Summary
Native polyacrylamidgelelektroforese er et grundlæggende redskab til analyse af RNA-proteininteraktioner. Traditionelt har de fleste eksperimenter brugt vertikale geler. Imidlertid tilvejebringer vandrette geler flere fordele, såsom muligheden for at overvåge komplekser under elektroforese. Vi leverer en detaljeret protokol til generering og anvendelse af horisontal indfødte gelelektroforese.
Abstract
Native polyacrylamidgelelektroforese er et grundlæggende værktøj for molekylærbiologi, der er blevet anvendt i vid udstrækning til den biokemiske analyse af RNA-proteininteraktioner. Disse interaktioner er traditionelt analyseret med polyacrylamidgeler frembragt mellem to glasplader og prøver elektroforeseret vertikalt. Polyacrylamidgeler støbes i bakker og elektroforeses horisontalt, men giver flere fordele. For eksempel kan vandrette geler, som anvendes til analyse af komplekser mellem fluorescerende RNA-substrater og specifikke proteiner, afbildes flere gange, idet elektroforese udvikler sig. Dette giver den unikke mulighed for at overvåge RNA-proteinkomplekser på flere punkter under eksperimentet. Derudover gør horisontal gelelektroforese det muligt at analysere mange prøver parallelt. Dette kan i høj grad lette tidskursforsøg samt analysere flere reaktioner samtidigt for at sammenligne forskellige komponenter og betingelser. Her prOvide en detaljeret protokol til generering og anvendelse af horisontal indfødt gelelektroforese til analyse af RNA-Protein-interaktioner.
Introduction
Elektroforetiske mobilitetsforskydningsassays (EMSA'er) har vist sig at være et uvurderligt biokemisk værktøj til analyse af specifikke protein-nucleinsyre-interaktioner 1 , 2 , 3 . Disse analyser kan tilvejebringe vigtig information vedrørende proteinbindings bindingsaffinitet til RNA eller DNA 3 , komponentstøkiometrien for nukleinsyre-protein-komplekser 1 og tilvejebringe vigtige nye indsigter om bindingsspecificiteten af RNA-bindingsproteiner via substratkonkurrenceforsøg 1 .
Den traditionelle eksperimentelle opsætning for disse analyser består i at blande renset protein med et radioaktivt mærket RNA-substrat. De resulterende komplekser analyseres derefter med ikke-denaturerende (native) polyacrylamidgeler hældt mellem to glasplader efterfulgt af prøveelektroforese i et lodret apparat 3. Selvom denne tilgang er blevet udtømmende anvendt til at tilvejebringe vigtige indsigter i de biokemiske mekanismer, der ligger til grund for bindingen af proteiner til nukleinsyrer, har den også flere begrænsninger. For eksempel har denne grundlæggende strategi relativt lav gennemstrømning, og det er ikke let at tilpasse til applikationer, der kræver analyse af mange bindende reaktioner parallelt. Derudover er det med det traditionelle vertikale apparat udfordrende at potentielt overvåge komplekser ved flere gange under elektroforese 3 , 4 .
Her præsenterer vi en tilpasning af EMSA-analysen, der anvender native polyacrylamidgeler, der støbes i et flatbed apparat, vandret elektroforese og fluorescensmærkede RNA-substrater 4 , 5 , 6 , 7 . Indarbejdelsen af disse relativt enkle modifikationer af den basale straTegy giver nogle stærke fordele. Især gør det vandrette flatbed format let at analysere snesevis af prøver samtidigt 4 . For nogle RNA-proteinkomplekser, såsom dem der dannes mellem Bicaudal-C-proteinet og dets RNA-substratelektroforese i en vandret gel, tilvejebringer også en øget evne til at løse forskellige RNA-proteinkomplekser og diskriminere disse fra ubundet RNA-substrat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af den horisontale indfødte polyacrylamidgel 4 .
- Forberedelse af de nødvendige materialer.
- Til det vandrette gelapparat skal du bruge en gelkasse (37 cm x 24 cm) med en 27 cm x 21 cm bakke og en kapacitet til to 24 brønde kamme. Denne opsætning giver i alt 48 prøver, der kan analyseres samtidigt.
- Forbered følgende reagenser: 40% Acrylamide-Bis 19: 1, 5x TBE (Tris-Borat-EDTA pH 8,0), TEMED og 10% APS (ammoniumpersulfat).
- Frembringelse af en 10% naturlig acrylamidgel.
- I en 500 ml kolbe tilsættes 80 ml 5x TBE, 100 ml 40% acrylamid og vand til et slutvolumen på 400 ml.
- Tilsæt 4 ml 10% APS og 400 μl TEMED. Bland godt.
- Hæld blandingen i den vandrette støbebakke og lad gelen polymerisere i 30 min. Gelen vil være ca. 2 cm tyk.
BEMÆRK: Geler kan kaste i en røghætte for at øge hastighedenUp polymerisation. Efter polymerisering forbliver et tyndt lag væske oven på gelen. - Hæld væsken af og skyll med løbende buffer. Fjern kammen / kamrene forsigtigt, og skyll brøndene med løbende puffer ved hjælp af en sprøjte.
- Fremstilling af løbende buffer.
- Forbered 2 l 1x TBE kørerbuffer til gelboksen. Fortynd 400 ml 5XTBE med 1600 ml og bland. Placer 1x TBE-buffer i koldt rum for at afkøle.
- Forløb gelen
- Tilsæt 2 liter kold løbebuffer til gelboksen og indsæt gelen.
- Forbered gelen ved 120 V i 1 time ved 4 ° C i et koldt rum. I løbet af denne tid forbereder du bindingsreaktionen.
2. Bindende reaktion 8
- 2.1. Forbered de følgende reaktionskomponenter.
20 mM DTT
10 mM BSA
10 mM gær-tRNA'er
5X bindingsbuffer (50 mM HEPES pH 8,0, 5 mM EDTA, 250 mM KCI, 0,2% Tween-20)
100 nM fluoresceinmærket RNA købt kommercielt
Koncentreret Bicaudal-C protein
50% glycerol i DEPC-behandlet H2O
DEPC-behandlet H2O - Sammensæt de bindende reaktionskomponenter i et RNase-frit mikrocentrifugerør.
- Til røret tilsættes 5 μl 10 mM BSA, 5 μl 20 mM DTT, 5 μl 10 mM gær-tRNA'er, 10 μl 5x bindingsbuffer.
- Tilsæt protein til en slutkoncentration på 250 nM i 50 μl. Tilsæt vand til et slutvolumen på 45 μl.
- Tilsæt 5 μL fluorescensmærket RNA-substrat. Brug et kommercielt købt 3'-fluoresceinmærket 32-nukleotidsubstrat.
- Bland og inkuber i mørke i 30 minutter ved stuetemperatur.
3. Analyse af prøver på den indfødte vandrette polyacrylamidgel
- Til hver reaktion tilsættes 15 μl 50% glycerol og blandes forsigtigt.
- CarefuTilsæt 30 μl af hver reaktion til gelen. Mængden af prøve, som kan lægges i en enkelt brønd, varierer afhængigt af gelens tykkelse og brøndens størrelse. Vi har lastede mængder så lidt som 15 μL og så meget som 45 μL i en enkelt brønd af geler oprettet med en 24 brøndskam og hældes til en tykkelse på 2 cm.
- Efter tilslutning af strømforsyningen til gelapparatkontakten tændes strømmen og juster spændingen. Kør gelen i 4 ° C ved 120 V.
BEMÆRK: For det vandrette gelapparat slutter dette at være ca. 5 V / cm. For det vertikale gelapparat er dette 16 V / cm.- For at forhindre skade eller blegning af det fluorescensmærkede RNA, udfør elektroforese i mørke.
- Varierende elektroforese gange afhængig af specifikationerne af RNA-proteinkomplekset, der analyseres.
BEMÆRK: En stor fordel ved den horisontale EMSA-analyse er, at elektroforese kan stoppes, gelen afbildet og derefter den geJeg kan placeres tilbage i apparatet, og elektroforese kan fortsættes i længere tid.
4. Imaging gel
- Udfør analyse med ethvert instrument designet til detektering og billeddannelse af fluorescerende substrater.
- Placer gelen på billedet.
- Juster billedindstillinger. For fluorescein-mærkede RNA ligander skal du bruge følgende indstillinger: FAM (bølgelængde 473 nm), 750 fotomultiplikator spænding (PMT), 100 μm pixel størrelse.
- Scan gelen for at fange billede.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at demonstrere kraften og alsidigheden af den horisontale indfødte gelelektroforese analyserede vi bindingen af Xenopus Bicaudal-C (Bicc1) -proteinet til et fluorescensmærket RNA indeholdende et Bicc1-bindingssted. Bicc1-proteiner virker som mRNA-specifikke translationsundertrykkere for at kontrollere beslutninger om cellernes skæbne under moderfasen af dyreudvikling 9 , 10 , 11 , 12 samt funktionerne hos specifikke organer hos voksne 13 , 14 . Vores arbejde i Xenopus identificerede det første bindingssted for et Bicc1 protein 8 : en 32-nukleotid region fra 3'UTR af Cripto-1 mRNA 8 , 12 . Dette bindingssted blev defineret under anvendelse af en kombination af teknikker: RNase-beskyttelseIon- og fodtryksassays, in vivo bindingsforsøg og in vitro EMSA assays 8 .
Oprenset Xenopus Bicc1 protein blev blandet med et fluorescensmærket 32 nukleotid RNA; Bicc1-bindingsstedet fra Cripto-1 mRNA 8 . I en separat reaktion blev Bicc1-protein blandet med et fluorescensmærket 32 nukleotid-RNA afledt af 3'UTR'et af cyclin B1-mRNA'et. Bicc1 binder ikke til cyclin B1 mRNA 8 , 12, og dette RNA tjener som en negativ kontrol. Halvdelen af hver reaktion blev analyseret på en lodret indfødt polyacrylamidgel ( figur 1A ), medens den anden del blev analyseret parallelt under anvendelse af vandret nativ gel ( figur 1B ). Det er let tydeligt at anvende enten en metode, som Bicc1 binder til RNA Cripto-1 RNA og danner et specifikt kompleks aNd det binder ikke cyclin B1 negativ kontrol RNA. Bicc1-Cripto-1-komplekserne er imidlertid signifikant mere adskilte, når de analyseres med den vandrette gel, både letter deres påvisning og muliggør diskrimination af protein-RNA-komplekser fra ubundet RNA. Efter billeddannelse blev gelen anbragt tilbage i gelapparatet og elektroforeseret i yderligere tre og en halv time. Efter re-imaging af gelen havde komplekserne migreret yderligere og var stadig let detekterbare, hvilket indikerer deres stabilitet ( figur 1C ). Denne evne til at fortsætte elektroforese og analyse efter indledende billeddannelse ville være udfordrende, om ikke umuligt, med det vertikale gelformat.
Figur 1: En sammenligning af de vertikale og de vandrette native geler til analyse af bindingen af Bicc1 til Cripto1 RNA. BiCc1 bindingsforsøg blev udført med en 32-nukleotid fluorescerende CyclinB1 RNA negativ kontrol eller en fluorescerende 32-nucleotid Cripto1 RNA positiv kontrol. Hver reaktion indeholdt enten 0 nM eller 250 nM SUMO-Bicc1 N-terminale og analyseret på enten en ( A ) vertikal polyacrylamid-nativ gelkørsel i 30 minutter ved 120 V ved 4 ° C eller som duplikatprøver i den vandige polyacrylamid-native gel for ( B ) 2 timer ved 120 V ved 4 ° C eller ( C ) 5,5 timer ved 120 V ved 4 ° C. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Indfødte polyacrylamidgeler er et uvurderligt redskab til undersøgelse af protein-RNA-interaktioner, og traditionelt er disse geler elektroforeseret vertikalt 2 , 3 . Vi har anvendt en modifikation af protokollen, som erstatter native polyacrylamidgeler, der er oprettet og elektroforeseret vandret 1 , 4 , 6 , 7 , 15 . Disse ændringer, der anvendes i kombination med fluorescensmærkede RNA-substrater, tilvejebringer adskillige fordele ved den biokemiske analyse af protein-RNA-bindingsinteraktioner. Disse fordele indbefatter følgende: blanding af buffere simplificeres sammenlignet med et vertikalt apparat, som kræver en pumpe til overførsel af buffer fra det nedre kammer til det øvre, vandrette geler kan genereres med større brønde, der giver en øget kapacitet til analyse af larverGerprøver, elektroforese på vandrette geler giver ofte forbedret opløsning af RNA-proteinkomplekser sammenlignet med vertikale geler, og horisontal gelelektroforese tilvejebringer evnen til billedforsøg på flere tidspunkter under analyse.
En anden stor fordel er, at det vandrette format egner sig til at skabe geler med et stort antal brønde, der giver mulighed for at analysere flere prøver parallelt 1 . Denne funktion udvider deres brug betydeligt som et biokemisk værktøj til analyse af RNA-proteininteraktioner. Evnen til at analysere flere prøver letter for eksempel undersøgelsen af de kvantitative parametre for protein-RNA-kompleksdannelse ved anvendelse af konkurrenceeksperimenter 15 , k off- analyse 15 såvel som eksperimenter designet til at definere støkiometrien af de bindende komplekse komponenter 15 . Desuden er brugen af aFluorescerende RNA-substrater gør det muligt at udføre flere analyser, såsom fluorescenspolarisationsbindingsassays fra en enkelt reaktion og opnå både kvantitative og kvalitative bindingsdata 5 , 15 .
For at opnå optimale resultater fra den vandrette gelopsætning er der en række parametre, der kan justeres for at forbedre kompleksernes kvalitet til billedbehandling. Disse omfatter ændring af acrylamidprocentdelen af gelen for at gøre det lettere at håndtere og forbedre separationen af protein-RNA-komplekser fra fri RNA mere. Det kan dog være svært at håndtere lave procentvise acrylamidgeler på grund af størrelsen. Vi finder det nemmest at bruge geler, der har en acrylamidkoncentration på 7,5% eller derover. Om nødvendigt kan elektroforesebetingelserne ændres for at forbedre stabiliteten af protein-RNA-komplekser; Justering af elektroforese spænding, kører gelen ved stuetemperatur insteAd ved 4 ° C og justering af præ-run betingelser.
På trods af de mange fordele er der også nogle begrænsninger af horisontale indfødte gelelektroforese-analyser. For eksempel maksimeres dets anvendelighed ved anvendelse af fluorescerende RNA-substrater. Afhængigt af den valgte fluorofor og størrelsen af RNA kan opnåelse af sådanne substrater være dyrt. Derudover er vandrette geler generelt meget større end vertikale geler og kræver derfor større mængder materiale såsom polyacrylamid og DEPC-behandlede opløsninger.
Horisontal indfødt gelelektroforese har potentialet til at blive anvendt som et valideringsværktøj til molekylære skærme, der søger at identificere forbindelser, der målretter klinisk relevante RNA-proteininteraktioner 16 . Sådanne skærmbilleder bruger typisk biokemiske analyser til at identificere relevante forbindelser til yderligere undersøgelse. Det højere gennemgangspotentiale i det vandrette format sammenlignet med det lodrette formatDes mulighed for at anvende nativ gelelektroforese som et værktøj til sekundær validering af potentielle kandidater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Laura Vanderploeg for at forberede tal. Arbejde i Sheets lab understøttes af NSF grant 1050395 og NIH grant (R21HD076828). Arbejde i Ryder-labet understøttes af NIH-tilskud R01GM117237 og R01GM117008. Megan Dowdle støttes af et SciMed GRS Advanced Opportunity Fellowship gennem University of Wisconsin-Madison Graduate School og Bioteknologi Training Program gennem National Institute of General Medical Sciences af National Institutes of Health (T32GM008349).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Horizontal Gel Box | OWL | N/A | Product no longer made. Similar gel boxes can be found at Thermo Scientific, A-series gel boxes. Catalog Number: A2-BP |
| 24-well large large horizontal gel electrophoresis combs | OWL | N/A | Product no longer made. Similar gel boxes can be found at Thermo Scientific, A-series gel box combs. Catalog Number: A2-24C |
| Powerpac 300 | Bio-Rad | 1655050 | |
| Mini-Protean II Electrophoresis Cell | Bio-Rad | 165-2940 | |
| InstaPAGE-19 40% 19:1 Acrylamide/Bis | IBI | IB70015 | |
| TEMED | IBI | IB70120 | |
| APS | IBI | IB70080 | |
| Yeast tRNAs | Ambion | AM7119 | |
| Fluorescein labeled RNA | IDT | N/A | Order can be made custom to length and desired sequence |
| EDTA tetrasodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | E5391-1KG | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-500G | |
| Tris Base Ultrapure | US Biological | T8600 | |
| Boric Acid | Fisher Scientific | BP168-500 | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-1 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| DEPC | Sigma-Aldrich | 1609-47-8 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 3483 12 3 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 |
References
- Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift. Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).
- Dahlberg, A. E., Dingman, C. W., Peacock, A. C. Electrophoretic characterization of bacterial polyribosomes in agarose-acrylamide composite gels. J Mol Biol. 41 (1), 139-147 (1969).
- Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat Protoc. 2 (8), 1849-1861 (2007).
- Pagano, J. M., Farley, B. M., Essien, K. I., Ryder, S. P. RNA recognition by the embryonic cell fate determinant and germline totipotency factor MEX-3. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (48), 20252-20257 (2009).
- Royer, C. A., Scarlata, S. F. Fluorescence approaches to quantifying biomolecular interactions. Meth Enzymol. 450, 79-106 (2008).
- Su, C., Wang, F., Ciolek, D., Pan, Y. C. Electrophoresis of proteins and protein-protein complexes in native polyacrylamide gels using a horizontal gel apparatus. Anal Biochem. 223, 93-98 (1994).
- Buczek, P., Horvath, M. P. Thermodynamic Characterization of Binding Oxytricha nova Single Strand Telomere DNA with the Alpha Protein N-terminal Domain. J Mol Biol. 359 (5), 1217-1234 (2006).
- Zhang, Y., Park, S., Blaser, S., Sheets, M. D. Determinants of RNA binding and translational repression by the Bicaudal-C regulatory protein. J Biol Chem. 289 (11), 7497-7504 (2014).
- Gamberi, C., Lasko, P. The Bic-C family of developmental translational regulators. Comp Funct Genomics. , 141386 (2012).
- Saffman, E. E., et al. Premature translation of oskar in oocytes lacking the RNA-binding protein bicaudal-C. Mol Cell Biol. 18 (8), 4855-4862 (1998).
- Chicoine, J., et al. Bicaudal-C recruits CCR4-NOT deadenylase to target mRNAs and regulates oogenesis, cytoskeletal organization, and its own expression. Dev Cell. 13 (5), 691-704 (2007).
- Zhang, Y., et al. Bicaudal-C spatially controls translation of vertebrate maternal mRNAs. RNA. 19 (11), 1575-1582 (2013).
- Maisonneuve, C., et al. Bicaudal C, a novel regulator of Dvl signaling abutting RNA-processing bodies, controls cilia orientation and leftward flow. Development. 136 (17), 3019-3030 (2009).
- Tran, U., et al. The RNA-binding protein bicaudal C regulates polycystin 2 in the kidney by antagonizing miR-17 activity. Development. 137 (7), 1107-1116 (2010).
- Pagano, J. M., Clingman, C. C., Ryder, S. P. Quantitative approaches to monitor protein-nucleic acid interactions using fluorescent probes. RNA. 17 (1), 14-20 (2011).
- Foley, T. L., et al. Platform to Enable the Pharmacological Profiling of Small Molecules in Gel-Based Electrophoretic Mobility Shift Assays. J Biomol Screen. 21 (10), 1125-1131 (2016).
