Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Metode for effektiv Refolding og rensing av Chemoreceptor Ligand bindende domene

Published: December 12, 2017 doi: 10.3791/57092
Automatic Translation
1,2, 1,2,3
1Infection and Immunity Program, Monash Biomedicine Discovery Institute, 2Department of Microbiology, Monash University, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, Monash University

Summary

En prosedyre er presentert for refolding dCACHE periplasmic ligand binding domenet av Campylobacter jejuni chemoreceptor Tlp3 fra inkludering organer og rensing å gi mg mengder protein.

Abstract

Identifikasjon av naturlige ligander chemoreceptors og strukturelle studier for utviklingen av molekylære grunnlaget for ligand spesifisitet kan være mye lettere ved produksjon av mg mengder rent, foldet ligand binding domener. Forsøk å uttrykke heterologously periplasmic ligand binding domener av bakteriell chemoreceptors i Escherichia coli (E. coli) ofte føre målrettingen i inkludering organer. Her vises en metode for protein utvinning fra inkludering organer, refolding og rensing, bruke periplasmic dCACHE ligand binding domenet Campylobacter jejuni (C. jejuni) chemoreceptor Tlp3 som et eksempel. Tilnærmingen innebærer uttrykket av proteinet rundt med en cleavable hans6-tag, isolasjon og urea-mediert solubilisation av inkludering organer, protein refolding urea uttømming og rensing med affinitet Ture, etterfulgt av tag fjerning og størrelse-utestenging kromatografi. Sirkulære dichroism spektroskopi brukes til å bekrefte foldet tilstanden til ren protein. Det har blitt demonstrert at denne protokollen er vanligvis nyttig for produksjon av mg mengder dCACHE periplasmic ligand binding domener av andre bakterielle chemoreceptors i en løselig og crystallisable form.

Introduction

Chemotaxis og motilitet har vist å spille viktige roller i Campylobacter jejuni patogenesen ved å fremme bakteriell kolonisering og invasjonen av verten1,2,3. Chemotaxis kan bakterier til et optimalt miljø for vekst, som styres av kjemiske signaler. Denne prosessen innebærer anerkjennelse av intracellulær og miljømessige kjemiske signaler av et sett med proteiner kalt chemoreceptors eller svinger-lignende proteiner (Tlps). De fleste chemoreceptors er membran-embedded proteiner med en extracytoplasmic ligand bindende domene (LBD), en transmembrane domene og en cytoplasmatiske signalerer domenet, som samhandler med signal cytosolic proteiner som overfører signalet til flagellar motorer4,5,6,7.

Elleve forskjellige chemoreceptors har blitt identifisert i C. jejuni genomet4,8. Noen av disse chemoreceptors har vist hittil og ligand spesifisiteten av Tlp19, Tlp310,11, Tlp411, Tlp712og Tlp1113 er kjent. Identifikasjon av naturlige ligander de gjenværende chemoreceptors i denne arten og mange chemoreceptors i andre bakterier, kan være mye lettere ved produksjon av brettet og svært ren rekombinant chemoreceptor LBDs14, 15 , 16. men forsøk på å heterologously express periplasmic LBDs av bakteriell chemoreceptors i Escherichia coli ofte føre målrettingen i inkludering organer17,18,19 . Likevel, dette fenomenet kan lette lett isolasjon og gjenoppretting av proteinet i hånden. Her vises en metode for protein utvinning fra inkludering organer, refolding og rensing, bruke den periplasmic LBD av C. jejuni chemoreceptor Tlp3 som et eksempel. Dette eksemplet ble valgt fordi Tlp3-LBD tilhører dCACHE familie20 sensing domener som finnes rikelig i to-komponent histidin kinaser og chemoreceptors i prokaryoter20,21, 22 , 23.

I denne uttrykket konstruksjon, basert på en pET151/D-TOPO vektor, er utformet for å innlemme en N-terminal hans6-merket, etterfulgt av en tobakk etse virus (TEV) protease cleavage nettsted, for etterfølgende kode fjerning19. Protokollen beskriver protein overuttrykte i E. coli, isolasjon og urea-mediert solubilisation av inkludering organer og protein refolding av urea uttømming. Etter refolding, prøven er renset ved affinitet Ture, med valgfri kode fjerning og størrelse-utestenging kromatografi. Foldet delstaten renset protein er bekreftet ved hjelp av sirkulære dichroism spektroskopi. Dette er en modifisert versjon av metoden som har blitt utviklet for å gjenopprette og rense LBD av en annen chemoreceptor, Helicobacter pylori TlpC19. Denne prosedyren, oppsummert i figur 1gir 10-20 mg av ren, ukodede Tlp3-LBD per 1 L bakteriell kultur, med protein renhet av > 90% som anslagsvis SDS-side.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. uttrykk for hans6-Tlp3-LBD i E. coli

  1. Vaksinere 150 mL steril Luria-Bertani (LB) buljong som inneholder 50 µg mL-1 ampicillin med BL21-Codon-Plus (DE3) - RIPL celler forvandlet med pET151/D-TOPO vektoren for uttrykk for hans6- Tlp3-LBD (aminosyre rester 42-291), og Inkuber det på 37 ° C i en shaker (bane diameter, 25 mm) med 200 rpm over natten.
  2. Forberede seks 2 L Erlenmeyer flasker med 800 mL steril LB buljong og 50 µg mL-1 ampicillin. Vaksinere hver kolbe med 20 mL av natten kultur fra trinn 1.1. Inkuber dem på 37 ° C med kontinuerlig rister på 200 rpm til optisk densitet ved 600 nm når 0,6.
  3. Ta en 1 mL aliquot fra en av flasker (uninduced kontroll prøven), pellets med en Borstemmaskin sentrifuge (13.000 x g, 4 ° C, 10 min) og kast nedbryting. Lagre den bakterielle pellet på 20 ° C for påfølgende SDS side analyse.
  4. Indusere protein uttrykk ved å legge 1 mM av isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG) til hver flasken kultur. Fortsette rugende flasker på 37 ° C i en shaker på 200 rpm en ekstra 4 h.
  5. Høste celler med sentrifugering 5000 x g i 15 min på 4 ° C og kast nedbryting.
    Merk: på dette punktet, prosedyren kan pauses ved å plassere celle pellet i-80 ° C fryser for lagring.

2. isolering og denaturering av inkludering organer

  1. Overføre alle cellen pellets innhentet i trinn 1.5 til en 250 mL kanne og legge 100 mL buffer A (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl). At cellene å tine helt (hvis frossen), og resuspend pellet. Holde prøven på is medmindre annet er opplyst.
  2. Pass resuspended cellene til en høytrykks homogeniser tre ganger til lyse cellene og sikre komplett klipping av genomisk DNA.
  3. Sentrifuge lysate på 10 000 x g i 15 min på 4 ° C. Samle et 1 mL utvalg av nedbryting (løselig brøkdel) og lagre den på 20 ° C for påfølgende SDS side analyse. Se bort fra resten av nedbryting og plasser pellet på is.
    Merk: Denne pellets er hvit i fargen (lett kan skilles fra ubrutt celler som er skyggen av brun farge) og inneholder inkludering organer.
  4. Resuspend inkludering organer pellet grundig i 20 mL iskald bufferen B (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.2 mM phenylmethanesulfonyl fluor (PMSF), 1% Triton X-100). Dette forenkler solubilisation membran og membran proteiner. Vortex i 1-2 min å hjelpe rørets.
  5. Sentrifuge prøven på 10.000 x g i 15 min på 4 ° C og kast nedbryting.
  6. Resuspend pellet grundig i 20 mL iskald bufferen B av vortexing røret i 1-2 min. sikre at pellet er brutt i små biter. Pipetter prøven opp og ned for å hjelpe pellet rørets.
    Merk: Det er viktig å resuspend pellets grundig for å få inkludering kropp fri for urenheter.
  7. Gjenta trinn 2.5. Hvis nedbryting skyet eller farget, Gjenta trinn 2.6 og 2.5 (i den rekkefølgen) til nedbryting er klar og fargeløs.
  8. Resuspend pellets i 20 mL iskald bufferen C (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.2 mM PMSF) av vortexing røret i 1-2 min.
  9. Gjenta trinn 2.5.
  10. Legg til 25 mL av iskalde denaturing buffer D (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 8 M urea, 10 mM dithiothreitol (DTT), 0.2 mM PMSF) å oppløse inkludering organer pellets. Resuspend grundig av vortexing i 1-2 min, eller til pellet er brutt i små biter.
  11. Blande suspensjon av aksial rotasjon med en rotasjon rate på 30 rpm for 30-120 minutter til 4 ° C.
  12. Avklare denaturert protein løsningen med sentrifugering 30.000 x g, 4 ° C i 30 min, plassere nedbryting på is og kast pellet.
  13. Måle protein konsentrasjonen med Bradford analysen. 24 ta en aliquot for SDS-gel analyse og plassere den på 20 ° C.
    Merk: på dette punktet, prosedyren kan pauses av snapin-frysing aliquoted prøven i flytende nitrogen og holde det ved-80 ° C for lagring.

3. protein Refolding

  1. Forberede 250 mL buffer E (3 M urea, 100 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.4 M L-arginine monohydrochloride, 20 mM redusert L-glutation, 2 mM oksidert L-glutathione) i et 500 mL beaker og kule bufferen til 4 ° C.
  2. Legge til 60 mg denaturert protein blanding som inneholder hans6-Tlp3-LBD fikk i trinn 2.13 til 250 mL buffer E, mens røring bufferen på 500 rpm. Inkuber refolding blandingen på 4 ° C med kontinuerlig omrøring på 500 rpm 24-48 h. Siste protein konsentrasjonen i dette trinnet er 0,2 mg mL-1.
  3. Forberede 7 L buffer A i en 8-10 L bøtte og avkjøle det ned 4 ° C i forberedelse til neste trinn (trinn 3.4) som vil skje i 24-48 h (se flytskjemaet i figur 1).
  4. Lev en ~ 50 cm stykke dialyse rør av 28 mm oppblåst diameter, med molekylvekt cut-off på 12-14 kDa i 200 mL 10 mM ethylenediaminetetraacetic syre disodium salt (EDTA-Na2) og varme den over gass varme til koking. Skyll dialyse membranen med 200 mL ddH2O.
  5. Klemme en ende av dialyse membranen med en dialyse rør nedleggelse og overføre den 250 mL refolding blanding fikk i trinn 3.2 i dialyse røret. Lukke den åpne enden med en annen bøyle. Kontroller integriteten til membranen å sikre det er ingen lekkasjer.
  6. Sett dialyse røret i en dialyse bøtte med pre-avkjølt 7 L av bufferen i trinn 3.3. Plass en magnetic røre bar, sikrer at det ikke vil ta dialyse slangen under omrøring.
  7. Dialyse prøven på 4 ° C med fortsette omrøring på 500 rpm og endre bufferen minst fire ganger over en periode på 12 h. Etter den siste endringen, la eksemplet dialyse over natten.
    Merk: Under dialyse, overskytende av urea (~ 3 M) gradvis fjernes fra denaturert protein løsning, som gir protein til refold. Tunge protein nedbør kan observeres på slutten av dialyse.
  8. Fjerne dialyse røret fra bøtte og overføre innholdet i et 500 mL beger. Holde protein løsningen på is, medmindre annet er opplyst.
  9. Filtrere protein løsningen gjennom en 0.43 µm pore størrelse membran i en 500 mL glassflaske fjerne alle utfelt protein.

4. rensing av hans6-merket Protein bruker Immobilised metall Ion affinitet kromatografi

  1. Lade og equilibrate en 5 mL ferdigpakkede chelaterande kolonne.
    1. Koble kolonnen til en peristaltiske pumpe, sikre at det er ingen luft fanget koble slangen.
    2. Vask kolonnen ved å passere gjennom 25-50 mL av ddH2O.
    3. Lade kolonnen ved lasting 3 mL 0.1 M NiCl2 og deretter passerer gjennom 25 mL av ddH2O.
    4. Equilibrate kolonnen med 25 mL bufferen F (lasting buffer, 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 500 mM NaCl, 20 mM imidazole).
  2. Justere refolded protein prøven oppnås i trinn 3.9 til sammensetningen av buffer F ved å legge 2,5 mL 1 M Tris-HCl pH 8.0, 25 mL av 5 M NaCl og 2,5 mL av 2 M imidazole lager løsninger.
  3. Laste inn prøven på kolonnen på en rate på 5 mL/min eller mindre og kast gjennomflytsenhet (ubundet proteiner).
  4. Vask kolonnen med 50-100 mL buffer F å fjerne nonspecifically bundet proteiner og kast gjennomflytsenhet.
  5. Elute hans6-Tlp3-LBD med 25 mL buffer G (elueringsrør buffer, 20 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 500 mM imidazole) og gjennomflytsenhet fraksjoner som inneholder protein (som bestemmes ved hjelp av Bradford reagensen).
  6. Måle protein konsentrasjonen i grupperte utvalget med Bradford analysen. Ta en liten aliquot for SDS side analyse og sted på 20 ° C.

5. hans6-merke fjerning ved hjelp av TEV Protease (valgfritt)

  1. Forberede, og kjøle ned 4 ° C, 4 L bufferen H (TEV cleavage buffer, 10 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% (v/v) glyserol, 2 mM DTT).
  2. Kuttet ca 5-7 cm dialyse rør (diameter 2-3 cm) og Dynk kjeden i 200 mL av ddH2O.
  3. Legge til hans6-merket TEV protease til hans6-tag protein forberedt i trinn 4.5 til siste molar forholdet 1 TEV: 8 protein.
  4. Klemme ene enden av slangen med en dialyse rør nedleggelse og fyll den med protein/TEV protease blandingen. Lukk den andre enden, og sikre det er ingen lekkasjer.
  5. Dialyse rør i pre-avkjølt 4 L bufferen H (fra trinn 5.1) og ruge det på 4 ° C med kontinuerlig stirring for 2 h. endre bufferen og fortsette dialyse over natten å tillate TEV-mediert cleavage reaksjonen å fullføre.
  6. I mellomtiden, forberede og kult (4 ° C) 4 L bufferen jeg (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% (v/v) glyserol) i forberedelse til neste dag.
  7. Etter natten dialyse, utveksle bufferen til bufferen jeg forberedt i trinn 5.6 og dialyse for en ytterligere 1-2 h på 4 ° C.
  8. Fjerne røret fra dialyse bøtte, unclip en ende av røret og overføre protein løsningen til en 50 mL Falcon rør. Filtrere løsningen gjennom filtere 0.43 µm pore størrelse sprøyten og holde det på is, med mindre annet er oppgitt.
  9. Måle volumet av prøven og justere Tris, NaCl og imidazole konsentrasjonen til sammensetningen av buffer F (f.eks for 25 mL av protein løsning i buffer J legge 0,25 mL 1 M Tris-HCl pH 8.0, 1,75 mL 5 M NaCl og 0,25 mL av 2 M imidazole).
  10. Forbered en 5 mL HiTrap chelaterande HP kolonne som beskrevet i trinn 4.1.
  11. Laste inn prøven på kolonnen (flyt: 5 mL/min) og samle gjennomflytsenhet, som inneholder ukodede Tlp3-LBD (rester 42-291). Uncleaved protein, i kløyvde hans6-koden og hans6- TEV beholdes etter kolonnen.
  12. Vask kolonnen med 5 mL buffer F (lasting buffer) for å tillate alle ukodede protein å strømme gjennom og samle eluate.
  13. Eluate fikk i trinn 5.11 og 5,12 og måle protein konsentrasjonen. Ta en liten aliquot og lagre den på 20 ° C for SDS side analyse.

6. størrelse-utestenging kromatografi (Gel filtrering) av Tlp3-LBD

  1. Forberede 1 L buffer A (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl) og filter bruker en 0.43 µm membran.
  2. Equilibrate en 26/60 størrelse-utestenging kolonne med buffer A ved en strømningshastighet på 4 mL/min.
  3. Konsentrere protein prøven fikk i trinn 5.13 til et volum på 3-4 mL, 15 mL sentrifugal konsentrator med en 10 kDa cut-off (4 ° C, 4000 x g).
  4. Avklare protein løsningen med sentrifugering 13.000 x g, 4 ° C i 30 min å fjerne alle utfelt protein.
  5. Laste inn prøven på kolonnen for pre equilibrated 26/60 gel-filtrering. Utføre Ture i buffer A ved en strømningshastighet på 4 mL/min. skjermen UV sporingen. Tlp3-LBD elutes med oppbevaring volum på 210-220 mL. Basseng peak fraksjoner.
  6. Måle protein konsentrasjonen. Ta en liten aliquot for SDS side analyse.

7. SDS-side analyse av prøver innsamlet på forskjellige stadier av renselse, Protein

  1. Forberede 1 L SDS side kjører buffer (buffer J), med 25 mM Tris og 250 mM glysin pH 8.3 0,1% (w/v) natrium dodecyl sulfate (SDS).
  2. Forberede 10 mL av 5 x SDS-lasting buffer (buffer K), inneholder 0,25 M Tris-HCl pH 6.8, 10% (w/v) SDS, 50% (v/v) glyserol, 1 mM DTT og 0,05% bromophenol blå.
  3. Kan dele samlet inn under de ulike trinnene i rensing (trinn 1.3, 2.3, 2.13, 4.6, 5.13, 6.6) å tine.
  4. For hver prøve, blande volumet tilsvarende 15 µg totale protein med 2 µL av 5 x SDS-lasting buffer, og juster volumet til 10 µL med ddH2O.
  5. Varme prøvene på 95 ° C i 5-10 min, spinne dem på 10.000 x g for 30 s og overføre prøvene i en ren rør.
  6. Forberede en SDS side gel, med 15% polyakrylamid skille gel (for 5 mL: 2,5 mL 30% (w/v) bis-akrylamid, 1,2 mL 1,5 M Tris-HCl pH 8,8, 1,2 mL ddH2O, 50 µL 10% (w/v) SDS, 50 µL 20% (w/v) ammonium persulfate (APS), 3 µL tetramethylethylenediamine (TEMED) og 5% polyakrylamid stabling gel (for 2 mL: 340 µL 30% (w/v) bis-akrylamid, 250 µL 1 M Tris pH 6.8, 1.37 mL ddH2O, 20 µL 10% (w/v) SDS, 20 µL 20% (w/v) APS, 2 µL TEMED).
  7. Montere geleelektroforese apparatet og fyll den med 1 x SDS siden kjører buffer per produsentens anbefaling.
  8. Laste inn en protein molekylvekt markør og prøvene i trinn 7.5. Utføre geleelektroforese på en konstant strøm av 25 mA.
  9. Overføre gel i en beholder og skyll den med ddH2O. legge 150 mL Coomassie blå flekker løsning med 25% (v/v) isopropanol, 10% (v/v) eddiksyre og 0,03% (w/v) briljant blå R-250. Plass beholderen på en horisontal rotasjon plattform for 30 min ved romtemperatur.
  10. Skyll gel med ddH2O og plasser i den destaining løsningen inneholder 5% (v/v) metanol og 7% (v/v) eddiksyre. Destain mens bruk en horisontal rotasjon plattform 1t.
  11. Bilde gel og analysere.

8. sirkulære Dichroism (CD) spektroskopi analyse av sekundær oppbygning refolded ren Protein

  1. Overføre 0,5 - 1 mg refolded protein fikk i trinn 6.6 inn i et dialyse rør og plassere den i en dialyse bøtte som inneholder 5 L bufferen L (50 mM natrium fosfat pH 7.4), forkjøles og lagres til 4 ° C. Dialyse prøven på 4 ° C med kontinuerlig omrøring og utføre minst 3-4 buffer endringer over 2-4 h før avreise eksemplet dialyse over natten.
  2. Konsentrere seg dialysed protein løsningen 0,06 mg mL-1 bruker en 10 kDa cut-off sentrifugal konsentrator.
  3. Avklare løsningen med sentrifugering 13.000 x g, 4 ° C i 30 min.
  4. Registrere langt-UV CD spekteret av prøven ved 25 ° C over en bølgelengde rekke 200-260 nm bruker en spectropolarimeter med en skanning hastighet på 20 nm min-1. Bruke dialyse bufferen som en tom kontroll. Gjenta opptak i tre eksemplarer og generere gjennomsnitt spekteret.
  5. Beregne sekundær innholdet av deconvoluting CD spectra bruke programmet CDSSTR fra DichroWeb Server25 (http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Rekombinant uttrykk for hans6-Tlp3-LBD i E. coli resulterte i protein avsettelse i inkludering organer. Uttrykket avkastningen fra 1 L bakteriell kultur beregnet i trinn 2.13 var ca 100 mg av hans6-Tlp3-LBD avsatt i inkludering organer. Protein isolasjon prosedyren beskrevet her og illustrert i figur 1, består av solubilisation av inkludering organer, protein refolding og rensing, affinitet Ture, fjerning av merker og størrelse-utestenging kromatografi , og gir 10-20 mg av ren, ukodede Tlp3-LBD per 1 L bakteriell kultur.

Protein elut fra kolonnen gel-filtrering som en enkel, symmetrisk topp tilsvarer et oppbevaring volum på 220 mL (figur 2A). Beregning av molekylvekt (MW) ved å bruke en kalibrering tomt Logg (MW) versus oppbevaring volum (Voppbevaring (mL) = 549.3-73.9 x log(MW)) tilgjengelig på webområdet EMBL Protein uttrykk og kjernen renseanlegget (http://www.embl.de/ pepcore/pepcore_services/protein_purification/chromatography/hiload26-0_superdex200/index.html), gitt verdien av 29 kDa. Denne verdien var svært nær beregnet fra aminosyresekvens (28.7 kDa), som foreslo at Tlp3-LBD er en monomer i løsningen.

For å evaluere en renselsesprosess, ble prøver samlet i forskjellige trinn vurdert SDS side analyse. Som vist i figur 2B, inkludering organer finnes hovedsakelig hans6-Tlp3-LBD. Små mengder av dette proteinet var også tilstede i løselig fraksjonen av indusert kultur (IPTG(+)), og i uninduced kultur (IPTG(-))-tilsynelatende som følge av lekk uttrykk for T7 utvalg. Hans6-Tlp3-LBD overført på polyakrylamid gel med en tilsynelatende molekylvekt av 28 kDa, som er nær verdien beregnet fra aminosyresekvens (31,8 kDa). I hans6-merke fjerning, affinitet kromatografi og gel filtrering skritt gitt svært ren protein (> 90% electrophoretic homogenitet).

Bekrefte at protein ved denne prosedyren var foldet, sekundær strukturen i hans6-Tlp3-LBD ble evaluert av CD spektroskopi. Estimering av α-helix og β arks innhold fra CD spekteret (Figur 3) bruker CDSSTR ga verdier av 31% α og 23% β. Disse verdiene ble nær dem som ble spådd fra sekvensen analyse med Jpred3 server (http://www.compbio.dundee.ac.uk/www-jpred/) (37% α og 26% β), som indikerer at protein fra urea-denaturert inkludering likene ble kastet.

Figure 1
Figur 1: skjematisk presentert metoden. Rekombinant hans6-Tlp3-LBD er expressd i E. coli ved induksjon med IPTG (se avsnitt 1). Etter 4 h uttrykk, bakterielle celler er høstet og lysed (se avsnitt 2). Uløselig brøken med inkludering likene (IB) er vasket fjerning av membran og membran proteiner urenheter, hvoretter IB oppløst i en buffer med urea på høy konsentrasjon (se avsnitt 2). Hans6-Tlp3-LBD er refolded av fortynning i buffer E etterfulgt av uttømmende dialyse for gradvis urea fjerning (del 3). Refolded hans6-Tlp3-LBD er så renset ved immobilisert metall ion affinitet kromatografi som beskrevet i Seksjon 4. I hans6-koden fjernes med TEV protease (del 5). Ukodede Tlp3-LBD er konsentrert og ytterligere renset ved gel filtrering kromatografi (inndelingen 6). Poeng for innsamling av prøver for SDS-side analyse er merket med *. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: rensing av rekombinant Tlp3-LBD. (A) størrelse-utestenging kromatografi spor av ukodede Tlp3-LBD på en Superdex 200 HiLoad 26/60 gel filtrering kolonne. Protein elut med oppbevaring volum på 220 mL. (B) redusert 15% SDS-side Coomassie blå-farget gel. M: protein molekylvekt penn; IPTG (-): uninduced kontroll prøven samlet i trinn 1.3; IPTG (+): løselig brøkdel etter IPTG induksjon (samlet i trinn 2.3); IB: isolert inkludering organer (trinn 2.13); Refolded hans6-Tlp3-LBD: refolded protein eksempel fra trinn 4.6; Ukodede Tlp3-LBD: protein eksempel fikk i trinn 5.13; Gel filtrering 1 og 2: to fraksjoner protein toppen elut fra kolonnen gel-filtrering (trinn 6.6). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: sirkulære dichroism spekter av renset rekombinant Tlp3-LBD. Spekteret ble innspilt ved 25 ° C i 50 mM natrium fosfat pH 7.4. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En enkel prosedyre for uttrykk og refolding fra inkludering likene av den periplasmic LBD av bakteriell chemoreceptor Tlp3 presenteres. Utarbeidelse av ren protein innebærer over uttrykk for pET-plasmider-kodet genet E. coli, rensing og solubilisation av inkludering organer, refolding denaturert protein og rensing sin av påfølgende affinitet og størrelse-utestenging kromatografi trinn. Den urea-tilrettelagt rødsprit og fortynning/dialyse-mediert refolding er kritisk trinnene i protokollen, optimalisering som er ofte nødvendig for å sikre riktig renaturation av proteinet avsatt i inkludering organer26.

Refolding av Tlp3-LBD ble oppnådd i en to-trinns måte, først ved å fortynne denaturert prøven inn i en buffer med urea, og deretter dialysing prøven mot en buffer uten den. Refolded protein får denne protokollen var funksjonelle og crystallisable18,23. Presentert metoden har imidlertid noen begrensninger. Det er kjent at carbamylation av amino skjer ofte når protein er denaturert og refolded i nærvær av urea27,28,29. Dette er på grunn av det faktum at oppløst urea dekomponerer med tid og produserer cyanate30 som reagerer med protein amino grupper å danne en stabil carbamylated produkt og, i mindre grad, med andre funksjonelle grupper31, 32. nedbryting av urea er akselerert under forhold med alkaliske pH og høy temperatur. Så det anbefales å gjøre fersk urea løsninger fra ultrapure (> 99%) solid reagens, og utfør refolding/dialyse trinn på lav temperatur (4 ° C)30,33, reduserer cyanate formasjon. Dessuten er velge bufferen som inneholder primære aminer, som Tris, glysin eller ammonium bikarbonat, for refolding blanding betydelig å tillate scavenging produsert cyanate29,33. Andre alternativet er å bruke guanidine hydroklorid i stedet for urea, som guanidine hydroklorid ikke er rapportert kjemisk endre proteiner.

I tillegg til urea, et reduksjonsmiddel (DTT eller β-mercaptoethanol) er ofte nødvendig å solubilize inkludering organer og for å hindre ikke-native intra- og intermolekylære disulfide obligasjoner dannelsen av opprettholde cystein rester i redusert tilstand26 ,34. Tlp3-LBD har en intramolekylære disulfide obligasjon, og i denne protokollen, 10 mM DTT ble innlemmet i inkludering organer rødsprit bufferen (trinn 2.10) å hjelpe rørets uløselig protein. DTT konsentrasjon ble deretter redusert med ~ 100 fold fortynne prøven i protein refolding buffer, etterfulgt av dialyse foranstaltningen å gradvis fjerne alle DTT. Det er viktig å merke seg at anvendelsen av denne prosedyren til refolding proteiner med flere disulfide obligasjoner må optimalisering av konsentrasjonen av både oksiderende og reduksjonsmidler (f.eks oksidert og redusert glutathione (GSSH/GSH), GSSH/DTT, cystamine/cysteamineor cystine/cystein) å fremme riktig dannelsen av disulfide broer34,35. Hvis protein rundt har unpaired cysteinene som ikke er involvert i disulfide obligasjon formasjon, bør videre et reduksjonsmiddel legges til alle rensing buffere. Prediksjon av de potensielle disulfidbroer fra aminosyresekvens av et protein kan utføres ved hjelp av flere i sili verktøy (f.eks cys_rec: http://linux1.softberry.com/berry.phtml?topic=cys_rec&group=programs& undergruppen = propt).

Bruk av presentert protokollen for rensing av ulike proteiner er også krever optimalisering av konsentrasjonen av imidazole under vask trinnet 4.4. Som vist i figur 2B (lane merket IB), isolerte inkludering likene inneholdt, i dette tilfellet, hovedsakelig protein av interesse. Hvis flere betydelig band er synlige på SDS siden gel på IB utvalget, øker imidazole konsentrasjonen i trinn 4.4 må fjerne forurensninger, men kan redusere protein avkastning36,37. Andre alternativet er å bruke en lineær forløpning imidazole konsentrasjon og basseng eluted fraksjoner som inneholder protein av interesse.

Det siste trinnet i rensing størrelse-utestenging Ture, gir midler til å samtidig anslå molekylær masse eluted partikler og utlede oligomeric staten av protein. Imidlertid er estimering av molekylære massen av størrelse-utestenging kromatografi bare nøyaktig for sfærisk molekyler, som ikke tilfelle for mange proteiner38,39. En kan bestemme protein molekylær masse og oligomeric tilstand med høyere nøyaktighet ved å bruke størrelse-utestenging kromatografi kombinert multi-Angle lysspredning (SEC-MALS)40 eller analytisk ultracentrifugation41. Vi har tidligere bekreftet at Tlp3-LBD er monomerisk i løsning ved hjelp av SEC-MALS analyse23, og resultatet er i samsvar med rapporter om andre dCACHE LBDs42,43.

Presentert protokollen, har i sin opprinnelige eller litt endret form, blitt brukt til refold og rense flere chemoreceptor LBDs fra dCACHE familien for X-ray krystallografisk studier17,18,19, 23 , 42 , 44. denne prosedyren kan være generelt nyttig for produksjon av mg mengder periplasmic LBDs av andre bakterielle chemoreceptors i en løselig og crystallisable form. I hvert separate tilfelle er protokollen optimalisering sannsynlig nødvendig. I tillegg til punktene beskrevet ovenfor, optimal solubilisation av inkludering organer og protein refolding kan kreve bruk av rengjøringsmidler (f.eks SDS eller N-acetyl trimethyl salmiakk), tilsetningsstoffer (f.eks L-arginine) og justering av konsentrasjon og inkubasjon tiden i individuelle refolding trinn26,34,45,46. Videre påvirker protein konsentrasjonen i refolding trinn betydelig refolding avkastningen. En rekke konsentrasjoner fra 1 ng mL-1 til 10 mg mL-1 bør generelt testes. Tlp3-LBD var optimal konsentrasjon av proteinet i refolding blandingen 0,2 mg mL-1.

Ekstremt lav refolding avkastning er vanligvis et tegn på at prøve refolding forholdene er langt fra optimal. Man kan forvente at høy avkastning er forenlig med en foldet protein, som kan valideres ved hjelp av CD spektroskopi (som beskrevet i denne fremgangsmåten). Videre crystallisability av resulterende protein kan sugguest protein's foldet tilstand. Alternativt kan en funksjonell analysen (hvis tilgjengelig) brukes til å bekrefte at protein er kastet. I Tlp3-LBD, for eksempel ble refolded protein vist å beholde sin ligand-bindende evne, som vist av isotermiske calorimetry. 23

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Vi takker Yu C. Liu for hans tidlige arbeide på Tlp3-LBD produksjon. Mayra A. Machuca er gjeld til Departamento Admistrativo de Ciencia, Tecnología e Innovación COLCIENCIAS om doktor stipend.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tris base AMRESCO 497
Sodium chloride (NaCl) MERK MILLIPORE 1064041000
Ampicillin G-BIOSCIENCES A051-B
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) MERCK 52332
Triton x-100 AMRESCO 694
Isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG) ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD AST0487
Urea AMRESCO VWRC0568
Dithiothreitol ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD C-1029
L-arginine monohydrochloride SIGMA-ALDRICH A5131
Reduced L-glutathione SIGMA-ALDRICH G4251
Oxidized L-glutathione SIGMA-ALDRICH G4376
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) SIGMA-ALDRICH 7558-79-4
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) SIGMA-ALDRICH 10049-21-5
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dehydrate (EDTA) AMRESCO VWRC20302.260
Imidazole SIGMA-ALDRICH I2399
Glycerol ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD BIOGB0232
Nickel chloride (NiCl2) SIGMA-ALDRICH 339350
Glycine AMRESCO VWRC0167
Sodium dodecyl sulfate (SDS) SIGMA-ALDRICH L4509
Unstained Protein Ladder, Broad Range (10-250 kDa) NEW ENGLAND BIOLABS P7703
Amicon Ultracel centrifugal concentrator (Millipore) MERCK UFC901096
50 mL Falcon tube FALCON BDAA352070
Dialysis tubing LIVINGSTONE INTERNATIONAL PTY Dialysis
Snakeskin dialysis tubing THERMO SCIENTIFIC™ 68100
Prepacked HiTrap Chelating HP column GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES 17-0408-01
EmulsiFlex-C5 high-pressure homogeniser AVESTIN EmulsiFlex™ - C5
Peristaltic Pump P-1 GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES 18-1110-91
Superdex 200 HiLoad 26/60 size-exclusion column  GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES 28989336
JASCO J-815 spectropolarimeter JASCO J-815

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dasti, J. I., Tareen, A. M., Lugert, R., Zautner, A. E., Gross, U. Campylobacter jejuni: a brief overview on pathogenicity-associated factors and disease-mediating mechanisms. Int J Med Microbiol. 300 (4), 205-211 (2010).
  2. Josenhans, C., Suerbaum, S. The role of motility as a virulence factor in bacteria. Int J Med Microbiol. 291 (8), 605-614 (2002).
  3. Morooka, T., Umeda, A., Amako, K. Motility as an intestinal colonization factor for Campylobacter jejuni. J Gen Microbiol. 131 (8), 1973-1980 (1985).
  4. Zautner, A. E., Tareen, A. M., Gross, U., Lugert, R. Chemotaxis in Campylobacter jejuni. Eur J Microbiol Immunol (Bp). 2 (1), 24-31 (2012).
  5. Zhulin, I. B. The superfamily of chemotaxis transducers: from physiology to genomics and back. Adv Microb Physiol. 45, 157-198 (2001).
  6. Fernando, U., Biswas, D., Allan, B., Willson, P., Potter, A. A. Influence of Campylobacter jejuni fliA, rpoN and flgK genes on colonization of the chicken gut. Int J Food Microbiol. 118 (2), 194-200 (2007).
  7. Salah Ud-Din, A. I., Roujeinikova, A. Methyl-accepting chemotaxis proteins: a core sensing element in prokaryotes and archaea. Cell Mol Life Sci. , (2017).
  8. Parkhill, J., et al. The genome sequence of the food-borne pathogen Campylobacter jejuni reveals hypervariable sequences. Nature. 403 (6770), 665-668 (2000).
  9. Hartley-Tassell, L. E., et al. Identification and characterization of the aspartate chemosensory receptor of Campylobacter jejuni. Mol Microbiol. 75 (3), 710-730 (2010).
  10. Rahman, H., et al. Characterisation of a multi-ligand binding chemoreceptor CcmL (Tlp3) of Campylobacter jejuni. PLoS Pathog. 10 (1), e1003822 (2014).
  11. Li, Z., et al. Methyl-accepting chemotaxis proteins 3 and 4 are responsible for Campylobacter jejuni chemotaxis and jejuna colonization in mice in response to sodium deoxycholate. J Med Microbiol. 63 (Pt 3), 343-354 (2014).
  12. Tareen, A. M., Dasti, J. I., Zautner, A. E., Gross, U., Lugert, R. Campylobacter jejuni proteins Cj0952c and Cj0951c affect chemotactic behaviour towards formic acid and are important for invasion of host cells. Microbiology. 156 (Pt 10), 3123-3135 (2010).
  13. Day, C. J., et al. A direct-sensing galactose chemoreceptor recently evolved in invasive strains of Campylobacter jejuni. Nat Commun. 7, 13206 (2016).
  14. McKellar, J. L., Minnell, J. J., Gerth, M. L. A high-throughput screen for ligand binding reveals the specificities of three amino acid chemoreceptors from Pseudomonas syringae pv. actinidiae. Mol. Microbiol. 96 (4), 694-707 (2015).
  15. Fernandez, M., Morel, B., Corral-Lugo, A., Krell, T. Identification of a chemoreceptor that specifically mediates chemotaxis toward metabolizable purine derivatives. Mol. Microbiol. 99 (1), 34-42 (2016).
  16. Corral-Lugo, A., et al. Assessment of the contribution of chemoreceptor-based signaling to biofilm formation. Environ. Microbiol. , (2015).
  17. Machuca, M. A., Liu, Y. C., Roujeinikova, A. Cloning, expression, refolding, purification and preliminary crystallographic analysis of the sensory domain of the Campylobacter chemoreceptor for aspartate A (CcaA). Acta Crystallogr F Struct Biol Commun. 71 (Pt 1), 110-113 (2015).
  18. Machuca, M. A., Liu, Y. C., Beckham, S. A., Roujeinikova, A. Cloning, refolding, purification and preliminary crystallographic analysis of the sensory domain of the Campylobacter chemoreceptor for multiple ligands (CcmL). Acta Crystallogr F Struct Biol Commun. 71 (Pt 2), 211-216 (2015).
  19. Liu, Y. C., Roujeinikova, A. Expression, refolding, purification and crystallization of the sensory domain of the TlpC chemoreceptor from Helicobacter pylori for structural studies. Protein Expr. Purif. 107, 29-34 (2015).
  20. Upadhyay, A. A., Fleetwood, A. D., Adebali, O., Finn, R. D., Zhulin, I. B. Cache Domains That are Homologous to, but Different from PAS Domains Comprise the Largest Superfamily of Extracellular Sensors in Prokaryotes. PLoS Comput. Biol. 12 (4), e1004862 (2016).
  21. Bardy, S. L., Briegel, A., Rainville, S., Krell, T. Recent advances and future prospects in bacterial and archaeal locomotion and signal transduction. J. Bacteriol. , (2017).
  22. Glekas, G. D., et al. The Bacillus subtilis chemoreceptor McpC senses multiple ligands using two discrete mechanisms. J. Biol. Chem. 287 (47), 39412-39418 (2012).
  23. Liu, Y. C., Machuca, M. A., Beckham, S. A., Gunzburg, M. J., Roujeinikova, A. Structural basis for amino-acid recognition and transmembrane signalling by tandem Per-Arnt-Sim (tandem PAS) chemoreceptor sensory domains. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 71 (Pt 10), 2127-2136 (2015).
  24. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  25. Whitmore, L., Wallace, B. A. Protein secondary structure analyses from circular dichroism spectroscopy: methods and reference databases. Biopolymers. 89 (5), 392-400 (2008).
  26. Singh, S. M., Panda, A. K. Solubilization and refolding of bacterial inclusion body proteins. J Biosci Bioeng. 99 (4), 303-310 (2005).
  27. Lippincott, J., Apostol, I. Carbamylation of cysteine: a potential artifact in peptide mapping of hemoglobins in the presence of urea. Anal Biochem. 267 (1), 57-64 (1999).
  28. Cejka, J., Vodrazka, Z., Salak, J. Carbamylation of globin in electrophoresis and chromatography in the presence of urea. Biochim Biophys Acta. 154 (3), 589-591 (1968).
  29. Sun, S., Zhou, J. Y., Yang, W., Zhang, H. Inhibition of protein carbamylation in urea solution using ammonium-containing buffers. Anal Biochem. 446, 76-81 (2014).
  30. Hagel, P., Gerding, J. J., Fieggen, W., Bloemendal, H. Cyanate formation in solutions of urea. I. Calculation of cyanate concentrations at different temperature and pH. Biochim Biophys Acta. 243 (3), 366-373 (1971).
  31. Volkin, D. B., Mach, H., Middaugh, C. R. Degradative covalent reactions important to protein stability. Mol Biotechnol. 8 (2), 105-122 (1997).
  32. Stark, G. R. Reactions of cyanate with functional groups of proteins. 3. Reactions with amino and carboxyl groups. Biochemistry. 4 (6), 1030-1036 (1965).
  33. Lin, M. F., Williams, C., Murray, M. V., Conn, G., Ropp, P. A. Ion chromatographic quantification of cyanate in urea solutions: estimation of the efficiency of cyanate scavengers for use in recombinant protein manufacturing. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 803 (2), 353-362 (2004).
  34. Fischer, B., Sumner, I., Goodenough, P. Isolation, renaturation, and formation of disulfide bonds of eukaryotic proteins expressed in Escherichia coli as inclusion bodies. Biotechnol Bioeng. 41 (1), 3-13 (1993).
  35. Vallejo, L. F., Rinas, U. Strategies for the recovery of active proteins through refolding of bacterial inclusion body proteins. Microb Cell Fact. 3 (1), 11 (2004).
  36. Porath, J. Immobilized metal ion affinity chromatography. Protein Expr Purif. 3 (4), 263-281 (1992).
  37. Bornhorst, J. A., Falke, J. J. Purification of proteins using polyhistidine affinity tags. Methods Enzymol. 326, 245-254 (2000).
  38. Stulik, K., Pacakova, V., Ticha, M. Some potentialities and drawbacks of contemporary size-exclusion chromatography. J Biochem Biophys Methods. 56 (1-3), 1-13 (2003).
  39. Kunji, E. R., Harding, M., Butler, P. J., Akamine, P. Determination of the molecular mass and dimensions of membrane proteins by size exclusion chromatography. Methods. 46 (2), 62-72 (2008).
  40. Folta-Stogniew, E. Oligomeric states of proteins determined by size-exclusion chromatography coupled with light scattering, absorbance, and refractive index detectors. Methods Mol Biol. 328, 97-112 (2006).
  41. Lebowitz, J., Lewis, M. S., Schuck, P. Modern analytical ultracentrifugation in protein science: a tutorial review. Protein Sci. 11 (9), 2067-2079 (2002).
  42. Machuca, M. A., Liu, Y. C., Beckham, S. A., Gunzburg, M. J., Roujeinikova, A. The Crystal Structure of the Tandem-PAS Sensing Domain of Campylobacter jejuni Chemoreceptor Tlp1 Suggests Indirect Mechanism of Ligand Recognition. J. Struct. Biol. 194 (2), 205-213 (2016).
  43. Rico-Jimenez, M., et al. Paralogous chemoreceptors mediate chemotaxis towards protein amino acids and the non-protein amino acid gamma-aminobutyrate. Mol. Microbiol. 88 (6), 1230-1243 (2013).
  44. Salah Ud-Din, A. I. M., Roujeinikova, A. The periplasmic sensing domain of Pseudomonas fluorescens chemotactic transducer of amino acids type B (CtaB): Cloning, refolding, purification, crystallization, and X-ray crystallographic analysis. Biosci. Trends. 11 (2), 229-234 (2017).
  45. Stockel, J., Doring, K., Malotka, J., Jahnig, F., Dornmair, K. Pathway of detergent-mediated and peptide ligand-mediated refolding of heterodimeric class II major histocompatibility complex (MHC) molecules. Eur J Biochem. 248 (3), 684-691 (1997).
  46. Cardamone, M., Puri, N. K., Brandon, M. R. Comparing the refolding and reoxidation of recombinant porcine growth hormone from a urea denatured state and from Escherichia coli inclusion bodies. Biochemistry. 34 (17), 5773-5794 (1995).

Tags

Biokjemi problemet 130 Chemotaxis chemoreceptor svinger som protein ligand sensing domene dCACHE refolding
Metode for effektiv Refolding og rensing av Chemoreceptor Ligand bindende domene
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Machuca, M. A., Roujeinikova, A.… More

Machuca, M. A., Roujeinikova, A. Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain. J. Vis. Exp. (130), e57092, doi:10.3791/57092 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter