Summary
O objetivo do presente protocolo é avaliar o efeito dos factores pro e anti migratory na migração de células dentro de uma matriz tridimensional de fibrina.
Abstract
Atualmente, a maioria dos modelos em vitro de cicatrização, tais como ensaios de risco bem estabelecidos, envolvem estudando o fechamento da célula migração e ferida em superfícies bidimensionais. No entanto, o ambiente fisiológico no qual ferida na vivo tem lugar de cura é tridimensional, ao invés de bidimensional. Está se tornando cada vez mais claro que o comportamento da célula difere grandemente em bidimensional vs ambientes tridimensionais; Portanto, há uma necessidade de mais fisiologicamente relevantes em vitro modelos para estudar os comportamentos de migração celular no encerramento da ferida. O método descrito neste documento permite o estudo da migração celular em um modelo tridimensional que melhor reflete as condições fisiológicas do que ensaios zero bidimensionais previamente estabelecidos. A finalidade deste modelo é avaliar a consequência natural da célula através do exame de migração celular longe um esferoide corpo incorporado dentro de uma matriz de fibrina na presença de fatores de pro ou anti migratory. Usando esse método, célula consequência natural do organismo em uma matriz tridimensional de esferoide pode ser observado e é facilmente quantificável ao longo do tempo através de microscopia brightfield e análise da área de corpo de esferoide. O efeito de fatores pro-migratórias e/ou inibitórios sobre a migração de células também pode ser avaliado neste sistema. Este método fornece a pesquisadores com um método simples de analisar a migração celular no ferimento tridimensional associado matrizes em vitro, aumentando assim a relevância da vitro em células estudos prévio à utilização de animais na vivo modelos.
Introduction
Cicatrização de feridas é um processo complexo que resulta na restauração da integridade de tecidos após lesão. Este processo é dividido em quatro fases sobrepostas englobadas por hemostasia, inflamação, proliferação e remodelação,-que cada um são regulados por uma combinação complexa de pistas solúveis, interações célula-matriz e comunicações célula-célula. 1 , 2 a orquestração destes tacos controla uma infinidade de respostas celulares na cicatrização de feridas, importante, incluindo migração celular. 3 , 4 migração celular é um processo altamente dinâmico dependente as propriedades bioquímicas e biofísicas de meio de matriz extracelular e celulares fenótipos. 5 células continuamente sonda ambiente matriz extracelular através de vias mediadas por integrina; Este processo permite que as células a perceber uma ampla gama de propriedades de matriz, incluindo topografia, rigidez e confinamento. Análise de bidimensional (2D) de migração celular demonstra que a migração é impulsionada pela formação de lamellipodia na vanguarda através da geração de feixes de filamentos de actina. Subsequente formação de aderências focais na vanguarda, em combinação com actomyosin conduzido contração e retração à aresta de fuga, conduz a célula para frente. 6 migração celular tridimensional (3D) atualmente não é bem compreendida, no entanto, estudos recentes demonstram que a migração 3D é marcadamente diferente do que o acima descrito o mecanismo em 2D e é, provavelmente, conduzido por mecanismos alterative. Por exemplo, estudos recentes por Petrie et al. demonstrado que, dependendo das propriedades do ECM, células em matrizes 3D podem alternar entre lamellipodium e lobopodium conduzido mecanismos de migração. 7 porque a migração celular é um componente crítico da resposta de cicatrização de feridas, modelos 3D de migração celular são críticos para compreender as respostas fisiológicas aos diversos estímulos durante a cicatrização de feridas. Embora o comportamento migratório de célula em superfícies 2D foi mostrado para variar muito de migração em matrizes 3D, modelos em vitro mais atuais de migração celular durante a processo, incluindo o ensaio de risco bem estabelecido, de cicatrização de feridas utilizam 2D culturas de monocamada. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 mais recentemente desenvolvidos ensaios utilizaram uma matriz 3D, mas ainda cultura de células em um monolayer em cima da matriz, limitando assim a capacidade de verdadeiramente recapitular a tridimensionalidade do ambiente celular in vivo. 15
O objetivo do método aqui descrito é estudar a migração celular em um modelo 3D fisiologicamente relevante, em vez de em uma superfície 2D, a fim de obter uma compreensão mais robusta de respostas de migração associados os estímulos aplicados. Este método permite a avaliação da migração celular dentro de uma matriz de coágulo de fibrina 3D na presença de fatores que ativar ou inibir vias associadas a migração celular. Uma matriz de fibrina foi escolhida para esse método devido as peças de fibrina papel crítico nos estágios iniciais de cicatrização de feridas; seguir lesão, um coágulo de fibrina é formada dentro de ambientes de ferida para travar a perda de sangue e serve como um andaime para infiltração de pilha inicial durante a remodelação e reparação tecidual. 2 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 além disso, fibrina é usada clinicamente como um vedador cirúrgico e a composição dos selantes foi amarrada a migração celular e ultimate resultados de cura. Um estudo anterior por Cox et al. investigou a migração de fibroblastos com coágulos de fibrina, compostos de fibrina variada e concentrações de trombina para fins de otimização de um selante de fibrina. Nesses estudos, a migração de células de coágulos de fibrina em pratos plásticos foi quantificada. 20 aqui apresentamos um método que permite a quantificação da migração de células dentro do ambiente 3D de fibrina. Enquanto o método descrito neste protocolo especificamente usa fibrina, este modelo pode ser facilmente modificado para usar materiais alternativos matriz conforme desejado, tais como colágeno ou outras matrizes 3D. Além disso, apresentamos o uso de esferoides de fibroblasto neste ensaio como a migração de fibroblastos no leito da ferida é de suma importância para a síntese de matriz extracelular e remodelação/reparação de tecidos. No entanto, durante o reparo processo neutrófilos são o primeiro tipo de célula para migrar para o leito da lesão, seguido por macrófagos. Fibroblastos, então, começar a infiltrar o ambiente da ferida aproximadamente 48 horas após a lesão inicial, no início da fase proliferativa da processo de cicatrização de feridas. 19 este ensaio pode ser facilmente modificado para incluir os neutrófilos, macrófagos ou outros tipos de células para avaliar como alterações na estrutura do coágulo de fibrina afetam a migração desses tipos de célula. 21
Para implementar este ensaio, em primeiro lugar, um esferoide de fibroblasto é formado usando uma modificação das técnicas descritas anteriormente para cultura de células-tronco. 22 o spheroid fibroblasto é posteriormente transferido para uma matriz de fibrina 3D, e a consequência pode ser facilmente monitorizada e quantificada durante vários dias. Este protocolo leva em consideração o 3D dos sistemas fisiológicos incorporando esferoides 3D celular dentro de uma matriz de fibrina, evitando assim as limitações na relevância provocada por um usando uma superfície de crescimento 2D com uma monocamada de células migratórias comportamento modelo, enquanto ainda permitindo a avaliação do comportamento de células em um ambiente altamente controlado em vitro .
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Protocol
1. dia 1: célula e preparação do reagente
Nota: toda preparação celular e reagente deve ser executada em uma câmara de segurança biológica para evitar a contaminação das amostras.
- Morna filtrada Dulbecco ' s Modified Eagle ' s médio (DMEM), soro bovino fetal (FBS), L-glutamina e penicilina/estreptomicina em banho maria a 37 ° C.
- Preparar mídia de fibroblastos dérmicos humanos neonatal (HDFn), completando aquecido DMEM com 10% FBS, 1% penicilina/estreptomicina e 1% L-glutamina.
- Descongelar um frasco de congelados HDFns e centrífuga para 8 min a 200 x g para remover o meio de criopreservação. Ressuspender as células em meios de HDFn preparados em uma densidade de sementes de 1 x 10 6 células/mL em um frasco de cultura T-75.
- Balão de lugar na incubadora (37 ° C, 5% CO 2) para permitir a proliferação celular.
- Loja HDFn mídia em 4 ° C.
- Preparar pro e anti migratory reagentes conforme necessário.
2. Dia 3: Spheroid preparação
- executar o seguinte em uma capa de cultura para evitar a contaminação das amostras.
- Quando células alcançar 80% de confluência, mídia, Aspire e adicionar 5 mL de 0,25% Trypsin-EDTA. Balão de loja em uma incubadora de 37 ° C por 5 min separar totalmente as células da superfície do balão.
- Adicionar 5 mL de mídia aquecida no balão para neutralizar a tripsina.
- Em um tubo de microcentrifugadora, misture 10 μL de Trypan azul e 10 μL da suspensão celular.
- Centrifugar a suspensão celular original para 8 min a 200 g. x
- Enquanto a suspensão celular é ser centrifugada, adicionar 10 μL da suspensão celular Trypan azul para um hemocytometer e realizar uma contagem celular.
- Após centrifugação, Aspire mídia sem desalojar o centrifugado. Ressuspender as células em uma concentração de 1,25 x 10 5 células/mL.
- Adicionar 5 mL de soro fisiológico estéril tamponado de fosfato (PBS) para o fundo de um prato de Petri para manter um ambiente hidratado durante o crescimento do esferoide de 10 cm.
- Inverter a tampa da caixa de Petri. Adicionar vários 20 μL gotas de suspensão de células para a superfície interna da tampa do prato de Petri.
- Rapidamente inverter a tampa novamente e coloque-o na parte inferior do prato, tomando cuidado para não deslocar as gotas de suspensão. a Figura 1 ilustra o enforcamento com sucesso formado gotas.
- Cuidadosamente coloque o prato em uma incubadora de 37 ° C e permitir esferoides crescer em um enforcamento larga cultura por um período de 72 h.
3. Dia 6: Incorporação de esferoides em 3D Matrix
- executar o seguinte em uma capa de cultura para evitar a contaminação das amostras.
- Para a formação da primeira camada de fibrina, criar uma solução de coágulo volume suficiente para adicionar 100 μL de solução de coágulo por alvéolo para poços como muitos como necessário (1 esferoide por alvéolo). Os coágulos são compostos de 10% 10 X HEPES de buffer por volume (250 mM HEPES, 1500 mM NaCl, 50mm CaCl 2, pH 7,4), fibrinogênio humano de 2 mg/mL e trombina alfa humana de 0,1 U/mL. O restante do volume coágulo é composto de água ultrapura.
- Adicionar trombina última e rapidamente adicionar solução desejados poços em uma placa de 48 para prevenir coágulos de polimerização antes sendo adicionadas aos poços.
- Suavemente agitar/torneira bem placa para garantir que a mistura do coágulo de fibrina é revestimento todo o bem e em seguida coloque a placa bem na incubadora para 1 h permitir que a camada inferior de coágulo polimerizar. Não agite bem placa forte o suficiente para induzir a formação de bolhas; simplesmente rock placa conforme necessário até que a totalidade do poço é revestida. Se volumes maiores de coágulo são utilizados, este passo pode não ser necessário.
- Esferoides de transferência para a camada de fibrina.
Placa
- remover o poço e o prato de Petri contendo esferoides no enforcamento soltar cultura da incubadora e examinar esferoides sob um microscópio. Em seguida, coloque o prato ao subúrbio de cultura.
- Inverter cuidadosamente a tampa da caixa de Petri para permitir o acesso para o enforcamento cair culturas.
- Cuidadosamente usando uma agulha 21G, ligada a uma seringa de 1 mL, transferir uma gota da tampa invertida no centro de cada bem, tomando cuidado para não perfurar a camada de fibrina polimerizada, revestindo o fundo do poço. Para efetivamente transferir a gota, puxe lentamente a queda para a agulha. Pare de puxar o êmbolo, assim que a gota inteira está dentro da agulha; puxando a queda para trás longe demais pode apresentar bolhas de ar, que podem interromper a transferência eficaz esferoide ou imagens subsequentes.
- Examinar a placa bem sob um microscópio para garantir que esferoides transferiram corretamente em poços tudo desejados.
- Para a formação da segunda camada de fibrina, criar uma outra solução de coágulo, usando a mesma preparação como acima para a criação da primeira camada de fibrina (passo 3.2). Pipetar 100 μL em cada gota que contenham esferoide e examinar ao microscópio novamente para garantir que esferoides ainda estão intactos e não foram empurrados para as bordas dos poços cuidadosamente.
- Devolve a chapa bem para a incubadora e permitir que a segunda camada polimerizar por 1 h.
4. Dia 6: Adição de fatores inibitórios ou Pro-migratória
- mídia HDFn aquecido a 37 ° C.
- Execute as seguintes etapas em um capuz para evitar a contaminação.
- Preparar a mídia para cada grupo incluindo concentrações adequadas de pro/anti-migratory agentes a ser avaliada.
- Remover a placa bem da incubadora e coloque em uma capa de cultura.
- Adicionar 500 μL de mídia padrão para cada poço do grupo controle de esferoide, 500 μL de mídia inibitória a cada poço do grupo esferoide inibidora de migração e 500 μL de mídia pro-migratórias a cada poço do grupo migração aprimorada esferoide.
- Devolve a chapa bem para a incubadora.
- Mídia de mudança cada 48 h.
5. Dias 6-9: avaliação da migração celular e proliferação
- imagem esferoides usando microscopia brightfield imediatamente após a adição da mídia (0 h) e em seguida cada 24h por 72 h. opcional: em cada ponto de tempo, pegue uma imagem de z-pilha a fim de determinar se migração está ocorrendo em aviões fora da área principal de foco. Em nossa experiência, isso não ocorre; no entanto, é útil garantir que este é o caso em cada experimento.
- Uso ImageJ para determinar a consequência natural de célula em cada poço, analisando o aumento percentual de área para cada esferoide traçando a borda de célula para cada esferoide em cada ponto de tempo sucessivos e usando o " medida " função para obter a área de.
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Representative Results
Cultura de esferoide pode ser utilizada para avaliar com sucesso o efeito dos agentes pro e antimigratórias na migração de fibroblastos in vitro
Esferoides fibroblasto 3D podem ser formadas através de cultura de gota de suspensão durante um período de 72 h (Figura 1). Após o período de cultura, esferoides são incorporados dentro da matriz do coágulo e fotografaram usando microscopia brightfield (Figura 2). As áreas iniciais dos esferoides (representados na figura, como nas zonas delimitadas pelas beiras brancas) foram determinadas usando o ImageJ e usado como um ponto de referência para determinar o grau de consequência célula subsequente dos corpos esferoide. Medições de área média inicial para os esferoides estavam determinadas a ser 4.3 x 104 μm2 ± 1,1 x 104 μm2 para os esferoides de controle, 4.4 x 104 μm2 ± 1,1 x 104 μm2 para o pro-migratórias esferoides e 4.5 x 104 ± 7,7 x 103 μm2 para os antimigratórias esferoides. Mídia contendo pro ou anti migratory fatores foi adicionada para a formação de coágulos que contenham esferoide e consequência de célula do corpo esferoide inicial foi fotografada cada 24 h, com finais imagens tomadas 72 h após a mídia original foi adicionada (Figura 3).
Após a conclusão do experimento, crescimento de esferoide ao longo do tempo foi analisado usando o ImageJ para calcular as mudanças na área de esferoide para cada amostra. Como mostrado na Figura 3, a borda mais externa do cluster célula em cada ponto de tempo foi usada para determinar o grau de tempo específico de consequência natural da célula. Esperamos que os pontos fora de foco, mostrados na Figura 3 são fragmentos de células, e não contamos isto em nossa quantificação. Imagens em tamanho real mostram uma borda de célula clara, contínua, emergindo do corpo de esferoide; é esta fronteira que é rastreada ao determinar a consequência natural. Consequência de célula foi quantificada por normalizar a área de consequência de célula em relação à área de corpo de esferoide original em t = 0 h e em seguida expressar o crescimento como uma porcentagem da área original de esferoide. Quantificação da consequência da célula durante o período de 72 h revela que esferoides expostos a um agente pro-migratórias apresentam um grau significativamente aumentado de migração longe do corpo original de esferoide em comparação com esferoides exposto a um agente inibidor de migração e de esferoides controle expostos a mídia padrão (p < 0,0001, Figura 4). Por outro lado, expostos a um agente antimigratório de esferoides exibiram significativamente reduzido grau de migração longe do corpo original de esferoide quando comparado com o controle de esferoides (p < 0,0001).
Para comparação, nós fornecemos um exemplo de um ensaio de zero (Figura 5). Este ensaio foi realizado por semeadura fibroblastos em 500.000 células/cm2 na 24 placas de alvéolos, revestidos com fibrinogénio 2 mg/mL. Fibroblastos foram autorizados a crescer durante a noite. A superfície bem depois foi riscada com a ponta da pipeta e migração celular para a área de risco foi fotografada mais de 24 horas. Como mostrado nas imagens representativas, apresentadas na Figura 5A, existem limitações para este ensaio; arranhões não são muito reprodutíveis e em alguns casos, os limites não são claramente delineados. No entanto, as tendências de migração global na presença de fatores de pro e anti migratory são os mesmos que os presentes no ensaio de esferoide 3D, apesar da variabilidade acima mencionada e as diferenças de modos de migração. Deve notar-se que as taxas de migração são mais rápidas no ensaio de rascunho 2D, comparado com o ensaio de esferoide 3D. Encerramento foi mais rápido na presença do agente pro-migratórias e todas as amostras cultivadas na presença do agente pro-migratórias foram completamente fechadas dentro de 24 h.
Figura 1 : Fibroblastos dérmicos humanos em um enforcamento larga cultura. As células são deixadas em um enforcamento larga cultura para 72 h induzir a formação de esferoide. Uma parte superior (A) e (B) vista de lado o enforcamento larga cultura são apresentados. (C) diagrama esquemático representando a vista lateral de formação esferoide em uma gota de suspensão. A linha preta representa o topo da placa, a esfera rosa representa a mídia e as esferas roxas representam as células dentro do esferoide. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Aparência de esferoide após incorporação inicial na matriz de fibrina (t = 0 h após adição de mídia) fotografada usando microscopia brightfield na ampliação de 10x. (A, D) Esferoide de controle; (B, E) Esferoide exposto ao agente antimigratória nos meios de comunicação; (C, F) Esferoide exposto ao agente pro-migratórias na mídia. Imagens são mostradas com (D-F) e sem (A-C) branco linhas que indicam as fronteiras usadas para determinar a área de consequência. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Aparência de esferoide após 72 h fotografada usando microscopia brightfield na ampliação de 10x. (A, D) Esferoide de controle; (B, E) Esferoide exposto ao agente antimigratória nos meios de comunicação; (C, F) Esferoide exposto ao agente pro-migratórias na mídia. Imagens são mostradas com (D-F) e sem (A-C) branco linhas que indicam as fronteiras usadas para determinar a área de consequência. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Crescimento de esferoide mais de 72 h. Agentes pro-migratórias e antimigratórias nos meios de comunicação são mostrados para afetar significativamentemigração de fibroblastos e proliferação em ambientes 3D. N = 3/grupo; * representa p < 0,0001. Barras de erro representam desvios-padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : Comparação com o padrão 2D ensaio zero. (A) imagens representativas da migração celular em um ensaio de risco padrão mais de 24 horas. Fibroblastos foram cultivados em meios condicionados com fatores migratory pro ou anti, e diferenças no encerramento zero foram quantificadas ao longo do tempo. (B) fechamento por cento ao longo do tempo pelos fibroblastos cultivados em controle, pro-migratórias, ou mídia antimigratórias. Embora existam diferenças nos modos de migração presente neste ensaio 2D vs o ensaio 3D esferoide, tendências de migração global manter-se coerente. N = 3/grupo; * representa p < 0,05. Barras de erro representam desvios-padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este protocolo permite para o exame de migração celular, na cicatrização de feridas associada ECMs através de um modelo 3D in vitro . Um passo crucial na boa execução do processo é o desenvolvimento adequado de esferoides de fibroblastos; concentração de células durante a preparação foi otimizada para dar uma concentração inicial de 2.500 células/soltar, permitindo esferoides de forma confiável ao longo de um período de incubação de 72 h. Se um número insuficiente de células é usado, esferoides não podem agregar eficazmente e podem quebrar em cima sendo transferidos e incorporados as camadas de fibrina. Se são utilizados diferentes tipos de células, concentração inicial de células e/ou esferoide tempo de maturação pode ter que ser ajustada para obter formação esferoide consistente e estável. Para tipos de células que se proliferam mais lentamente do que os fibroblastos, uma concentração muito maior de pilha inicial pode ser necessária para garantir a formação adequada de esferoide dentro do intervalo de tempo de 72 horas. Células não devem permanecer em um enforcamento cair mais de 72 h devido à incapacidade de mudar os meios de comunicação sobre os esferoides enquanto na cultura de cultura. Diferenças no tamanho do esferoide inicial são esperadas devido à variabilidade biológica inerente; abordamos esta variabilidade, iniciando a formação de esferoide com um número consistente de células para minimizar as diferenças de tamanho, tanto quanto possíveis e normalizando o crescimento ao longo do tempo para permitir comparações de dados.
O principal desafio para a implementação desse método é a transferência de esferoides de um enforcamento larga cultura dentro da matrix de coágulo. Este protocolo usa uma agulha e uma seringa para aspirar o droplet esferoide-contendo da tampa invertida de Petri, mas outros métodos, tais como o uso de pinças ou de micropipetas anexadas às pontas aparadas, também podem ser aplicados para transferir efetivamente o esferoides de gota de suspensão a matrix. Esferoides podem ser transferidos de forma confiável, puxando o êmbolo da seringa volta um pouco antes da transferência da gota e garantindo que a gota é elaborada para a agulha lentamente para que as bolhas de gás não sejam introduzidas o droplet. O êmbolo da seringa deve apenas ser puxado para trás apenas o suficiente para trazer a gota toda a agulha; puxando para trás qualquer mais irá também apresentar bolhas e interferir com a transferência fiável dos esferoides nos poços da placa bem. Suspensão especializado larga cultura placas também podem ser usadas para simplificar a cultura de esferoide, mas são menos custo eficiente meio de fazê-lo do que simplesmente usar um prato padrão.
Durante ferida cura na vivo, fibroblastos que invadem a área ferida produzem proteases de serina extensa que resultam na degradação de matriz de fibrina. Estas células posteriormente sintetizam nova matriz extracelular, predominantemente composta de colágeno, a fim de reparar o tecido danificado. 23 este mecanismo de migração permite invasão controlada, que não é capturado por nosso método e representa uma limitação do sistema. Também deve ser notado que os fibroblastos utilizados neste método irão secretar proteases que iria ao longo do tempo, degradam a rede de fibrina; Portanto, se a longo prazo (> 72 horas) estudos de migração são desejadas, inibidores de protease, tais como a aprotinina, devem ser adicionados para o meio de cultura celular.
Apesar dessas limitações, este método oferece um método simples, econômico e reprodutível, dedicada ao estudo 3D celular migração em vitro. Enquanto proporcionando um ambiente mais fisiologicamente relevante que comumente utilizados modelos 2D, análise de crescimento no modelo 3D aqui descrito mantém a análise direta fornecida pelos modelos 2D. Esferoides são fáceis de Visualizar usando microscopia brightfield ou fase simples e, se desejado, esse método pode ser facilmente modificado para uso em microscopia de fluorescência através da marcação fluorescente as membranas celulares e proteínas da matriz. Este protocolo feito uso de neonatais fibroblastos dérmicos humanos devido ao papel da migração dos fibroblastos no tecido de reparação/remodelação. Se desejado, neutrófilos, macrófagos, queratinócitos ou outros tipos de células podem ser usados neste ensaio para avaliar alterações na estrutura do coágulo de fibrina como afetam a migração de outros tipos de células envolvidas na cicatrização de feridas. O material 3D também pode ser modificado conforme necessário; dependendo da aplicação desejada, colágeno ou outros materiais de matriz 3D podem ser utilizados em vez de uma matriz de fibrina, a fim de fornecer um modelo fisiologicamente relevante. Um modelo útil para o estudo de longo prazo migração celular em um ambiente de ferida, como pode ser obtido com este protocolo usando queratinócitos e colágeno ao invés de fibroblastos e fibrina. Os métodos descritos também permitem maior flexibilidade e custo-efetividade na migração celular e ferida cura estudos através da implementação de um modelo fisiologicamente relevantes em vitro , ao invés de exigir trabalho imediato na vivo Após estudos clássicos bidimensional em vitro .
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Financiamento para este trabalho foi fornecido pela American Heart Association (16SDG29870005) e a North Carolina State University Research e financiamento de sementes de inovação.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium, 4.5 g/L Glucose, w/ Sodium Pyruvate, w/out L-Glutamine | VWR | VWRL0148-0500 | DMEM already containing L-glutamine can also be used |
| 100mm Tissue Culture Dish, Non-Treated, Sterilized, Non-Pyrogenic | VWR | 10861-594 | Dishes of any size can be used for hanging drop culture |
| Fetal Bovine Serum from USDA approved countries, heat inactivated, sterile-filtered, cell culture tested | Sigma-Aldrich | 12306C-500ML | |
| L-glutamine | Fisher Scientific | ICN1680149 | Not needed if using DMEM that already contains L-glutamine |
| Penicillin-Streptomycin Solution stabilized, sterile-filtered, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | |
| Human Dermal Fibroblasts, neonatal | Thermo Fisher | C0045C | Can be replaced with other cell type of interest |
| 21 G x 1 1/2' needle | BD | 305167 | 22 G x 1 1/2 needles will also work |
| 1 mL syringe | VWR | 89174-491 | Syringes of any volume can be used |
| Cell Culture Multiwell Plates, Polystyrene, Greiner Bio-One (Individially Wrapped) (48 wells) | VWR | 82051-004 | |
| Human Fibrinogen - Plasminogen, von Willebrand Factor and Fibronectin Depleted | Enzyme Research Laboratories | FIB 3 | Can be replaced with matrix protein of interest |
| Human Alpha Thrombin | Enzyme Research Laboratories | HT 1002a | May not be necessary depending on matrix protein of interest |
| Equipment | |||
| BSL2 cell culture hood | |||
| Cell culture incubator | |||
| Inverted microscope with 10X objective | |||
| Centrifuge compatibile with 15 mL tubes |
References
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