PCR di fusione ad alta risoluzione per il recettore del complemento 1 lunghezza di polimorfismo Genotipizzazione: uno strumento innovativo per la malattia di Alzheimer Valutazione sulla suscettibilità dei geni

L'obiettivo generale di questo metodo è quello di genotipizzare i polimorfismi di lunghezza del recettore 1 del complemento da utilizzare nella valutazione della suscettibilità a malattie, come il morbo di Alzheimer, per comprendere meglio il ruolo delle isoforme di CR1 nella patogenesi della malattia. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle neuroscienze, come la patogenesi del morbo di Alzheimer. I principali vantaggi di questa tecnica è che non richiede campioni di sangue fresco ed è più facile, più economica, più veloce e quindi applicabile a popolazioni più grandi.

Abbiamo avuto l'idea di questo metodo per la prima volta quando abbiamo riconosciuto le sfide nell'esecuzione dei Western blot per quanto riguarda il tempo necessario e la necessità di campioni di sangue fresco. Pipettare 20 microlitri di proteinasi K sul fondo di una provetta da 1,5 millilitri. Quindi, aggiungere 200 microlitri di campione alla provetta.

Aggiungere 200 microlitri di tampone di lisi al campione. Mescolare a impulsi per 15 secondi. Dopo la miscelazione, incubare a 56 gradi Celsius per 10 minuti a bagnomaria.

Centrifugare brevemente la provetta da 1,5 millilitri per rimuovere le gocce dall'interno del coperchio. Quindi, aggiungere 100 microlitri di etanolo al campione. Mescolare nuovamente a impulsi per 15 secondi prima di centrifugare brevemente la provetta come prima.

Successivamente, applicare con cura la miscela sulla colonna della membrana in una provetta di raccolta da due millilitri. Senza bagnare il bordo, chiudere il tappo e centrifugare a 6.000 volte G per un minuto. Posizionare la colonna a membrana in una provetta di raccolta pulita da due millilitri e gettare la provetta contenente il filtrato.

Aprire con cautela la colonna della membrana e aggiungere 500 microlitri di tampone di lavaggio senza bagnare il bordo. Chiudere il tappo e centrifugare a 6,000 volte G per un minuto. Quindi, posizionare la colonna a membrana in una provetta di raccolta pulita da due millilitri e gettare la provetta contenente il filtrato.

Dopo aver aperto con cura la colonna a membrana, aggiungere 500 microlitri di tampone di lavaggio due senza bagnare il bordo. Chiudere il tappo e centrifugare a 20.000 volte G per tre minuti. Quindi, posizionare la colonna a membrana in una nuova provetta di raccolta da due millilitri e centrifugare nuovamente.

Dopo la centrifugazione, posizionare la colonna a membrana in una provetta pulita da 1,5 millilitri e gettare la provetta di raccolta contenente il filtrato. Aprire con cautela la colonna della membrana e aggiungere 200 microlitri di acqua distillata. Incubare la colonna a temperatura ambiente per cinque minuti prima di centrifugare a 6.000 volte G per un minuto.

Per eseguire il protocollo HRM-PCR, diluire prima i campioni di DNA in provette da 1,5 millilitri con acqua a una concentrazione di 10 nanogrammi per microlitro. Successivamente, diluire le soluzioni di primer scongelate in provette da 1,5 millilitri con acqua alla stessa concentrazione di sei micromolari. Scongelare le soluzioni del kit HRM-PCR e miscelare accuratamente a vortice per garantire il recupero di tutto il contenuto.

Centrifugare brevemente le tre fiale contenenti la miscela enzimatica con il colorante legante il DNA, il cloruro di magnesio e l'acqua in una microcentrifuga prima di aprirle. In una provetta da 1,5 millilitri a temperatura ambiente, utilizzare i componenti per preparare la miscela PCR per la reazione da 120 microlitri come descritto nel protocollo di testo. Mescolare accuratamente a vortice.

È fondamentale lavorare con attenzione e applicazione secondo le buone pratiche in biologia molecolare. Pipettare 19 microlitri della miscela PCR in ciascun pozzetto di una piastra multipozzetto bianca. Aggiungere un microlitro del modello di DNA aggiustato per la concentrazione, quindi sigillare la piastra multipozzetto bianca con un foglio sigillante.

Centrifugare la piastra bianca a più pozzetti per un minuto a 1,500 volte G in una centrifuga standard a secchio oscillante contenente un rotore per piastre a più pozzetti con adattatori adatti. Caricare la piastra multipozzetto bianca nello strumento HRM-PCR. Avviare il programma HRM-PCR con le condizioni PCR presenti nel protocollo di testo.

Dopo la reazione HRM-PCR, eseguire l'analisi HRM per determinare il polimorfismo di lunghezza CR1 come descritto nel protocollo di testo. Le curve di fusione sono state analizzate utilizzando il software dopo la fusione ad alta risoluzione degli ampliconi derivati dalla PCR dal DNA genomico di soggetti con diverse isoforme di CR1. I risultati sono curve che discriminano i soggetti in base ai loro fenotipi allotipici di espressione di CR1.

Come mostrato dalle due modalità di presentazione, dalle curve di fusione normalizzate e spostate e dal grafico delle differenze normalizzate e variate in temperatura, i profili delle curve sono distribuiti secondo la stella CR1 tre, la stella CR1 un gruppo, la stella CR1 uno, la stella CR1 due gruppi, la stella CR1 un gruppo, la stella CR1 due gruppi e la stella CR1 due, CR1 stella quattro gruppo. Queste curve corrispondono agli alleli del polimorfismo di lunghezza CR1. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come genotipizzare facilmente il polimorfismo di lunghezza CR1 secondo curve perfette ottenute mediante HRM-PCR.

In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà a causa della necessità di campioni di riferimento di genotipi di lunghezza CR1 già noti. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in quattro ore se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di utilizzare la stessa concentrazione per ogni campione di DNA.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come il sequenziamento conico del DNA per rispondere a ulteriori domande come la scoperta di un nuovo SNP privato noto. Dopo questo sviluppo, questa tecnica apre la strada alla ricerca nel campo della genetica delle popolazioni per esplorare la pressione selettiva dei patogeni nel polimorfismo di lunghezza CR1. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla suscettibilità nella patogenesi della malattia di Alzheimer, può anche essere applicato ad altri studi su malattie come il lupus eritematoso sistemico e la malaria.