Introduction
Hjertet er den første funksjonelle organ for å utvikle seg i embryo 1, 2. I forbindelse med sirkulasjonssystemet, leverer den oksygen, næringsstoffer, og en avfalls mekanisme under utvikling. Tre uker etter befruktning, slår det menneskelige hjertet for første gang og riktig regulering opprettholdes av cardiomyocytes (CMS). Den irreversible tap av disse spesialiserte celler er derfor det grunnleggende problemet som ligger til grunn progressiv hjertesvikt. Mens noen organismer som sebrafisk og Xenopus har potensial for hjerte-regenerering, er den voksne pattedyr-hjerte mer begrensede 3, 5, 6. Således, gitt den kritiske funksjon av hjertet, er det forbausende at hjertesykdom er den ledende årsak til død i verden, og utgjør 600.000 dødsfall i USA alene 7. Derefore, cellebasert terapi for å effektivt reparere eller erstatte den skadde hjertemuskelen er av stor klinisk interesse.
Den banebrytende studie av Yamanaka og kolleger 8 viste at tvangs uttrykk av fire transkripsjonsfaktorer er tilstrekkelig til å konvertere fullt differensierte fibroblast celler til pluripotente stamceller. Imidlertid har den tumorgene kapasiteten til alle pluripotent stamcelle strategier har vært et kritisk problem i deres bruk for terapeutiske formål. Dette motiverte fagfeltet for å søke etter alternative metoder for å transdifferentiate celler samtidig unngå en pluripotent scenen. Nylig har flere grupper vist gjennomførbarheten av denne strategien ved å vise direkte konvertering av musefibroblastere til indusert cardiomyocyte lignende celler (iCLMs) med ektopisk uttrykk av transkripsjonsfaktorene Gata4, Mef2c, Tbx5, og senere, Hand2 (GMT og GHMT , henholdsvis) 9, 10. furthermore, kan den samme strategi bli utført in vivo og in human-deriverte vev 9, 11, 12. Nyere studier har markert tilleggsfaktorer eller signalveier som kan være modulert for å ytterligere forbedre hjerte omprogrammering effektivitet 13, 14, 15. Samlet utgjør disse studiene viser potensialet rettet transdifferensiering for regenerativ behandling. Men den lave effektiviteten i CM omprogrammering, de ukjente molekylære mekanismer, inkonsekvent reproduserbarhet på grunn av metodiske forskjeller 16, og den heterogene natur av iCLMs forbli uadressert.
For å evaluere direkte iCLM heterogeniteten, har vi utviklet en diskret og robust enkeltcelleanalyse for identifisering av sarcomere utvikling og kardial avstamning spesifikasjonern-to nødvendige egenskapene til funksjonelle cardiomyocytes. Det er minst tre hovedtyper av CM i hjertet som definert av deres plassering og unike elektriske egenskaper: atrial (AM), ventrikkel (VM) og pacemaker (PM) 17, 18, 19, 20. I en orkestrert kombinasjon, de tillater riktig pumping av blod. Under hjerte skade, kan en eller alle undergrupper bli berørt, og den type celleterapi må tas opp fra sak til sak. Foreløpig fleste strategier fokusere på den totale generasjonen av cardiomyocytes, mens lite arbeid som gjøres for å studere molekylære mekanismer som regulerer subtype spesifikasjonen.
Følgende studie viser hvordan du skal kvantifisere velorganiserte sarcomeres og identifisere et mangfoldig sett av cardiomyocyte subtyper. Ved hjelp av en pacemaker (PM) -spesifikk reporter mus, er vi i stand til å anvende en jegmmunocytochemical tilnærming for å skille indusert atrial lignende muskelceller (IAM), induserte ventrikulære lignende muskelceller (IVM), og indusert PM-lignende muskelceller (IPMS) 21. Basert på våre observasjoner, bare celler som viser sarcomere organisasjonen er i stand til spontan juling. Denne unike omprogrammering plattform åpner for å vurdere rollen av visse parametre i sarcomere organisasjon, subtype spesifikasjon, og effektiviteten av CM omprogrammering på enkeltcelle oppløsning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle prosedyrer som involverer dyr praksis ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved UT Southwestern Medical Center.
1. Isolering av Hcn4-GFP E12.5 Mouse Embryonic fibroblast (MEFs)
- Sett opp tidsbestemte parringer mellom homozygote Hcn4-GFP hanner og CD-1 hunner.
- Sacrifice gravid kvinne på E12.5 av karbondioksid eutanasi og påfølgende halshugging.
- Fjern uterine horn med dissekere tang som beskrevet tidligere 22, 23, og plassere dem i en petriskål på is med 1 x fosfatbufret saltvann (PBS) uten Ca2 + eller Mg2 +.
- Utfør alle etterfølgende trinn i vevskultur panseret Bruk steril teknikk.
- Fjern embryoer fra livmor og fostervann sac med saks og dissekere tang. Hold morkaken festet for bedre håndtering. pregnant CD-1 hunnene vanligvis føder mellom 10 og 14 valper.
- Ved hjelp av dissekere tang, kan de isolerte embryoer og raskt å skylle dem to ganger i 70% (v / v) EtOH.
MERK: De vasker bør være rask for å redusere celledød. - Fjern hodet, lemmer, hale, og indre organer, inkludert hjertet fra de isolerte embryoer.
- Legg den gjenværende vev i en 10-cm tallerken med 1 ml 1x PBS og fint kjøttdeig med en steril barberblad til ca 1 mm 3 i størrelse.
- Overfør hakket vev inn i et 50 ml konisk rør med PBS.
- Spin 300 xg i 3 min. Nøye aspirer skytende PBS.
- Tilsett 1 ml steril 0,25% trypsin-EDTA pr embryo. Inkuber cellene i et 37 ° C vannbad i 15 min. Bland forsiktig røret hvert 4 min. Over-fordøyelse av vevet vil vesentlig redusere utbyttet.
- Vortex celleblanding ved maksimal hastighet (3200 rpm) i 4 s.
- Tilsett 2 mL av fibroblast media per embryo og bland. filter through en 100 mikrometer celle sil ved hjelp av en pipette for å hjelpe cellene gjennom silen. Se tabell 1 for utformingen av alle etterfølgende medier.
- Spin 300 xg i 4 min. aspirer nøye supernatant.
- Tilsett 10 ml av frisk fibroblast-medium per 3 embryoer og triturer 6-10 ganger.
- Plate cellene i en 15-cm vev kultur parabolen for hver 3 embryoer forberedt. Kultur over natten i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator.
- Etter inkubasjon over natten, erstatte media med friske 30 ml av media per plate. Plassere cellene tilbake i inkubatoren natten over.
MERK: Se etter Hcn4-GFP + celle forurensning under et fluorescerende mikroskop. Kulturen skal være GFP - og bare bli GFP + på omprogrammering. - Den neste dag, slakte celler med 3 ml frisk forvarmet 0,25% trypsin-EDTA. Telle og fryse celler. Typisk fryse cellene ved 3 x 10 6 celler pr ml. Den forventede yieLD bør være 3 x 10 6 celler pr embryo.
2. Retrovirus Produksjon og Omprogrammering
Forsiktig: Følgende protokollen krever produksjon og håndtering av smittsomme retrovirus. Utfør følgende trinn i et biosikkerhetsnivå 2 skap under BSL-2 retningslinjer og steril teknikk. Bruk 10% blekemiddel for å kvitte seg med alle materialer som utsettes for retrovirus.
- Retrovirus produksjon og MEFs forberedelse
MERK: Følgende protokoll er for retrovirusproduksjon i 6-brønns plater og MEF-infeksjon i 24-brønners plater. For andre formater, se tabell 2. MEFs er belagt på dag -1, så timingen må være koordinert hensiktsmessig for hvert forsøk (se avsnitt 2.3 og figur 2).- Oppretthold Plat-E (PE) celler som per produsentens anbefalinger. I korthet kultur PE-celler i DMEM supplert med 10% FBS, 1 ug / mL puromycin, 10 ug / ml blasticidin, penicillin og streptomycin. Passage celler 1: 4 hver dag når kulturen når 70-90% konfluens.
- Dag -2: Dagen før transfeksjon, frø Plat-E celler på 1 x 10 6 celler / brønn på en seks-brønns plate i transfeksjon media. Cellene bør være 70-80% konfluent på tidspunktet for transfeksjon.
- Transfeksjon ved hjelp av et kommersielt transfeksjon agent.
MERK: De kommersielle reagenser bør ha romtemperatur (RT) før transfeksjon. For DNA transfeksjon, legge til hver retroviral plasmid DNA individuelt (G, H, M og T) for å danne en GHMT cocktail 9.- Dag 1: I et 15 ml konisk rør polystyren, bland 60 ul av redusert serum media med 6 ul transfeksjonsbuffer reagens per reaksjon for en 6-brønners plateformat. Inkuber blandingen i 5 min ved romtemperatur.
MERK: Siden transfeksjon reagens brukes her binder seg til plast, endd direkte til den reduserte serum media for å unngå enhver reduksjon i transfeksjonseffektivitet. - Legg til sammen 2 mikrogram av GHMT cocktail per reaksjon og banke forsiktig på å blande det. Ikke vortex. Inkuber reaksjonsblandingen i 15 minutter ved RT.
- Tilsett blandingen fra trinn 2.2.3 til PE-cellene i en dråpevis måte.
- Inkuber transfekterte Plat-E-celler over natten i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator. Registrerer tiden for transfeksjon.
- Dag 1: I et 15 ml konisk rør polystyren, bland 60 ul av redusert serum media med 6 ul transfeksjonsbuffer reagens per reaksjon for en 6-brønners plateformat. Inkuber blandingen i 5 min ved romtemperatur.
- Seeding av Hcn4-GFP mus embryonale fibroblaster.
- 1 time før plating MEFs, utarbeide en 24-brønns plate for immunocytochemistry.
- Legg en 12 mm fibronektin dekk per brønn.
- Belegge brønnene med 300 ul av kollagen-oppløsning (f.eks SureCoat) og inkuberes i et 37 ° C inkubator i 1 time.
- Sug belegg løsning umiddelbart før MEF plating.
- Tine en frossen hetteglass med Hcn4-GFP MEFs og vask x1 med forvarmet fibroblast media ved 500 xg i 5 min.
- Bestem celleviabilitet ved hjelp av trypanblått eksklusjon eller lignende fargestoffer. Beregn antallet levedyktige celler pr ml kultur ved anvendelse av følgende formel:
% levedyktige celler = [1,00 - (Antall blå celler / antall totale celler)] x 100- Beregn totale antall levedyktige celler ved hjelp av følgende formel:
Levedyktige celler =% levedyktige celler x fortynningsfaktor x 10 000 x totale volum av cellesuspensjon
- Beregn totale antall levedyktige celler ved hjelp av følgende formel:
- Seed 3 x 10 4 celler pr brønn mot en 24-brønns plate med på forhånd fremstilt oppløsning kollagen fibronektin-dekkglass.
- 1 time før plating MEFs, utarbeide en 24-brønns plate for immunocytochemistry.
- Transduksjon og omprogrammering av MEFs
MERK: Ifølge produsentens notater, skal vedlikeholdes Plat-E cellene produserer en gjennomsnittlig titer på 1 x 10 7 infeksjons enheter / ml. Selv om titeren ikke direkte måles for hvert eksperiment, er en GFP kontroll alltid tatt med som et surrogat for infeksjon effektivitet.Høy GFP uttrykk og intensitet (GFP +> 95%) korrelerer vanligvis med vellykket GHMT-mediert generasjon iCLMs.- Dag 0: 24 timer etter transfeksjon, filtrere PE retrovirale medium gjennom et 0,45 um porestørrelse-overflateaktivt middel-frie celluloseacetat-filter og overføres til et 15 ml konisk rør. Legg polybren til en endelig konsentrasjon på 8 ug / ml. Omhyggelig fylle cellene med 2 ml friskt medium transfeksjon.
MERK: Celler lett løsner fra platen hvis media endres for raskt. - Aspirer mediet av de dyrkede MEFs og tilsett fersk samlet retroviral medium; Det bør gi 1,7 ml medium per brønn i en 6-brønns plate. Legg ~ 800 ul per brønn av en 24-brønns plate. Returner MEF plate til inkubatoren og inkuberes over natten.
- Dag 1: Gjenta trinn 2.4.1 og 2.4.2. Kast celler etter 2 nd virus samling. Returner infiserte MEFs til inkubatoren og la dem hvile over natten.
- Dag 2: 48 timer etter induksjon, aspirer cellekondisjonerte medier og vask x1 med 1x PBS. Legg 500 mL forvarmes iCLM medium per brønn i en 24 brønners plate.
- Bytt iCLM media hver 2 - 3 dager. Fremgangsmåte plate 14 dager etter viral induksjon for immunocytokjemi (ICC) analyse av hjerte omprogrammering.
- Dag 0: 24 timer etter transfeksjon, filtrere PE retrovirale medium gjennom et 0,45 um porestørrelse-overflateaktivt middel-frie celluloseacetat-filter og overføres til et 15 ml konisk rør. Legg polybren til en endelig konsentrasjon på 8 ug / ml. Omhyggelig fylle cellene med 2 ml friskt medium transfeksjon.
3. Farging av omprogrammert MEFs
- 14 dager etter induksjon, nøye aspirer media.
- Skylle hver brønn med 300 ul iskald 1 x PBS. Aspirer overflødig oppløsning.
- Feste celler til 250 ul av 4% paraformaldehyd (PFA) oppløsning per brønn av en 24 brønns plate. Inkuber 15 min ved RT.
MERK: Fast celler kan lagres i PBS ved 4 ° C i 1 - 2 uker før farging. - Permeabilize celler ved vaske brønner x3 med 300 mL 0,1% PBS-TritonX 100 (PBST). Inkuber 5 min ved RT mellom hver vask. Aspirer overflødig oppløsning etter siste vask.
- Block for 10min ved RT med 1x Universal Block Buffer på 300 ul / brønn.
- Forbered (ICC) flekker buffer: Legg 1: 1 av 1x PBS og 1x Universal blokkeringsbuffer. Fortynnet primære antistoffer i ICC flekker buffer og inkuberes antistoffer over natten ved 4 ° C. Henvis til seksjon for anbefalte fortynninger.
- Flekk ett par lysbilder med mus α-actinin, kylling αGFP og kanin Nppa for IPM og Iam identifikasjon.
- Flekk ett par lysbilder med muse α-actinin, kylling αGFP, og kanin Myl2 for IPM og IVM identifikasjon.
- Dagen etter vask brønner x3 med 300 mL 0,1% PBST. Inkuber 5 min ved RT mellom hver vask. Aspirer overflødig oppløsning etter siste vask.
- Forbered de sekundære antistoff fortynninger i ICC flekker buffer. Henvis til seksjon for anbefalte fortynninger. Inkuber sekundære antistoffer i 1 time ved romtemperatur, beskyttet mot lys.
- Flekk alle lysbilder med følgende sekundære antilegemers: mus Alexa-555, kylling Alexa-488, og kanin Alexa-647.
- Vask brønner x3 med 300 mL 0,1% PBST. Inkuber 5 min ved RT mellom hver vask. Beskytt mot lys.
- Legg 2,4 mL av monterings media inneholdende 1,5 ug / ml av 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) til et mikroskop-objektglass. Fjern forsiktig dekkglass fra brønnen av 24-brønns plate, fjerne overskudd av oppløsning, og overføring til glass-slide med festemateriale. trykk på dekkglass forsiktig for å fjerne overflødig volum og luft.
- Seal lysbilder med foretrukket neglelakk eller plast tetningsmasse. Oppbevares monterte lysbilder ved 4 ° C beskyttet mot lys.
4. Identifisering av Hjerte Subtyper hjelp konfokalmikroskopi
MERK: For bildebehandling, en konfokal mikroskop utstyrt med minst 2 fluorescerende detektorer som kan spektral deteksjon ved 405, 488, 555 og 639 nm bølgelengde er nødvendig for å identifisere IPMS, Iams, og iVMs. image cellene ved hjelp av en Plan-Apochromat 20X / 0.75 objektiv eller bedre. Ved hjelp av produsentens bildeanalyse programvare, skanning zoom bilder kan oppnå bilder 40X-olje nedsenking kvalitet.
- Bildearkiv: ta 8-bits bilder med DAPI, Alexa-488, Alexa-555, og Alexa-647 kanaler (kap.). Pixel holdetid av 6 s, 1024 rammestørrelse, linje trinn 2, og i snitt av to er tilstrekkelig for høyoppløste bilder.
- For hvert bilde, starte fra en kant og begynne å skanne opp og ned i den røde fluorescerende kanal (kap.) For α-actinin + sarcomere + celler (se figur 3 og figur 5A for eksempler). Sarcomere stripedannelser er lettere å identifisere visuelt i bølgelengde på 555 nm.
- Når en α-actinin + sarcomere + celle har blitt identifisert, bytte til den grønne lm. og holde notat hvis den er positiv (IPM). Bytt til datamaskinen for å vurdere vidt rød 647 ch. (IAM eller IVM).
MERK: Celler som erα-actinin + / sarcomere + / Hnc4-GFP + / Nppa - / Myl2 - er utpekt som IPMS. GFP uttrykk vil bli sett i hele cellen (Figur 4A). - Flekke lysbilder med α-actinin (mus-Alexa555), Hcn4-GFP (kylling-Alexa488), Nppa (kanin-Alexa647), og DAPI. Celler som er α-actinin + / sarcomere + / Hnc4-GFP - / Nppa + er IAM. Nppa flekker vises perinukleær og punktat (figur 4B).
- Flekke lysbilder med α-actinin (mus-Alexa555), Hcn4-GFP (kylling-Alexa488), Myl2 (kanin-Alexa647). Celler positive for α-actinin + / sarcomere + / Hnc4-GFP - / Myl2 + er iVMs. Myl2 flekker vil vise en tverrstripet skjema langs sarcomere filament. På grunn av variasjoner i kvaliteten av fargings og Z-planet, kan det striper ikke alltid være lett synlig (figur 4C).
- Når en α-actinin + sarcomere + celle har blitt identifisert, bytte til den grønne lm. og holde notat hvis den er positiv (IPM). Bytt til datamaskinen for å vurdere vidt rød 647 ch. (IAM eller IVM).
MERK: For å vurdere det faktiske antallet potensielt omprogrammeres MEFs, er 2 brønner på en 24-brønns plate seeded parallelt med de eksperimentelle brønnene og høstes én dag etter plating. Det totale antall celler belagt blir deretter bestemt ved å ta gjennomsnittet av to brønner. Dette blir den faktiske totale celler belagt (atotal).
- sarcomere +
- Inspiser visuelt hver celle på et dekkglass for riktig α-actinin + / sarcomere + (høyre panel Figur 3) og posten (figur 5B-i).
- Tabuleringene det totale antall α-actinin + / sarcomere + på hver dekkglass og dele med de faktiske totale celler belagt (atotal) (figur 5B-iii). For eksempel, hvis atotal = 12.500 celler, og 100-celler ble a-Actinin + / + sarcomere da, 0,8% av de pletterte MEFs ble omprogrammeres. Et gjennomsnittreprograming eksperiment vil gi en% a-Actinin + / sarcomere + celler (figur 5C).
- subtype +
MERK: For de neste trinnene, se figur 5B / C for et representativt iCLM kvantifisering arbeidsflyt. I korthet, for hver sarcomere + celle, tabulere hvis det er unikt for hver undertype (figur 5B-i). Beregn% Undertype (figur 5B-iii) ved å dividere antall subtype + celler over gjennomsnittlig sarcomere + celler x 100 (figur 5B-i). For å beregne den absolutte% subtype effektivitet (figur 5B-iv), del subtype + celletallet fra figur 5B-i av det totale antall celler sådd x 100 (figur 5B-ii).- For hver av de α-actinin + / sarcomere + -celler, vurdere om de er GFP +, Nppa +, eller Myl2
- Tabuleringene totale antall α-actinin + / sarcomere + / Hnc4-GFP + / Nppa - / Myl2 -, actinin + / sarcomere + / Hnc4-GFP - / Nppa +, og α-actinin + / sarcomere + / Hnc4-GFP - / Myl2 + celler (Figur 5B-I).
- For å beregne den prosentandel av hver undertype, dividere antallet Subtypesamlinger + celler ved det totale antall α-actinin + / sarcomere + celler i at brønn og multiplisere med 100. GHMT genererer IPMS, Iams, og iVMs i omtrent like forhold (figur 5B-iii).
- For å beregne det absolutte antall subtype + celler, dividere det totale antallet subtype + celler for den eksperimentelle tilstand ved atotal og multiplisere med 100 (figur 5B-ii). I gjennomsnitt IPMS utgjør 0,3% av den totale infiserte cellepopulasjon, Iams 0,3%, ogiVMs 0,25% (Figur 5B-iv).
- For hver av de α-actinin + / sarcomere + -celler, vurdere om de er GFP +, Nppa +, eller Myl2
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Å dra nytte av PM-spesifikke reporter mus, har vi utviklet en multiplex farging strategi for å identifisere ulike endogene muskelceller som vist i figur 1. Etter de reprogrammerings-trinnene vist i figur 2, kan induksjon av undertypespesifikke CMs oppdages så tidlig som dag 4 21, om enn ved en lav hastighet. Ved dag 14, kan forsøket stoppes og vurderes for sarcomere organisasjon (figur 3) og subtype-spesifikasjonen (figur 4). Figur 5 oppsummerer arbeidsflyten av glide forberedelse for ICC (figur 5 panel A), og kvantifisering av iCLM subtype-spesifikke celler (figur 5 Panel B / C).
Figur 1: Undertype Mangfold av endogenCardiomyocytes. (AB) Immunocytochemistry (ICC) farging av neonatale atrial cardiomyocytes fra Hcn4-GFP reporter mus for α-actinin (sarcomere markør, rød), Hcn4-GFP (PM markør, grønn), og Nppa (atrial markør, oransje). (C) Immunocytochemistry farging av neonatal ventrikkel cardiomyocytes fra Hcn4-GFP reporter mus for α-actinin (sarcomere markør, rød), Hcn4-GFP (PM markør, grønn), og Myl2 (ventrikkel markør, oransje). DAPI (blå): nukleær farging. Skala barer: 20 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tabell 1: Culture Medium. Tabell sammendrag for utarbeidelse av flere medier som brukes under GHMT-indusert omprogrammering. Tabell 2: Seeding, Transfeksjon og Induksjon formater.(A) Tabell sammendrag for plating og transfeksjon av celler. (B) Seeding tetthet og omtrentlig infeksjon enheter (eller viral supernatant) for å indusere MEFs inn cardiomyocyte-lignende celler. 
Figur 2: Omprogrammering Tidslinje Skjematisk. Skjematisk fremstilling av GHMT-indusert Hcn4-GFP MEFs. De tre store scener er avbildet. 
Figur 3: Grad av sarcomere Organization. ICC farging av Hcn4-GFP MEFs 14 dager etter GHMT transduksjon for α-actinin (sarcomere markør, rød) viser et variert utvalg av sarcomere organisasjon. Graden av organisasjonen øker fra venstre mot høyre panel. Representative bilder av hvert nivå (n = 3). Skala: 20 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 
Figur 4: Undergruppe spesifikke omprogrammeres Cardiomyo cytes. (AC) ICC farging av GHMT-transduced Hcn4-GFP MEFs for α-actinin (sarcomere markør, rød), Hcn4-GFP (PM markør, grønn), Nppa (atrial markør, oransje), eller Myl2 (ventrikkel markør, oransje) . DAPI (blå): nukleær farging. Skala barer: 20 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 
Figur 5: Image Acquisition og analyse arbeidsflyt. Skjematisk fremstilling for bildeanalyse. Panel A viser prioriteringsrekkefølge for tildeling sarcomere + og subtype-spesifisitet til en celle. Panel B (i-iv) og C viser de forventede resultatene fra en gjennomsnittlig GHMT-iCLM eksperiment. Viktige punkter og formler er vist i grønt.om / filer / ftp_upload / 55456 / 55456fig5large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. iCLM media Komponent Volum (ml) Sluttkonsentrasjon konsentrasjon~~POS=HEADCOMP DMEM 270 medium 199 90 FBS 50 10% Insulin-Transferrin-Selen G 2,5 0,50% MEM vitamin løsning 10 2% MEM Amino Acids 20 4% Ikke-essensielle aminosyrer 10 2% Antibiotika-Antimykotikum 10 2% B-27 supplement 10 2% Heat inaktivert Horse Serum 25 5% Na-pyruvat 2,5 1,5 mm Plat-E media (PE) Komponent Volum (ml) Sluttkonsentrasjon konsentrasjon~~POS=HEADCOMP DMEM 450 FBS 50 10% Penicillin / streptomycin 5 1% puromycin 0,05 1 pg / ml Blasticidin 0.5 10 ug / mL Fibroblast medium (FB) Komponent0; Volum (ml) Sluttkonsentrasjon konsentrasjon~~POS=HEADCOMP DMEM 450 FBS 50 10% Penicillin / streptomycin 5 1% Glutamax 5 1% Transfeksjon medium (TXF) - filtrert (0,45) Komponent Volum (ml) Sluttkonsentrasjon konsentrasjon~~POS=HEADCOMP DMEM 450 FBS 50 10% Immunocytochemistry (ICC) flekker buffer Komponent Volum (ml) Sluttkonsentrasjon konsentrasjon~~POS=HEADCOMP 1 x PBS 5 1x Universal blokkeringsbuffer 5 A) Cell seeding og transfeksjon Plate / oppvask Surface Area (cm 2) Seeding tetthet (celler) Vekstmedium (ml) Total DNA utgjør transfektere (mikrogram) Transfeksjon Reagens (pl) Redusert Serum Media (pl) 15 cm plate 152 1.00E + 06 20 25 75 600 10 cm plate 55 5.50E + 06 10 9 27 300 6 cm plate 21 2.20E + 06 4 3,5 10.5 105 6 brønn / x1 9 1.00E + 06 2 2 6 60 12 brønn / x1 4 4.00E + 05 1 0.5 1.5 15 24 brønn / x1 2 2.00E + 05 0.5 0.3 0.9 9 48 brønn / x1 1 1.70E + 05 0,25 0,15 0,45 4.5 B) Fibroblast seeding og induksjon Plate / oppvask Fibroblast seeding tetthet (millioner) Omtrentlige infeksjons enheter for iCLM 6 cm plate 0,22 til 0,33 5.00E + 7 (~ 5 ml) 6 brønn / x1 0,1-0,15 3.00E + 7 (~ 3 ml) 12 brønn / x1 0,04-0,06 1.30E + 7 (~ 1 ml) 24 brønn / x1 0,02 til 0,03 6.50e + 6 (~ 0,8 ml) 48 godt 0,001 til 0,015 3.00E + 6 (~ 0,4 ml)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne studien gir en direkte omprogrammering strategi for konvertering av MEFs til et mangfoldig sett av hjerte subtyper via retrovirus-mediert uttrykk for hjertetranskripsjonsfaktorer Gata4, Mef2c, Tbx5, og Hand2 (GHMT). Ved hjelp av en multiplex farging tilnærming i kombinasjon med en PM-spesifikke reporter mus, er vi i stand til å identifisere IAM, iVMs, og IPMS på enkelt celle oppløsning. En slik analyse gjør det mulig for en eksperimentell in vitro-system er i stand til å isolere de individuelle bidragene fra transkripsjonsfaktorer mot subtype mangfold og sarcomere utvikling. Parallelt kan dette gi innsikt i nye transkripsjonsfaktorer eller små molekyler som Bias iCLMs mot en bestemt avstamning. Likevel er det flere viktige skritt for en vellykket gjennomføring av denne analysen. Nedenfor tar vi effekten av viral titer, fibroblast kvalitet, og bildeanalyse i en generell iCLM eksperiment.
I vår studie, EMP viLoy ekotropisk-retrovirus å omprogrammere E12.5 MEFs. Vi la merke til den retrovirale titer er direkte relatert til kvaliteten av cellene. Høy passasje nummer (> 35) og dårlige dyrkningsteknikker alvorlig påvirker kvaliteten av de retrovirale partikler; derfor er det flere hensyn å huske på. Plat-E-celler ikke produsere VSV-G pseudotyped virus, og er således ute av stand til å motstå ultrasentrifugering eller frysesykluser 24, 25. For å bevare den lange levetid av cellene, er det viktig å opprettholde lager med antibiotikavalg. De bør imidlertid bli opprettholdt i antibiotika gratis media i løpet av virusproduksjon. I vår erfaring, transfeksjon reagens brukes her gir de høyeste transfeksjonseffektiviteter i cellene. Hvis andre transfeksjonsmetoder skal benyttes, å sammenlikne de virale titere som produseres er vesentlig 26. Selv om det er anbefalinger av produsenten for å høsteviral supernatanten 48 timer etter transfeksjon, observerte vi at to 24-h høsting runder gi høyere omprogrammering effektivitet og samtidig unngå toksiske effekter som vanligvis forbindes med høyere titer virus forbereder. Videre, selv om flere studier har vist muligheten for kommersielle viral supernatant-konsentratorer 27, har vi ikke anvendes disse i våre vanlige protokoll for å kunne opprettholde en høyere gjennomstrømning.
I tillegg til høy titer virus cocktails, fibroblast kvalitet er av avgjørende betydning for en vellykket omprogrammering analysen 28. Hvis timet riktig, bør nylig isolerte MEFs benyttes på grunn av deres høyere effektivitet sammenlignet med frosne aksjer. Dette kan være relatert til naturen av retrovirus, som de trenger et høyt-proliferativ vert for å integrere 29. I tillegg spiller MEF seeding tetthet en avgjørende rolle. Vi har tatt med en tabell med seeding tettheter ansatti våre eksperimenter (tabell 2). Videre aging de MEFs vil også betydelig redusere omprogrammering effektivitet.
Immunocytochemistry (ICC) er vår standard teknikk for analyse av sarcomere organisasjon og subtype spesifikasjon. Med hjelp av en PM-GFP reporter mus, var vi i stand til å danne et antistoff panel for påvisning av tre store hjerte undergrupper (AM, VM, og PM). Men på grunn av begrensninger av antistoffarter tilgjengelighet og begrensning av 4-kanaler på en standard konfokalt mikroskop oppsett, er to dekk pr subtype nødvendig for å kvantifisere utbredelsen av alle tre undergrupper. En dekk vil farge for α-Actinin / GFP (Hcn4) / Myl2, og en for α-Actinin / GFP (Hcn4) / Nppa. Basert på vår forrige observasjon at sarcomeric struktur er et fellestrekk for alle CMS og en potensiell forutsetning for subtype spesifikasjon 21, det første trinnet i vår analyse er å avgjøre sarcomere +celler. Likevel, på grunn av sin subjektive natur, å etablere graden av sarcomere organiseringen er kanskje den vanskeligste delen av denne analysen; dette kan begrenses ved gjennomsnitt flere observatørens quantifications eller ved å utvikle beregningscelle segmentering programvare for å automatisere prosessen 30. Ved hjelp av endogene celler som et referansepunkt, oppdaget vi en terskel for velorganisert sarcomere + og utnyttet det å score iCLMs (figur 3). Gitt disse parametre, vil en gjennomsnittlig eksperiment gi opphav til 20 - 30% a-Actinin + celler, men bare 1% er a-Actinin + / sarcomere +. Av de 1% sarcomere + celler, ~ 30% vil være Nppa +, Myl2 +, eller Hcn4-GFP +.
Gitt at cardiomyocytes er strukturelt komplekst, populasjonsbasert genekspresjon (f.eks QRT-PCR) eller flowcytometri analyser kan ikke fange den intrikate morfologisk lmanges som oppstår under iCLM omprogrammering. I kontrast, patch klem og kalsium forbigående bildebehandling er svært strenge encellede funksjonelle analyser, men spesialisert kompetanse og utstyr er nødvendig for å gjennomføre disse eksperimentene. Således er den beskrevne metoden unik ved at den tilveiebringer en grei måte for å studere viktige strukturelle og funksjonelle parametre for iCLM reprogrammerings uten vesentlig å gå på akkord gjennomstrømming.
Til tross for de mange nylige fremskritt i direkte omprogrammering, gjenstår mye arbeid som må gjøres for å bedre forstå de molekylære mekanismene som regulerer hjerte omprogrammering, og mer spesifikt, subtype spesifikasjonen. Disse mekanismene vil bli spesielt viktig å oversette direkte omprogrammering for kliniske applikasjoner. Som sådan, i denne studien beskriver vi en plattform er i stand til direkte å modulere diskrete parametere for å evaluere bidraget til sarcomere utvikling, subtype spesifikasjon, og iCLM modenhet. Moreover, kan dette systemet videreutvikles til å jobbe i et high-throughput format slik at for kompleks screening av små molekyler eller ekstracellulære matriser for neste trinn i regenerativ kardiologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma | D5796 | Component of iCLM media, Plat-E media, fibroblast, and Transfection media |
| Medium 199 | Thermo Fisher Scientific | 11150059 | Component of iCLM media |
| Fetal bovine serrum (FBS) | Sigma | F2442 | Component of iCLM media, Plat-E media, fibroblast, and Transfection media |
| Insulin-Transferrin-Selenium G | Thermo Fisher Scientific | 41400-045 | Component of iCLM media |
| MEM vitamin solution | Thermo Fisher Scientific | 11120-052 | Component of iCLM media |
| MEM amino acids | Thermo Fisher Scientific | 1601149 | Component of iCLM media |
| Non-Essential amino acids | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | Component of iCLM media |
| Antibiotic-Antimycotics | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Component of iCLM media |
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | Component of iCLM media |
| Heat-Inactivated Horse Serum | Thermo Fisher Scientific | 26050-088 | Component of iCLM media |
| NaPyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360-70 | Component of iCLM media |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 1514022 | Component of Plat-E media and fibroblast media |
| Puromycin | Thermo Fisher Scientific | A11139-03 | Component of Plat-E media |
| Blasticidin | Gemini Bio-Products | 400-128P | Component of Plat-E media |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | Component of Fibroblast media |
| Confocal laser scanning LSM700 | Zeiss | For confocal analysis | |
| FuGENE 6 transfection Reagent | Promega | E2692 | Transfection reagent |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985-070 | Transfection reagent |
| Polybrene | Millipore | TR-1003-G | Induction reagent. Use at a final concentration of 8 μM/mL |
| Platinium-E (PE) Retroviral Packagin Cell Line, Ecotropic | CellBiolabs | RV-101 | Retroviral pacaking cell line |
| Trypsin 0.25% EDTA | Thermo Fisher Scientific | For MEFs and Plat-E dissociation | |
| Mouse anti α-Actinin (Clone EA-53) | Sigma | A7811 | Antibody for confocal analysis. Use at 1:200 |
| Chicken anti-GFP IgY | Thermo Fisher Scientific | A10262 | Antibody for confocal analysis. Use at 1:200 |
| Rabbit Pab anti-NPPA | Abgent | AP8534A | Antibody for confocal analysis. Use at 1:400 |
| Rabbit Pab anti Myl2 IgG | ProteinTech | 10906-1-AP | Antibody for confocal analysis. Use at 1:200 |
| Vectashield solution with DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Vector Labs | H-1500 | Dye for confocal analysis |
| Superfrost Plus Microscope slides | Thermo Fisher Scientific | 12-550-15 | 25 x 75 x 1.0 mm |
| BioCoat Fibronectin 12 mm coverslips | NeuVitro Corp | GG-12-1.5 | Coverslips for confocal analysis |
| 100 μm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| 0.45 μm Syringes filters SFCA 25MM | Thermo Fisher Scientific | 09-740-106 | For virus filtration |
| 6 mL Syringes | Covidien | 8881516937 | For virus filtration |
| Goat anti-Chicken IgY (H&L) A488 | Abcam | AB150169 | Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400 |
| Donkey anti-rabbit A647 IgG(H+L) | Thermo Fisher Scientific | A31573 | Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400 |
| Goat anti-mouse IgG(H+L) A555 | Thermo Fisher Scientific | A21422 | Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400 |
| Triton X-100 | Sigma | 93443-100ml | For cell permeabilization |
| Dulbecco's PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS) | Sigma | D8537 | |
| Power Block 10x Universal Blocking reagent | Thermo Fisher Scientific | NC9495720 | Dilute to 1x in H2O |
| 16% Paraformaldehyde aqueous solution (PFA) | Electro Microscopy Sciences | 15710 | Use at 4% diluted in dH2O |
| 6 cm plates | Olympus | 25-260 | |
| 6-well plates | Genesee Scientific | 25-105 | |
| 24-well plates | Genesee Scientific | 25-107 | |
| 10 cm Tissue culture dishes | Corning | 4239 | |
| 15 cm Tissue culture dishes | Thermo Fisher Scientific | 5442 | |
| 15 mL Conical tubes | Corning | 4308 | |
| 50 mL Conical tubes | Corning | 4249 | |
| 0.4% Trypan blue solution | Sigma | T8154 | For viability |
| Ethyl Alcohol 200 proof | Thermo Fisher Scientific | 7005 | |
| Bleach | Thermo Fisher Scientific | 6009 |
References
- Sissman, N. J. Developmental landmarks in cardiac morphogenesis: comparative chronology. Am J Cardiol. 25 (2), 141-148 (1970).
- Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nat Rev Genet. 6 (11), 826-835 (2005).
- Ali, S. R., et al. Existing cardiomyocytes generate cardiomyocytes at a low rate after birth in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (24), 8850-8855 (2014).
- Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
- Senyo, S. E., et al. Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes. Nature. 493 (7432), 433-436 (2013).
- Lin, Z., Pu, W. T. Strategies for cardiac regeneration and repair. Sci Transl Med. 6 (239), 239rv231 (2014).
- Writing Group, M., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), e38-e360 (2016).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).
- Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
- Qian, L., et al. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 485 (7400), 593-598 (2012).
- Fu, J. D., et al. Direct reprogramming of human fibroblasts toward a cardiomyocyte-like state. Stem Cell Reports. 1 (3), 235-247 (2013).
- Zhou, H., Dickson, M. E., Kim, M. S., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. Akt1/protein kinase B enhances transcriptional reprogramming of fibroblasts to functional cardiomyocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (38), 11864-11869 (2015).
- Zhou, Y., et al. Bmi1 Is a Key Epigenetic Barrier to Direct Cardiac Reprogramming. Cell Stem Cell. 18 (3), 382-395 (2016).
- Zhao, Y., et al. High-efficiency reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes requires suppression of pro-fibrotic signalling. Nat Commun. 6, 8243 (2015).
- Miki, K., Yoshida, Y., Yamanaka, S. Making steady progress on direct cardiac reprogramming toward clinical application. Circ Res. 113 (1), 13-15 (2013).
- Atkinson, A., et al. Anatomical and molecular mapping of the left and right ventricular His-Purkinje conduction networks. J Mol Cell Cardiol. 51 (5), 689-701 (2011).
- Bootman, M. D., Smyrnias, I., Thul, R., Coombes, S., Roderick, H. L.
- Miquerol, L., Beyer, S., Kelly, R. G. Establishment of the mouse ventricular conduction system. Cardiovasc Res. 91 (2), 232-242 (2011).
- Später, D., Hansson, E. M., Zangi, L., Chien, K. R. How to make a cardiomyocyte. Development. 141 (23), 4418-4431 (2014).
- Nam, Y. J., et al. Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors. Development. 141 (22), 4267-4278 (2014).
- Conner, D. A. Current Protocols in Molecular Biology. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), (2012).
- Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (17), 8033-8037 (1993).
- Ichim, C. V., Wells, R. A. Generation of high-titer viral preparations by concentration using successive rounds of ultracentrifugation. J Transl Med. 9, 137 (2011).
- Qian, L., Berry, E. C., Fu, J. D., Ieda, M., Srivastava, D. Reprogramming of mouse fibroblasts into cardiomyocyte-like cells in vitro. Nat Protoc. 8 (6), 1204-1215 (2013).
- Yang, R., et al. Direct conversion of mouse and human fibroblasts to functional melanocytes by defined factors. Nat Commun. 5, 5807 (2014).
- Muraoka, N., Ieda, M. Direct reprogramming of fibroblasts into myocytes to reverse fibrosis. Annu Rev Physiol. 76, 21-37 (2014).
- Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. Retroviruses. Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. , (1997).
- Bass, G. T., et al. Automated image analysis identifies signaling pathways regulating distinct signatures of cardiac myocyte hypertrophy. J Mol Cell Cardiol. 52 (5), 923-930 (2012).
