Che caratterizzano la migrazione delle cellule all'interno del tridimensionale In Vitro ferita ambienti

L'obiettivo generale di questa procedura è osservare l'effetto di trattamenti specifici di interesse sulla migrazione cellulare all'interno di una matrice tridimensionale di fibrina associata a una ferita. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della guarigione delle ferite, riguardo al modo in cui le alterazioni nella struttura della rete di fibre influenzano la migrazione cellulare nei coaguli di fibrina nei siti delle lesioni. Il principale vantaggio di questa tecnica è che fornisce un metodo semplice e riproducibile per analizzare la migrazione cellulare all'interno di coaguli di fibrina in 3D. In generale, le persone nuove a questo metodo potrebbero incontrare difficoltà, poiché il trasferimento degli sferoidi può risultare complesso.

Iniziare riscaldando una provetta contenente fibroblasti dermici umani neo-natali congelati in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Quando le cellule sono appena scongelate, raccoglierle mediante centrifugazione e risospendere il pellet in mezzo fresco per fibroblasti dermici umani neo-natali alla concentrazione di 1 x 10 alla sesta cellule per millilitro. Successivamente, seminare le cellule in una fiasca da coltura T75 per un'incubazione di 72 ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.

Quando la coltura raggiunge una confluenza dell'80%, staccare le cellule con cinque millilitri di tripsina EDTA. Dopo cinque minuti a 37 gradi Celsius, neutralizzare la tripsina con cinque millilitri di mezzo riscaldato e mescolare 40 microlitri di cellule con blu di tripano in rapporto 1:1. Riservare un'aliquota di 10 microlitri di cellule per il conteggio.

Raccogliere le cellule mediante centrifugazione e risospendere il pellet a una concentrazione di 1,25 x 10⁵ cellule per millilitro. Successivamente, aggiungere sul fondo di una piastra di Petri da 10 centimetri cinque millilitri di PBS sterile. Quindi capovolgere il coperchio della piastra di Petri e aggiungere diverse gocce da 20 microlitri di sospensione cellulare sulla superficie interna del coperchio.

Dopo aver posizionato tutte le gocce, reinserire con attenzione il coperchio al contrario sulla piastra, facendo attenzione a non spostare le gocce sospese, quindi posizionare delicatamente la piastra in un incubatore a 37 gradi celsius per 72 ore. Al termine dell'incubazione, aggiungere 100 microlitri di soluzione di coagulo per ogni sferoide in ogni pozzetto, in una piastra a 48 pozzetti, quindi agitare e battere delicatamente la piastra per assicurarsi che la miscela di coagulo di fibrina ricopra l'intero pozzetto. Posizionare la piastra in incubazione per un'ora.

Una volta che lo strato di coagulo si è polimerizzato, verificare la presenza di sferoidi nella coltura a goccia sospesa mediante microscopio ottico e trasferire la piastra a 48 pozzetti e la piastra per colture a goccia sospesa in una cappa a flusso laminare. Capovolgere con attenzione il coperchio della piastra di Petri per accedere alle colture a goccia sospesa e utilizzare una siringa da un millilitro dotata di un ago da 21 gauge per trasferire una goccia in ciascun pozzetto rivestito di fibrina. Presto particolare attenzione durante l'aspirazione e il posizionamento dei sferoidi, poiché il passaggio più delicato e critico del processo è il trasferimento dei sferoidi senza danneggiarli.

Esaminare la piastra al microscopio per verificare che gli sferoidi siano stati correttamente seminati nei pozzetti appropriati. Applicare delicatamente 100 microlitri di soluzione di coagulo appena preparata su ciascuna goccia contenente sferoidi ed esaminare nuovamente gli sferoidi al microscopio, per confermare che siano ancora integri e posizionati al centro di ogni pozzetto. Successivamente, rimettere la piastra a 48 pozzetti nell'incubatrice per permettere la polimerizzazione del secondo strato di fibrina.

Dopo un'ora, trattare ogni pozzetto con 500 microlitri del mezzo appropriato per il corrispondente gruppo sferoidale sperimentale e reinserire la piastra nell'incubatrice a 37 gradi Celsius. Ottenere immagini degli sferoidi mediante microscopia a campo chiaro ogni 24-72 ore, utilizzando uno stack z per visualizzare sezioni trasversali successive della coltura cellulare tridimensionale. Successivamente, mediante un software adeguato di analisi delle immagini, tracciare il bordo cellulare di ciascun sferoide in ogni punto temporale successivo e utilizzare la funzione di misura per determinare l'aumento percentuale della superficie per ciascun sferoide.

Dopo la coltura, in presenza dell'agente pro- o anti-migratorio di interesse, le aree iniziali degli sferoidi possono essere determinate mediante imaging microscopico in campo chiaro e utilizzate come riferimento per valutare il grado di espansione cellulare successiva dagli sferoidi a ogni punto temporale successivo. In questo esperimento rappresentativo, gli sferoidi esposti a un agente pro-migratorio hanno mostrato un grado significativamente maggiore di migrazione rispetto agli sferoidi esposti a un agente inibitore della migrazione o a un agente di controllo. Al contrario, gli sferoidi esposti a un agente anti-migratorio hanno mostrato un grado significativamente ridotto di migrazione rispetto agli sferoidi trattati con il controllo.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in due ore e mezza, escluso il tempo di coltura cellulare, se eseguita correttamente. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come coltivare e incorporare sferoidi cellulari per saggi tridimensionali di migrazione cellulare in vitro. Dopo aver seguito questa procedura, altri metodi come l'istologia e l'immunohistochimica possono essere eseguiti per rispondere ad ulteriori domande su come la struttura della rete di fibrina all'interno del coagulo o l'allineamento dell'actina nelle cellule dello sferoide corrispondano a un aumento o una diminuzione della migrazione cellulare.

Ricordare che lavorare con colture cellulari e aghi può essere estremamente pericoloso e che è sempre necessario adottare precauzioni, come indossare l'adeguata attrezzatura di protezione e operare in un'appaio asettica, durante l'esecuzione di questa procedura.