Summary
Bu iletişim kuralı yanlısı ve anti migratory faktörlerin etkisi hücre geçiş bir üç boyutlu fibrin matris içinde değerlendirmek için hedeftir.
Abstract
Şu anda, en vitro model, iyileşmesi gibi köklü sıfırdan deneyleri, hücre göç ve yara kapatma iki boyutlu yüzeyler eğitim içerir. Ancak, yer alır şifa hangi vivo içinde yara fizyolojik ortamında üç boyutlu tercihan--dan iki boyutlu. Hücre davranışı büyük ölçüde olarak farklı olduğunu giderek daha açık hale geliyor iki boyutlu ve üç boyutlu ortamlarda; Bu nedenle, yara kapatma hücre geçiş davranışları eğitim için daha fizyolojik ilgili vitro modelleri için bir ihtiyaç vardır. Burada açıklanan yöntemi daha iyi daha önce kurulan iki boyutlu sıfırdan deneyleri fizyolojik şartlarda yansıtan bir üç boyutlu model hücre göç çalışmanın olanak sağlar. Hücre akıbet hücre göç pro veya anti migratory faktörlerin varlığında fibrin matris içinde gömülü bir küresel gövdesinden çekin incelenmesi yoluyla değerlendirmek için bu model amacı budur. Bu yöntemi kullanarak, hücre yapılan üç boyutlu bir matris küresel vücuttan gözlenen ve aydınlık alan mikroskobu ve küresel gövde alanı analizi ile zaman içinde kolayca ölçülebilir. Pro-göçmen ve/veya inhibitör faktörleri etkisi hücre göç de bu sistem içinde değerlendirilebilir. Bu yöntem araştırmacılar hücre göç ilişkili üç boyutlu yara matrisler vitroanaliz basit bir yöntem sağlar, böylece artan alaka içinde in vitro hücre önceden in vivo hayvan kullanımı için çalışmalar modelleri.
Introduction
Yara iyileşmesi yaralanma takip doku bütünlüğü restorasyon sonuçları karmaşık bir süreçtir. Bu işlem içine hemostazın, inflamasyon, yayılması ve remodeling, tarafından çevrelenmiş dört örtüşen aşamaları olan her düzenlenmektedir çözünür cues, hücre-matris etkileşimleri ve hücre-hücre iletişim karmaşık bir kombinasyonu tarafından bozuldu. 1 , 2 bu cues orkestrasyon hücresel yanıt-e doğru dahil, önemlisi, hücre göç yara iyileşmesinde çok sayıda kontrol eder. 3 , 4 hücre geçiş bağımlı hücresel fenotipleri ve hücre dışı matriks ortamın Biyokimya ve biyofizik özelliklerini üzerinde son derece dinamik bir süreç değil. 5 hücreler sürekli hücre dışı matriks çevreleri integrin aracılı yollar aracılığıyla araştırma; Bu süreci hücreleri matris özellikleri topografya, sertlik ve hapsi de dahil olmak üzere geniş bir anlamda verir. İki boyutlu (2D) analizi hücre göç göç öncü aktin filaman demetleri nesil aracılığıyla, lamellipodia formasyonu tarafından tahrik edilmektedir gösterir. Öncü kasılma ve retraksiyon firar kenarında tahrik actomyosin ile birlikte, odak yapışıklıklar sonraki oluşumunu hücrenin ileri sürüyor. 6 boyutlu üç (3D) hücresel geçiş şu anda iyi anlaşılamamıştır, ancak, son yıllarda yapılan çalışmalarda 3D geçiş daha belirgin farklı olduğunu ispat yukarıda adı geçen mekanizması 2D açıklanan ve büyük olasılıkla değiştirici mekanizma ile tahrik edilmektedir. Örneğin, son yıllarda yapılan çalışmalarda Petrie ve arktarafından. ECM özelliklerine bağlı olarak, 3D Matris hücrelerinde lamellipodium geçiş mekanizmalarının tahrik lobopodium arasında geçiş yapabilirsiniz, gösterdi. 7 hücre geçiş yanıt şifa yara, kritik bir bileşeni olduğundan hücre göç 3D modelleri yara iyileşmesi sırasında çeşitli uyaranlara fizyolojik yanıtlarını anlamak için kritik önem taşımaktadır. 2D yüzeylerde hücre göç davranışı büyük ölçüde göç 3D matrisler farklı olduğu gösterilmiştir, ancak en güncel vitro modelleri hücre göç sırasında köklü sıfırdan tahlil dahil olmak üzere işlem, şifa yara 2D kullanmak monolayer kültürler. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 deneyleri daha son zamanlarda geliştirilen 3D matris kullanılan, ama hala böylece yeteneği gerçekten hücre çevre three-dimensionality özetlemek için sınırlama monolayer matrix, üstüne hücrelerde kültür içinde vivo. 15
Burada açıklanan yöntemin amacı ile uygulanan uyaranlara ilişkili geçiş yanıt daha sağlam bir anlayış kazanmak için hücre göç fizyolojik ilgili bir 3D modeli yerine bir 2D yüzey incelemektir. Bu yöntem, hücre geçiş etkinleştirmek veya hücre geçiş ile ilişkili yollar engelleyen faktörleri varlığında bir 3D fibrin pıhtısı matris içinde değerlendirilmesi için sağlar. Fibrin matris nedeniyle kritik rol fibrin yara iyileşmesi erken aşamalarında, bu yöntem için seçildi; Aşağıdaki yaralanma, fibrin pıhtısı yara ortamlar içinde kan kaybı kök oluşturduğu ve ilk hücre infiltrasyonu sırasında doku onarım ve tadilat için bir iskele olarak hizmet vermektedir. 2 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 Ayrıca, fibrin cerrahi bir mastik olarak klinik olarak kullanılır ve Mastikler bileşimi hücre göç ve nihai sonuçları şifa için bağlı olmuştur. Cox ve arktarafından önceki bir çalışma. fibroblast geçiş değişen fibrin ve fibrin dolgu macunu en iyi duruma getirme amacıyla Trombin konsantrasyonları oluşan fibrin pıhtısı ile araştırıldı. Bu çalışmalarda, plastik yemekleri üzerine fibrin pıhtısı hücreleri geçirilmesi sayısal. 20 burada miktar göç 3D fibrin ortamı içindeki hücreleri için izin veren bir yöntem mevcut. Bu protokol için özel olarak açıklanan yöntemi fibrin kullanırken, bu model alternatif matris malzeme kullanmak istediğiniz gibi kollajen veya diğer 3B matrisleri gibi için kolayca değiştirilebilir. Ayrıca, biz fibroblast geçiş yara yatağına büyük önem hücre dışı matriks sentezi ve doku onarım/tadilat olduğundan bu tahlil fibroblast pulcuklarının kullanımı mevcut. Ancak, onarım sırasında süreç nötrofiller makrofajlar tarafından takip yara yatağa geçirmek için ilk hücre tipi vardır. Fibroblastlar sonra yaklaşık 48 saat sonra ilk yaralanma, yara iyileşme süreci proliferatif faz başında yara ortamı sızmaya başlar. 19 bu tahlil kolayca nötrofil, makrofajlar veya fibrin pıhtısı yapısındaki değişiklikler geçiş bu hücre tiplerinin nasıl etkiler değerlendirmek için diğer hücre tipleri eklemek için değiştirilmiş olabilir. 21
Bu tahlil uygulamak için ilk olarak, fibroblast küresel bir değişiklik kök hücre kültürü için daha önce açıklanan teknikleri kullanarak oluşturulur. 22 fibroblast küresel daha sonra 3D fibrin matris aktarılır ve sonucu sonra kolayca izlenebilir ve birkaç gün içinde sayılabilir. Bu iletişim kuralı dikkate fizyolojik sistemleri 3D 3D cep pulcuklarının fibrin matris içinde katıştırma tarafından alır böylece sınırlamaları hakkında getirdiği bir 2D büyüme yüzeyi ile bir hücre monolayer model göç davranışı için kullanarak alaka içinde kaçınarak, süre hala hücre davranışı son derece kontrollü vitro ortamda değerlendirilmesi için izin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. gün 1: hücre ve reaktif hazırlık
Not: tüm hücre ve reaktif hazırlık biyolojik Emanet örneklerinin kontaminasyonu önlemek için kabine gerçekleştirilmelidir.
- Sıcak filtre Dulbecco ' s modifiye kartal ' s orta (DMEM), fetal sığır serum (FBS), L-glutamine ve penisilin/streptomisin 37 ° C su banyosunda.
- Hazırlama yenidoğan insan dermal fibroblast (HDFn) medya ilave tarafından ısıttı DMEM %10 FBS, % 1 penisilin/streptomisin ve % 1'l-glutamin.
- Donmuş HDFns ve 200 x g de 8 dk santrifüj dondurma orta kaldırmak için bir şişe çözülme. 1 x 10 6 hücre/mL ve tohum yoğunluğu bir T-75 kültür şişesi içine de hazır HDFn medya hücrelerde resuspend.
- (37 ° C, % 5 CO 2) hücre çoğalması izin vermek için bir kuluçka yer şişeye.
- Mağaza HDFn medya 4 ° C.
- Yanlısı ve anti migratory reaktifler gerektiği gibi hazırlayın.
2. 3. gün: Küresel hazırlık
- bir kültür hood örneklerinin kontaminasyonu önlemek için aşağıdakileri gerçekleştirmek. Hücrelerin % 80 confluency, geldiğinizde
- Aspire medya ve % 0.25 5 mL ekleyin tripsin-EDTA. 37 ° C kuluçka tam hücreleri şişesi yüzeyinden ayırmak 5 min için mağaza flask.
- 5 mL ılık medya tripsin nötralize etmek için şişe ekleyin.
- Bir microcentrifuge tüp mix 10 μL Trypan mavi ve hücre süspansiyon 10 μL.
- Santrifüj orijinal hücre süspansiyon için 200 x g., 8 dk
- Hücre süspansiyon centrifuged iken, bir hemasitometre için Trypan mavi hücre süspansiyon 10 μL ekleyin ve bir hücre sayısı gerçekleştirmek.
- Hücre Pelet kekii olmadan Santrifüjü, medya Aspire edin. 1,25 10 5 hücre/mL x konsantrasyon, hücre Pelet resuspend.
- 5 mL steril fosfat tamponlu tuz (PBS) altına 10 cm küresel büyüme sırasında sulu bir ortam sağlamak için Petri kabına ekleyin.
- Petri kabına kapağını tersine çevirin. Hücre süspansiyon Petri kabına kapak iç yüzeyinin çeşitli 20 μL damla ekleyin.
- Hızlı bir şekilde kapağı tekrar ters çevir ve çanak asılı damla çıkarmak değil dikkatli olmak, altta geri yerleştirin. şekil 1 gösterir başarıyla kurulan asılı damla.
- Dikkatli bir 37 ° C kuluçka makinesine çanak yerleştirin ve pulcuklarının asılı bir büyümeye izin bırakın kültür 72 h. bir süre için
3. 6. gün: Pulcuklarının 3D matris gömme
- bir kültür hood örneklerinin kontaminasyonu önlemek için aşağıdakileri gerçekleştirmek. İlk fibrin tabaka oluşumu yaratmak için pıhtı çözüm çok sayıda wells için iyi başına 100 μL eklemek için yeterli hacim bir pıhtı çözüm
- (iyi başına 1 küresel) gerekli. Pıhtı yüzde 10'u 10 X HEPES tampon hacmi (250 mM HEPES, 1500 mM NaCl, 50 mM CaCl 2, pH 7,4), 2 mg/mL insan fibrinojen ve 0.1 U/mL insan Alfa Trombin tarafından oluşmaktadır. Pıhtı birimin geri kalanını ultrasaf su oluşmaktadır.
- Ekle Trombin son ve hızlı bir şekilde çözüm eklemek istediğiniz wells bir 48-şey plaka için kuyu için eklendi önce polymerizing pıhtıları önlemek için.
- Yavaşça shake/fibrin pıhtısı karışımı de tüm kaplama emin olmak için iyi plaka dokunun ve sonra alt pıhtı tabaka polimerize izin vermek 1 h için kuluçka iyi plaka yer. İyi plaka kabarcık oluşumu ikna etmek zor sallama; Sadece rock plaka kuyu tamamı kaplanır kadar gerektiği gibi. Daha büyük pıhtı birimleri kullandıysanız, bu adım gerekli olmayabilir.
- Fibrin katmana aktarmak pulcuklarının.
- Kaldır iyi plaka ve Petri kabına pulcuklarının asılı içinde içeren kültür kuluçka makinesi bırakın ve pulcuklarının mikroskop altında incelemek. Kültür kapağın çanak yerleştirin.
- Dikkatli bir şekilde erişime izin vermek için Petri kabına kapağını ters çevir'i kültürler için asılı bırakın.
- 1 mL şırınga için bağlı 21 G iğne kullanarak dikkatli bir kuyunun kaplama polimerli fibrin tabaka delmek değil dikkat çekici damla ters kapağını her şey, merkezi haline gelen transfer. Etkili bir şekilde açılan aktarmak için yavaş yavaş açılan iğne çek. En kısa zamanda tüm açılan içinde iğne döndü pistonu çekmeyi bırak; damla çok ileri geri çekerek etkili küresel transferi veya sonraki görüntüleme bozabilir hava kabarcıkları tanıtmak.
- İyi plaka pulcuklarının düzgün istenen tüm kuyu transfer var emin olmak için mikroskop altında incelemek.
- İkinci fibrin tabaka oluşumu için yukarıdaki gibi ilk fibrin tabaka (Adım 3.2) oluşturulması için aynı hazırlık kullanarak başka bir pıhtı çözüm oluşturun. Dikkatle her küresel içeren açılan üzerine 100 μL pipet ve tekrar pulcuklarının hala tek parça ve kuyular kenarlarına itti değil emin olmak için mikroskop altında incelemek.
- Kuluçka makinesi iyi plakasına dönmek ve ikinci katman için 1 h. polimerize izin
4. 6. gün: Pro-göçmen veya inhibitör faktörleri eklenmesi
- sıcak HDFn medya 37 ° c
- Bir hood kontaminasyonu önlemek için aşağıdaki adımları gerçekleştirin.
- Uygun konsantrasyonlarda değerlendirilmek üzere pro/anti-migratory ajanları dahil olmak üzere her grubu için ortam hazırlamak.
- Kuluçka Gelişim makinesi ve kültür kukuIeta yerde iyi plaka kaldırmak.
- Ekle 500 μL standart medya denetim küresel grubunun her şey için 500 μL geçiş inhibe küresel grubunun her şey için inhibitör medya ve geçiş gelişmiş küresel grubunun her şey için pro-göçmen medya 500 μL.
- İyi plaka da kuluçka için iade.
- Değişim medya her 48 h.
5. Gün 6-9: hücre göç değerlendirme ve nükleer silahların yayılmasına karşı
- görüntü pulcuklarının aydınlık alan mikroskobu hemen medya (0 h) ve sonra her 24 h eklenmesinden sonra 72 h. isteğe bağlı kullanarak: her zaman noktası, z-yığın görüntü almak olup olmadığını belirlemek amacıyla geçiş odak birincil alan dışında uçaklarda meydana gelen. Deneyimlerimize göre bu oluşmaz; Ancak, bu her deneme durumda olduğundan emin olmak yararlıdır.
- Kullanım için her küresel alanda yüzde artış her küresel her her başarılı zaman noktasında için hücre kenarlığı izleme ve kullanarak analiz ederek hücre yapılan her iyi belirlemek için ImageJ " ölçü " alanı elde etmek için işlev.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Küresel kültür başarıyla fibroblast geçiş tüp bebek yanlısı ve anti-göçmen aracıları etkisini değerlendirmek için kullanılması gereken
3D fibroblast pulcuklarının açılan kültür 72 h (şekil 1) bir süre içinde asılı yolu ile oluşturulabilir. Kültür dönemi pulcuklarının pıhtı matris içinde gömülü ve aydınlık alan mikroskobu (Şekil 2) kullanarak yansıma. (Resimde beyaz Kenarlıklar tarafından sınırlı alanlarda tasvir) pulcuklarının başlangıç alanlarında ImageJ kullanarak kararlı ve sonraki hücre akıbet küresel organları derecesini belirlemek için bir referans noktası olarak kullanılır. Pulcuklarının için başlangıç ortalama alanı ölçümleri 4.3 x 104 μm kalınlığında2 ± 1.1 x 104 μm kalınlığında2 için denetim pulcuklarının, 4.4 x 104 μm kalınlığında2 ± 1.1 x 104 μm kalınlığında2 pro-göçmen için olduğu tespit pulcuklarının ve 4.5 x 104 ± 7,7 x 103 μm kalınlığında2 Anti-göçmen pulcuklarının için. Pro veya anti migratory faktörler içeren medya küresel içeren pıhtıları eklendi ve hücre yapılan ilk küresel vücuttan her 24 h son görüntüleri orijinal medya (şekil 3) eklendikten sonra 72 h alınan yansıma.
Deneme tamamlandığında, küresel büyüme zaman içinde küresel alan her örnek için değişiklikleri hesaplamak için ImageJ kullanarak analiz edildi. Şekil 3' te gösterildiği gibi her zaman bir noktada hücre kümesinin en dış kenar hücre akıbet zaman özel derecesini belirlemek için kullanıldı. Şekil 3 ' te gösterilen odak noktalar hücre artıkları vardır ve biz bu bizim miktar sayılmaz bekliyoruz. Tam boyutlu görüntüleri küresel vücuttan ortaya çıkan açık, sürekli hücre kenarlığı göster; akıbet belirlerken takip Bu sınır olduğunu. Hücre çıkıntı sayısal hücre akıbet alan özgün küresel gövde alanı t göre normalleştirme tarafından = 0 h ve sonra özgün küresel çevrenin yüzde olarak büyüme şeklinde ifade. Hücre yapılan miktar 72 h dönemde ortaya koymaktadır pro-göçmen bir ajana maruz pulcuklarının geçiş maruz pulcuklarının ile karşılaştırıldığında orijinal küresel vücuttan önemli ölçüde artan bir ölçüde sergi bir geçiş inhibitör Ajan ve denetim pulcuklarının standart medyaya maruz için (p < 0.0001, şekil 4). Tersine, sergilenen Anti-göçmen bir aracıya maruz pulcuklarının pulcuklarının denetlemek için karşılaştırıldığında orijinal küresel gövdesinden çekin göçün önemli ölçüde azalmıştır derecesi (p < 0.0001).
Karşılaştırma için biz sıfırdan tahlil (şekil 5) örneği sağladı. Bu tahlil fibroblastlar 500.000 hücreler/cm2 24 iyi-plakaları 2 mg/mL fibrinojen ile kaplı tohum tarafından gerçekleştirildi. Fibroblastlar gecede büyümeye izin verildi. İyi yüzeyi sonra bir pipet ucu ile çizilir ve hücre göç Karalama alanı içine üzerinden 24 saat görüntüsü. Şekil 5içindeAsunulan temsili resimlerde görüldüğü gibi bu tahlil için sınırlamalar vardır; çizikler çok tekrarlanabilir değildir ve bazı durumlarda, sınırları değil açıkça tarif. Ancak, genel göç eğilimleri yanlısı ve anti migratory faktörlerin varlığında bu 3D küresel tahlil anılan değişkenliği ve modları geçiş farklılıkları rağmen mevcut olarak aynıdır. Bu geçiş oranları 3D küresel tahlil için karşılaştırıldığında 2D sıfırdan tahlil daha hızlı olması gerekmektedir. Kapatma pro-göçmen Ajan varlığında en hızlı ve tüm örneklerini huzurunda pro-göçmen Ajan kültürlü 24 saat içinde tamamen kapalıydı.
Resim 1 : İnsan dermal fibroblastlar içerebilen bir asılı bırakın kültür. Hücreleri bir asılı bırakılır bırak kültür küresel oluşumu ikna etmek 72 h için. Bir üst(a)ve yan (B) görünümünü kültür bırak asılı sunulmaktadır. (C) şeması küresel oluşumu içinde asılı damla yan görünüm tasvir. Siyah çizgi üst plaka, pembe küre medya temsil eder ve mor küre küresel içindeki hücreleri temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : İlk fibrin matris içinde katıştırma sonra küresel görünümü (t = 0 h medya eklenmesinden sonra) 10 X büyütme aydınlık alan mikroskobu kullanarak yansıma. (A, D) Denetim küresel; (B, E) Küresel anti-göç aracı medya maruz; (C, F) Küresel medya yandaş göçmen Ajan maruz. Görüntüleri (D-F) gösterilir ve beyaz (A-C) satırları akıbet alanı belirlemek için kullanılan sınırları belirtin. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Küresel görünümü 72 h 10 X büyütme aydınlık alan mikroskobu kullanarak yansıma sonra. (A, D) Denetim küresel; (B, E) Küresel anti-göç aracı medya maruz; (C, F) Küresel medya yandaş göçmen Ajan maruz. Görüntüleri (D-F) gösterilir ve beyaz (A-C) satırları akıbet alanı belirlemek için kullanılan sınırları belirtin. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : Küresel büyüme üzerinde 72 h. Pro-göçmen ve anti-göçmen aracıları medya önemli ölçüde çarpışmaya gösterilirfibroblast göç ve nükleer silahların yayılmasına karşı 3D ortamlarda. N = 3/grup; * temsil eder p < 0,0001. Hata çubukları standart sapmalar gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5 : Karşılaştırma standart 2D sıfırdan tahlil için. (A)hücre göç standart sıfırdan tahlil üzerinden 24 saat içinde temsilcisi görüntüler. Fibroblastlar pro veya anti migratory faktörler ile klimalı ortamda yetiştirilmiştir ve sıfırdan kapatma farklılıkları zaman içinde sayısal. (B) denetimi, pro-göçmen, veya anti-göçmen medya fibroblastlar için zaman içinde yüzde kapatma. Geçiş 3D küresel tahlil vs 2D bu tahlil mevcut modları farklılıkları olmakla birlikte, genel göç eğilimleri tutarlı kalır. N = 3/grup; * temsil eder p < 0,05. Hata çubukları standart sapmalar gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yara iyileşmesinde hücre göç incelenmesi ECMs bir vitro 3D modeli ile ilişkili bu iletişim kuralı sağlar. Çok önemli bir adım olarak uygun yordam yürütülmesini fibroblast pulcuklarının uygun gelişmedir; hücre toplama hazırlık sırasında 2.500 hücreler/damla, ilk bir konsantrasyon vermek için optimize edilmiş pulcuklarının formu için güvenilir bir 72 h kuluçka döneminde izin. Hücreleri yetersiz sayıda kullandıysanız, pulcuklarının etkili toplamak değil ve transfer ve fibrin katmanları içine gömülü varlık üzerine ayrı kırabilir. Farklı hücre tipleri kullandıysanız, ilk hücre toplama ve/veya zaman olgunlaşma küresel tutarlı, istikrarlı küresel formasyonu elde etmek için ayarlanması gerekebilir. Fibroblastlar göre daha yavaş çoğalırlar hücre tipleri için çok ilk hücre yoğun uygun küresel formasyonu 72 saatlik zaman dilimi içerisinde sağlamak gerekli olabilir. Hücreleri yok olmaya devam etmelidir bir asılı bırakın Kültür Kültür iken pulcuklarının medyada değiştirmek için yetersizlik nedeniyle 72 h daha uzun. İlk küresel boyutu farklılıkları doğal biyolojik değişkenlik nedeniyle beklenen; Biz bu değişkenliği küresel oluşumu hücre boyutu farklılıklarını mümkün olduğu kadar en aza indirmek için tutarlı bir dizi ile başlayan ve veri karşılaştırmaları için izin zamanla normalize adresi.
Bir asılı pulcuklarının transferi bu yöntemin uygulanması için birincil mücadeledir kültür pıhtı matris bırakın. Bu iletişim kuralı bir iğne ve şırınga ters Petri kabına kapak üzerinden küresel içeren damlacık Aspire için kullanır, ancak cımbız veya kesilmiş ipuçları için bağlı MİKROPİPETLER kullanıldığını gibi diğer yöntemler de etkili bir şekilde aktarmak için uygulanabilir damla matris için asılı üzerinden pulcuklarının. Pulcuklarının transfer güvenilir belgili tanımlık tenkıye pistonu çekerek geri biraz önce damlacığı aktarma ve böylece gaz kabarcıkları damlacık tanıttı değil damlacığı iğne yavaş yavaş çizilir olduğunu sağlayarak. Şırınga pistonu sadece geri iğne tüm damlacık getirecek kadar çekilmiş olmalıdır; geri çekme herhangi daha da Ayrıca kabarcıklar tanıtmak ve pulcuklarının güvenilir transfer iyi plaka kuyu içine müdahale. Özel asılı bırakın plakaları da küresel kültür basitleştirmek için kullanılabilir, ama sadece standart bir tabak kullanmaktan daha böylece bir daha az maliyet etkili anlamına gelir kültür.
Vivoşifa yara sırasında yara alan istila fibroblastlar fibrin matris düşmesine neden geniş serin proteaz üretmek. Bu hücreler daha sonra ağırlıklı olarak hasarlı doku tamiretmek için kollajen oluşan yeni hücre dışı matriks sentez. 23 hangi bizim yöntemi tarafından yakalanmış değil ve bir sınırlama sistemi gösteren kontrollü işgal için göç bu mekanizma sağlar. Ayrıca Bu yöntemde kullanılan fibroblastlar zaman içinde fibrin ağı küçük düşürmek proteaz salgılar dikkat edilmelidir; Bu nedenle, eğer uzun süreli (> 72 saat) geçiş çalışmaları gibi aprotinin, proteaz inhibitörleri hücre kültür ortamına eklenen istenilen.
Bu sınırlamaları rağmen bu yöntem hangi çalışmaya 3D geçiş vitrohücre basit, uygun maliyetli ve tekrarlanabilir bir yöntem sağlar. Daha yaygın olarak kullanılan 2D modelleri, büyüme analiz burada açıklanan 3D model daha fizyolojik ilgili bir ortam 2D modelleri tarafından sağlanan düz ön analiz korur sırada. Pulcuklarının basit aydınlık alan veya faz mikroskobu kullanarak görselleştirmek kolay ve istenirse, bu yöntem kolayca kullanılmak üzere Floresans mikroskobu fluorescently hücre zarlarında ve matriks proteinlerinin etiketleme tarafından değiştirilebilir. Bu protokol yapılan doku onarım/remodeling fibroblast göç rolü nedeniyle yenidoğan insan dermal fibroblastlar kullanın. İstenirse, nötrofiller, makrofajlar, keratinositler veya diğer hücre tipleri bu tahlil fibrin pıhtısı yapısındaki değişiklikler geçiş yara iyileşmesinde dahil diğer hücre tiplerinin nasıl etkiler değerlendirmek için kullanılabilir. 3D malzeme de karşılayacak biçimde değiştirilmiş; İstenen uygulamaya bağlı olarak, kollajen veya diğer 3D matris malzeme yerine fibrin matris fizyolojik ilgili bir model sağlamak için kullanılabilir. Daha uzun vadeli hücre geçiş bir yara benzeri ortamda çalışmak için uzun bir faydalı model bu iletişim kuralıyla lenfositi ve kollajen yerine fibroblastlar ve fibrin kullanarak elde edilebilir. Açıklanan yöntemler de daha fazla esneklik ve maliyet-etkililik hücre göç izin ve çalışmalar fizyolojik ilgili vitro manken uygulanması ile şifa yerine hemen vivo içinde çalışması gerektiren yara Klasik iki boyutlu vitro çalışmalar takip.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu iş için finansman Amerikan Kalp Derneği (16SDG29870005) ve North Carolina Devlet Üniversitesi Araştırma ve yenilik tohum finansman ile sağlandı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium, 4.5 g/L Glucose, w/ Sodium Pyruvate, w/out L-Glutamine | VWR | VWRL0148-0500 | DMEM already containing L-glutamine can also be used |
| 100mm Tissue Culture Dish, Non-Treated, Sterilized, Non-Pyrogenic | VWR | 10861-594 | Dishes of any size can be used for hanging drop culture |
| Fetal Bovine Serum from USDA approved countries, heat inactivated, sterile-filtered, cell culture tested | Sigma-Aldrich | 12306C-500ML | |
| L-glutamine | Fisher Scientific | ICN1680149 | Not needed if using DMEM that already contains L-glutamine |
| Penicillin-Streptomycin Solution stabilized, sterile-filtered, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | |
| Human Dermal Fibroblasts, neonatal | Thermo Fisher | C0045C | Can be replaced with other cell type of interest |
| 21 G x 1 1/2' needle | BD | 305167 | 22 G x 1 1/2 needles will also work |
| 1 mL syringe | VWR | 89174-491 | Syringes of any volume can be used |
| Cell Culture Multiwell Plates, Polystyrene, Greiner Bio-One (Individially Wrapped) (48 wells) | VWR | 82051-004 | |
| Human Fibrinogen - Plasminogen, von Willebrand Factor and Fibronectin Depleted | Enzyme Research Laboratories | FIB 3 | Can be replaced with matrix protein of interest |
| Human Alpha Thrombin | Enzyme Research Laboratories | HT 1002a | May not be necessary depending on matrix protein of interest |
| Equipment | |||
| BSL2 cell culture hood | |||
| Cell culture incubator | |||
| Inverted microscope with 10X objective | |||
| Centrifuge compatibile with 15 mL tubes |
References
- Chester, D., Brown, A. C. The role of biophysical properties of provisional matrix proteins in wound repair. Matrix Biol. , (2016).
- Martin, P., Leibovich, S. J. Inflammatory cells during wound repair: the good, the bad and the ugly. Trends in Cell Biology. 15 (11), 599-607 (2005).
- Lin, B., Yin, T., Wu, Y. I., Inoue, T., Levchenko, A. Interplay between chemotaxis and contact inhibition of locomotion determines exploratory cell migration. Nat Commun. 6, 6619 (2015).
- Ngalim, S. H., et al. Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy. J Vis Exp. (74), (2013).
- Charras, G., Sahai, E. Physical influences of the extracellular environment on cell migration. Nat Rev. Mol Cell Biol. 15 (12), 813-824 (2014).
- Petrie, R. J., Yamada, K. M. Fibroblasts Lead the Way: A Unified View of 3D Cell Motility. Trends Cell Biol. 25 (11), 666-674 (2015).
- Petrie, R. J., Gavara, N., Chadwick, R. S., Yamada, K. M. Nonpolarized signaling reveals two distinct modes of 3D cell migration. J Cell Biol. 197 (3), 439-455 (2012).
- Carlson, M. W., Dong, S., Garlick, J. A., Egles, C. Tissue-Engineered Models for the Study of Cutaneous Wound-Healing. Bioengineering Research of Chronic Wounds. , http://link.springer.com/chapter/10.1007/978-3-642-00534-3_12 263-280 (2009).
- Doyle, A. D., Wang, F. W., Matsumoto, K., Yamada, K. M. One-dimensional topography underlies three-dimensional fibrillar cell migration. J Cell Bio. 184 (4), 481-490 (2009).
- Fraley, S. I., et al. A distinctive role for focal adhesion proteins in three-dimensional cell motility. Nat Cell Biol. 12 (6), 598-604 (2010).
- Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Random versus directionally persistent cell migration. Nat Rev. Mol Cell Biol. 10 (8), 538-549 (2009).
- Rommerswinkel, N., Niggemann, B., Keil, S., Zänker, K. S., Dittmar, T. Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix. J Vis Exp. (92), (2014).
- Jonkman, J. E. N., et al. An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy. Cell Adh Migr. 8 (5), 440-451 (2014).
- Lämmermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).
- Chen, Z., Yang, J., Wu, B., Tawil, B. A Novel Three-Dimensional Wound Healing Model. J Dev Biol. 2 (4), 198-209 (2014).
- Ross, R., Benditt, E. P. Wound healing and collagen formation. The J Cell Biol. 12 (3), 533-551 (1962).
- Sproul, E. P., Argraves, W. S. A cytokine axis regulates elastin formation and degradation. Matrix Biol. 32 (2), 86-94 (2013).
- Almine, J. F., Wise, S. G., Weiss, A. S.
- Tracy, L. E., Minasian, R. A., Caterson, E. J. Extracellular Matrix and Dermal Fibroblast Function in the Healing Wound. Adv Wound Care. 5 (3), 119-136 (2016).
- Cox, S., Cole, M., Tawil, B. Behavior of Human Dermal Fibroblasts in Three-Dimensional Fibrin Clots: Dependence on Fibrinogen and Thrombin Concentration. Tissue Eng. 10 (5-6), 942-954 (2004).
- Brown, A. C., Barker, T. H. Fibrin-based biomaterials: Modulation of macroscopic properties through rational design at the molecular level. Acta Biomaterialia. 10 (4), 1502-1514 (2014).
- Bartosh, T. J., Ylostalo, J. H. Preparation of anti-inflammatory mesenchymal stem/precursor cells (MSCs) through sphere formation using hanging drop culture technique. Curr Protoc Stem Cell Biol. 28, Unit-2B.6 (2014).
- Bainbridge, P. Wound healing and the role of fibroblasts. J Wound Care. 22 (8), 410-412 (2013).
