält protein kan vara helt åtskilda från trombin-digererad protein (figur 1D). På en S200 16/600 kolonn omärkt rPPEP-1 migrerar som monomer med tillfällig Fronting troligen motsvarande de dimera arter (Figur 2A). Proteinet är ren (figur 2B) och utbytet är ca 50 mg protein från ett L av E. coli kulturen. rPPEP-1 kristalliserar i olika förhållanden (Figur 3), som ofta innehåller fosfat. Kristallerna är mycket sammanväxta under alla förhållanden, så kristall optimering måste utföras. Figur 4 visar Scheme av optimeringsprocedur som utförs för kristaller som härrör från tillståndet kommersiella skärm SaltRx E4 (52) (Figur 3B-C). Återigen sammanväxta kristaller dök upp i brunnarna A6-D6 (Figur 4). En microseed lager framställdes av kristaller odlas i skick C6 (2,55 M ammoniumfosfat dibasisk, 0,1 M Tris pH 8,5) av optimerings skärmen och späddes 1: 1000 i moderluten. Två till sju dagar efter sådd med den utspädda fröunderlag i de övriga återstående 20 villkor med tydliga droppar stora enda gitter kristaller av hög diffraktion kvalitet observerades (Figur 5) i de flesta droppar. Efter montering av kristallerna till nylon slingor (Figur 5E) diffraktionsdata till 1,67 Å upplösning uppsamlades för strukturbestämning via zink-SAD (tabell 1), med en oregelbunden signal som sträcker sig till 2 Å. Dessutom var infödda diffraktionsdata till 1,4 Å upplösning samlas för bestämning av en high-upplösning struktur (tabell 1). Kristallstrukturen av rPPEP-1 kunde lösas (Figur 6) och modellen av den nativa strukturen förfinas R / R _gratis faktorer 0,156 / 0,182 vid 1,4 Å upplösning (PDB ID: 5A0P) ¹⁴ (för ytterligare förfining statistik se tabell 1).

Struktur / dataset	topp Zn-ED	inföding
Datainsamling
rymdgrupp	P2 1 2 1 2 1	P2 1 2 1 2 1
a, b, c (Å)	43,17, 71,68, 117,70	43,17, 71,77, 117,80
α, β, γ (°)	90, 90, 90 90, 90, 90
Våglängd (Å)	1,28254	1
Upplösning (Å)	45,5-1,67 (1,72-1,67)	45,5-1,40 (1,49-1,40)
Antal observationer	779717 (34025)	310074 (45851)
Antal unika reflektioner	80960 (5597)	71874 (11172)
Mångfald	9,6 (6,1)	4,3 (4,1)
Fullständighet (%)	99,2 (93,0)	98,2 (95,6)
Rmerge (%)	6,8 (56,5)	5,2 (52,6)
<I / σ (I)>	21,86 (2,81)	15,66 (2,48)
CC (1/2) (%)	100 (85,1)	99,9 (85,5)
förfining statistik
R work / R gratis d (%)		15,60 / 18,17
Antal icke-H-proteinatomer		3109
Antal vattenmolekyler		532
Antal joner / tunga atomer		2 Zn
Antal andra molekyler		-
Antal TLS grupper / kedja		9
Root-mean-square avvikelser
Bindningslängder (Å)		0,006
Bindningsvinklar (°)		1,022
Genomsnittliga B faktor (A 2)
Alla proteinatomerna		16,12
Vatten		29,74
andra atomer		10,12
Ramachandran tomt e (%)
mest gynnad		98,72
dessutom tillåts		1,28
underkänt		0
PDB inträde		5a0p

Tabell 1: Datainsamling och förfining statistik.

Discussion

Röntgenkristallografi är fortfarande den snabbaste och mest exakta metoden för att bestämma tredimensionella nära atom upplösning strukturer av proteiner ^28. Det kräver dock tillväxten av välordnade enkristaller. Dessa är ofta svårt att få och det kristallina tillståndet är konstgjord. En jämförelse av proteinstrukturer bestämts genom röntgenkristallografi med de som fastställts av andra metoder, framför allt NMR, visar i allmänhet en mycket god överensstämmelse. I fallet med PPEP-1, en NMR-struktur publicerade nyligen ²⁹ visar utmärkt överensstämmelse med vår kristallstruktur ^14, inklusive rörligheten hos S-slingan.

Detta protokoll beskriver produktionen och reningen av N-terminalt His-märkt rPPEP-1 protein för strukturella studier och den kristallisering och strukturbestämning av omärkta rPPEP-1. Enkristaller var svårt att växa i det här fallet och krävde en särskild microseeding förfarande. i than följande avsnitt kommer vi att diskutera resultaten för PPEP-1 och ange hur protokollet kan anpassas för produktion och kristallisering av något annat protein.

Variationer på konstruktion design och uttryck

rPPEP-1 uttrycks som en N-terminalt His-märkta varianten (Figur 1A), som för kristallisation är det att föredra att avlägsna His-taggen genom trombin smälta på grund av dess eventuella inverkan på kristallisa framgång och proteinstruktur ^30. För andra proteiner kan det vara lämpligt att dessutom testa ett C-terminalt His-märkt version (t ex klonat med användning av samma restriktionsställen, vektorn pET22b och en omvänd primer utan stoppkodon vid 3'-änden) eller att lämna den N-terminala His-tag oklyvt, som i vissa fall till en tagg kan hjälpa till under kristallisation. För rPPEP-1 utbytet och stabiliteten hos ett C-terminalt His-märkt konstruktet var underlägsen. Dessutom, en inledande tester för bästa soluble proteinuttryck bör ingå i följande E. coli-stammar: BL21 (DE3), BL21 (DE3) pLysS eller Lemo21 (DE3), BL21 (DE3) kodon plus RIPL eller Rosetta 2 (DE3), BL21 (DE3) Star och C41 (DE3) vid tre olika temperaturer / inkubationstider (3-4 h vid 37 ° C, 5 h vid 30 ° C och över natt vid 20 ° C). Före kloning, kontrollera förekomsten av en intern trombinklyvningsställe med hjälp av ExPASy PeptideCutter verktyget ³¹ för att förhindra klyvning av proteinet av intresse. Alternativt finns det vektorer tillgängliga som tillhandahåller ett klyvningsställe för HRV3C (dvs. EMBL: s PETM-14 ³²⁾ eller TEV-proteas (dvs. EMBL: s PETM-11).

proteinrening

För rPPEP-1-konstruktioner cellys sker via sonikering på is / vatten. För mer känsliga proteiner som tenderar att aggregera eller utlösa en mer "mild" cellslys metod som innebär en cell disruptor kan vara brukd. Kontrollera om stora mängder av olösligt protein efter det första centrifugeringssteg, som inte kan detekteras när man använder lysmetoden såsom kemisk cell-lys. För rening av rPPEP-1 vanligtvis 2 ml av NiNTA harts användes. Läs tillverkarens instruktioner om hur stor proteinbindningskapaciteten hos det valda hartset är och justera därefter. Under de första reningar av rPPEP-1, där endast en ml harts användes, mycket protein var inte bunden till kolonnen och hittades i genomflödet (Figur 1D). Å andra sidan använder för mycket harts kan sänka renheten av det renade proteinet. Justera imidazol koncentrationen till bindningsaffiniteten för den använda His-märkt konstruktet till NiNTA matrisen. En stegvis tvättningsförfarande föredrages här (dvs. 10 mM, 30 mM, 50 mM, 70 mM imidazol), i vilket A280 övervakas och tillåts nå baslinjen under varje steg. På detta sätt inget protein förloras, även om det skulle eluera under enhög imidazol tvättsteg (t.ex. vid 50 eller 70 mM). I fallet med NHis-rPPEP-en något protein redan eluerar vid 30 mM imidazol, men det är oklart vilken typ av proteinarter den representerar. Vissa proteiner utfällas / aggregat när imidazol dialyseras eller späds ut av proteinlösningen. I sådana fall minska koncentrationen av imidazol i elueringsbufferten till 150 mM och tiden för exponering för höga imidazol koncentrationer, t ex minska koncentrationen av imidazol genom eluering i en bägare innehållande en 5-10-faldig volym av buffert utan imidazol jämfört med den planerade elueringsvolymen. För NHis-rPPEP-en inkubation med 2 enheter trombin per mg protein över natt vid 4 ° C är tillräckliga för att klyva den His-tag till nästan 100%. Justera mängden trombin för proteinet av intresse genom att använda 1-10 enheter per mg protein vid 4 ° C till 20 ° C. När koncentrering av proteinet med hjälp av en centrifugal ultrafiltreringsenhet paus i intervaller om 5-10 minuter och blanda protein att homogenisera koncentrationsgradienten byggas upp i koncentratorn. Annars högkoncentrerad proteinet kunde aggregera / fällning.

kristallisation

rPPEP-1 producerar ständigt mycket sammanväxta kristaller (enkristaller växer ovanpå varandra och på så sätt ha flera kristallgitter) som inte är lämpliga för röntgendiffraktion analys. Förklaringen kan vara att alltför många kärnbildnings händelser sker i kärnområdet av fasdiagrammet (Figur 7).

Figur 7: Fasdiagram av ett protein kristallisering experiment. Kristaller kan endast bilda, när proteinet är övermättad. Kärnbildning sker i kärnbildningszonen och kristalltillväxt i den metastabila zonen. När ett protein är undersaturated kommer droppen förbli klar.

<p class = "jove_content"> Sänkning av protein eller fällnings koncentrationer förbättrar inte situationen då ingen kärnbildning av rPPEP-1 observeras längre och dropparna bo klart. Microseeding var den metod som, som små kärnor förs direkt in i den metastabila zonen, där rPPEP-1-kristaller så småningom växa (Figur 7). Genom att utforma optimering skärmen på ett sådant sätt att det ursprungliga tillståndet (2,4 M ammoniumfosfat dibasisk, 0,1 M Tris pH 8,5) är belägen vid positionen C5 (Figur 4) (snarare den övre delen av pH och fällningsmedel koncentration) de flesta av de nya förhållanden motsvarar ett tillstånd med lägre övermättnad med en hög benägenhet att utgöra en del av den metastabila zonen ¹⁶ (fig 7). Således kan kärnor som förs in under sådd potentiellt växa till stora enkristaller. För att optimera detta förfarande (mängden och storleken av nybildade kristaller) den ursprungliga fröunderlag kan spädas 10 -5. Här flera utspädningar av frökapslar kan testas för att bestämma den bästa frö utspädning för produktion av stora enkristaller. Alternativt strimma sådd med hjälp av ett djur morrhår eller svans hår (kanin, katt, chinchilla eller häst) kan användas ^33.

Förfarandet kan användas för att samkristallisera produkt-peptider och substrat-peptider av rPPEP-1. Kristaller i rymdgrupp P2 _en brytande upp till 1,25 Å erhölls från frön lager utspätt 1: 250 i optimeringsförfarandet. Kristaller växer i de två rymd grupperna P2 ₁ 2 ₁ 2 ₁ (obundet protein) och P2 ₁ (komplexa strukturer), medan härrör från mycket likartade förhållanden inom ammoniumfosfat skärmen i optimeringsprocessen. På grund av den kristallpacknings finns i både r-PPEP-1 kristallformer, huvudsakligen alla små molekyler och peptider som behandlar oprimade sidan av det aktiva stället ensam skulle kunna vara soakedi de kristaller. Denna sida av molekylen är tillgänglig från lösningsmedel närvarande i kristallen. Men molekyler adresse både underwebbplatser eller grundade sidan behöver bara vara co-kristalliseras med rPPEP-1, S-loop öppning skulle krävas för att rymma dem i det aktiva stället. Dessutom är rPPEP-1 i kontakt med de angränsande molekyler vid utloppet från substratet-bindningsställe nära S3'site (främjande av kristallkontakter i detta område) - ett faktum som även begränsar längden av substratpeptider till 3 rester vid primas sida i dessa två kristallformer.

Crystal montering och Cryo-skydd

Montering av proteinkristaller är en metod som kräver viss skicklighet i manipulation under stereo och behöver därför lite övning. Välja den optimala längden av nylon slinga (eller annan slinga av val, t.ex. litholoop) för att förhindra att överskott av lösningsmedel runt kristallen som bidrar till background-spridning och därmed en lägre signalbrusförhållande av diffraktionsdata. Den optimala slinga storlek / längd gör också fiske av kristallerna lättare eftersom kristallen inte glider genom öglan. För rPPEP-1-kristaller, som är cirka 100-200 um i den längsta dimensionen, var nylon slingor av 0,1-0,2 mm storlek väljs. Kryo-skyddsmedel kan också bidra till försämring av datakvalitet, eftersom kristallen kan stöta på en osmotisk chock när den överförs till Cryo-tillståndet. Detta kan försvåra eller till och med förstöra den inre ordningen i kristallen. välja den typ och koncentration av Cryo-skyddande noggrant. rPPEP-1-kristaller var Cryo-skyddad med antingen 20% glycerol eller 30% sackaros. Om kristallisering av ett substrat-peptidkomplex eller ett komplex av rPPEP-1 med en annan ligand, bör sackaros väljas som kryo-skyddsmedel såsom glycerol binder till den grundade platsen av substratet-bindningsstället hos rPPEP-en ^14.

strukturbestämning

Den Autosol erhållna lösningen en Bayes-CC av 49,2 ± 18,4, en FOM (godhetstal) av 0,41, en skev på 0,17 och en korrelations RMS 0,85. Modellen karta korrelationen är 0,86 och R / R _gratis faktorer är 0,21 / 0,24. Alla dessa parametrar indikerar en framgångsrik struktur lösning.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Genes / Vectors / cell strains
pET28a vector	Merck-Millipore	69864	Thrombin cleavable N-terminal His-tag
E. coli strain BL21 (DE3) Star	ThermoFisher Scientific	C601003	RNase H deficient
Codon-optimized gene (for E. coli) of PPEP-1 (CD630_28300)	Geneart (Thermo Fisher Scientific)	custom	amino acids 27-220
Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
Yeast extract	any
Tryptone	any
Antifoam B	Sigma-Aldrich	A5757	aqueous-silicone emulsion
Agar	any
Kanamycin	any
IPTG	AppliChem	A1008
Tris-HCl	AppliChem	A1087	Buffer grade
NaCl	any		Buffer grade
DNaseI	AppliChem	A3778
Imidazole	AppliChem	A1073	Buffer grade
Thrombin	Sigma-Aldrich	T4648
Ammonium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	215996
Glycerol 100%	any		purest grade
Sucrose	Sigma-Aldrich	84097
Liquid nitrogen	any		for storage and cryocooling of crystals
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment (general)
Shaking incubator	any		providing temperatures of 20 °C - 37 °C
Glassware	any		baffled Erlenmeyer flasks (50 ml - 2.8 L)
Centrifuge for large culture volumes	any		centrifuge for processing volumes up to 12 L
Sonicator Vibra-Cell VCX500	Sonics	SO-VCX500	or any other sonicator / cell disruptor
Ultracentrifuge	any		centrifuge providing speeds up to 150,000 x g
NiNTA Superflow resin	Qiagen
Empty Glass Econo-Column	Bio-Rad	7371007	or any other empty glass or plastic column
Size exclusion chromatography column HiLoad Superdex 200 16/600	GE Healthcare	28989335
Chromatography system Äkta Purifier	GE Healthcare	28406264	or any other chromatography system
Dialysis tubing Spectra/Por 3	Spectrum Labs	132724
Dialysis tubing closures	Spectrum Labs	132738
Ultrafiltration units (concentrators) 10,000 NWCO	any
UV-Vis spectrophotometer	any
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment (crystallography)
Low volume pipette 0.1-10 µl	any
Positive displacement pipette Microman M10	Gilson	F148501
Crystallization robot	any
96-well crystallization plates TTP IQ with three protein wells	TTP	4150-05810	or any other 96-well crystallization plate
24-well CombiClover Junior Plate	Jena Bioscience	EB-CJR
Crystal Clear Sealing Tape	Hampton Research	HR3-511
Siliconized Glass Cover Slides	Hampton Research	HR3-225
Commercial crystallization screens: SaltRx, Index, PEG/Ion, Crystal	Hampton Research	diverse
Commercial crystallization screens: Wizard, PACT++, JCSG++	Jena Bioscience	diverse
JBS Beads-for-Seeds	Jena Bioscience	CO-501
CrystalCap SPINE HT (nylon loops)	Hampton Research	diverse	loop sizes 0.025 mm - 0.5 mm
CrystalCap Vial	Hampton Research	HR4-904
Cryogenic Foam Dewar 800 ml	Hampton Research	HR4-673
Cryogenic Foam Dewar 2 L	Hampton Research	HR4-675
Vial Clamp, Straight	Hampton Research	HR4-670
CrystalWand Magnetic, Straight	Hampton Research	HR4-729
CryoCane 6 Vial Holder	Hampton Research	HR4-711
CryoSleeve	Hampton Research	HR4-708
CryoCane Color Coder - White	Hampton Research	HR4-713
Scalpel	any
Straight microforcep	any		for manipulation of sealing tape. etc.
Acupuncture needle	any		e.g. from a pharmacy
Stereo microscope	any		for inspection of crystallization plates and crystal mounting, magnification up to 160X