Summary
Um procedimento é apresentado para o dobrar do domínio de ligação do ligante periplasmático dCACHE de Campylobacter jejuni chemoreceptor Tlp3 de corpos de inclusão e a purificação para produzir quantidades de miligrama de proteína.
Abstract
Identificação de ligantes naturais de quimiorreceptores e estudos estruturais destinados a elucidação da base molecular da especificidade ligante pode ser facilitada pela produção de quantidades de miligrama de domínios de ligação do ligante puro, dobrado. As tentativas de heterologously express domínios de ligação ligante periplasmático de quimiorreceptores bacterianas em Escherichia coli (e. coli) muitas vezes resultam em seu direcionamento em corpos de inclusão. Aqui, um método é apresentado para recuperação de proteína de corpos de inclusão, dobrar e purificação, usando o domínio de ligação do ligante dCACHE periplasmático de Campylobacter jejuni (c. jejuni) chemoreceptor Tlp3 como exemplo. A abordagem envolve a expressão da proteína de interesse com um cleavable seu6-tag, isolamento e solubilização mediada por ureia, de corpos de inclusão, proteína dobrar pela depleção de ureia e purificação através de cromatografia de afinidade, seguido por cromatografia de tamanho-exclusão e remoção de marca. A espectroscopia de Dicroísmo circular é usada para confirmar o estado dobrado da proteína pura. Foi demonstrado que este protocolo é geralmente útil para produção de quantidades de miligrama de domínios de ligação ligante periplasmático dCACHE de outros quimiorreceptor bacteriana na forma solúvel e crystallisable.
Introduction
Quimiotaxia e a motilidade foram mostrados para desempenhar um papel importante na patogênese de Campylobacter jejuni , promovendo a colonização bacteriana e a invasão do hospedeiro1,2,3. Quimiotaxia permite que as bactérias para avançar para um ambiente ideal para o crescimento, como guiado por sinais químicos. Esse processo envolve o reconhecimento de sugestões químicas intracelulares e ambientais por um conjunto de proteínas denominadas quimiorreceptor ou transdutor, como proteínas (TIPS). A maioria dos quimiorreceptores são proteínas de membrana-incorporado com um extracytoplasmic ligand binding domain (LBD), um domínio transmembrana e um domínio citoplasmático de sinalização, o último dos quais interage com as proteínas de sinalização citosólica que transmitem o sinal o flagelar motores4,5,6,,7.
Foram identificados onze quimiorreceptor diferentes do genoma de c. jejuni 4,8. Até à data, apenas alguns destes quimiorreceptores têm sido caracterizados e a especificidade de ligante de Tlp19, Tlp310,11, Tlp411, Tlp712e Tlp1113 é conhecida. Identificação de ligantes naturais dos restantes quimiorreceptor nesta espécie e numerosos quimiorreceptor em outras bactérias, pode ser facilitada pela produção de dobrada e altamente puro recombinante chemoreceptor LBDs14, 15 , 16. no entanto, as tentativas de heterologously express LBDs periplasmático de quimiorreceptores bacterianas em Escherichia coli muitas vezes resultam em seu direcionamento em corpos de inclusão17,18,19 . No entanto, este fenómeno pode facilitar fácil isolamento e recuperação da proteína na mão. Aqui, um método é apresentado para recuperação de proteína de corpos de inclusão, dobrar e purificação, usando o LBD periplasmático do c. jejuni chemoreceptor Tlp3 como exemplo. Este exemplo foi escolhido porque Tlp3-LBD pertence a família dCACHE20 de sensoriamento domínios que são encontrados abundantemente em dois-componente histidina quinases e quimiorreceptores em procariontes20,21, 22 , 23.
Nesta abordagem, a construção de expressão, com base em um vetor TOPO-pET151/D, foi projetada para incorporar um N-terminal dele6-etiqueta, seguido de um tabaco etch local de clivagem do protease do vírus (TEV), para marca subsequente remoção19. O protocolo descreve a superexpressão da proteína em e. coli, isolamento e solubilização de ureia-mediada de corpos de inclusão e proteína dobrar pela depleção de ureia. Após dobrar, a amostra é purificada por cromatografia de afinidade, com cromatografia de remoção e tamanho-exclusão opcional marca. O estado dobrado da proteína purificada é confirmado usando espectroscopia de Dicroísmo circular. Esta é uma versão modificada do método que foi desenvolvido anteriormente para recuperar e purificar o LBD de um chemoreceptor diferente, Helicobacter pylori TlpC19. Este procedimento, resumido na Figura 1, produz 10 a 20 mg de puro, sem marcas de formatação Tlp3-LBD por 1 L de cultura bacteriana, com uma pureza de proteína de > 90%, como estimado por SDS-PAGE.
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Protocol
1. a expressão de seu6-Tlp3-LBD em e. coli
- Inocular a 150 mL de caldo de Luria-Bertani (LB) estéril contendo 50 µ g ampicilina de-1 de mL com BL21-códon-Plus (DE3) - células RIPL transformadas com o vetor de pET151/D-TOPO para expressão de seu6- Tlp3-LBD (resíduos de aminoácidos 42-291), e -incube a 37 ° C em um shaker (diâmetro da órbita, 25mm) com 200 rpm durante a noite.
- Prepare-se seis Erlenmeyers de 2L contendo 800 mL de caldo estéril de LB e 50 µ g ampicilina de-1 mL. Inocule cada frasco com 20 mL de cultura durante a noite, Obtida de passo 1.1. -Incube a 37 ° C, com agitação contínua a 200 rpm até a densidade óptica em 600 nm atinge 0,6.
- Tomar um mL 1 alíquota de um dos frascos (amostra de controle uninduced), pelota utilizando uma centrífuga de bancada (13.000 x g, 4 ° C, 10 min) e descartar o sobrenadante. Armazene a pelota bacteriana a-20 ° C para posterior análise de SDS-PAGE.
- Induzi a expressão de proteínas adicionando 1 mM de isopropil-β-D-thiogalactoside (IPTG) para cada balão com cultura. Continue incubando os frascos a 37 ° C em uma coqueteleira a 200 rpm para um adicional 4 h.
- Recolher as células por centrifugação a 5.000 x g, durante 15 min a 4 ° C e descartar o sobrenadante.
Nota: neste ponto, o procedimento pode ser pausado, colocando o centrifugado em um freezer-80 ° C para armazenamento.
2. isolamento e desnaturação de corpos de inclusão
- Transferir todas as pelotas de célula obtidas na etapa de 1,5 para um copo de 250 mL e adicionar 100 mL de tampão A (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl). Permitir que as células descongelar completamente (se congelado) e resuspenda o pellet. Manter a amostra em gelo, salvo indicação em contrário.
- Passe as ressuspensa células através de um homogeneizador de alta pressão três vezes para lisar as células e assegurar a completa distorção do DNA genômico.
- Centrifugue o lisado a 10.000 x g, durante 15 min a 4 ° C. Recolher uma amostra de 1 mL do sobrenadante (fração solúvel) e armazená-lo a-20 ° C para posterior análise de SDS-PAGE. Descartar o resto do líquido sobrenadante e colocar a pelota no gelo.
Nota: Esta pelota é na cor branca (facilmente distinguíveis de células contínua, que são as tonalidades de marrom na cor) e contém corpos de inclusão. - Resuspenda o pellet de corpos de inclusão completamente em 20 mL de tampão gelada B (pH 10 mM Tris-HCl 8.0, fluoreto de phenylmethanesulfonyl de 0,2 mM (PMSF), 1% Triton X-100). Isto facilita a solubilização da membrana e proteínas da membrana. Vórtice para 1-2 min a ressuspensão de auxílio.
- Centrifugar a amostra a 10.000 x g, durante 15 min a 4 ° C e descartar o sobrenadante.
- Resuspenda o pellet em 20 mL de tampão gelada B vortexing o tubo para o 1-2 min.. Certifique-se de que a pelota é quebrada em pedaços pequenos. Pipetar o exemplo acima e para baixo para ajudar a ressuspensão de sedimento.
Nota: É importante resuspenda o pellet cuidadosamente, para se obter corpos de inclusão livres de impurezas. - Repita a etapa 2.5. Se o sobrenadante está nublado ou coloridos, repita os passos de 2.6 e 2.5 (nessa ordem) até que o sobrenadante é clara e incolor.
- Resuspenda o pellet em 20 mL de tampão gelada C (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0,2 mM PMSF) pela utilização do Vortex o tubo para o 1-2 min.
- Repita a etapa 2.5.
- Adicione 25 mL de tampão de desnaturação gelada D (pH 8.0, ureia de 8 M, 10 mM ditiotreitol (DTT), 0,2 mM PMSF de 10 mM Tris-HCl) para dissolver a pelota de corpos de inclusão. Resuspenda completamente vortexing para 1-2 min, ou até a pelota é quebrada em pedaços pequenos.
- Misture a suspensão por rotação axial com uma taxa de rotação de 30 rpm para 30 a 120 min a 4 ° C.
- Esclarecer a solução da proteína desnaturada por centrifugação a 30.000 x g, 4 ° C por 30 min, coloque o sobrenadante no gelo e descartar a pelota.
- Medir a concentração de proteína usando o ensaio de Bradford. 24 tomar uma alíquota para análise do gel de SDS e colocá-lo a-20 ° C.
Nota: neste ponto, o procedimento pode ser pausado por snap-congelamento em nitrogênio líquido a amostra aliquotada e mantê-lo a-80 ° C para armazenamento.
3. proteína dobrar
- Preparar 250 mL de tampão E (3M ureia, 100 mM Tris-HCl pH 8.0, 0,4 M monocloridrato de L-arginina, 20 milímetros reduzida L-glutationa, 2 L-glutationa oxidada milímetros) em um copo de 500 mL e arrefecer o buffer até 4 ° C.
- Adicionar 60 mg de mistura de proteína desnaturada contendo seu6-Tlp3-LBD obtido na etapa 2.13 a 250 mL de tampão E, agitando o buffer a 500 rpm. Incube a mistura redobramento em 4 ° C, com agitação contínua a 500 rpm por 24-48 h. A concentração de proteína final nesta etapa é 0,2 mg mL-1.
- Preparar 7 L de tampão A um balde de 8-10 L e resfriá-lo até 4 ° C, em preparação para o próximo passo (3.4) que terá lugar em 24-48 h (Veja o fluxograma na Figura 1).
- Mergulhe um pedaço de ~ 50 cm de tubo de diálise de diâmetro inflado de 28 mm, com peso molecular de corte em 12-14 kDa em 200 mL de sal de ácido dissódico 10mm ácido etilenodiaminotetracético (EDTA-at2) e aqueça-o em uma chama de gás até ferver. Lavar a membrana de diálise com 200 mL de DDQ2O.
- Prenda uma extremidade da membrana com um fechamento do tubo de diálise diálise e transferir a 250 mL de dobrar a mistura obtida na etapa 3.2 dentro do tubo de diálise. Feche a extremidade aberta com outra pinça. Verificar a integridade da membrana para garantir que não existem fugas.
- Coloque o tubo de diálise em um balde de diálise com o pre-cooled 7 L do tampão A preparada no passo 3.3. Coloque uma agitação magnética bar, garantindo que ele não vai tocar, agitando o tubo de diálise.
- Dialize a amostra a 4 ° C, com continua agitando a 500 rpm e alterar o buffer de pelo menos quatro vezes durante um período de 12 h. Após a última alteração de reserva, deixe a amostra para Dialize durante a noite.
Nota: Durante a diálise, o excesso de ureia (~ 3M) gradualmente é removido da solução proteína desnaturada, que permite que a proteína a redobrar. Precipitação de proteínas pesado pode ser observada no final da diálise. - Retire o tubo de diálise do balde e transferir seu conteúdo para um copo de 500 mL. Manter a solução de proteína no gelo, salvo indicação em contrário.
- Filtre a solução da proteína através de uma membrana de tamanho de poro de 0.43 µm em um frasco de vidro de 500 mL para remover qualquer proteína precipitada.
4. purificação de seu6-com a tag proteína usando cromatografia de afinidade do íon do Metal imobilizado
-
Cobrar e equilibrar uma coluna de quelantes pré-embalados de 5 mL.
- Conectar-se a coluna a uma bomba peristáltica, assegurando que não haja nenhum ar preso na tubulação de conexão.
- Lavar a coluna passando através de 25-50 mL de DDQ2O.
- Cobrar a coluna carregando 3 mL de 0.1 M NiCl2 e então passando através de 25 mL de DDQ2O.
- Equilibrar a coluna com 25 mL de tampão F (amortecedor do carregamento, 20 mM Tris-HCl pH 8.0, NaCl, imidazol de 20 mM a 500 mM).
- Ajuste a amostra de proteína reabertos obtida na etapa 3,9 para a composição do buffer F adicionando 2,5 mL de 1 M Tris-HCl pH 8.0, 25 mL de 5 M NaCl e 2,5 mL das soluções estoque de 2m imidazol.
- Carrega a amostra para a coluna em uma taxa igual ou inferior a 5 mL/min e descarte o escoamento (as proteínas unbound).
- Lave a coluna com 50-100 mL de buffer F para remover as proteínas não especificamente ligadas e descartar o escoamento.
- Eluir a6-Tlp3-LBD com 25 mL de tampão G (tampão de eluição, 20 mM Tris-HCl, NaCl, imidazol 500 mM a 500 mM) e pool de escoamento frações que contêm a proteína (conforme determinado pelo usando o reagente de Bradford).
- Medir a concentração de proteína na amostra em pool usando o ensaio de Bradford. Pegue uma pequena alíquota para análise de SDS-PAGE e lugar a-20 ° C.
5. seu6-marca remoção usando TEV Protease (opcional)
- Prepare-se e esfriar até 4 ° C, 4L de H de buffer (buffer de clivagem TEV, 10 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM de NaCl, 1% (v/v) glicerol, 2 mM DTT).
- Corte aproximadamente 5-7 cm de tubo de diálise (diâmetro de 2-3 cm) e mergulhe-a em 200 mL de DDQ2O.
- Adicionar seu6-com a tag protease do PEV para a sua6-proteína marca preparado na etapa 4.5 para uma relação molar final 1 TEV: proteína 8.
- Fixe uma extremidade do tubo com um fechamento do tubo de diálise e encha-o com a mistura de protease de proteína/TEV. Feche a outra extremidade e garantir que não existem fugas.
- Lugar a diálise do tubo para o pre-cooled 4 L de tampão H (da etapa 5.1) e incube-a 4 ° C, com contínua mexendo por 2 h. alterar o buffer e continuar a diálise durante a noite para permitir que a reação de clivagem mediada por TEV completar.
- Enquanto isso, prepare-se e legal (4 ° C) 4 L de tampão eu (pH 8.0, 150 mM de NaCl, 1% (v/v) glicerol de 10 mM Tris-HCl) em preparação para o dia seguinte.
- Após a diálise durante a noite, trocar o buffer para buffer que preparei na etapa 5.6 e Dialize para um mais 1-2 h a 4 ° C.
- Retire o tubo do balde a diálise, solte uma das extremidades do tubo e transferir a solução da proteína para um tubo Falcon de 50ml. Filtrar a solução através de um filtro de seringa de tamanho de poro de 0.43 µm e mantê-lo no gelo, salvo indicação em contrário.
- Medir o volume da amostra e ajustar a concentração de Tris, NaCl e imidazol para a composição do buffer F (por exemplo, para 25 mL de solução de proteína no buffer J adicionar 0,25 mL de 1 M Tris-HCl pH 8.0, 1,75 mL de 5 M NaCl e 0,25 mL de imidazol 2 M).
- Prepare uma coluna HiTrap quelantes HP de 5 mL, conforme descrito na etapa 4.1.
- Carregar a amostra na coluna (vazão: 5 mL/min) e coletar o escoamento, que contém a formatação Tlp3-LBD (resíduos 42-291). Proteína uncleaved, o clivada seu6-tag e seu6- PEV são retidos pela coluna.
- Lave a coluna com 5 mL de tampão F (tampão de carregamento) para permitir que todas as proteínas não marcas fluir e recolher o eluato.
- Piscina o eluato obtido nas etapas 5.11 e 5.12 e mede a concentração de proteína. Pegue uma pequena alíquota e armazená-lo a-20 ° C para análise de SDS-PAGE.
6. tamanho-exclusão cromatografia (Gel filtração) de Tlp3-LBD
- Preparar 1 L de tampão A (pH 8.0, 150 mM NaCl de 10 mM Tris-HCl) e filtrá-la usando uma membrana de 0.43 µm.
- Equilibrar uma coluna de tamanho-exclusão 26/60 com tampão A um débito de 4 mL/min.
- Concentre a amostra de proteína obtida na etapa 5.13 a um volume de 3-4 mL usando concentrador de centrífuga de 15 mL com um corte de kDa 10 (4 ° C, 4.000 x g).
- Esclarecer a solução da proteína por centrifugação a 13.000 x g, 4 ° C por 30 min remover qualquer proteína precipitada.
- Carrega a amostra para a coluna de filtração de gel de 26/60 pre-equilibrado. Realize a cromatografia em tampão A um débito de 4 mL/min. Monitor o rastreamento de UV. Tlp3-LBD elutes em um volume de retenção de 210-220 mL. As frações de pico da piscina.
- Medir a concentração de proteína. Pegue uma pequena alíquota para análise de SDS-PAGE.
7. SDS-PAGE de análise das amostras coletadas em vários estágios de purificação de proteínas
- Preparar 1 L de buffer de execução de SDS-PAGE (tampão J), contendo 25 mM Tris, 250mm glicina pH 8.3 e 0,1% (p/v) de sódio Dodecil sulfato (SDS).
- Prepare-se 10 mL de 5 x amortecedor do carregamento SDS-PAGE (tampão de K), contendo 0,25 M Tris-HCl pH 6,8, SDS 10% (p/v), 50% (v/v) glicerol, 1 milímetro DTT e 0,05% bromofenol azul.
- Permitir que as alíquotas recolhidas durante as diferentes etapas da purificação (etapas 1.3, 2.3, 2.13, 4.6, 5.13, 6.6) para descongelar.
- Para cada amostra, misturar o volume correspondente a 15 µ g de proteína total com 2 µ l de 5x SDS-PAGE de carregamento do buffer e ajuste o volume para 10 µ l com DDQ2O.
- Aquecer as amostras a 95 ° C por 5-10 min, girá-los a 10.000 x g, durante 30 s e transferência das amostras em um tubo limpo.
- Preparar um gel de SDS-PAGE, usando 15% de poliacrilamida separando o gel (para 30% (p/v) de 5 mL: 2,5 mL bis-acrilamida, 1,2 mL 1,5 M Tris-HCl pH 8.8, 1,2 mL ddH2O, 50 µ l 10% (p/v) SDS, 50 µ l 20% (p/v) de amônio persulfato (APS), 3 µ l tempted (TEMED) e poliacrilamida 5% gel de empilhamento (para 2 mL: 340 µ l 30% (p/v) bis-acrilamida, 250 µ l 1m pH do Tris 6,8, 1,37 mL ddH2O, 20 µ l 10% (p/v) SDS, 20 µ l 20% (p/v) APS, 2 µ l TEMED).
- Montar o aparelho de eletroforese e preenchê-lo com 1x SDS Página executando o buffer de acordo com a recomendação do fabricante.
- Carrega um marcador de peso molecular de proteínas e as amostras preparadas na etapa de 7,5. Realizar a eletroforese em uma corrente constante de 25 mA.
- Transferir o gel em um recipiente e lave-o com DDQ2O. Adicionar 150 mL de solução contendo isopropanol de 25% (v/v), ácido acético a 10% (v/v) e 0,03% (p/v) R-250 azul brilhante de coloração o azul de Coomassie. Coloque o recipiente sobre uma plataforma horizontal de rotação por 30 min à temperatura ambiente.
- Lave o gel com O ddH2e coloque na descoloração solução contendo 5% (v/v) de metanol e 7% (v/v) de ácido acético. Destain enquanto mistura usando uma plataforma de rotação horizontal por 1h.
- O gel de imagem e analisar.
8. circular Dicroísmo (CD) espectroscopia análise da estrutura secundária da proteína pura reabertos
- Transferência de 0,5 - 1 mg de proteína reaberta obtida na etapa 6.6 em um tubo de diálise e coloque-o em um balde de diálise contendo 5 L de tampão L (50mm de sódio fosfato pH 7,4), pré-resfriado a 4 ° C. Dialize a amostra a 4 ° C, com agitação contínua e realizar alterações de reserva de pelo menos 3-4 mais 2-4 h antes de deixar a amostra para Dialize durante a noite.
- Concentre a solução de dialysed de proteína para 0,06 mg mL-1 , usando um concentrador centrífugo de corte 10 kDa.
- Esclarecer a solução por centrifugação a 13.000 x g, 4 ° C por 30 min.
- Grave CD espectro UV distante da amostra a 25 ° C em um intervalo de comprimento de onda de 200-260 nm, utilizando um spectropolarimeter com uma taxa de varredura de 20 nm min-1. Use o buffer de diálise como um controle em branco. Repetir a gravação em triplicado e gerar o espectro em média.
- Calcular o teor de estrutura secundária por deconvoluting o CD usando o programa CDSSTR do DichroWeb de espectros cortar25 (http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk).
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Representative Results
Expressão recombinante de seu6-Tlp3-LBD em e. coli resultou na deposição de proteína em corpos de inclusão. O expressão rendimento de 1 L de cultura bacteriana, calculada na etapa 2.13 foi aproximadamente 100 mg de seu6-Tlp3-LBD depositado em corpos de inclusão. O procedimento de isolamento de proteína, aqui descrito e ilustrado na Figura 1, consiste a solubilização de corpos de inclusão, proteína dobrar e purificação, através de cromatografia de afinidade, remoção de marca e tamanho-exclusão cromatografia e produz 10 a 20 mg de puro, sem marcas de formatação Tlp3-LBD por 1 L de cultura bacteriana.
A proteína eluída da coluna gel filtração como um pico único e simétrico, correspondente a um volume de retenção de 220 mL (Figura 2A). Cálculo do peso molecular (MW), usando uma trama de calibração do log (MW) versus volume de retenção (Vretenção (mL) = 549.3-73,9 x log(MW)) disponível no site da expressão da proteína de EMBL e purificação Core Facility (http://www.embl.de/ pepcore/pepcore_services/protein_purification/Chromatography/hiload26-0_superdex200/index.html), rendeu o valor de 29 kDa. Este valor foi muito próximo ao calculado a partir da sequência de aminoácidos (28,7 kDa), que sugeriu que Tlp3-LBD é um monômero na solução.
Para avaliar o processo de purificação, as amostras coletadas em diferentes etapas foram avaliadas usando a análise de SDS-PAGE. Como mostrado na Figura 2B, corpos de inclusão predominantemente continha seu6-Tlp3-LBD. Pequenas quantidades de proteína também estiveram presentes na fração solúvel da cultura induzida (IPTG(+)) e na cultura do uninduced (IPTG(-)) – aparentemente como resultado da expressão gotejante do polymerase de T7. Seu6-Tlp3-LBD migrados sobre o gel de poliacrilamida com uma massa molecular aparente de 28 kDa, que é próximo do valor calculado a partir da sequência de aminoácidos (31,8 kDa). O seu6-tag remoção, cromatografia de afinidade e etapas de filtração rendidas altamente pura proteína do gel (> 90% eletroforética homogeneidade).
Para confirmar que a proteína obtida por este procedimento foi dobrado, a estrutura secundária da sua6-Tlp3-LBD foi avaliada por espectroscopia de CD. Estimativa do α-hélice e folha β conteúdo do CD espectro (Figura 3) usando CDSSTR deu valores de β α e 23% de 31%. Estes valores foram próximos aos previsto a partir da análise de sequência usando o servidor de Jpred3 (http://www.compbio.dundee.ac.uk/www-jpred/) (β α e 26% 37%), indicando que a proteína recuperada os corpos de inclusão de ureia desnaturado foi dobrada.
Figura 1: esquemático do método apresentado. Recombinante seu6-Tlp3-LBD é expressd em e. coli após indução com IPTG (ver seção 1). Após a expressão de 4h, as células bacterianas são colhidas e lysed (ver secção 2). A fração insolúvel contendo os corpos de inclusão (IB) é lavada para a remoção da membrana e impurezas de proteínas de membrana, após o qual o IB são dissolvidos em um buffer que contém ureia em concentração elevada (ver secção 2). Seu6-Tlp3-LBD é dobrado por diluição em buffer E seguida pela diálise exaustiva para remoção gradual de ureia (secção 3). Novamente seu6-Tlp3-LBD é então purificado por cromatografia de afinidade imobilizada do íon do metal, conforme descrito na seção 4. O seu6-tag é removido usando a protease do PEV (secção 5). Sem marcas de formatação Tlp3-LBD é concentrada e mais purificada por cromatografia de gel filtração (secção 6). Pontos de recolha de amostras para análise de SDS-PAGE são indicados com *. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: purificação de recombinante Tlp3-LBD. (A) vestígio de cromatografia de exclusão-tamanho de Tlp3-LBD sem marcas de formatação em uma coluna de filtração de gel de Superdex 200 HiLoad 26/60. A proteína eluída com um volume de retenção de 220 mL. (B) reduziu 15% gel de SDS-PAGE Coomassie azul manchado. M: marcador de peso molecular da proteína; IPTG (-): amostra de controlo uninduced coletados na etapa 1.3; IPTG (+): fração solúvel após a indução de IPTG (coletada na etapa 2.3); IB: corpos de inclusão isolados (etapa 2.13); Novamente seu6-Tlp3-LBD: amostra de proteína reabertos da etapa 4.6; Não Marcado Tlp3-LBD: amostra de proteína obtida na etapa 5.13; Gel filtração 1 e 2: duas frações do pico proteína eluída da coluna de gel filtração (etapa 6.6). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: espectro de Dicroísmo Circular de purificado recombinante Tlp3-LBD. O espectro foi gravado a 25 ° C em 50 milímetros de sódio fosfato pH 7,4. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Um procedimento simples para a expressão e dobrar de corpos de inclusão do LBD periplasmático da chemoreceptor bacteriana Tlp3 é apresentado. Preparação da proteína pura envolve sobre-expressão do gene do animal de estimação-plasmídeo-codificado em e. coli, purificação e solubilização de corpos de inclusão, dobrar de proteína desnaturada e sua purificação por afinidade a consecutivos e etapas da cromatografia de exclusão de tamanho. A desnaturação de ureia-facilitado e diluição/diálise-mediada dobrar são os passos críticos no protocolo, optimização dos quais geralmente é necessário para garantir a adequada renaturalização da proteína depositada em corpos de inclusão26.
Dobrar de Tlp3-LBD foi conseguido de forma em duas etapas, primeiro diluindo a amostra desnaturada em um buffer que contém ureia e depois por dialysing a amostra contra um buffer desprovido de la. A proteína reaberta obtida usando este protocolo era funcional e crystallisable18,23. No entanto, o método apresentado tem algumas limitações. É sabido que carbamylation dos grupos aminoácidos geralmente ocorre quando a proteína é desnaturada e novamente na presença de ureia27,28,29. Isto é devido ao fato de que o dissolvidos ureia decompõe-se com o tempo e produz cianato30 que reage com os grupos amino de proteínas para formar um produto estável carbamylated e, em menor grau, com outros grupos funcionais31, 32. a decomposição da ureia é acelerada sob condições de pH alcalino e temperatura elevada. Então, é recomendável fazer soluções de ureia fresco de ultrapura (> 99%) reagente sólido e execute as etapas de dobrar/diálise em baixa temperatura (4 ° C)30,33, para diminuir a formação de cianato. Além disso, escolher o buffer que contém aminas primárias, tais como Tris, glicina ou bicarbonato de amônio, para mistura redobramento é importante para permitir a eliminação do cianato produzidos29,33. Outra opção é usar o cloridrato de guanidina ao invés de ureia, como cloridrato guanidina não foi relatado para modificar quimicamente proteínas.
Além de ureia, um agente redutor (DTT ou β-Mercaptoetanol) é muitas vezes necessário para solubilizar os corpos de inclusão e evitar a não-nativas intrae intermolecular dissulfeto títulos de formação, mantendo os resíduos de cisteína em seu estado reduzido26 ,34. Tlp3-LBD tem uma ligação de dissulfeto intramoleculares e no presente protocolo, 10 mM DTT foi incorporado o buffer de desnaturação de corpos de inclusão (passo 2.10) para auxiliar a ressuspensão da proteína insolúvel. Concentração de TDT então foi reduzida em ~ 100 dobra diluindo a amostra para a proteína reenovelamento buffer, seguido por etapa a diálise para remover gradualmente todos os TDT. É importante notar que a aplicação deste procedimento para o dobrar de proteínas com várias ligações de bissulfeto pode precisar de otimização da concentração de oxidantes e agentes redutores (por exemplo, oxidado e reduzido a glutationa (GSH/GSSH), GSSH/DTT, cystamine/cysteamineor cistina/cisteína) promover a formação adequada de dissulfeto pontes34,35. Além disso, se a proteína de interesse tem desirmanada cisteínas que não estão envolvidas na formação de ligação dissulfeto, um agente redutor deve ser adicionado para todos os buffers de purificação. Previsão das pontes dissulfeto potencial da sequência de aminoácidos de uma proteína pode ser realizada usando diversos in silico ferramentas (por exemplo, cys_rec: http://linux1.softberry.com/berry.phtml?topic=cys_rec&group=programs& subgrupo = propt).
O uso do protocolo apresentado para a purificação de proteínas diferentes é também provável que exigem otimização da concentração de imidazol durante a etapa de lavagem 4.4. Como mostrado na Figura 2B (lane rotulado IB), os corpos de inclusão isolados contidos, neste caso, predominantemente da proteína de interesse. Se adicionais significativas bandas são visíveis em SDS-PAGE gel da amostra IB, aumentando a concentração de imidazole na etapa 4.4 será necessário para remover os contaminantes, mas pode reduzir o rendimento de proteína36,37. Outra opção é aplicar um gradiente linear de concentração de imidazol e piscina eluted frações que contêm a proteína de interesse.
A etapa final na purificação, cromatografia de exclusão de tamanho, fornece os meios para estimar a massa molecular das partículas eluted e derivar o estado oligoméricos da proteína simultaneamente. No entanto, estimativa da massa molecular pela cromatografia de exclusão-tamanho só é exata para moléculas esféricas, que não é o caso de muitas proteínas38,39. Um pode determinar a proteína massa molecular e oligoméricos estado com maior precisão, usando cromatografia de exclusão de tamanho, acoplado ao multi-ângulo de espalhamento de luz (SEC-MALS)40 ou ultracentrifugação analítica41. Anteriormente, confirmamos que Tlp3-LBD é monomérica em solução usando análise de SEC-MALS23, e este resultado é consistente com os relatórios sobre outro dCACHE LBDs42,43.
O protocolo apresentado, na sua forma original ou pouco modificada, tem sido usado para redobrar e purificar vários chemoreceptor LBDs da família dCACHE para raio x estudos cristalográficos17,18,19, 23 , 42 , 44. este procedimento pode ser útil em geral para a produção de quantidades de miligrama de LBDs periplasmático de outros quimiorreceptor bacteriana na forma solúvel e crystallisable. Em cada caso em separado, otimização de protocolo é provavelmente necessário. Além dos pontos discutidos acima, solubilização ideal de corpos de inclusão e proteína dobrar pode exigir a utilização de detergentes (por exemplo, SDS ou N-acetil trimetil cloreto de amônio), aditivos (por exemplo, L-arginina) e ajuste do seu tempo de concentração e incubação no indivíduo dobrar passos26,34,,45,46. Além disso, a concentração de proteína na etapa redobramento afeta significativamente o rendimento redobramento. A gama de concentrações de 1 ng mL-1 a 10 mg mL-1 geralmente deve ser testada. Para Tlp3-LBD, a concentração ideal de proteínas na mistura redobramento foi 0,2 mg mL-1.
Extremamente baixo rendimento redobramento é geralmente um sinal de que o julgamento redobramento condições estão longe de ser ideal. Pode-se esperar de alto rendimento que é consistente com uma proteína dobrada, que pode ser validada usando espectroscopia de CD (conforme descrito neste procedimento). Além disso, crystallisability da proteína resultante pode sugguest estado dobrado da proteína. Alternativamente, um ensaio funcional (se disponível) pode ser usado para confirmar que a proteína é dobrada. No caso de Tlp3-LBD, por exemplo, a proteína reaberta foi mostrada para manter sua capacidade de ligação de ligante, como mostrado por calorimetria isotérmica. 23
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Disclosures
Os autores declaram não concorrentes interesses financeiros.
Acknowledgments
Agradecemos seus primeiros trabalhos sobre a produção de Tlp3-LBD-Yu C. Liu. Mayra A. Machuca está em dívida com o Departamento Admistrativo de Ciencia, Tecnología e Innovación COLCIENCIAS para uma bolsa de doutorado.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris base | AMRESCO | 497 | |
| Sodium chloride (NaCl) | MERK MILLIPORE | 1064041000 | |
| Ampicillin | G-BIOSCIENCES | A051-B | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | MERCK | 52332 | |
| Triton x-100 | AMRESCO | 694 | |
| Isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG) | ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD | AST0487 | |
| Urea | AMRESCO | VWRC0568 | |
| Dithiothreitol | ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD | C-1029 | |
| L-arginine monohydrochloride | SIGMA-ALDRICH | A5131 | |
| Reduced L-glutathione | SIGMA-ALDRICH | G4251 | |
| Oxidized L-glutathione | SIGMA-ALDRICH | G4376 | |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | SIGMA-ALDRICH | 7558-79-4 | |
| Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) | SIGMA-ALDRICH | 10049-21-5 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dehydrate (EDTA) | AMRESCO | VWRC20302.260 | |
| Imidazole | SIGMA-ALDRICH | I2399 | |
| Glycerol | ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD | BIOGB0232 | |
| Nickel chloride (NiCl2) | SIGMA-ALDRICH | 339350 | |
| Glycine | AMRESCO | VWRC0167 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | SIGMA-ALDRICH | L4509 | |
| Unstained Protein Ladder, Broad Range (10-250 kDa) | NEW ENGLAND BIOLABS | P7703 | |
| Amicon Ultracel centrifugal concentrator (Millipore) | MERCK | UFC901096 | |
| 50 mL Falcon tube | FALCON | BDAA352070 | |
| Dialysis tubing | LIVINGSTONE INTERNATIONAL PTY | Dialysis | |
| Snakeskin dialysis tubing | THERMO SCIENTIFIC™ | 68100 | |
| Prepacked HiTrap Chelating HP column | GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES | 17-0408-01 | |
| EmulsiFlex-C5 high-pressure homogeniser | AVESTIN | EmulsiFlex™ - C5 | |
| Peristaltic Pump P-1 | GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES | 18-1110-91 | |
| Superdex 200 HiLoad 26/60 size-exclusion column | GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES | 28989336 | |
| JASCO J-815 spectropolarimeter | JASCO | J-815 |
References
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