Summary
Родной полиакриламидный гель-электрофорез является фундаментальным инструментом для анализа взаимодействия РНК-белок. Традиционно в большинстве экспериментов использовались вертикальные гели. Однако горизонтальные гели обладают рядом преимуществ, таких как возможность мониторинга комплексов во время электрофореза. Мы предоставляем подробный протокол для генерации и использования горизонтального гель-электрофореза.
Abstract
Родной полиакриламидный гель-электрофорез является фундаментальным инструментом молекулярной биологии, который широко используется для биохимического анализа взаимодействий РНК-белок. Эти взаимодействия традиционно анализировались полиакриламидными гелями, образованными между двумя стеклянными пластинами и образцами, электрофорезированными вертикально. Однако полиакриламидные гели, литые в лотках и электрофорезированные горизонтально, обладают несколькими преимуществами. Например, горизонтальные гели, используемые для анализа комплексов между флуоресцентными субстратами РНК и конкретными белками, могут быть отображены несколько раз по мере развития электрофореза. Это дает уникальную возможность контролировать РНК-белковые комплексы в нескольких точках во время эксперимента. Кроме того, горизонтальный гель-электрофорез позволяет параллельно анализировать многие образцы. Это может значительно облегчить эксперименты с временным курсом, а также одновременно проанализировать несколько реакций для сравнения различных компонентов и условий. Здесь мы имеемOvide подробный протокол для генерации и использования горизонтального нативного гель-электрофореза для анализа взаимодействия РНК-белок.
Introduction
Анализы сдвига электрофоретической подвижности (EMSAs) оказались бесценным биохимическим инструментом для анализа специфических взаимодействий белок-нуклеиновая кислота 1 , 2 , 3 . Эти анализы могут предоставить важную информацию о связывании сродства белков к РНК или ДНК 3 , стехиометрии компонентов нуклеиновых кислот-белковых комплексов 1 и дать важные новые сведения о специфичности связывания РНК-связывающих белков через субстратные конкурентные эксперименты 1 .
Традиционная экспериментальная установка для этих анализов состоит из смешивания очищенного белка с радиоактивно меченым РНК-субстратом. Полученные комплексы затем анализируют с помощью неденатурирующих (нативных) полиакриламидных гелей, вылитых между двумя стеклянными пластинами с последующим электрофорезом образца в вертикальном устройстве 3, Хотя этот подход был использован исчерпывающе, чтобы дать важные сведения о биохимических механизмах, которые лежат в основе связывания белков с нуклеиновыми кислотами, он также имеет несколько ограничений. Например, эта базовая стратегия имеет относительно низкую пропускную способность и не легко адаптируется для приложений, требующих параллельного анализа многих реакций связывания. Кроме того, с традиционным вертикальным аппаратом сложно потенциально контролировать комплексы в несколько раз во время электрофореза 3 , 4 .
Здесь мы представляем адаптацию анализа EMSA, в котором используются нативные полиакриламидные гели, литые в планшетном аппарате, горизонтальный электрофорез и флуоресцентно меченные РНК-субстраты 4 , 5 , 6 , 7 . Включение этих относительно простых модификаций в основную структуруTegy дает некоторые мощные преимущества. В частности, горизонтальная планшетный формат , который легко поддается анализу десятков образцов одновременно 4. Кроме того, для некоторых РНК-белковых комплексов, таких как те, которые образуются между белком Bicaudal-C и его электрофорезом в РНК-субстрате в горизонтальном геле, обеспечивается повышенная способность разрешать различные комплексы РНК-белок и отличить их от несвязанного РНК-субстрата.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка Горизонтального Нативного Полиакриламидного гел 4 .
- Подготовка необходимых материалов.
- Для горизонтального гелеобразного аппарата используйте гелевую коробку (37 см х 24 см) с поддоном 27 см х 21 см и емкость для двух 24-луночных гребней. Эта настройка обеспечивает в общей сложности 48 выборок, которые могут быть проанализированы одновременно.
- Приготовить следующие реагенты: 40% акриламид-бис 19: 1, 5x TBE (Tris-Borate-EDTA pH 8,0), TEMED и 10% APS (персульфат аммония).
- Получение 10% активного акриламидного геля.
- В колбу на 500 мл добавьте 80 мл 5-кратного ТВЭ, 100 мл 40% акриламида и воду до конечного объема 400 мл.
- Добавить 4 мл 10% APS и 400 мкл TEMED. Хорошо перемешать.
- Вылейте смесь в горизонтальный литейный лоток и дайте гелю полимеризоваться в течение 30 мин. Гель будет иметь толщину приблизительно 2 см.
ПРИМЕЧАНИЕ. Гели могут вставляться в вытяжной шкаф для ускоренияПолимеризации. После полимеризации тонкий слой жидкости останется на вершине геля. - Вылейте жидкость и промойте бегущим буфером. Удалите гребенку (ы) тщательно и ополосните лунки бегущим буфером с помощью шприца.
- Подготовка бегущего буфера.
- Подготовьте 2 л 1x TBE-буфера для гелевой коробки. Разбавляют 400 мл 5XTBE 1600 мл и перемешивают. Поместите буфер 1x TBE в холодную комнату для охлаждения.
- Предварительная работа геля
- Добавьте 2 г холодного буфера в гелевую коробку и вставьте гель.
- Предварительно запустить гель при 120 В в течение 1 ч при 4 ° С в холодной комнате. В это время подготовьте реакцию связывания.
2. Связывающая реакция 8
- 2.1.Подготовьте следующие компоненты реакции.
20 мМ DTT
10 мМ BSA
10 мМ дрожжевых тРНК
5X (50 мМ HEPES pH 8,0, 5 мМ ЭДТА, 250 мМ KCl, 0,2% Твин-20)
100 нМ флуоресцеиновой меченной РНК, приобретенной на коммерческой основе
Концентрированный белок Bicaudal-C
50% глицерина в обработанном DEPC H 2 O
Обработанный DEPC H 2 O - Соберите компоненты реакции связывания в бесконтактной микроцентрифужной пробирке, свободной от РНКазы.
- В пробирку добавьте 5 мкл 10 мМ BSA, 5 мкл 20 мМ DTT, 5 мкл 10 мМ дрожжей тРНК, 10 мкл 5x Binding Buffer.
- Добавить белок до конечной концентрации 250 нМ в 50 мкл. Добавьте воду до конечного объема 45 мкл.
- Добавьте 5 мкл флуоресцентно меченого РНК-субстрата. Используйте коммерчески приобретенный 3'-флуоресцеин, меченный 32-нуклеотидным субстратом.
- Смешать и инкубировать в темноте в течение 30 мин при комнатной температуре.
3. Анализ образцов на родном горизонтальном полиакриламидном геле
- Для каждой реакции добавьте 15 мкл 50% глицерина и осторожно перемешайте.
- сторожныДобавьте 30 мкл каждой реакции к гелю. Количество образца, которое может быть загружено в одну лунку, варьируется в зависимости от толщины геля и размера лунок. Мы загрузили объемы всего 15 мкл и до 45 мкл в одну лунку гелей, созданных с помощью 24-луночного гребня, и вылили до толщины 2 см.
- После подключения источника питания к гелевому устройству включите питание и настройте напряжение. Запустите гель при 4 ° C при 120 В.
ПРИМЕЧАНИЕ. Для горизонтального гелеобразного аппарата это составляет примерно 5 В / см. Для вертикального гелеобразного аппарата это 16 В / см.- Чтобы предотвратить повреждение или отбеливание флуоресцентно меченной РНК, проводите электрофорез в темноте.
- Время размораживания электрофореза в зависимости от специфики анализируемого комплекса РНК-белок.
ПРИМЕЧАНИЕ. Основным преимуществом горизонтального анализа EMSA является то, что электрофорез может быть остановлен, геля визуализированы, а затем geЛ можно поместить обратно в аппарат, и электрофорез можно продолжать в течение более длительного времени.
4. Изображение геля
- Проведите анализ с помощью любого инструмента, предназначенного для обнаружения и визуализации флуоресцентных субстратов.
- Поместите гель на тепловизор.
- Отрегулируйте настройки изображения. Для флуоресцеин-меченных РНК-лигандов используйте следующие настройки: FAM (длина волны 473 нм), 750 фотоумножителей (PMT), размер пикселя 100 мкм.
- Сканирование геля для захвата изображения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Чтобы продемонстрировать мощность и универсальность горизонтального гель-электрофореза, мы проанализировали связывание белка Xenopus Bicaudal-C (Bicc1) с флуоресцентно меченной РНК, содержащей сайт связывания Bicc1. Белки Bicc1 функционируют в качестве мРНК-специфических трансляционных репрессоров для управления решениями о судьбе клеток во время материнской стадии развития животных 9 , 10 , 11 , 12, а также функции конкретных органов у взрослых 13 , 14 . Наша работа в Xenopus идентифицировала первый сайт связывания белка Bicc1 8 : 32-нуклеотидную область из 3'UTR мРНК Крипто-1 8 , 12 . Этот сайт связывания был определен с использованием комбинации методов: защита RNaseИонные и следовые анализы, эксперименты по связыванию in vivo и анализы EMSA in vitro 8 .
Очищенный белок Xenopus Bicc1 смешивали с флуоресцентно меченной 32 нуклеотидной РНК; Сайт связывания Bicc1 из мРНК 8 Крипто-1. В отдельной реакции белок Bicc1 смешивали с флуоресцентно меченной 32 нуклеотидной РНК, полученной из 3'UTR мРНК cyclin B1. Bicc1 не связывается с мРНК 8 , 12 циклина B1 , и эта РНК служит отрицательным контролем. Половину каждой реакции анализировали на вертикальном нативном полиакриламидном геле ( фиг. 1А ), а другая часть анализировали параллельно с использованием горизонтального нативного геля ( фиг. 1В ). Это легко понять с помощью любого метода, который Bicc1 связывается с РНК-крипто-1-РНК и образует специфический комплекс aИ он не связывает отрицательную контрольную РНК циклина B1. Однако комплексы Bicc1-Cripto-1 значительно отличаются друг от друга при анализе с помощью горизонтального геля, способствуя их обнаружению и позволяя различать комплексы белок-РНК от несвязанной РНК. После визуализации гель помещали обратно в аппарат для геля и подвергали электрофорезу в течение дополнительных трех с половиной часов. После повторной визуализации геля комплексы еще мигрировали и все еще были легко обнаружимы, что свидетельствует об их стабильности ( рис. 1C ). Эта способность продолжать электрофорез и анализ после первоначальной визуализации была бы сложной, если не невозможной, с вертикальным гелевым форматом.
Рисунок 1: Сравнение вертикальных и горизонтальных природных гелей для анализа связывания Bicc1 с Cripto1 РНК. BiЭксперименты по связыванию cc1 проводили с 32-нуклеотидным флуоресцентным регулятором CyclinB1-РНК или флуоресцентным 32-нуклеотидным контрольным РНК-рецептором Cripto1. Каждая реакция содержала либо 0 нМ, либо 250 нМ N-конца SUMO-Bicc1 и анализировалась либо на ( А ) вертикальном полиакриламидном нативном геле в течение 30 мин при 120 В при 4 ° С, либо в виде дублированных образцов в горизонтальном геле на основе полиакриламида для ( B ) 2 ч при 120 В при 4 ° С или ( С ) 5,5 ч при 120 В при 4 ° С. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Родные полиакриламидные гели являются бесценным инструментом для исследования взаимодействия белок-РНК, и традиционно эти гели подвергают электрофорезу по вертикали 2 , 3 . Мы использовали модификацию протокола, который заменяет нативные полиакриламидные гели, созданные и электрофорезированные по горизонтали 1 , 4 , 6 , 7 , 15 . Эти изменения, используемые в сочетании с флуоресцентно мечеными субстратами РНК, дают многочисленные преимущества для биохимического анализа взаимодействий, связывающих белок-РНК. Эти преимущества включают в себя следующее: смешивание буферов упрощается по сравнению с вертикальным устройством, которое требует, чтобы насос передавал буфер из нижней камеры в верхние горизонтальные гели, могут генерироваться с более крупными лунками, которые обеспечивают повышенную способность к анализу larGer образцы, электрофорез на горизонтальных гелях часто обеспечивают улучшенное разрешение комплексов РНК-белок по сравнению с вертикальными гелями, а горизонтальный гель-электрофорез обеспечивает возможность экспериментов с изображениями в нескольких временных точках во время анализа.
Другим важным преимуществом является то, что горизонтальный формат позволяет создавать гели с большим количеством скважин, что обеспечивает возможность анализа нескольких выборок параллельно 1 . Эта особенность значительно расширяет их использование в качестве биохимического инструмента для анализа взаимодействия РНК-белок. Например, способность анализировать несколько образцов облегчает исследование количественных параметров образования комплекса белка и РНК с использованием конкурентных экспериментов 15 , k off analysis 15, а также экспериментов, направленных на определение стехиометрии связывающих комплексных компонентов 15 . Кроме того, использованиеФлуоресцентные РНК-субстраты позволяют проводить множественные анализы, такие как анализы связывания флуоресцентной поляризации от одной реакции и получать как количественные, так и качественные данные связывания 5 , 15 .
Для получения оптимальных результатов от горизонтальной установки геля существуют различные параметры, которые можно настроить для улучшения качества комплексов для визуализации. Они включают изменение процентного содержания акриламида в геле, чтобы облегчить его обработку и улучшить отделение белково-РНК-комплексов от свободной РНК. Однако из-за размера может быть трудно обрабатывать акриламидные гели с низким процентом. Мы считаем, что легче использовать гели с концентрацией акриламида 7,5% или более. Кроме того, при необходимости условия электрофореза могут быть изменены для улучшения стабильности комплексов белок-РНК; Регулируя напряжение электрофореза, управляя гелем при комнатной температуре insteAd при температуре 4 ° C и настройке условий предварительного запуска.
Несмотря на многочисленные преимущества, существуют также некоторые ограничения, связанные с анализом на основе электрофореза на локальном геле. Например, его полезность максимизируется с использованием флуоресцентных субстратов РНК. В зависимости от выбранного флуорофора и размера РНК получение таких субстратов может быть дорогостоящим. Кроме того, горизонтальные гели обычно намного больше, чем вертикальные гели, и поэтому требуют большего количества материала, такого как полиакриламид и DEPC-обработанные растворы.
Горизонтальный нативный гель-электрофорез имеет потенциал для использования в качестве инструмента для проверки молекулярных экранов, которые направлены на выявление соединений, которые нацелены на клинически значимые взаимодействия РНК-белок. 16 . Такие экраны обычно используют биохимические анализы для определения соответствующих соединений для дальнейшего изучения. Более высокий пропускной потенциал горизонтального формата по сравнению с вертикальным форматом proviДают возможность применять собственный гель-электрофорез в качестве инструмента для вторичной валидации потенциальных кандидатов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим Лауру Вандерплоэг за подготовку цифр. Работа в лаборатории Sheets поддерживается грантом NSF 1050395 и грантом NIH (R21HD076828). Работа в лаборатории Райдера поддерживается грантами NIH R01GM117237 и R01GM117008. Меган Доудл поддерживает стипендию SciMed GRS Advanced Opportunity через Университет Висконсин-Мэдисон и программу обучения биотехнологии через Национальный институт общих медицинских наук Национального института здоровья (T32GM008349).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Horizontal Gel Box | OWL | N/A | Product no longer made. Similar gel boxes can be found at Thermo Scientific, A-series gel boxes. Catalog Number: A2-BP |
| 24-well large large horizontal gel electrophoresis combs | OWL | N/A | Product no longer made. Similar gel boxes can be found at Thermo Scientific, A-series gel box combs. Catalog Number: A2-24C |
| Powerpac 300 | Bio-Rad | 1655050 | |
| Mini-Protean II Electrophoresis Cell | Bio-Rad | 165-2940 | |
| InstaPAGE-19 40% 19:1 Acrylamide/Bis | IBI | IB70015 | |
| TEMED | IBI | IB70120 | |
| APS | IBI | IB70080 | |
| Yeast tRNAs | Ambion | AM7119 | |
| Fluorescein labeled RNA | IDT | N/A | Order can be made custom to length and desired sequence |
| EDTA tetrasodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | E5391-1KG | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-500G | |
| Tris Base Ultrapure | US Biological | T8600 | |
| Boric Acid | Fisher Scientific | BP168-500 | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-1 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| DEPC | Sigma-Aldrich | 1609-47-8 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 3483 12 3 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 |
References
- Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift. Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).
- Dahlberg, A. E., Dingman, C. W., Peacock, A. C. Electrophoretic characterization of bacterial polyribosomes in agarose-acrylamide composite gels. J Mol Biol. 41 (1), 139-147 (1969).
- Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat Protoc. 2 (8), 1849-1861 (2007).
- Pagano, J. M., Farley, B. M., Essien, K. I., Ryder, S. P. RNA recognition by the embryonic cell fate determinant and germline totipotency factor MEX-3. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (48), 20252-20257 (2009).
- Royer, C. A., Scarlata, S. F. Fluorescence approaches to quantifying biomolecular interactions. Meth Enzymol. 450, 79-106 (2008).
- Su, C., Wang, F., Ciolek, D., Pan, Y. C. Electrophoresis of proteins and protein-protein complexes in native polyacrylamide gels using a horizontal gel apparatus. Anal Biochem. 223, 93-98 (1994).
- Buczek, P., Horvath, M. P. Thermodynamic Characterization of Binding Oxytricha nova Single Strand Telomere DNA with the Alpha Protein N-terminal Domain. J Mol Biol. 359 (5), 1217-1234 (2006).
- Zhang, Y., Park, S., Blaser, S., Sheets, M. D. Determinants of RNA binding and translational repression by the Bicaudal-C regulatory protein. J Biol Chem. 289 (11), 7497-7504 (2014).
- Gamberi, C., Lasko, P. The Bic-C family of developmental translational regulators. Comp Funct Genomics. , 141386 (2012).
- Saffman, E. E., et al. Premature translation of oskar in oocytes lacking the RNA-binding protein bicaudal-C. Mol Cell Biol. 18 (8), 4855-4862 (1998).
- Chicoine, J., et al. Bicaudal-C recruits CCR4-NOT deadenylase to target mRNAs and regulates oogenesis, cytoskeletal organization, and its own expression. Dev Cell. 13 (5), 691-704 (2007).
- Zhang, Y., et al. Bicaudal-C spatially controls translation of vertebrate maternal mRNAs. RNA. 19 (11), 1575-1582 (2013).
- Maisonneuve, C., et al. Bicaudal C, a novel regulator of Dvl signaling abutting RNA-processing bodies, controls cilia orientation and leftward flow. Development. 136 (17), 3019-3030 (2009).
- Tran, U., et al. The RNA-binding protein bicaudal C regulates polycystin 2 in the kidney by antagonizing miR-17 activity. Development. 137 (7), 1107-1116 (2010).
- Pagano, J. M., Clingman, C. C., Ryder, S. P. Quantitative approaches to monitor protein-nucleic acid interactions using fluorescent probes. RNA. 17 (1), 14-20 (2011).
- Foley, T. L., et al. Platform to Enable the Pharmacological Profiling of Small Molecules in Gel-Based Electrophoretic Mobility Shift Assays. J Biomol Screen. 21 (10), 1125-1131 (2016).
