Che caratterizzano la migrazione delle cellule all'interno del tridimensionale In Vitro ferita ambienti

L'obiettivo generale di questa procedura è osservare l'effetto di specifici trattamenti di interesse sulla migrazione cellulare in uno scaffold di fibrina tridimensionale associato alla ferita. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della guarigione delle ferite, su come le alterazioni nella struttura della rete di fibre influenzano la migrazione cellulare e i coaguli di fibrina nei siti delle ferite, il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce un metodo semplice e riproducibile per analizzare la migrazione cellulare all'interno dei coaguli di fibrina in 3D. In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché il trasferimento degli sferoidi può essere difficile.

Inizia riscaldando una fiala di fibroblasto dermico umano neonatale congelato in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Quando le cellule sono appena scongelate, raccoglierle mediante centrifugazione e risospendere il pellet in un terreno fresco di fibroblasti dermici umani neonatali a una concentrazione di 1 x 10 alla sesta cellula per millilitro. Quindi seminare le cellule in una fiaschetta di coltura T75 per un'incubazione di 72 ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.

Quando la coltura raggiunge l'80% di confluenza, staccare le cellule con cinque millilitri di tripsina EDTA. Dopo cinque minuti a 37 gradi Celsius, neutralizzare la tripsina con cinque millilitri di terreno riscaldato e mescolare 40 microlitri di cellule con il blu di tripano in un rapporto 1:1. Riservare un'aliquota di 10 microlitri di cellule per il conteggio.

Raccogliere le celle mediante centrifugazione e risospendere il pellet a una concentrazione di 1,25 x 10 alla 5a cella per millilitro. Quindi, impiattare il fondo di una capsula di Petri da 10 centimetri con cinque millilitri di PBS sterile. Quindi capovolgere il coperchio della capsula di Petri e aggiungere più gocce da 20 microlitri di sospensione cellulare sulla superficie interna del coperchio.

Quando tutte le gocce sono state posizionate, capovolgere nuovamente il coperchio sul piatto, facendo attenzione a non rimuovere le gocce pendenti e posizionare delicatamente il piatto in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per 72 ore. Al termine dell'incubazione, aggiungere 100 microlitri di soluzione di coagulo per sferoide per pozzetto, a una piastra da 48 pozzetti e agitare delicatamente e picchiettare la piastra per assicurarsi che la miscela di coagulo di fibrina ricopra l'intero pozzetto. Mettere la piastra nell'incubatrice per un'ora.

Quando lo strato di coagulo si è polimerizzato, confermare la presenza di sferoidi nella coltura a goccia sospesa, al microscopio ottico e trasferire la piastra a 48 pozzetti e la piastra di coltura a goccia sospesa in una cappa per coltura cellulare. Capovolgere con cautela il coperchio della capsula di Petri per accedere alle colture di gocce sospese e utilizzare una siringa da un millilitro dotata di un ago calibro 21, per trasferire una goccia in ciascun pozzetto rivestito di fibrina. Faccio molta attenzione quando aspiro e piastrino gli sferoidi, poiché la fase più difficile e critica del processo è trasferire gli sferoidi senza distruggerli.

Esaminare la piastra al microscopio per confermare che gli sferoidi siano stati seminati correttamente nei pozzetti appropriati. Sovrapporre delicatamente 100 microlitri di soluzione di coagulo appena preparata su ogni goccia contenente sferoidi e riesaminare gli sferoidi al microscopio, per confermare che siano ancora intatti e al centro di ogni pozzetto. Quindi rimettere la piastra a 48 pozzetti nell'incubatore per consentire la polimerizzazione del secondo strato di fibrina.

Dopo un'ora, trattare ogni pozzetto con 500 microlitri del terreno appropriato per il corrispondente gruppo di sferoidi sperimentali e rimettere la piastra nell'incubatore a 37 gradi Celsius. Ottenere immagini degli sferoidi mediante microscopia a campo chiaro ogni 24-72 ore, utilizzando una pila z per visualizzare sezioni trasversali successive della coltura cellulare 3D. Quindi, nel software di analisi delle immagini appropriato, tracciare il bordo della cella di ogni sferoide in ogni punto temporale successivo e utilizzare la funzione di misurazione per accedere all'aumento percentuale dell'area per ogni sferoide.

Dopo la loro coltura, nell'agente pro o anti-migratorio di interesse, le aree iniziali degli sferoidi possono essere determinate mediante imaging microscopico in campo chiaro e utilizzate come riferimento per determinare il grado di successiva crescita cellulare dai corpi sferoidi in ogni punto temporale successivo. In questo esperimento rappresentativo, gli sferoidi che sono stati esposti a un agente pro-migratorio, hanno mostrato un grado significativamente maggiore di migrazione lontano dal corpo sferoidale originale rispetto agli sferoidi esposti a un inibitore della migrazione o a un agente di controllo. Al contrario, gli sferoidi esposti a un agente anti-migratorio hanno mostrato un grado significativamente ridotto di migrazione lontano dal corpo sferoidale originale, rispetto agli sferoidi trattati con controllo.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in due ore e mezza, escluso il tempo di coltura cellulare, se eseguita correttamente. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come coltivare e incorporare sferoidi cellulari per saggi tridimensionali di migrazione cellulare in vitro. Seguendo questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi, come l'istologia e l'immunoistochimica, per rispondere a ulteriori domande su come la struttura della rete di fibrina all'interno del coagulo o l'allineamento dell'actina nelle cellule sferoidi corrispondano all'aumento o alla diminuzione della migrazione cellulare.

Non dimenticare che lavorare con colture cellulari e aghi può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come indossare i dispositivi di protezione adeguati e lavorare in una cappa di coltura sterile.