PCR di fusione ad alta risoluzione per il recettore del complemento 1 lunghezza di polimorfismo Genotipizzazione: uno strumento innovativo per la malattia di Alzheimer Valutazione sulla suscettibilità dei geni
18 luglio 2017
Qui descriviamo un metodo innovativo per determinare i polimorfismi di lunghezza del recettore del recettore 1 (CR1) per l'uso in diverse applicazioni, in particolare la valutazione della suscettibilità a malattie come la malattia di Alzheimer (AD). Questo metodo potrebbe essere utile per comprendere meglio il ruolo delle isoforme CR1 nella patogenesi dell'AD.
L'obiettivo generale di questo metodo è genotipizzare le polimorfie di lunghezza del recettore del complemento 1 per valutarne la suscettibilità a malattie come il morbo di Alzheimer, al fine di comprendere meglio il ruolo degli isoformi di CR1 nella patogenesi delle malattie. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo delle neuroscienze, come la patogenesi del morbo di Alzheimer. I principali vantaggi di questa tecnica sono che non richiede campioni di sangue fresco ed è più semplice, economica, rapida e quindi applicabile a popolazioni più ampie.
L'idea iniziale di questo metodo è nata riconoscendo le difficoltà associate all'esecuzione dei Western blot riguardo al tempo necessario e alla necessità di campioni di sangue freschi. Pipettare 20 microlitri di proteinasi K sul fondo di un tubo da 1,5 millilitri. Successivamente, aggiungere 200 microlitri di campione al tubo.
Aggiungere 200 microlitri di buffer di lisi al campione. Mescolare mediante vortexaggio pulsato per 15 secondi. Dopo la miscelazione, incubare a 56 gradi Celsius per 10 minuti in un bagno termico.
Centrifugare brevemente il tubo da 1,5 millilitri per rimuovere le gocce dall'interno del coperchio. Quindi, aggiungere 100 microlitri di etanolo al campione. Mescolare nuovamente mediante vortexaggio impulsivo per 15 secondi prima di centrifugare brevemente il tubo come in precedenza.
Successivamente, applicare con attenzione la miscela sulla colonna della membrana posta in una provetta di raccolta da due millilitri. Senza bagnare il bordo, chiudere il cappuccio e centrifugare a 6.000 ×g per un minuto. Posizionare la colonna della membrana in una provetta di raccolta da due millilitri pulita e scartare la provetta contenente il filtrato.
Aprire con attenzione la colonna a membrana e aggiungere 500 microlitri di tampone di lavaggio senza bagnare il bordo. Chiudere il cappuccio e centrifugare a 6.000 ×g per un minuto. Successivamente, posizionare la colonna a membrana in una nuova provetta di raccolta da 2 millilitri e scartare la provetta contenente il filtrato.
Dopo aver aperto con attenzione la colonna a membrana, aggiungere 500 microlitri del tampone di lavaggio due senza bagnare il bordo. Chiudere il cappuccio e centrifugare a 20.000 ×g per tre minuti. Successivamente, posizionare la colonna a membrana in una nuova provetta di raccolta da due millilitri e centrifugare nuovamente.
Dopo la centrifugazione, posizionare la colonna con membrana in una provetta pulita da 1,5 millilitro e scartare la provetta di raccolta contenente il filtrato. Aprire con attenzione la colonna con membrana e aggiungere 200 microlitri di acqua distillata. Incubare la colonna a temperatura ambiente per cinque minuti, quindi centrifugare a 6.000 ×g per un minuto.
Per eseguire il protocollo HRM-PCR, diluire prima i campioni di DNA in provette da 1,5 millilitri con acqua fino a una concentrazione di 10 nanogrammi per microlitro. Successivamente, diluire le soluzioni di primer scongelate in provette da 1,5 millilitri con acqua fino alla stessa concentrazione di sei micromolare. Scongelare le soluzioni del kit HRM-PCR e mescolare accuratamente mediante vortex per assicurare il recupero di tutti i componenti.
Centrifugare brevemente i tre vial contenenti la miscela enzimatica con colorante per il legame del DNA, cloruro di magnesio e acqua in una microcentrifuga prima di aprirli. In un tubo da 1,5 millilitri a temperatura ambiente, utilizzare i componenti per preparare la miscela PCR per una reazione da 120 microlitri come descritto nel protocollo testuale. Mescolare accuratamente mediante vortex.
È fondamentale lavorare con attenzione e precisione seguendo le buone pratiche della biologia molecolare. Pipettare 19 microlitri della miscela PCR in ogni pozzetto di una piastra bianca a multi-pozzetti. Aggiungere un microlitro del campione di DNA la cui concentrazione è stata aggiustata, quindi sigillare la piastra bianca a multi-pozzetti con pellicola adesiva.
Centrifugare la piastra bianca a pozzetti multipli per un minuto a 1.500 ×g in una centrifuga standard a testa oscillante dotata di un rotore per piastre a pozzetti multipli con adattatori adeguati. Caricare la piastra bianca a pozzetti multipli nell'apparecchio HRM-PCR. Avviare il programma HRM-PCR con le condizioni di PCR indicate nel protocollo testuale.
Dopo la reazione HRM-PCR, eseguire l'analisi HRM per determinare il polimorfismo di lunghezza di CR1 come descritto nel protocollo testuale. Le curve di fusione sono state analizzate mediante software dopo il melting ad alta risoluzione degli ampliconi ottenuti dalla PCR sul DNA genomico di soggetti con diversi isoformi di CR1. I risultati sono curve che discriminano i soggetti in base ai loro fenotipi di espressione allotipica di CR1.
Come mostrato dalle due modalità di presentazione, curve di fusione normalizzate e spostate e grafico differenziale normalizzato e spostato in temperatura, i profili delle curve sono distribuiti in base al gruppo CR1 star tre, CR1 star uno, al gruppo CR1 star uno, CR1 star due, al gruppo CR1 star uno, al gruppo CR1 star due e al gruppo CR1 star due, CR1 star quattro. Queste curve corrispondono agli alleli del polimorfismo di lunghezza di CR1. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come genotipizzare facilmente il polimorfismo di lunghezza di CR1 in base alle curve perfette ottenute mediante HRM-PCR.
Generalmente, le persone nuove rispetto a questo metodo incontreranno difficoltà a causa della necessità di campioni di riferimento con genotipi di lunghezza del CR1 già noti. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in quattro ore se effettuata correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di utilizzare la stessa concentrazione per ogni campione di DNA.
Al termine di questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi come il sequenziamento del DNA conico al fine di rispondere a ulteriori domande, ad esempio l'individuazione di un nuovo SNP privato noto. Dopo questo sviluppo, questa tecnica apre la strada a ricerche nel campo della genetica delle popolazioni per esplorare la pressione selettiva dei patogeni sulla polimorfia della lunghezza di CR1. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla suscettibilità alla patogenesi della malattia di Alzheimer, può essere applicato anche ad altri studi su malattie come il lupus eritematoso sistemico e la malaria.
Panoramica
Questo articolo presenta un nuovo metodo per il genotipaggio delle polimorfie di lunghezza del recettore del complemento 1 (CR1), che può contribuire alla valutazione della suscettibilità a malattie come la malattia di Alzheimer (AD). La tecnica presenta il vantaggio di non richiedere campioni di sangue fresco ed è più efficiente per popolazioni di grandi dimensioni.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Genetica
- Patologia
Sfondo
- Si ritiene che gli isoformi di CR1 siano coinvolti nella patogenesi della malattia di Alzheimer.
- Comprendere i polimorfismi di lunghezza di CR1 può fornire informazioni sul rischio di malattia.
- I metodi tradizionali come i blotting Western presentano limitazioni, tra cui la necessità di campioni freschi.
- Questo metodo mira a superare tali ostacoli.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo per il genotipaggio delle polimorfie di lunghezza di CR1.
- Valutare la relazione tra gli isoformi di CR1 e la suscettibilità alla malattia di Alzheimer.
- Facilitare la ricerca in genetica di popolazione riguardo alle polimorfie di CR1.
Metodi Utilizzati
- Preparazione del campione mediante proteinasi K e buffer di lisi.
- PCR con fusione ad alta risoluzione (HRM-PCR) per il genotipaggio.
- Analisi delle curve di fusione per discriminare i fenotipi di espressione di CR1.
- Applicazione del metodo a vari studi su malattie oltre l'Alzheimer.
Risultati principali
- Il metodo consente un genotipaggio efficiente dei polimorfismi di lunghezza di CR1.
- I risultati mostrano profili distinti di curve di denaturazione corrispondenti a diversi alleli di CR1.
- Applicabilità dimostrata su popolazioni più ampie senza l'uso di campioni freschi.
- Potenzialità per ulteriori ricerche su altre malattie come il lupus eritematoso sistemico e la malaria.
Conclusioni
- Questo metodo innovativo migliora la comprensione del ruolo di CR1 nella malattia.
- Fornisce un approccio pratico per studi genetici su larga scala.
- Applicazioni future potrebbero estendersi a diverse malattie influenzate da polimorfismi di CR1.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La genotipizzazione dei polimorfismi di lunghezza del recettore del complemento 1 (CR1) consente una riduzione del rischio meccanicistica nella validazione di bersagli per la malattia di Alzheimer, collegando l'espressione degli isoformi ai percorsi di eliminazione dell'amiloide-beta. Questo metodo PCR ad alta risoluzione di fusione fornisce un'elevata affidabilità predittiva per l'analisi delle ipotesi terapeutiche, senza richiedere campioni freschi, supportando screening su larga scala negli studi di genetica delle popolazioni. L'approccio migliora la continuità traslazionale dalla scoperta alla valutazione preclinica della suscettibilità alla malattia mediata da CR1.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo di Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Verifica ipotesi terapeutiche correlando il polimorfismo di lunghezza di CR1 con la capacità di fagocitosi dell'amiloide-beta.
- Valore operativo: Consente la riduzione del rischio biologico per bersagli mediati dal complemento mediante l'utilizzo di DNA archiviato, riducendo la dipendenza da campioni biologici freschi.
- Valore predittivo: Supporta la selezione del portafoglio progettuale quantificando la distribuzione degli isoformi associata a una regolazione alterata del complemento nei percorsi neurodegenerativi.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Produce rapporti quantitativi delle curve HRM che discriminano gli allotipi CR1 per un genotipaggio affidabile in grandi coorti.
- Valore operativo: Standardizza il rilevamento degli ampliconi attraverso il confronto tra frammenti invarianti e varianti, garantendo riproducibilità tra laboratori.
- Scalabilità: Applicabile a studi su scala di popolazione grazie al basso costo, ai minimi requisiti di input e alla compatibilità con piattaforme PCR ad alto rendimento.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore traslazionale: Collega il genotipaggio degli isoformi di CR1 ai meccanismi fisiopatologici nella malattia di Alzheimer e in altre condizioni immuno-mediate.
- Continuità preclinica: Permette decisioni di avanzamento corrette per il rischio, stratificando i modelli in base ai profili di polimorfismo della lunghezza di CR1.
- Riduzione del rischio meccanicistico: Chiarisce il potenziale di interazione con il bersaglio identificando soggetti con una clearance alterata, mediata da CR1, di peptidi patogeni.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione del bersaglio all'identificazione del composto attivo, fornendo coorti geneticamente definite per lo screening meccanicistico e l'allineamento dei biomarcatori.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sul ruolo del CR1 nella rimozione dei complessi immunitari e nei percorsi di neuroinfiammazione.
- Screening: Fornisce output quantitativi e riproducibili per la valutazione dell'effetto di composti in campioni stratificati per CR1.
- Analisi: Genera misurazioni di rapporto derivate dalla HRM che consentono il confronto statistico delle associazioni genotipo-fenotipo.
- Ricerca traslazionale: Collega la stratificazione genetica alla validazione preclinica di terapie mirate al sistema del complemento solo quando supportato dai dati disponibili.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma di genotipizzazione riutilizzabile, applicabile a diverse aree di malattie oltre l'Alzheimer, inclusi disturbi infettivi e autoimmuni.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva nella validazione del bersaglio grazie al collegamento meccanicistico tra isoforme di CR1 e patogenesi della malattia.
- Valore operativo: Standardizzazione, riproducibilità e scalabilità rese possibili dalla PCR-HRM in provetta chiusa e da un minimo trattamento del campione.
- Valore strategico: Miglioramento delle decisioni di avanzamento o interruzione dello sviluppo grazie alla riduzione dell'incertezza biologica riguardo al legame al bersaglio e alla modulazione del percorso.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione corretta in base al rischio dei candidati modulatori del complemento sulla base di profili di suscettibilità geneticamente definiti.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'ottimizzazione della PCR e nell'analisi ad alta risoluzione delle curve di denaturazione.
- Dependenza dall'accesso a strumentazione compatibile con l'HRM e a genotipi di riferimento validati per un'accurata assegnazione degli alleli.
- Necessità di standardizzare tra gruppi di lavoro le procedure di quantificazione del DNA e di diluizione dei primer per garantire coerenza tra laboratori.
- Aspetti da considerare nell'adattamento includono la validazione su diversi tipi di campioni (ad esempio, sangue, saliva) mantenendo rapporti costanti degli ampliconi.
- Limitazione pratica: l'accuratezza del metodo dipende dalla disponibilità di campioni di riferimento con genotipi noti per la lunghezza del CR1, necessari per l'interpretazione delle curve.
