Introduction
El corazón es el primer órgano funcional para el desarrollo en el embrión de 1, 2. En combinación con el sistema circulatorio, que suministra oxígeno, nutrientes, y un mecanismo de eliminación de residuos durante el desarrollo. Tres semanas después de la fecundación, el corazón humano late por primera vez y su regulación adecuada es mantenida por los cardiomiocitos (CMS). Por lo tanto, la pérdida irreversible de estas células especializadas es la cuestión fundamental que subyace en la insuficiencia cardíaca progresiva. Si bien algunos organismos, tales como el pez cebra y Xenopus tienen el potencial para la regeneración cardiaca, el corazón de los mamíferos adultos es más limitada 3, 5, 6. Por lo tanto, dada la función crítica del corazón, no es sorprendente que la enfermedad cardíaca es la causa principal de muerte en el mundo, con 600.000 muertes sólo en 7 de los Estados Unidos. losrefore, las terapias basadas en células para reparar o reemplazar el miocardio lesionado de manera eficiente son de gran interés clínico.
El estudio seminal de Yamanaka y colegas 8 mostró que la expresión forzada de cuatro factores de transcripción es suficiente para convertir células de fibroblastos completamente diferenciadas a células madre pluripotentes. Sin embargo, la capacidad tumorigénico de todas las estrategias de células madre pluripotentes ha sido una preocupación fundamental en su uso para fines terapéuticos. Esto motivó el campo científico para buscar métodos alternativos para transdifferentiate células evitando al mismo tiempo una etapa pluripotente. Recientemente, varios grupos han demostrado la viabilidad de esta estrategia mediante la visualización de conversión directa de fibroblastos de ratón a células cardiomiocitos como inducidas (iCLMs) con la expresión ectópica de los factores de transcripción Gata4, MEF2C, Tbx5, y más tarde, Hand2 (GMT y GHMT , respectivamente) 9, 10. Furthermore, la misma estrategia se puede realizar in vivo y en los tejidos humanos derivados de 9, 11, 12. Estudios recientes han puesto de relieve factores adicionales o vías de señalización que pueden ser modulados para mejorar aún más la eficiencia de reprogramación cardíaca 13, 14, 15. Tomados en conjunto, estos estudios demuestran el potencial de transdiferenciación dirigida para las terapias regenerativas. Sin embargo, la baja eficiencia de reprogramación CM, los mecanismos moleculares desconocidos, reproducibilidad inconsistentes debido a las diferencias metodológicas 16, y la naturaleza heterogénea de iCLMs siguen sin resolverse.
Con el fin de evaluar directamente ICLM heterogeneidad, se diseñó un ensayo de una sola célula discreta y robusto para la identificación del desarrollo sarcómero y specificatio linaje cardiacon-dos características necesarias de los cardiomiocitos funcionales. Hay al menos tres tipos principales de CM en el corazón tal como se define por su ubicación y propiedades eléctricas únicas: auricular (AM), ventricular (VM) y el marcapasos (PM) 17, 18, 19, 20. En una combinación orquestada, que permiten el bombeo de la sangre adecuado. Durante la lesión del corazón, uno o todos los subtipos podrían verse afectados, y tendrían que ser abordado sobre una base caso por caso, el tipo de terapia celular. En la actualidad, la mayoría de las estrategias se centran en la generación global de los cardiomiocitos, mientras que poco trabajo se está haciendo para estudiar los mecanismos moleculares que regulan la especificación subtipo.
El siguiente estudio detalla cómo cuantificar adecuadamente sarcómeros bien organizados e identificar un conjunto diverso de subtipos de cardiomiocitos. El uso de un marcapasos (MP) de ratón específico de reportero, somos capaces de aplicar un immunocytochemical enfoque para distinguir los miocitos auriculares inducidas similar (IAM), miocitos ventriculares-como inducidas (IVM), y miocitos inducida PM-como (IPMS) 21. Sobre la base de nuestras observaciones, solamente las células que exhiben organización del sarcómero son capaces de latidos espontáneos. Esta plataforma permite la reprogramación única para evaluar el papel de ciertos parámetros en la organización del sarcómero, la especificación de subtipo, y la eficiencia de reprogramación CM en la resolución de una sola célula.
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Protocol
Todos los procedimientos experimentales con las prácticas con animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de UT Southwestern Medical Center.
1. Aislamiento de HCN4-GFP E12.5 de embriones de ratón de fibroblastos (MEF)
- Establecieron apareamientos cronometrados entre homocigotos machos HCN4-GFP y hembras CD-1.
- Sacrificar mujer embarazada en E12.5 mediante eutanasia, dióxido de carbono y dislocación cervical posterior.
- Retire cuernos uterinos con pinza de disección como se ha descrito previamente 22, 23, y colocarlos en una placa de Petri en el hielo con solución salina tamponada con fosfato 1x (PBS) sin Ca2 + o Mg2 +.
- Realizar todos los pasos subsiguientes en la campana de cultivo de tejidos utilizando una técnica estéril.
- Retire los embriones del útero y el saco amniótico con unas tijeras y pinzas de disección. Mantenga la placenta unida para un mejor manejo. pregnant CD-1 hembras suelen dar a luz a entre 10 y 14 crías.
- El uso de pinzas de disección, tome los embriones aislados y rápidamente enjuagarlos dos veces en 70% (v / v) EtOH.
NOTA: Los lavados deben ser rápido para minimizar la muerte celular. - Retire la cabeza, las extremidades, cola, y los órganos internos, incluyendo el corazón de los embriones aislados.
- Coloque el tejido restante en un plato de 10 cm con 1 ml de PBS 1x y carne picada finamente utilizando una cuchilla de afeitar estéril a aproximadamente 1 mm 3 en tamaño.
- Transferencia de tejido picado en un tubo cónico de 50 ml con PBS.
- Girar a 300 xg durante 3 min. aspirar cuidadosamente el exceso de PBS.
- Añadir 1 ml de 0,25% de tripsina-EDTA estéril por embrión. Se incuban las células en un baño de agua a 37 ° durante 15 min. Mezclar suavemente el tubo cada 4 minutos. El exceso de la digestión del tejido reducirá significativamente el rendimiento.
- mezcla de células vórtice a la máxima velocidad (3.200 rpm) durante 4 s.
- Añadir 2 ml de medio de fibroblastos por embrión y mezclar. filtro tediante un filtro de células de 100 micras usando una pipeta para ayudar a las células a través del filtro. Consulte la Tabla 1 para la formulación de todos los medios posteriores.
- Girar a 300 xg durante 4 minutos. Con cuidado, aspirar el sobrenadante.
- Añadir 10 ml de medio de fibroblastos fresca por 3 embriones y triturar 6-10 veces.
- Placa de las células en 1 15-cm placa de cultivo de tejido por cada 3 embriones preparados. Noche a la mañana la cultura en un 37 ° C, 5% de CO2.
- Después de la incubación durante la noche, vuelva a colocar los medios de comunicación con frescos 30 ml de medio por placa. Coloque las células de nuevo en la incubadora durante la noche.
NOTA: Compruebe si hay HCN4-GFP + contaminación de células bajo un microscopio de fluorescencia. La cultura debe ser GFP - y sólo convertirse GFP + sobre la reprogramación. - El día siguiente, las células de la cosecha con 3 ml de fresco precalentado 0,25% de tripsina-EDTA. Contar y congelar las células. Por lo general, congelar las células a 3 x 10 6 células por ml. El Yie esperadaLD debe ser de 3 x 10 6 células por embrión.
2. Producción y reprogramación Retrovirus
Precaución: La siguiente protocolo requiere la producción y el manejo de los retrovirus infecciosos. Realice los siguientes pasos en un gabinete de seguridad biológica de nivel 2 bajo BSL-2 directrices y una técnica estéril. Utilice lejía al 10% de disponer de todos los materiales expuestos a los retrovirus.
- La producción y preparación de retrovirus MEFs
NOTA: El siguiente protocolo es para la producción retroviral en placas de 6 pocillos y la infección por el MEF en placas de 24 pocillos. Para otros formatos, consulte la Tabla 2. MEFs se siembran en el Día -1, por lo que tendrá que ser coordinado adecuadamente para cada experimento (ver la sección 2.3 y en la Figura 2) el calendario.- Mantener las células según las recomendaciones del fabricante Plat-E (PE). Brevemente, las células de cultivo de PE en DMEM suplementado con 10% FBS, 1 mg / ml puromycin, 10 mg / ml de blasticidina, penicilina, y estreptomicina. células de paso 1: 4 cada dos días cuando el cultivo alcanza el 70-90% de confluencia.
- Día -2: El día antes de la transfección, las células semilla Plat-E en células de 1 x 10 6 / pocillo en una placa de 6 pocillos en medio de transfección. Las células deben ser 70 a 80% de confluencia en el momento de la transfección.
- La transfección usando un agente de transfección comercial.
NOTA: Los reactivos comerciales deben estar a temperatura ambiente (TA) antes de la transfección. Para la transfección de ADN, añadir cada plásmido retroviral DNA individualmente (G, H, M y T) para formar un cóctel GHMT 9.- Día -1: En un tubo de poliestireno de 15 ml cónico, mezclar 60 l de medio de suero reducido con 6 l de reactivo de transfección por reacción de un formato de placa de 6 pocillos. Incubar la mezcla durante 5 min a temperatura ambiente.
NOTA: Puesto que el reactivo de transfección utilizada aquí se une a los plásticos, unadd directamente a los medios de comunicación de suero reducido para evitar cualquier disminución en la eficiencia de la transfección. - Añadir un total de 2 g de GHMT cóctel por la reacción y golpear suavemente para que se mezcle. No hacer vórtice. Incubar la reacción durante 15 min a TA.
- Añadir la mezcla de la etapa 2.2.3 a las células de PE en una manera prudente gota.
- Se incuban las células transfectadas Plat-E durante la noche en un 37 ° C, 5% de CO2. Registre el momento de la transfección.
- Día -1: En un tubo de poliestireno de 15 ml cónico, mezclar 60 l de medio de suero reducido con 6 l de reactivo de transfección por reacción de un formato de placa de 6 pocillos. Incubar la mezcla durante 5 min a temperatura ambiente.
- La siembra de fibroblastos de embriones de ratón HCN4-GFP.
- 1 h antes del chapado MEFs, preparar una placa de 24 pocillos para inmunocitoquímica.
- Añadir un cubreobjetos de 12 mm fibronectina por pocillo.
- Recubrir los pocillos con 300 l de solución de colágeno bovino (por ejemplo, surecoat) y se incuban en una incubadora a 37ºC durante 1 h.
- Aspirar solución de revestimiento inmediatamente antes de chapado MEF.
- Descongelar un vial congelado de HCN4-GFP MEFs y lavar con x1 fibrobl pre-calentadomedios ast a 500 xg durante 5 min.
- Determinar la viabilidad celular mediante exclusión con azul de tripano o tintes similares. Calcular el número de células viables por ml de cultivo utilizando la siguiente fórmula:
% de células viables = [1.00 - (Número de células azules / Número de células totales)] x 100- Calcular el número total de células viables utilizando la siguiente fórmula:
Las células viables =% de células viables x factor de dilución x 10.000 x volumen total de la suspensión celular
- Calcular el número total de células viables utilizando la siguiente fórmula:
- Semilla 3 x 10 4 células por pocillo en una placa de 24 pocillos con cubreobjetos previamente preparada solución de fibronectina colágeno bovino.
- 1 h antes del chapado MEFs, preparar una placa de 24 pocillos para inmunocitoquímica.
- Transducción y reprogramación de MEFs
NOTA: De acuerdo con las indicaciones del fabricante, debidamente mantenido células Plat-E producen un título promedio de 1 x 10 7 unidades de infección / ml. Aunque el título no se mide directamente para cada experimento, un control GFP siempre se incluye como un sustituto para la eficiencia de la infección.La expresión de alto GFP y la intensidad (GFP +> 95%) típicamente correlacionado con éxito la generación de GHMT mediada de iCLMs.- Día 0: 24 h después de la transfección, se filtra el medio retroviral PE a través de un tamaño de filtro de acetato de 0,45 micras de poro exento de tensioactivos de celulosa y transferir a un tubo cónico de 15 mL. Añadir polibreno a una concentración final de 8 mg / ml. reponer cuidadosamente las células con 2 ml de medio de transfección fresco.
NOTA: Las células se desprenden fácilmente de la placa si se cambia el material con demasiada rapidez. - Aspirar el medio de los MEFs cultivadas y añadir el medio retroviral recién recogida; debe producir 1,7 ml de medio por pocillo de una placa de 6 pocillos. Añadir ~ 800 l por pocillo de una placa de 24 pocillos. Volver placa MEF a la incubadora y se incuba durante la noche.
- Día 1: Repita los pasos 2.4.1 y 2.4.2. Desechar las células después de la colección de virus 2º. Volver MEFs infectadas a la incubadora y dejar reposar durante la noche.
- Día 2: 48 h después de la inducción, aspirar el celular acondicionado medios de comunicación y de lavado x1 con 1x PBS. Añadir medios ICLM 500 l pre-calentado por pocillo de una placa de 24 pocillos.
- Sustitución de los medios ICLM cada 2 - 3 días. Plataforma en 14 días después de la inducción viral para inmunocitoquímica análisis (CPI) de la reprogramación cardiaca.
- Día 0: 24 h después de la transfección, se filtra el medio retroviral PE a través de un tamaño de filtro de acetato de 0,45 micras de poro exento de tensioactivos de celulosa y transferir a un tubo cónico de 15 mL. Añadir polibreno a una concentración final de 8 mg / ml. reponer cuidadosamente las células con 2 ml de medio de transfección fresco.
3. La inmunotinción de MEFs reprogramadas
- 14 días después de la inducción, aspirar con cuidado los medios de comunicación.
- Enjuague cada pocillo con 300 l de helado de PBS 1x. Aspirar el exceso de solución.
- Fijar las células con 250 l de paraformaldehído al 4% de solución (PFA) por pocillo de una placa de 24 pocillos. Incubar 15 min a RT.
NOTA: Se ha corregido células se pueden almacenar en PBS a 4 ° C durante 1 - 2 semanas antes de la tinción. - permeabilizar las células por lavado de pozos x3 con 300 L de 0,1% Triton X-100 PBS (PBST). Incubar 5 minutos a temperatura ambiente después de cada lavado. Aspirar el exceso de solución después del último lavado.
- Bloque de 10min a TA con 1x universal almacenador intermediario del bloque a 300 l / pocillo.
- Preparar (CPI) tampón de tinción: Añadir 1: 1 de PBS 1x y 1x tampón de bloqueo universal. Diluir anticuerpos primarios en tampón de tinción ICC e incubar anticuerpos noche a 4 ° C. Consulte la sección de material para las diluciones recomendadas.
- Manchar un par de diapositivas con α-actinina ratón, αGFP pollo y conejo NPPA para el MIP y la identificación de IAM.
- Manchar un par de diapositivas con el ratón α-actinina, αGFP pollo, conejo y MYL2 para la identificación de MIP y MIV.
- Al día siguiente, se lavan los pocillos con 300 l x3 0,1% PBST. Incubar 5 minutos a temperatura ambiente después de cada lavado. Aspirar el exceso de solución después del último lavado.
- Preparar las diluciones de anticuerpos secundarios en tampón de tinción de la CPI. Consulte la sección de material para las diluciones recomendadas. Incubar anticuerpos secundarios 1 hora a temperatura ambiente, protegido de la luz.
- Manchar todas las diapositivas con la siguiente antibodie secundarias: ratón Alexa-555, pollo Alexa-488, y el conejo Alexa-647.
- Lavar los pocillos con 300 l x3 0,1% PBST. Incubar 5 minutos a temperatura ambiente después de cada lavado. Proteger de la luz.
- Añadir 2,4 l de medio de montaje que contienen 1,5 mg / ml de 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) a un portaobjetos de microscopio de vidrio. Retirar con cuidado el cubreobjetos del pozo de la placa de 24 pocillos, eliminar el exceso de solución y transferir al portaobjetos de vidrio con medio de montaje. Presione suavemente el cubreobjetos para eliminar el exceso de volumen y el aire.
- sellar los portas con esmalte de uñas preferido o sellador plástico. Tienda diapositivas montadas a 4 ° C protegido de la luz.
4. Identificación de los subtipos cardíacos Utilizando microscopía confocal
NOTA: Para imágenes, un microscopio confocal equipado con al menos 2 detectores fluorescentes capaces de detección espectral a 405, 488, 555, y 639 nm longitud de onda es necesaria con el fin de identificar IPMS, Iams, y IVMS. imagLas células E usando un Plan-Apocromático 20X / 0.75 o mejor objetivo. El uso de software de análisis de imágenes del fabricante, la digitalización de imágenes de zoom puede lograr imágenes de calidad inmersión 40X-petróleo.
- Biblioteca de imágenes: tomar imágenes de 8 bits con DAPI, Alexa-488, Alexa-555, y Alexa-647 canales (CH.). Pixel tiempo de permanencia de 6 s, 1024 tamaño de la trama, paso de línea a los 2, y un promedio de 2 es suficiente para imágenes de alta resolución.
- Para cada diapositiva, empezar desde un borde y comenzar a escanear hacia arriba y abajo en el canal rojo fluorescente (cap.) Para las células sarcómero + α-actinina + (Consulte la Figura 3 y la Figura 5A para ejemplos). estrías sarcómero son más fáciles de identificar visualmente en la longitud de onda de 555 nm.
- Una vez que se ha identificado un α-actinina + + células Sarcómero, cambiar a la ch verde. y mantener la nota si es positivo (MIP). Cambie a la computadora para evaluar el rojo lejano 647 ch. (IAM o IVM).
NOTA: Las celdas que estánα-actinina + / + Sarcómero / Hnc4-GFP + / NPPA - / MYL2 - se designan como IPMS. Expresión de GFP se verá en toda la célula (Figura 4A). - diapositivas mancha con α-actinina (ratón-Alexa555), HCN4-GFP (pollo-Alexa488), NPPA (conejo-Alexa647), y DAPI. Las células que son α-actinina + / + Sarcómero / Hnc4-GFP - / + NPPA son IAM. NPPA tinción perinuclear y aparecerá punteada (Figura 4B).
- diapositivas mancha con α-actinina (ratón-Alexa555), HCN4-GFP (pollo-Alexa488), MYL2 (conejo-Alexa647). Las células positivas para α-actinina + / + Sarcómero / Hnc4-GFP - / + MYL2 son IVMS. MYL2 tinción exhibirá una forma estriada a lo largo del filamento de sarcómero. Debido a variaciones en la calidad de la tinción y el plano z, estrías pueden no ser siempre fácilmente visible (Figura 4C).
- Una vez que se ha identificado un α-actinina + + células Sarcómero, cambiar a la ch verde. y mantener la nota si es positivo (MIP). Cambie a la computadora para evaluar el rojo lejano 647 ch. (IAM o IVM).
NOTA: A fin de evaluar el número real de MEFs potencialmente reprogramadas, 2 pocillos de una placa de 24 pocillos se siembran en paralelo a los pocillos experimentales y se cosechan un día después de la siembra. El número total de células cultivadas en placas se determina entonces el promedio de los dos pozos. Esto se convierte en las células totales reales plateados (Atotal).
- sarcómero +
- Inspeccione visualmente cada célula en un cubreobjetos para el buen α-actinina + / + Sarcómero (paneles de la derecha figura 3) y registro (Figura 5B-i).
- Tabular el número total de α-actinina + / + Sarcómero en cada cubreobjetos y se divide por el total de células chapados reales (Atotal) (Figura 5 B-III). Por ejemplo, si atotal = 12.500 células, y 100 células se alfa-actinina + / + Sarcómero entonces, 0,8% de los MEFs en placas fueron reprogramado. Un promedioexperimento reprogramación rendirá 1% alfa-actinina + / + células sarcómero (Figura 5C).
- subtipo +
NOTA: Para los siguientes pasos, consulte la Figura 5B / C para un flujo de trabajo ICLM cuantificación representativa. Brevemente, para cada sarcómero + de células, tabular si es única, ya sea para el subtipo (Figura 5B-i). Calcular el% de Subtipo (Figura 5B-iii) dividiendo el número de células de subtipo + sobre el sarcómero media + células x 100 (Figura 5B-i). Para el cálculo de la eficiencia absoluta del subtipo% (Figura 5B-IV), se divide el número de células de subtipo + Figura 5B-i por el número total de células sembradas x 100 (Figura 5 B-II).- Para cada uno de los α-actinina células + / + Sarcómero, evaluar si son GFP +, + NPPA, o MYL2
- Tabular número total de α-actinina + / Sarcómero + / Hnc4-GFP + / NPPA - / MYL2 -, actinina + / Sarcómero + / Hnc4-GFP - / NPPA +, y α-actinina + / Sarcómero + / Hnc4-GFP - / células MYL2 + (Figura 5B-I).
- Para calcular el porcentaje de cada subtipo, se divide el número de células de subtipos + por el número total de α-actinina + / + células sarcómero en que así y se multiplica por 100. GHMT genera IPMS, Iams, y IVMS proporciones aproximadamente iguales a (figura 5B-iii).
- Para calcular el número absoluto de subtipo + células, se divide el número total de células subtipo + para la condición experimental por Atotal y se multiplica por 100 (Figura 5 B-II). En iPMS promedio representan el 0,3% de la población total de células infectadas, Iams 0,3%, yIVMS 0,25% (Figura 5B-iv).
- Para cada uno de los α-actinina células + / + Sarcómero, evaluar si son GFP +, + NPPA, o MYL2
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Representative Results
Aprovechando el ratón reportero PM-específica, hemos desarrollado una estrategia inmunotinción múltiplex para identificar diversas miocitos endógenos como se muestra en la Figura 1. Siguiendo los pasos de reprogramación que se muestran en la Figura 2, la inducción de los CM subtipo específico puede detectarse ya en el día 4 21, aunque a una velocidad baja. Para el día 14, el experimento se puede detener y evaluado para la organización del sarcómero (Figura 3) y el subtipo de especificación (Figura 4). La Figura 5 resume el flujo de trabajo de preparación de los portaobjetos para el CPI (Figura 5 Panel A), y la cuantificación de células ICLM subtipo específico (Figura 5 Panel B / C).
Figura 1: Diversidad subtipo de EndógenoCardiomiocitos. (AB) La inmunocitoquímica (CPI) tinción de los miocitos auriculares neonatales de ratones reportero HCN4-GFP para α-actinina (marcadores sarcómero, rojo), HCN4-GFP (marcador de PM, verde), y NPPA (fibrilación marcador, naranja). (C) la tinción inmunocitoquímica de los cardiomiocitos ventriculares neonatales de ratones reportero HCN4-GFP para α-actinina (marcadores sarcómero, rojo), HCN4-GFP (marcador de PM, verde), y MYL2 (ventricular marcador, naranja). DAPI (azul): tinción nuclear. Barras de escala: 20 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1: medio de cultivo. resumen de la tabla para la preparación de los varios medios utilizados durante la reprogramación inducida por GHMT. Tabla 2: Siembra, transfección y la inducción formatos.(A) Cuadro resumen de la chapa y la transfección de células. Unidades (B) y la densidad de siembra de infección aproximada (o sobrenadante viral) necesarios para inducir a las células MEFs en cardiomiocitos similares. 
Figura 2: La reprogramación Cronología esquemática. Representación esquemática de los inducidos por GHMT MEFs HCN4-GFP. Los tres principales etapas se describen. 
Figura 3: Grado de Organización Sarcómero. tinción de CPI-GFP HCN4 MEFs 14 días después de la transducción GHMT de α-actinina (marcador sarcómero, rojo) muestra una amplia gama de organización del sarcómero. El grado de organización aumenta de izquierda a paneles de la derecha. imágenes representativas de cada nivel (n = 3). Barra de escala: 20 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 
Figura 4: subtipo específico Reprogramado Cardiomyo citos. (AC) tinción CPI de transducidas-GHMT HCN4-GFP MEF para la α-actinina (marcador sarcómero, rojo), HCN4-GFP (marcador de PM, verde), NPPA (marcador auricular, naranja), o MYL2 (marcador ventricular, naranja) . DAPI (azul): tinción nuclear. Barras de escala: 20 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 
Figura 5: Adquisición de imágenes y análisis de flujo de trabajo. Representación esquemática de análisis de imagen. Panel A representa el orden de prioridad de asignación de sarcómero + y subtipo especificidad a una célula. Grupo B (I-IV) y C muestran los resultados esperados de un experimento promedio GHMT-ICLM. Los puntos clave y las fórmulas se muestran en verde.om / archivos / ftp_upload / 55456 / 55456fig5large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. medios ICLM Componente Volumen (ml) La concentración final DMEM 270 Medium 199 90 FBS 50 10% La insulina-transferrina-selenio G 2.5 0,50% solución de vitaminas MEM 10 2% MEM Amino Acids 20 4% Los aminoácidos no esenciales 10 2% Antibióticos Antimicóticos 10 2% B-27 suplemento 10 2% Inactivado por calor suero de caballo 25 5% Na-piruvato 2.5 1,5 mM Medios Plat-E (PE) Componente Volumen (ml) La concentración final DMEM 450 FBS 50 10% Penicilina / estreptomicina 5 1% puromicina 0.05 1 mg / ml blasticidin 0,5 10 mg / ml Medio de fibroblastos (FB) Componente0; Volumen (ml) La concentración final DMEM 450 FBS 50 10% Penicilina / estreptomicina 5 1% glutamax 5 1% El medio de transfección (TxF) - filtrada (0,45 micras) Componente Volumen (ml) La concentración final DMEM 450 FBS 50 10% La inmunocitoquímica (CPI) tampón de tinción Componente Volumen (ml) La concentración final 1x PBS 5 tampón de bloqueo 1x universal 5 A) la siembra de células y transfección Plate / Plato Área de superficie (cm 2) Densidad de siembra (células) El medio de crecimiento (mL) Cantidad total de ADN para transfectar (g) Reactivo de transfección (l) Reducción de medio de suero (l) 15 cm de placa 152 1,00E + 06 20 25 75 600 10 cm de placa 55 5.50E + 06 10 9 27 300 placa de 6 cm 21 2.20E + 06 4 3.5 10.5 105 6 así / x1 9 1,00E + 06 2 2 6 60 12 así / x1 4 4.00E + 05 1 0,5 1.5 15 24 así / x1 2 2.00E + 05 0,5 0,3 0,9 9 48 así / x1 1 1.70E + 05 0.25 0.15 0.45 4.5 B) siembra de fibroblastos y la inducción Plate / Plato Densidad de siembra de fibroblastos (millones) Unidades de infección aproximados para ICLM placa de 6 cm 0,22-0,33 5.00e + 7 (~ 5 ml) 6 así / x1 0,1-0,15 3.00E + 7 (~ 3 ml) 12 así / x1 0,04-0,06 1.30E + 7 (~ 1 ml) 24 así / x1 0,02-0,03 6.50E + 6 (~ 0,8 ml) 48 así 0,001 a 0,015 3.00E + 6 (~ 0,4 ml)
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Discussion
El presente estudio proporciona una estrategia de reprogramación directa para la conversión de los MEF en un conjunto diverso de subtipos cardíacas a través de la expresión mediada por retrovirus de la transcripción cardiaca Factores Gata4, MEF2C, Tbx5, y Hand2 (GHMT). Utilizando un enfoque de inmunotinción múltiplex en combinación con un ratón reportero PM-específica, somos capaces de identificar IAM, IVMS, y iPMS a una resolución de una sola célula. Dicho ensayo permite una experimental sistema in vitro capaz de aislar las contribuciones de los factores de transcripción individuales hacia la diversidad subtipo y el desarrollo sarcómero. Al mismo tiempo, esto podría brindar una valiosa aportación a los nuevos factores de transcripción o moléculas pequeñas que sesgan iCLMs hacia un linaje particular. Sin embargo, hay varios pasos críticos para la finalización con éxito de este ensayo. A continuación, nos dirigimos a los efectos de la titulación viral, la calidad de fibroblastos, y el análisis de imágenes en un experimento en general ICLM.
En nuestro estudio, hemos EMPLoy ecotropic-retrovirus a reprogramar MEFs E12.5. Notamos que el título retroviral está directamente relacionada con la calidad de las células. número alto pasaje (> 35) y técnicas de cultivo pobres afectan gravemente a la calidad de las partículas retrovirales; Por lo tanto, hay varias consideraciones a tener en cuenta. Células Plat-E no producen virus pseudotyped VSV-G, y por tanto son incapaces de soportar ultracentrifugación o ciclos de congelación 24, 25. Con el fin de preservar la longevidad de las células, es imperativo mantener la población con selección de antibióticos. Sin embargo, deben ser mantenidos en un medio libre de antibióticos durante la producción viral. En nuestra experiencia, el reactivo de transfección utilizada aquí proporciona las más altas eficiencias de transfección en células. Si otros métodos de transfección se van a utilizar, la comparación de los títulos virales producidas es esencial 26. Aunque hay recomendaciones por el fabricante para la cosechael sobrenadante viral 48 h después de la transfección, se observó que dos rondas de 24 h de cosecha producen mayor eficiencia de reprogramación evitando al mismo tiempo los efectos tóxicos asociados generalmente con preparaciones virales de mayor titulación. Por otra parte, aunque varios estudios han demostrado la viabilidad de los concentradores de sobrenadante viral comerciales 27, no hemos empleado estos en nuestro protocolo regular con el fin de mantener un rendimiento superior.
Además de alta titulación cócteles virales, la calidad de los fibroblastos es de crucial importancia para un ensayo de reprogramación con éxito 28. Si el tiempo correctamente, MEFs recién aisladas deben ser utilizados debido a sus eficiencias más altas en comparación con las existencias congeladas. Esto podría estar relacionado con la naturaleza de los retrovirus, ya que necesitan un huésped altamente proliferativa con el fin de integrar 29. Además, la densidad de siembra MEF juega un papel crítico. Hemos incluido una tabla con las densidades de siembra empleadasen nuestros experimentos (Tabla 2). Por otra parte, los pases MEF también disminuirá significativamente la eficiencia de reprogramación.
La inmunocitoquímica (CPI) es nuestra técnica estándar para el análisis de la organización del sarcómero y la especificación de subtipo. Con la ayuda de un ratón reportero PM-GFP, hemos sido capaces de formar un panel de anticuerpos para la detección de tres subtipos principales cardíacas (AM, VM, y PM). Sin embargo, debido a las limitaciones de disponibilidad de especies de anticuerpos y la limitación de 4 canales en un estándar de microscopio confocal de configuración, se necesitan dos cubreobjetos por subtipo de cuantificar la prevalencia de los tres subtipos. Un cubreobjetos se mancha de α-actinina / GFP (HCN4) / MYL2, y uno para α-Actinin / GFP (HCN4) / NPPA. Sobre la base de nuestra observación anterior de que la estructura del sarcómero es una característica común de todos los CM y un requisito potencial para la especificación de subtipo 21, el primer paso en nuestro análisis es determinar sarcómero +Células. Sin embargo, debido a su naturaleza subjetiva, se establece el nivel de organización del sarcómero es quizás la parte más difícil de este ensayo; esto puede ser limitado por un promedio de cuantificaciones múltiple del observador o mediante el desarrollo de software segmentación celular computacional para automatizar el proceso 30. El uso de células endógenas como punto de referencia, descubrimos un umbral para bien organizado sarcómero + y utilizado para anotar que iCLMs (Figura 3). Teniendo en cuenta estos parámetros, un experimento promedio dará lugar a 20 --alfa actinina células 30% + 1%, pero sólo están a-Actinin + / + Sarcómero. De las células del sarcómero + 1%, ~ 30% será NPPA +, + MYL2, o HCN4-GFP +.
Dado que los cardiomiocitos son estructuralmente compleja, la expresión génica basada en la población (por ejemplo, QRT-PCR) o citometría de flujo análisis no pueden capturar la ch morfológica complejaanges que se producen durante ICLM reprogramación. Por el contrario, el patch clamp y la imagen del calcio son ensayos funcionales unicelulares muy rigurosas, pero se requieren habilidades y equipos especializados para llevar a cabo estos experimentos. Por lo tanto, la metodología descrita es única, ya que proporciona un enfoque sencillo para estudiar parámetros estructurales y funcionales clave de ICLM reprogramación sin comprometer significativamente el rendimiento.
A pesar de los muchos avances recientes en la reprogramación directa, queda mucho trabajo por hacer para comprender mejor los mecanismos moleculares que regulan la reprogramación cardiaca, y más específicamente, la especificación de subtipo. Estos mecanismos serán de especial importancia para traducir reprogramación directa para aplicaciones clínicas. Como tal, en este estudio describimos una plataforma capaz de modular directamente parámetros discretos para evaluar la contribución al desarrollo del sarcómero, la especificación de subtipo y la madurez ICLM. moreoembargo, este sistema puede desarrollarse aún más para trabajar en un formato de alto rendimiento que permite la detección complejo de moléculas pequeñas o matrices extracelulares para el siguiente paso en la cardiología regenerativa.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma | D5796 | Component of iCLM media, Plat-E media, fibroblast, and Transfection media |
| Medium 199 | Thermo Fisher Scientific | 11150059 | Component of iCLM media |
| Fetal bovine serrum (FBS) | Sigma | F2442 | Component of iCLM media, Plat-E media, fibroblast, and Transfection media |
| Insulin-Transferrin-Selenium G | Thermo Fisher Scientific | 41400-045 | Component of iCLM media |
| MEM vitamin solution | Thermo Fisher Scientific | 11120-052 | Component of iCLM media |
| MEM amino acids | Thermo Fisher Scientific | 1601149 | Component of iCLM media |
| Non-Essential amino acids | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | Component of iCLM media |
| Antibiotic-Antimycotics | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Component of iCLM media |
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | Component of iCLM media |
| Heat-Inactivated Horse Serum | Thermo Fisher Scientific | 26050-088 | Component of iCLM media |
| NaPyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360-70 | Component of iCLM media |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 1514022 | Component of Plat-E media and fibroblast media |
| Puromycin | Thermo Fisher Scientific | A11139-03 | Component of Plat-E media |
| Blasticidin | Gemini Bio-Products | 400-128P | Component of Plat-E media |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | Component of Fibroblast media |
| Confocal laser scanning LSM700 | Zeiss | For confocal analysis | |
| FuGENE 6 transfection Reagent | Promega | E2692 | Transfection reagent |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985-070 | Transfection reagent |
| Polybrene | Millipore | TR-1003-G | Induction reagent. Use at a final concentration of 8 μM/mL |
| Platinium-E (PE) Retroviral Packagin Cell Line, Ecotropic | CellBiolabs | RV-101 | Retroviral pacaking cell line |
| Trypsin 0.25% EDTA | Thermo Fisher Scientific | For MEFs and Plat-E dissociation | |
| Mouse anti α-Actinin (Clone EA-53) | Sigma | A7811 | Antibody for confocal analysis. Use at 1:200 |
| Chicken anti-GFP IgY | Thermo Fisher Scientific | A10262 | Antibody for confocal analysis. Use at 1:200 |
| Rabbit Pab anti-NPPA | Abgent | AP8534A | Antibody for confocal analysis. Use at 1:400 |
| Rabbit Pab anti Myl2 IgG | ProteinTech | 10906-1-AP | Antibody for confocal analysis. Use at 1:200 |
| Vectashield solution with DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Vector Labs | H-1500 | Dye for confocal analysis |
| Superfrost Plus Microscope slides | Thermo Fisher Scientific | 12-550-15 | 25 x 75 x 1.0 mm |
| BioCoat Fibronectin 12 mm coverslips | NeuVitro Corp | GG-12-1.5 | Coverslips for confocal analysis |
| 100 μm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| 0.45 μm Syringes filters SFCA 25MM | Thermo Fisher Scientific | 09-740-106 | For virus filtration |
| 6 mL Syringes | Covidien | 8881516937 | For virus filtration |
| Goat anti-Chicken IgY (H&L) A488 | Abcam | AB150169 | Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400 |
| Donkey anti-rabbit A647 IgG(H+L) | Thermo Fisher Scientific | A31573 | Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400 |
| Goat anti-mouse IgG(H+L) A555 | Thermo Fisher Scientific | A21422 | Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400 |
| Triton X-100 | Sigma | 93443-100ml | For cell permeabilization |
| Dulbecco's PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS) | Sigma | D8537 | |
| Power Block 10x Universal Blocking reagent | Thermo Fisher Scientific | NC9495720 | Dilute to 1x in H2O |
| 16% Paraformaldehyde aqueous solution (PFA) | Electro Microscopy Sciences | 15710 | Use at 4% diluted in dH2O |
| 6 cm plates | Olympus | 25-260 | |
| 6-well plates | Genesee Scientific | 25-105 | |
| 24-well plates | Genesee Scientific | 25-107 | |
| 10 cm Tissue culture dishes | Corning | 4239 | |
| 15 cm Tissue culture dishes | Thermo Fisher Scientific | 5442 | |
| 15 mL Conical tubes | Corning | 4308 | |
| 50 mL Conical tubes | Corning | 4249 | |
| 0.4% Trypan blue solution | Sigma | T8154 | For viability |
| Ethyl Alcohol 200 proof | Thermo Fisher Scientific | 7005 | |
| Bleach | Thermo Fisher Scientific | 6009 |
References
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