Introduction
Kalp embriyo 1, 2 geliştirmek için ilk fonksiyonel bir organdır. dolaşım sistemi ile birlikte, bu oksijen, besin ve geliştirme sırasında bir atık bertaraf mekanizması sağlamaktadır. Üç hafta döllenmeden sonra, insan kalbi ilk kez yener ve onun uygun düzenleme kardiyomiyositlerde (CMS) tarafından yapılmaktadır. Bu özel hücrelerin geri dönüşümsüz kaybı dolayısıyla ilerici kalp yetmezliği altında yatan temel bir konudur. Böyle Zebra balığı ve Xenopus gibi bazı organizmaların kalp rejenerasyon potansiyeli varken, yetişkin memeli kalp 3, 5, 6 daha sınırlıdır. Böylece, kalbin kritik işlevi göz önüne alındığında, kalp hastalığı tek başına 7 Amerika Birleşik Devletleri'nde 600.000 ölüm için muhasebe, dünyada önde gelen ölüm nedeni olduğunu şaşırtıcı değildir.verimli tamir veya yaralı miyokard yerine refore, hücre bazlı terapiler büyük bir klinik öneme sahiptir.
Yamanaka ve arkadaşları 8 seminal Çalışma dört transkripsiyon faktörlerinin zorla ifade pluripotent kök hücreleri tamamen farklılaşmış fibroblast hücrelerini dönüştürmek için yeterli olduğunu göstermiştir. Bununla birlikte, tüm pluripotent kök hücre stratejilerinin tümörijenik kapasitesi terapötik amaçlar için kullanımı ile önemli bir sorun olmuştur. Bu bir pluripotent sahne kaçınarak alternatif yöntemler hücrelerin transdifferentiate için aramak için bilimsel alanını motive etti. Son zamanlarda, çeşitli gruplar transkripsiyon ektopik ifadesi ile uyarılan kardiyomiyosit-benzeri hücreler (iCLMs) fare fibroblast doğrudan dönüşüm göstererek bu stratejinin uygulanabilirliğini göstermiştir Gata4, Mef2c Tbx5 ve daha sonra, Hand2 (GMT ve GHMT faktörleri sırasıyla) 9, 10. furthermore aynı strateji, in vivo olarak, insan-türevi doku 9, 11, 12 gerçekleştirilebilir. Son çalışmalar, ek faktörler ya da daha fazla kalp yeniden programlama verim 13, 14, 15 geliştirmek için modüle edilebilir yolakları sermiştir. Birlikte ele alındığında, bu çalışmalar rejeneratif tedaviler için yönlendirilmiş transdiferansiyonun potansiyelini göstermektedir. Ancak, metodolojik farklılıklara 16 CM yeniden programlama, bilinmeyen moleküler mekanizmaları, tutarsız tekrarlanabilirlik düşük verimlilik ve iCLMs heterojen yapısı adressiz kalır.
şirketinden iCLM heterojen değerlendirmek için biz sarkomer gelişimi ve kardiyak nesilli Specificatio tanımlanması için ayrı ve sağlam tek hücreli deneyi tasarlanmıştırN-iki fonksiyonel kardiyomiyositlerde gerekli özellikleri. Atriyal (AM), ventriküler (VM) ve kalp pili (PM) 17, 18, 19, 20: konumlarını ve eşsiz elektriksel özellikleri ile tanımlanan kalbinde CM en az üç ana tipi vardır. Bir orkestra birlikte, onlar kan düzgün pompalama sağlar. Kalp yaralanması sırasında, bir veya tüm alt tipleri etkilenebilir ve hücre tedavisi tip bir vaka ile ayrı ayrı ele alınması gerekir. az iş alt tipi özellikleri düzenleyen moleküler mekanizmaları incelemek için yapılırken Şu anda, en stratejileri, kardiyomiyositlerinin genel nesil odaklanmak.
Aşağıdaki çalışma düzgün iyi organize sarkomer ölçmek kardiyomyosit alt tiplerinin çeşitli bir dizi tanımlamak için nasıl ayrıntıları. Kalp pili (PM) 'e özgü muhabir Fareyi kullanarak, biz bir i uygulamak mümkünmmunocytochemical yaklaşım kaynaklı atriyal benzeri miyositleri (IAM), uyarılmış ventriküler benzeri miyositleri (IVM) ve uyarılmış PM benzeri miyositleri (IPMS) 21 ayırt etmek. Bizim gözlemlere dayanarak sadece sarkomer organizasyonu sergileyen hücreler spontan dayak yeteneğine sahiptirler. Bu eşsiz yeniden programlama platformu rolünü değerlendirmek için izin verir tek hücreli çözünürlükte sarkomer organizasyonu, alt tip şartname ve CM yeniden programlama verimliliği belli parametreleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvan uygulamaları içeren tüm deneysel prosedürleri UT Güneybatı Tıp Merkezi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi.
Hcn4-GFP E12.5 Fare Embriyonik Fibroplastı 1. izolasyonu (MEFS)
- homozigot Hcn4-GFP erkeklerde ve CD-1 dişiler arasındaki zamanlanmış çiftleşmelerin ayarlayın.
- karbondioksit ötanazi ve sonraki servikal dislokasyon ile E12.5 hamile kadın Kurban.
- , Daha önce 23 22 tarif edildiği gibi kesme forseps ile rahim boynuzları çıkarın ve Ca + 2 ya da Mg olmayan 1x Fosfat tamponlu tuz (PBS) ile buz üzerinde bir Petri 2+ içine yerleştirin.
- steril tekniği kullanarak doku kültürü kaputu sonraki tüm adımları uygulayın.
- makas kullanılarak ve forseps diseksiyon kesesi rahim ve amniyotik embriyolar çıkarın. Daha iyi kullanım için ekli plasentayı tutun. pregnant CD-1 dişi genellikle 10 ila 14 yavrular doğurur.
- Forseps kesme kullanılarak, izole edilmiş embriyolar, almak ve hızlı bir şekilde% 70 (h / h), EtOH içinde iki kez yıkayın.
NOT: yıkar hücre ölümünü en aza indirmek için hızlı olmalıdır. - İzole embriyolardan kalp de dahil olmak üzere, baş, kol ve bacaklarını, kuyruk ve iç organları çıkarın.
- Yaklaşık olarak 1 mm3 büyüklüğünde steril bir jilet kullanılarak 1 x PBS ve ince kıyma 1 mL 10 cm'lik bir tabak içinde kalan doku yerleştirin.
- PBS ile 50 ml konik tüp içine kıyılmış doku aktarın.
- 3 dakika boyunca 300 xg'de Spin. Dikkatle aşırı PBS aspire.
- embriyo başına steril% 0.25 tripsin-EDTA 1 ml. 15 dakika boyunca 37 ° C su banyosu içinde hücreleri inkübe edin. Yavaşça tüpü her 4 dakikada bir karıştırın. Aşırı sindirim dokusu önemli ölçüde verim düşürecektir.
- 4 saniye boyunca maksimum hızda (3200 rpm) vorteks hücre karışımı.
- embriyo başına fibroblast ortam 2 ml ilave edilir ve karıştırılır. filtre tsüzgecinden hücreleri yardım etmek için bir pipet kullanarak 100 mikron hücre süzgecinden hrough. Sonraki tüm ortamlar oluşturulması için Tablo 1'e bakınız.
- 4 dakika boyunca 300 xg'de Spin. Dikkatle süpernatant aspire.
- 3 embriyoların başına taze fibroblast medya 10 ml ekleyin ve 6-10 kez çiğnemek.
- hazırlanan her 3 embriyolar için 1 15 cm doku kültürü çanak hücreleri Plate. 37 ° C,% 5 CO2 inkübatörü içinde kültür, gece boyunca.
- Gece boyunca inkübasyondan sonra, plaka başına ortam taze 30 ml ile değiştirin. bir gecede geri kuvöz içine hücreleri yerleştirin.
NOT: floresan mikroskop altında Hcn4-GFP + hücre kirlenme kontrol edin. Kültür GFP olmalı - ve sadece yeniden programlama üzerine GFP + olur. - Bir sonraki gün, taze, önceden ısıtılmış,% 0.25 tripsin-EDTA 3 mL hasat hücreleri. Kont ve hücreleri dondurma. Tipik olarak, mL başına 3 x 10 6 hücre hücreleri dondurma. beklenen YieLD embriyo başına 3 x 10 6 hücre olmalıdır.
2. Retrovirus Üretim ve yeniden programlanması
Dikkat: Aşağıdaki protokol bulaşıcı retrovirüslerin üretimi ve işleme gerektirir. BSL-2 kurallar ve steril tekniği altında Biyogüvenlik Seviye 2 kabine aşağıdaki adımları uygulayın. retrovirüslere maruz kalan tüm malzemelerin imha etmek için% 10 çamaşır suyu kullanın.
- Retrovirüs üretimi ve MEFS hazırlık
Not: Aşağıdaki protokol 24 oyuklu plakalar içinde retroviral 6 oyuklu plakalar içinde üretimi ve MEF enfeksiyonu içindir. Diğer formatlar için, Tablo 2'ye bakınız. Zamanlama (bölüm 2.3 ve Şekil 2'ye bakın) her bir deney için uygun bir şekilde koordine edilmesi gerekir bu yüzden MEFS, Gün -1 de kaplanır.- Plat-E (PE) üreticinin önerilerine göre hücreler koruyun. Kısaca, DMEM kültür PE hücreleri,% 10 FBS, 1 ug / ml ile takviye edilmiş puromycin, 10 ug / ml Blasticidin, penisilin ve streptomisin üzerine yayıldı. Passage hücreleri 1: Kültür% 70-90 confluency ulaştığında 4 her iki günde.
- Gün -2: Transfeksiyondan bir önceki gün, transfeksiyon ortamı bir 6-yuvalı plaka / oyuk 1 x 10 6 hücre Plat-E hücreleri tohum. Hücreler, transfeksiyondan zamanında% 70-80 konfluent olmalıdır.
- Ticari bir transfeksiyon ajanı kullanılarak transfeksiyon.
Not: Ticari reaktifler transfeksiyondan önce oda sıcaklığında (RT) olmalıdır. DNA, transfeksiyonu için, GHMT kokteyli 9 oluşturmak için her bir retroviral plazmid DNA tek tek (G, H, K ve T) ekleyin.- Gün -1: 15 ml konik bir tüp içinde polistiren, bir 6-yuvalı plaka formatı için reaksiyon başına transfeksiyon reaktifi 6 uL düşük serum ortamında 60 uL karıştırın. Oda sıcaklığında 5 dakika süreyle inkübe karışımı.
Not: Burada kullanılan transfeksiyon reaktif plastik bağlanır beri,doğrudan indirgenmiş serum ortamına Transfeksiyon etkinliğindeki bir azalma bilmek dd. - reaksiyon başına GHMT kokteyli 2 mikrogram toplam ekleyin ve hafifçe karıştırın dokunun. vorteks etmeyin. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca reaksiyon inkübe edin.
- damla damla bir şekilde PE hücrelere adım 2.2.3 den karışımı ekleyin.
- 37 ° C,% 5 CO2 inkübatörü içinde bir gece boyunca transfekte Plat-E hücreleri inkübe edin. transfeksiyon zamanı kaydedin.
- Gün -1: 15 ml konik bir tüp içinde polistiren, bir 6-yuvalı plaka formatı için reaksiyon başına transfeksiyon reaktifi 6 uL düşük serum ortamında 60 uL karıştırın. Oda sıcaklığında 5 dakika süreyle inkübe karışımı.
- Hcn4-GFP fare embriyonik fibroblast tohumlama.
- 1 saat MEFS kaplama önce, immünsitokimya 24 plaka hazırlayın.
- kuyu başına 12 mm fibronektin lamel ekleyin.
- (Örneğin, SureCoat) sığır kollagen çözeltisi 300 uL ile kaplayın kuyu, 1 saat boyunca 37 ° C kuluçka makinesi içinde inkübe edilir.
- hemen MEF kaplama öncesi aspire kaplama solüsyonu.
- Hcn4-GFP MEFS donmuş şişe çözülme ve önceden ısıtılmış fibrobl ile x1 yıkayın5 dakika boyunca 500 xg'de ast ortamı.
- tripan mavisi dışlama veya benzeri boyalar kullanarak hücre canlılığı belirleyin. aşağıdaki formül kullanılarak kültür mL'si başına canlı hücre sayısını hesaplayın:
% Canlı hücreler = [1.00 - (toplam hücrelerin mavi hücre sayısı / Adet)] x 100- aşağıdaki formül kullanılarak canlı hücrelerin toplam sayısını hesaplayın:
Hücre süspansiyonu canlı hücreler =% canlı hücreler x seyreltme faktörü x 10,000 x toplam hacim
- aşağıdaki formül kullanılarak canlı hücrelerin toplam sayısını hesaplayın:
- Daha önce hazırlanan sığır kollagen çözelti fibronektin lamel ile 24 oyuklu plaka oyuk başına tohum 3 x 10 4 hücre.
- 1 saat MEFS kaplama önce, immünsitokimya 24 plaka hazırlayın.
- İletimi ve MEF'lerin yeniden programlama
NOT: Üreticinin notlarına göre, düzgün Plat-E hücreleri 1 x 10 7 enfeksiyon birimlerinin / mL ortalama titreye üretmek yapılmaktadır. titre doğrudan her bir deney için ölçülen olmasa da, bir GFP kontrolü her zaman enfeksiyon verimliliği için bir vekil olarak yer almaktadır.Yüksek GFP tanımı ve yoğunluğu (GFP +>% 95), tipik olarak iCLMs başarıyla GHMT aracılı üretimi ile ilişkilidir.- Gün 0: 24 saat post-transfeksiyon, 0.45 um gözenek boyutlu yüzey aktif madde içermeyen selüloz asetat filtre ile PE retroviral orta filtre ve 15 ml konik bir tüp aktarın. 8 ug / mL'lik bir nihai konsantrasyona kadar polibren ekleyin. Dikkatle taze transfeksiyon orta 2 ml hücreleri doldurmak.
NOT: Ortam çok hızlı değiştirilirse Hücreler kolayca levhadan ayırmak. - Kültür MEF'lerin orta aspire ve taze toplanan retroviral orta eklemek; Bir 6-çukurlu levha başına ortam 1.7 mL vermelidir. 24-iyi levha başına ~ 800 uL ekleyin. inkübatör MEF plaka dönün ve gece inkübe edin.
- 1. Gün: tekrarlayın 2.4.1 ve 2.4.2 adımları. 2. Virüs toplandıktan sonra hücreleri atın. inkübatör virüslü MEFS dönün ve onları bir gecede dinlendirin.
- 2. Gün: 48 saat sonrası indüksiyon, 1x PBS ile hücre klimalı ortam ve yıkama x1 aspire. 24 gözlü bir levha başına 500 uL önceden ısıtılmış iCLM ortam ekleyin.
- 3 gün - her 2 iCLM medya değiştirin. 14 gün kalp reprogramming immünsitokimya (ICC) analizi için viral indüksiyon sonrası süreç plakası.
- Gün 0: 24 saat post-transfeksiyon, 0.45 um gözenek boyutlu yüzey aktif madde içermeyen selüloz asetat filtre ile PE retroviral orta filtre ve 15 ml konik bir tüp aktarın. 8 ug / mL'lik bir nihai konsantrasyona kadar polibren ekleyin. Dikkatle taze transfeksiyon orta 2 ml hücreleri doldurmak.
Yeniden programlanması MEFS 3. immün
- 14-gün-indüksiyon sonrası, dikkatlice medya aspirat.
- buz soğukluğunda 1x PBS 300 ul her bir durulayın. Fazla çözüm aspire.
- 24 gözlü bir levha başına% 4 paraformaldehit (PFA) çözeltisi 250 uL hücreleri saptamak. Oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkalayın.
Not: - boyama önce 2 hafta sabit hücreler 1, 4 ° C de PBS içinde saklanabilir. - 300 uL% 0.1 PBS-Triton® X-100 (PBST) ile yıkanır kuyu X3 Permeabilize hücreleri. Yıkamalar arasında oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Son yıkamadan sonra aşırı çözüm aspire.
- 10 Blok300 uL / kuyu başında 1x Evrensel Blok Tampon ile oda sıcaklığında min.
- (ICC) boyama tampon hazırlayın: engelleme tampon 1x PBS ve 1x Universal 1: 1 ekleyin. ICC boyama tamponu primer antikorlar seyreltilir ve 4 ° C'de gece boyunca inkübe antikor. Önerilen dilüsyonları için maddi bölümüne bakın.
- Jüri özel IPM ve IAM tanımlama için fare a-aktinin, tavuk αGFP ve tavşan ile slaytlar bir çift Leke.
- iPM ve IVM tanımlama için fare α-aktinin, tavuk αGFP ve tavşan Myl2 ile slaytlar bir çift Leke.
- Ertesi gün, 300 uL% 0.1 PBST ile kuyu x3 yıkayın. Yıkamalar arasında oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Son yıkamadan sonra aşırı çözüm aspire.
- ICC tampon boyama ikincil antikor dilüsyonları hazırlayın. Önerilen dilüsyonları için maddi bölümüne bakın. İkincil antikorlar, ışıktan koruyarak oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
- Aşağıdaki ikincil Antikorların tüm slaytlar Lekes: fare Alexa-555, tavuk Alexa-488 ve tavşan Alexa-647.
- 300 uL% 0.1 PBST ile kuyu x3 yıkayın. Yıkamalar arasında oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Işıktan koruyunuz.
- cam bir mikroskop lamı, 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), 1.5 ug / ml ihtiva eden montaj medya 2.4 uL ekleyin. Dikkatle, 24 plaka kuyudan lamel kaldırmak fazla çözüm kaldırmak ve montaj medya ile cam slayt transfer. Yavaşça fazla hacim ve havayı çıkarmak için lamel basın.
- Tercih oje veya plastik dolgu macunu ile mühür slaytlar. Mağaza ışıktan korunan 4 ° C'de slaytlar.
Konfokal Mikroskobu kullanılarak Kardiyak Alt Tiplerinin 4. Kimlik
Not: görüntüleme için, konfokal mikroskop en az 2 floresan 405 spektral algılama kapasitesine sahip detektörler 488, 555 ve 639 nm dalga boyları ile donatılmış IPMS, IamS ve IVMS tespit etmek için gereklidir. imagPlan-Apochromat 20X / 0.75 objektif ya da daha iyi kullanarak e hücreleri. Üreticinin görüntü analiz yazılımı kullanarak 40X-immersiyon yağı kaliteli görüntüler elde edebilirsiniz yakınlaştırma görüntüleri taramak.
- Resim kütüphanesi: DAPI, Alexa-488, Alexa-555 ve Alexa-647 kanallı 8 bitlik görüntüleri almak (Böl.). Piksel 2'de 6 s 1024 çerçeve boyutu, çizgi adımı kalma süresi ve 2 ortalama yüksek çözünürlüklü görüntüler için yeterlidir.
- Her slayt için, bir ucundan başlayıp yukarı taramaya başlamak ve α-aktinin + Sarkomer + hücreleri için kırmızı floresan kanal (Böl.) Aşağı (örnekler için Şekil 3'e bakın ve Şekil 5A). Sarkomer çizgiler 555 nm dalga boyundaki görsel tespit etmek kolaydır.
- Bir α-aktinin + Sarkomer + hücre tespit edildikten sonra, yeşil ch geçin. pozitif olması durumunda ve (IPM) notu tutmak. uzak-kırmızı 647 ch değerlendirmek için bilgisayara geçin. (IAM veya IVM).
NOT: Hangi Hücrelerα-aktinin + / Sarkomer + / Hnc4-GFP + / jüri özel - / Myl2 - IPMS olarak belirlenir. GFP ifade hücre (Şekil 4A) boyunca görülecektir. - α-aktinin (fare-Alexa555), Hcn4-GFP (tavuk-Alexa488) ile Leke slaytlar, jüri özel (tavşan-Alexa647) ve DAPI. Α-aktinin + / Sarkomer + / Hnc4-GFP olan Hücreler - / jüri özel + IAM vardır. Jüri özel boyama perinükleer ve noktasal (Şekil 4B) görünecektir.
- α-aktinin (fare-Alexa555) ile Leke slaytlar, Hcn4-GFP (tavuk-Alexa488), Myl2 (tavşan-Alexa647). Α-aktinin için pozitif hücrelerin + / Sarkomer + / Hnc4-GFP - / Myl2 + IVMS vardır. Myl2 boyama sarkomer filamanın boyunca çizgili formu sergileyecek. Nedeniyle lekelenmesi ve Z-düzleminde kalitesinde farklılıklar nedeniyle, çizgiler her zaman (Şekil 4C) kolayca görülebilir olmayabilir.
- Bir α-aktinin + Sarkomer + hücre tespit edildikten sonra, yeşil ch geçin. pozitif olması durumunda ve (IPM) notu tutmak. uzak-kırmızı 647 ch değerlendirmek için bilgisayara geçin. (IAM veya IVM).
Not: potansiyel olarak yeniden programlanabilir MEF'ler gerçek sayısını belirlemek için, 24-çukurlu plaka 2 kuyu deney oyuklara paralel tohumlanır ve kaplama bir gün sonra hasat edilir. kaplama hücrelerinin toplam sayısı, daha sonra iki kuyu ortalamasının alınmasıyla belirlenmektedir. Bu kaplama gerçek toplam hücreleri (atotal) olur.
- sarkomer +
- Görme uygun α-aktinin + / Sarkomer + (Sağ paneller Şekil 3) ve kayıt (Şekil 5B-i) bir lamel her hücreyi kontrol edin.
- Kaplama gerçek toplam hücrelerin (atotal) her lamel ve böl üzerinde α-aktinin + / Sarkomer + toplam sayısını tablolaştırıyoruz (Şekil 5B-iii). Atotal = 12,500 hücre ve 100 hücre a-aktinin edildi, örneğin, + / Sarkomer + sonra kaplama MEF'ler% 0.8 yeniden programlanması edildi. Bir ortalamareprograming Deney,% 1 α-aktinin + / Sarkomer + hücreler (Şekil 5C) ürün elde edilir.
- Alt tür +
NOT: Aşağıdaki adımlar için, bir temsilci iCLM miktar iş akışı için 5B / C Şekil bakın. Ya alt (Şekil 5B-I) için farklı ise, kısa bir süre, her sarkomerinde + hücre için, çizelgeye. Ortalama sarkomerinde + hücreleri x 100 (Şekil 5B-i) üzerinden alt tipi + hücrelerinin sayısına bölünmesiyle% Alt (Şekil 5B-iii) hesaplayın. Mutlak% alt verimi (Şekil 5B-IV) hesaplamak için, Şekil, alt + hücre sayısına bölün 5B-i x 100 (Şekil 5B-II) 'tohumlanmıştır hücrelerin toplam sayısına göre.- GFP + jüri özel + veya Myl2 ise α-aktinin her + / Sarkomer + hücreleri için, değerlendirme
- / Myl2 - - aktinin + / Sarkomer + / Hnc4-GFP - / jüri özel + ve α-aktinin + / Sarkomer + / Hnc4-GFP α-aktinin + / Sarkomer + / Hnc4-GFP + / jüri özel sayısı tablolaştırıyoruz - / Myl2 + hücreleri (Şekil 5B-I).
- Her alt tip yüzdesini hesaplamak için, iyi ki + / Sarkomer + hücreleri α-aktinin toplam sayısına göre Tipi + hücre sayısını bölmek ve 100 GHMT ile çarpın IPMS, Iams ve IVMS kabaca eşit oranlarda oluşturur (Şekil 5B-iii).
- Alt tipi + hücrelerinin mutlak sayısını hesaplamak için, atotal tarafından deneysel koşul için alt tipi + hücrelerinin toplam sayısını bölmek ve 100 (Şekil 5B-ii) ile çarpın. ortalama iPMS toplam enfekte hücre popülasyonunun% 0.3, Iams% 0,3, temsil veIVMS% 0.25 (Şekil 5B-IV).
- GFP + jüri özel + veya Myl2 ise α-aktinin her + / Sarkomer + hücreleri için, değerlendirme
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PM-spesifik raportör fare yararlanan biz Şekil 1'de gösterildiği gibi çeşitli endojen miyositleri tanımlamak için multipleks immün strateji geliştirdi. Şekil 2'de gösterilen yeniden programlama adımları aşağıdakı, alt özel CMS indüksiyonu olsa düşük bir oranda, erken 4. günde 21 olarak tespit edilebilir. 14. günde tarafından, deney durdurulabilir ve sarkomer organizasyonu (Şekil 3) ve alt tip-şartname (Şekil 4) için değerlendirdi. Şekil 5, ICC (Şekil 5 A Paneli) slayt hazırlama akışı ve iCLM alt tiplerine spesifik hücreleri (Şekil / C 5 B Paneli) miktarının özetlemektedir.
Şekil 1: Endojen ve Tipi ÇeşitliliğiKardiyomiyositlerde. Α-aktinin için Hcn4-GFP muhabiri farelerden alınan yenidoğan atriyal kardiyomiyositlere (sarkomer işaretleyici, kırmızı), Hcn4-GFP (yeşil PM işaretleyici), ve jüri özel (atriyal işaretleyici, turuncu) (AB) İmmünositokimya (ICC) boyama. Α-aktinin Hcn4-GFP raportör farelerden yenidoğan ventriküler kardiyomiyositlerde (sarkomer markör, kırmızı), Hcn4-GFP (yeşil PM markeri) ve Myl2 (ventriküler markör, turuncu) (C) İmmünositokimya boyama. DAPI (mavi): Nükleer boyanma. Ölçek çubukları: 20 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Tablo 1: Kültür Orta. GHMT kaynaklı yeniden programlama sırasında kullanılan çeşitli ortamlar hazırlanması için Tablo özeti. Tablo 2: Tohumculuk, NAKLİ VE İndüksiyon Biçimleri.Hücrelerin kaplama ve transfeksiyonu için (A) Tablo özeti. (B) Tohum yoğunluğu ve yaklaşık enfeksiyon birimleri (veya viral süpernatant) kardiyomiyosit-benzeri hücrelere MEFS ikna etmek gerekiyordu. 
Şekil 2: Timeline şematik yeniden programlanması. GHMT kaynaklı Hcn4-GFP MEF'ler şematik temsili. üç büyük aşamalar tasvir edilmektedir. 
Şekil 3: Sarkomer Teşkilatı derecesi. α-aktinin (sarkomer işaretleyici, kırmızı) için Hcn4-GFP MEFS 14 gün GHMT sonra iletimi ICC boyama sarkomer örgütünün çeşitli bir yelpazede gösterir. Organizasyon artar derecesi doğru panellere bıraktı. her düzeyde Örnek resimler (n = 3). Ölçek çubuğu: 20 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. 
Şekil 4: Tipi özgü yeniden programlanması Cardiomyo lenfositler. Α-aktinin (sarkomer işaretleyici, kırmızı) için GHMT transduced Hcn4-GFP MEFS (AC) ICC boyama, Hcn4-GFP (PM işaretleyici, yeşil), jüri özel (atriyal işaretleyici, portakal) veya Myl2 (ventriküler işaretleyici, turuncu) . DAPI (mavi): Nükleer boyanma. Ölçek çubukları: 20 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. 
Şekil 5: Görüntü Alma ve Analiz İş Akışı. Görüntü analizi için şematik temsili. Panel A hücreye sarkomer + ve alt tip-özgüllük atama öncelik sırasını göstermektedir. Panel B, (I-IV) ve C ortalama GHMT-iCLM deney beklenen sonuçları göstermektedir. Anahtar noktalar ve formüller yeşil gösterilmiştir.om / files / ftp_upload / 55456 / 55456fig5large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. iCLM ortam Bileşen Hacim (ml) Nihai konsantrasyon DMEM 270 Orta 199 90 FBS 50 % 10 İnsülin Transferrin-Selenyum G 2.5 % 0,50 MEM vitamin solüsyonu 10 % 2 MEM Amino Asitler 20 % 4 Esansiyel olmayan amino asitler, 10 % 2 Antibiyotik-antimikotikum 10 % 2 B-27 takviyesi 10 % 2 Isı ile inaktive edilmiş At Serumu 25 % 5 Na-piruvata 2.5 1.5 mM Plat-E ortamı (PE) Bileşen Hacim (ml) Nihai konsantrasyon DMEM 450 FBS 50 % 10 Penisilin / Streptomisin 5 % 1 puromisin 0.05 1 ug / ml Blasticidin 0.5 10 ug / ml Fibroblast orta (FB) Bileşen0; Hacim (ml) Nihai konsantrasyon DMEM 450 FBS 50 % 10 Penisilin / Streptomisin 5 % 1 Glutamax 5 % 1 Transfeksiyon ortamı (Txf) - filtre (0.45 um) Bileşen Hacim (ml) Nihai konsantrasyon DMEM 450 FBS 50 % 10 İmmünositokimya (ICC) boyama tamponu Bileşen Hacim (ml) Nihai konsantrasyon 1X PBS 5 1x Evrensel bloke tamponu 5 A) Hücre tohumlama ve transfeksiyon Plaka / Bulaşık Yüzey Alanı (cm2) Ekim yoğunluğu (hücreler) Büyüme ortamı (mi) Transfekte etmek toplam DNA miktarı (ug) Transfeksiyon reaktifi (uL) Düşük serum ortamında (uL) 15 cm plaka 152 1.00E + 06 20 25 75 600 10 cm plaka 55 5.50e + 06 10 9 27 300 6 cm plaka 21 2.20E + 06 4 3.5 10.5 105 6 sıra / x1 9 1.00E + 06 2 2 6 60 12 gözlü / X1 4 4.00E + 05 1 0.5 1.5 15 24 kuyu / x1 2 2.00E + 05 0.5 0.3 0.9 9 48 kuyu / x1 1 1.70E + 05 0.25 0.15 0.45 4,5 B) Fibroblast tohumlama ve indüksiyon Plaka / Bulaşık Fibroblast ekim yoğunluğu (milyon) ICLM için yaklaşık enfeksiyonu birimleri 6 cm plaka 0,22-0,33 5.00E + 7 (~ 5 mL) içinde 6 sıra / x1 0.1-0.15 3.00E + 7 (~ 3 mL) 12 gözlü / X1 0,04-0,06 1.30E + 7 (~ 1 mL) içinde 24 kuyu / x1 0,02-0,03 6.50E + 6 (~ 0.8 mL) 48 çukurlu 0,001-0,015 3.00E + 6 (~ 0.4 mL)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışmada kardiyak transkripsiyon retrovirüs aracılı ifade yoluyla kardiyak alt tiplerinin farklı setine MEFS dönüşüm için doğrudan yeniden programlama strateji sağlar Gata4, Mef2c Tbx5 ve Hand2 (GHMT) faktörleri. Bir PM özgü muhabiri fare ile birlikte bir multipleks immün yaklaşımı kullanarak, biz tek bir hücre çözünürlükte IAM, IVMS ve IPMS tespit edebiliyoruz. Böyle bir tahlil alt tip çeşitlilik ve sarkomer geliştirilmesine yönelik bireysel transkripsiyon faktörlerinin katkıları izole edebilen vitro sistemde bir deneysel sağlar. Buna paralel olarak, bu yeni transkripsiyon faktörleri ya da belirli bir soydan doğru iCLMs önyargı küçük moleküllere fikir getirebilir. Bununla birlikte, bu testin başarıyla tamamlanması için birkaç kritik adımlar vardır. Aşağıda, genel iCLM deneyde viral titresi, fibroblast kalitesi ve görüntüleme analizi etkisini ele almaktadır.
Bizim çalışmamızda, EMPloy ecotropic-retrovirüsler E12.5 MEFS yeniden programlamak için. Biz retroviral titre doğrudan hücre kalitesine bağlıdır ettim. Yüksek geçiş sayısı (> 35) ve kötü kültür teknikleri ciddi retroviral parçacıkların kalitesini etkileyen; Bu nedenle, akılda tutulması gereken bazı noktalar vardır. Plat-E hücreleri VSV-G pseudotyped virüsü üretmek ve böylece Ultrasantrifügasyon veya donma döngüleri 24, 25 dayanmak mümkün değildir bilmiyorum. hücrelerin ömrünü korumak için, antibiyotik seçimi ile stokları sağlamak için zorunludur. Ancak, viral üretim sırasında antibiyotik içermeyen ortam içinde muhafaza edilmelidir. Bizim tecrübelerimize göre, burada kullanılan transfeksiyon reaktif hücrelerinde yüksek transfeksiyon verimliliği sağlar. Diğer transfeksiyon yöntemleri üretilen virüs titreleri karşılaştırılması, kullanılacak ise 26 gereklidir. önerileri üretici tarafından bulunmasına rağmen hasatViral süpernatant 48 saat transfeksiyondan sonra, genellikle yüksek titre viral preps ile ilişkili toksik etkileri kaçınarak iki 24 saatlik hasat mermi daha yüksek yeniden programlama verimliliği elde görülmektedir. Çeşitli çalışmalar ticari viral süpernatan konsantratörü 27 fizibilitesini göstermiştir olsa Dahası, biz daha yüksek bir verim korumak için düzenli protokolde bu istihdam değil.
Yüksek titre viral kokteyller yanı sıra, fibroblast kalitesi başarılı bir yeniden programlama tahlil 28 için büyük önem taşımaktadır. Doğru zaman aşımına ise, taze izole MEFS donmuş stokları ile karşılaştırıldığında kendi yüksek verimlilikleri nedeniyle kullanılmalıdır. Onlar 29 bütünleştirmek için bir yüksek proliferatif host gerekir gibi bu retrovirüslerin doğasına ilişkin olabilir. Buna ek olarak, MEF ekim yoğunluğu kritik bir rol oynar. tohumlama yoğunlukları istihdam ile bir tablo dahil ettikDeneylerimizde (Tablo 2). Ayrıca, MEFS pasaj da önemli ölçüde yeniden programlama verimliliği azaltacaktır.
İmmünositokimya (ICC) sarkomer organizasyonu ve alt tip şartname analizi için standart bir tekniktir. Bir PM-GFP raportör fare yardımıyla, biz üç büyük kardiyak alt tiplere (AM, VM ve PM) tespiti için bir antikor paneli oluşturmak başardık. Bununla birlikte, antikor türleri durumunu ve standart bir konfokal mikroskop kurulumu 4-kanal sınırlama kısıtlamaları nedeniyle, alt başına iki lamelleri Tüm üç alt tip sıklığını ölçmek için ihtiyaç vardır. Bir lamel α-aktinin / GFP (Hcn4) için leke olacak / Myl2 ve α-aktinin / GFP için bir (Hcn4) / jüri özel. + Sarkomerik yapı tüm CM'ler bir ortak özelliği ve bizim analizinde ilk adım sarkomer belirliyor alt tip şartname 21 için potansiyel bir ön koşul olduğunu önceki gözleme dayalıHücreler. Oysa, nedeniyle subjektif doğası gereği, sarkomer örgütlülük düzeyini kurulması belki de bu testin en zor kısmıdır; Bu çoklu gözlemcinin quantifications ortalamasını alarak veya süreci 30 otomatikleştirmek için sayısal hücre segmentasyon yazılım geliştirme ile sınırlı olabilir. Bir referans noktası olarak endojen hücreleri kullanılarak, biz iyi organize sarkomer + için bir eşik keşfetti ve iCLMs (Şekil 3) gol olduğunu kullandı. Bu parametreler göz önüne alındığında, ortalama bir deney 20 sebebiyet verecek -% 30 α-aktinin + hücreleri sadece% 1 a-aktinin vardır + / Sarkomer +. % 1 sarkomer + hücreleri, ~% 30 jüri özel + Myl2 + veya Hcn4-GFP + olacaktır.
Kardiyomiyositlerde yapısal karmaşık olduğunu, toplum temelli gen ifadesi (örneğin QRT-PCR) Verilen veya analizler karmaşık morfolojik ch yakalamak olamaz akım sitometriiCLM yeniden programlama sırasında meydana Anges'a. Buna karşılık, yama sıkma ve kalsiyum geçici görüntüleme son derece sıkı tek hücreli fonksiyonel tahliller, ancak özel beceri ve ekipman bu deneyler gereklidir. Bu nedenle, tarif edilen yöntem önemli ölçüde verim ödün vermeden iCLM yeniden programlama temel yapısal ve işlevsel parametreleri çalışma için basit bir yaklaşım sağlar ki benzersizdir.
Doğrudan yeniden programlama birçok yeni gelişmelere rağmen, çok iş daha iyi daha spesifik kardiyak yeniden programlama ve, alt tip şartname düzenleyen moleküler mekanizmaları anlamak için yapılması gereken kalır. Bu mekanizmalar, klinik uygulamalar için doğrudan yeniden programlamayı çevirmek için özellikle önemli hale gelecektir. Bunun gibi, bu çalışmada doğrudan sarkomer geliştirme, alt tip şartname ve iCLM olgunluk yolunda katkısını değerlendirmek için ayrı parametreler modüle edebilen bir platform açıklar. MoreoVer bu sistem, bundan başka, küçük moleküller veya rejeneratif kardiyoloji sonraki adım için hücre dışı matrisler kompleks taranması için izin veren, yüksek işleme kapasiteli bir düzende çalışması geliştirilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma | D5796 | Component of iCLM media, Plat-E media, fibroblast, and Transfection media |
| Medium 199 | Thermo Fisher Scientific | 11150059 | Component of iCLM media |
| Fetal bovine serrum (FBS) | Sigma | F2442 | Component of iCLM media, Plat-E media, fibroblast, and Transfection media |
| Insulin-Transferrin-Selenium G | Thermo Fisher Scientific | 41400-045 | Component of iCLM media |
| MEM vitamin solution | Thermo Fisher Scientific | 11120-052 | Component of iCLM media |
| MEM amino acids | Thermo Fisher Scientific | 1601149 | Component of iCLM media |
| Non-Essential amino acids | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | Component of iCLM media |
| Antibiotic-Antimycotics | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Component of iCLM media |
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | Component of iCLM media |
| Heat-Inactivated Horse Serum | Thermo Fisher Scientific | 26050-088 | Component of iCLM media |
| NaPyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360-70 | Component of iCLM media |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 1514022 | Component of Plat-E media and fibroblast media |
| Puromycin | Thermo Fisher Scientific | A11139-03 | Component of Plat-E media |
| Blasticidin | Gemini Bio-Products | 400-128P | Component of Plat-E media |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | Component of Fibroblast media |
| Confocal laser scanning LSM700 | Zeiss | For confocal analysis | |
| FuGENE 6 transfection Reagent | Promega | E2692 | Transfection reagent |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985-070 | Transfection reagent |
| Polybrene | Millipore | TR-1003-G | Induction reagent. Use at a final concentration of 8 μM/mL |
| Platinium-E (PE) Retroviral Packagin Cell Line, Ecotropic | CellBiolabs | RV-101 | Retroviral pacaking cell line |
| Trypsin 0.25% EDTA | Thermo Fisher Scientific | For MEFs and Plat-E dissociation | |
| Mouse anti α-Actinin (Clone EA-53) | Sigma | A7811 | Antibody for confocal analysis. Use at 1:200 |
| Chicken anti-GFP IgY | Thermo Fisher Scientific | A10262 | Antibody for confocal analysis. Use at 1:200 |
| Rabbit Pab anti-NPPA | Abgent | AP8534A | Antibody for confocal analysis. Use at 1:400 |
| Rabbit Pab anti Myl2 IgG | ProteinTech | 10906-1-AP | Antibody for confocal analysis. Use at 1:200 |
| Vectashield solution with DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Vector Labs | H-1500 | Dye for confocal analysis |
| Superfrost Plus Microscope slides | Thermo Fisher Scientific | 12-550-15 | 25 x 75 x 1.0 mm |
| BioCoat Fibronectin 12 mm coverslips | NeuVitro Corp | GG-12-1.5 | Coverslips for confocal analysis |
| 100 μm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| 0.45 μm Syringes filters SFCA 25MM | Thermo Fisher Scientific | 09-740-106 | For virus filtration |
| 6 mL Syringes | Covidien | 8881516937 | For virus filtration |
| Goat anti-Chicken IgY (H&L) A488 | Abcam | AB150169 | Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400 |
| Donkey anti-rabbit A647 IgG(H+L) | Thermo Fisher Scientific | A31573 | Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400 |
| Goat anti-mouse IgG(H+L) A555 | Thermo Fisher Scientific | A21422 | Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400 |
| Triton X-100 | Sigma | 93443-100ml | For cell permeabilization |
| Dulbecco's PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS) | Sigma | D8537 | |
| Power Block 10x Universal Blocking reagent | Thermo Fisher Scientific | NC9495720 | Dilute to 1x in H2O |
| 16% Paraformaldehyde aqueous solution (PFA) | Electro Microscopy Sciences | 15710 | Use at 4% diluted in dH2O |
| 6 cm plates | Olympus | 25-260 | |
| 6-well plates | Genesee Scientific | 25-105 | |
| 24-well plates | Genesee Scientific | 25-107 | |
| 10 cm Tissue culture dishes | Corning | 4239 | |
| 15 cm Tissue culture dishes | Thermo Fisher Scientific | 5442 | |
| 15 mL Conical tubes | Corning | 4308 | |
| 50 mL Conical tubes | Corning | 4249 | |
| 0.4% Trypan blue solution | Sigma | T8154 | For viability |
| Ethyl Alcohol 200 proof | Thermo Fisher Scientific | 7005 | |
| Bleach | Thermo Fisher Scientific | 6009 |
References
- Sissman, N. J. Developmental landmarks in cardiac morphogenesis: comparative chronology. Am J Cardiol. 25 (2), 141-148 (1970).
- Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nat Rev Genet. 6 (11), 826-835 (2005).
- Ali, S. R., et al. Existing cardiomyocytes generate cardiomyocytes at a low rate after birth in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (24), 8850-8855 (2014).
- Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
- Senyo, S. E., et al. Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes. Nature. 493 (7432), 433-436 (2013).
- Lin, Z., Pu, W. T. Strategies for cardiac regeneration and repair. Sci Transl Med. 6 (239), 239rv231 (2014).
- Writing Group, M., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), e38-e360 (2016).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).
- Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
- Qian, L., et al. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 485 (7400), 593-598 (2012).
- Fu, J. D., et al. Direct reprogramming of human fibroblasts toward a cardiomyocyte-like state. Stem Cell Reports. 1 (3), 235-247 (2013).
- Zhou, H., Dickson, M. E., Kim, M. S., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. Akt1/protein kinase B enhances transcriptional reprogramming of fibroblasts to functional cardiomyocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (38), 11864-11869 (2015).
- Zhou, Y., et al. Bmi1 Is a Key Epigenetic Barrier to Direct Cardiac Reprogramming. Cell Stem Cell. 18 (3), 382-395 (2016).
- Zhao, Y., et al. High-efficiency reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes requires suppression of pro-fibrotic signalling. Nat Commun. 6, 8243 (2015).
- Miki, K., Yoshida, Y., Yamanaka, S. Making steady progress on direct cardiac reprogramming toward clinical application. Circ Res. 113 (1), 13-15 (2013).
- Atkinson, A., et al. Anatomical and molecular mapping of the left and right ventricular His-Purkinje conduction networks. J Mol Cell Cardiol. 51 (5), 689-701 (2011).
- Bootman, M. D., Smyrnias, I., Thul, R., Coombes, S., Roderick, H. L.
- Miquerol, L., Beyer, S., Kelly, R. G. Establishment of the mouse ventricular conduction system. Cardiovasc Res. 91 (2), 232-242 (2011).
- Später, D., Hansson, E. M., Zangi, L., Chien, K. R. How to make a cardiomyocyte. Development. 141 (23), 4418-4431 (2014).
- Nam, Y. J., et al. Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors. Development. 141 (22), 4267-4278 (2014).
- Conner, D. A. Current Protocols in Molecular Biology. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), (2012).
- Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (17), 8033-8037 (1993).
- Ichim, C. V., Wells, R. A. Generation of high-titer viral preparations by concentration using successive rounds of ultracentrifugation. J Transl Med. 9, 137 (2011).
- Qian, L., Berry, E. C., Fu, J. D., Ieda, M., Srivastava, D. Reprogramming of mouse fibroblasts into cardiomyocyte-like cells in vitro. Nat Protoc. 8 (6), 1204-1215 (2013).
- Yang, R., et al. Direct conversion of mouse and human fibroblasts to functional melanocytes by defined factors. Nat Commun. 5, 5807 (2014).
- Muraoka, N., Ieda, M. Direct reprogramming of fibroblasts into myocytes to reverse fibrosis. Annu Rev Physiol. 76, 21-37 (2014).
- Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. Retroviruses. Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. , (1997).
- Bass, G. T., et al. Automated image analysis identifies signaling pathways regulating distinct signatures of cardiac myocyte hypertrophy. J Mol Cell Cardiol. 52 (5), 923-930 (2012).
