Summary
En procedur presenteras för att vika av dCACHE periplasmic ligand bindande domän Campylobacter jejuni chemoreceptor Tlp3 från organ i inkludering och rening till avkastning milligram mängder protein.
Abstract
Identifiering av naturliga ligander kemoreceptorer och strukturella studier syftar till att klarlägga den molekylära basen för ligand specificitet kan underlättas avsevärt av produktionen av milligram mängder ren, vikta ligand bindande domäner. Försök att heterologously express periplasmic ligand bindande domäner av bakteriell kemoreceptorer i Escherichia coli (E. coli) ofta leder till sin inriktning i inkludering kroppar. Här presenteras en metod för protein återhämtning från inkludering organ, dess vika och rening, med periplasmic dCACHE ligand bindande domän Campylobacter jejuni (C. jejuni) chemoreceptor Tlp3 som exempel. Metoden innebär uttryck av proteinet av intresse med en cleavable hans6-tagg, isolering och urea-medierad vävnadsupplösning inkludering organ, protein vika av urea utarmning och rening genom affinitetskromatografi, följt av taggen borttagning och storlek-utslagning kromatografi. Den cirkulärdichroism spektroskopin används för att bekräfta den vikta delstaten det rent proteinet. Det har visats att detta protokoll är allmänt användbara för produktion av milligram belopp av dCACHE periplasmic ligand bindande domänerna i andra bakteriella kemoreceptorer i lösliga och kristalliserbart form.
Introduction
Kemotaxis och motilitet har visat att spela viktiga roller i Campylobacter jejuni patogenes genom att främja bakteriell kolonisering och invasion av värd1,2,3. Chemotaxis tillåter bakterierna att närma sig en optimal miljö för tillväxt, som styrs av kemiska signaler. Denna process innebär erkännande av intracellulära och miljömässiga kemiska signaler genom en uppsättning av proteiner som kallas kemoreceptorer, eller givare-liknande proteiner (Tlps). De flesta kemoreceptorer är membran-inbäddade proteiner med en extracytoplasmic ligand bindande domän (LBD), en transmembrana domän och en cytoplasmiska signalering domän, den senare som interagerar med de cytosoliska signalering proteiner som sänder signalen till flagellar motorer4,5,6,7.
Elva olika kemoreceptorer har identifierats i C. jejuni genomet4,8. Hittills har endast några av dessa kemoreceptorer präglats och ligand specificitet Tlp19, Tlp310,11, Tlp411, Tlp712och Tlp1113 är känd. Identifiering av naturliga ligander de återstående kemoreceptorer i denna art, och talrika kemoreceptorer i andra bakterier, kan underlättas avsevärt genom produktion av vikta och högt rena rekombinant chemoreceptor LBDs14, 15 , 16. men försök att heterologously express periplasmic LBDs av bakteriell kemoreceptorer i Escherichia coli ofta resultera i deras inriktning till inkludering organ17,18,19 . Dock kan detta fenomen underlätta lätt isolering och återvinning av protein i hand. Här presenteras en metod för protein återhämtning från organ i inkludering, vika och rening, med den periplasmic LBD av C. jejuni chemoreceptor Tlp3 som exempel. Detta exempel valdes eftersom Tlp3-LBD tillhör den dCACHE familjära20 fjärranalys domäner som finns rikligt i tvåkomponents histidin kinaser och chemoreceptors i prokaryoter20,21, 22 , 23.
I denna strategi, den uttryck bygga, baserat på en pET151/D-TOPO vektor, har utformats för att införliva en N-terminal hans6-etiketten följt av en tobak etch virus (TEV) proteas klyvning webbplats, för efterföljande tagg borttagning19. Protokollet beskrivs protein överuttryck i E. coli, isolering och urea-medierad vävnadsupplösning av inkludering kroppar och protein vika av urea utarmning. Efter vika, provet renas genom affinitetskromatografi, med valfri tagg borttagning och storlek-utslagning kromatografi. Vikta staten av renat protein bekräftas med cirkulärdichroism spektroskopi. Detta är en modifierad version av den metod som tidigare har utvecklats för att återställa och rena LBD av en olika chemoreceptor, Helicobacter pylori TlpC19. Detta förfarande, sammanfattas i figur 1, räntor 10-20 mg ren, otaggade Tlp3-LBD per 1 L av bakterieodling, med en renhet som proteinet > 90% som uppskattade av SDS-PAGE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. redovisning av hans6-Tlp3-LBD i E. coli
- Inokulera 150 mL steril Luria-Bertani (LB) buljong som innehåller 50 µg mL-1 ampicillin med BL21-kodon-Plus (DE3) - RIPL celler omvandlas med den pET151/D-TOPO vektorn uttryck för hans6- Tlp3-LBD (aminosyra rester 42-291), och Inkubera det vid 37 ° C i en shaker (bana diameter, 25 mm) med 200 rpm över natten.
- Förbereda sex 2 L Erlenmeyer-kolvar som innehåller 800 mL steril LB buljong och 50 µg mL-1 ampicillin. Inokulera varje kolv med 20 mL av övernattning kultur erhållits från steg 1,1. Inkubera dem vid 37 ° C under ständig skakning på 200 rpm tills den optiska densiteten vid 600 nm når 0,6.
- Ta en 1 mL alikvotens från en av kolvar (uninduced kontrollprov), pellets använder en bänkmonterade centrifug (13 000 x g, 4 ° C, 10 min) och Kassera supernatanten. Lagra den bakteriella pelleten vid-20 ° C för efterföljande SDS-PAGE analys.
- Inducera proteinuttryck genom att lägga till 1 mM av isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG) till varje kolv med kultur. Fortsätt ruvning kolvar vid 37 ° C i en shaker på 200 rpm för en ytterligare 4 h.
- Skörda cellerna genom centrifugering vid 5 000 x g i 15 minuter vid 4 ° C och kasta bort supernatanten.
Obs: vid denna punkt, förfarandet kan pausas genom att placera cellpelleten i-80 ° C frys för förvaring.
2. isolering och denaturering av inkludering organ
- Överföra alla cell pellets erhölls i steg 1,5 till en 250 mL bägare och tillsätt 100 mL buffert A (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl). Tillåta cellerna Tina helt (om frysta), och återsuspendera pelleten. Förvara provet på is om inget annat anges.
- Passera de återsuspenderade cellerna genom en högtrycks Homogenisatorer tre gånger att lysera celler och säkerställa komplett klippning av genomisk DNA.
- Centrifugera det lysate vid 10 000 x g i 15 minuter vid 4 ° C. Samla en 1 mL prov av supernatanten (lösliga fraktionen) och lagra den på-20 ° C för efterföljande SDS-PAGE analys. Kassera resten av supernatanten och placera pelleten på is.
Obs: Denna pellets är vit i färgen (lätt urskiljbara från obruten celler som är nyansen av brunt i färg) och innehåller inkludering organ. - Återsuspendera pelleten organ i inkludering noggrant i 20 mL iskallt buffert B (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,2 mM phenylmethanesulfonyl fluor (PMSF), 1% Triton x-100). Detta underlättar vävnadsupplösning membran och membranproteiner. Virvel för 1-2 min till stöd resuspension.
- Centrifugera provet vid 10 000 x g i 15 minuter vid 4 ° C och kasta bort supernatanten.
- Återsuspendera pelleten grundligt i 20 mL iskallt buffert B av vortexa röret för 1-2 min. se till att pelleten bryts i små bitar. Pipettera provet upp och ner till stöd pellet resuspension.
Obs: Det är viktigt att återsuspendera pelleten noggrant för att erhålla inkludering organ fri från orenheter. - Upprepa steg 2.5. Om supernatanten är grumlig eller färgad, upprepa steg 2,6 och 2,5 (i den ordningen) tills supernatanten är klar och färglös.
- Återsuspendera pelleten i 20 mL iskallt buffert C (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,2 mM PMSF) av vortexa röret för 1-2 min.
- Upprepa steg 2.5.
- Tillsätt 25 mL iskallt denatureringen buffert D (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 8 M urea, 10 mM Ditiotreitol (DTT), 0,2 mM PMSF) för att upplösa inkludering organ pelleten. Återsuspendera grundligt av vortexa för 1-2 min, eller tills pelleten bryts i små bitar.
- Blanda suspensionen genom axiellt rotation med en rotation på 30 rpm 30-120 minuter vid 4 ° C.
- Klargöra denaturerat protein lösningen genom centrifugering vid 30 000 x g, 4 ° C i 30 min, placera supernatanten på isen och kassera pelleten.
- Mätning av protein koncentrationen med Bradford-analys. 24 ta en alikvot för SDS-gel analys och placera den vid-20 ° C.
Obs: vid denna punkt, förfarandet kan pausas av snapin-frysning aliquoted provet i flytande kväve och hålla det vid-80 ° C för lagring.
3. protein vika
- Bereda 250 mL buffert E (3 M urea, 100 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,4 M L-arginin arginin, 20 mM minskade L-glutation, 2 mM oxiderat L-glutation) i en 500 mL-bägare och cool bufferten ned till 4 ° C.
- Lägga till 60 mg av denaturerat protein mix som innehåller hans6-Tlp3-LBD erhölls i steg 2.13 till 250 mL buffert E, under omrörning bufferten på 500 rpm. Inkubera refolding mixen vid 4 ° C under kontinuerlig omrörning på 500 rpm för 24-48 h. Den slutliga proteinkoncentration i det här steget är 0,2 mg mL-1.
- Förbereda 7 L av buffert A i 8-10 L hink och kyla ned till 4 ° C i förberedelse för nästa steg (steg 3,4) som kommer att äga rum i 24-48 h (se flödesschemat i figur 1).
- Fördjupa en ~ 50 cm bit av dialys slangar av uppblåsta 28 mm i diameter, med molekylvikt cut-off på 12-14 kDa till 200 mL 10 mM etylendiamintetraättiksyra syra dinatriumsalt (EDTA-Na2) och värm över gaslågan till kokpunkten. Skölj dialys membranet med 200 mL ddH2O.
- Spänna fast ena änden av dialys membranet med dialys slangar förslutning och över 250 mL vika blandning erhålls i steg 3,2 i dialys röret. Nära den öppna änden med en annan klämma. Kontrollera integriteten av membranet att säkerställa det inte finns några läckor.
- Placera dialys röret i en dialys hink med nedkylda 7 L av buffert A bereddes i steg 3.3. Placera en magnetisk uppståndelse bar, att säkerställa att det inte kommer att röra dialys slangar under omrörning.
- Elektrodialys provet vid 4 ° C med fortsatt omrörning på 500 rpm och ändra bufferten minst fyra gånger under en period på 12 h. Efter den senaste buffer ändringen, lämna provet för att elektrodialys under natten.
Obs: Under dialys avlägsnas gradvis överskottet av urea (~ 3 M) från denaturerat protein lösning, vilket gör proteinet till refold. Tunga protein fällning kan observeras i slutet av dialys. - Ta bort dialys röret från hinken och överför innehållet till en 500 mL-glasbägare. Förvara protein lösningen på is, om inget annat anges.
- Filtrera protein lösningen genom ett 0,43 µm porstorlek storlek membran till en 500 mL glasflaska att ta bort alla utfällda proteinet.
4. rening av hans6-märkta proteinet med hjälp av immobiliserade metall jonkromatografi affinitet
-
Ta ut och låt jämvikta en 5 mL färdigförpackade kelaterande kolumn.
- Anslut kolumnen till en Peristaltisk pump, säkerställa att det finns ingen luft instängd i den anslutande slangen.
- Tvätta kolonnen genom att passera genom 25-50 mL ddH2O.
- Ladda kolumnen genom att fylla 3 mL 0,1 M NiCl2 och sedan passerar igenom 25 mL ddH2O.
- Jämvikta kolonnen med 25 mL buffert F (lastning buffert, 20 mM Tris-HCl pH 8,0, 500 mM NaCl, 20 mM Imidazol).
- Justera refolded protein provet erhålls i steg 3,9 till sammansättningen av buffert F genom att lägga till 2,5 mL 1 M Tris-HCl pH 8,0, 25 mL 5 M NaCl och 2,5 mL 2 M Imidazol stamlösningar.
- Fyll provet på kolumnen i en takt av 5 mL/min eller mindre och kassera genomströmmande (obundna proteiner).
- Tvätta kolonnen med 50-100 mL buffert F till avlägsna icke-specifikt bundna proteiner och kassera genomflöde.
- Eluera hans6-Tlp3-LBD med 25 mL buffert G (eluering buffert, 20 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 500 mM Imidazol) och pool genomflöde fraktioner som innehåller proteinet (som bestäms med hjälp av Bradford reagens).
- Mät koncentrationen av protein i poolade provet med Bradford-analys. Ta en liten delmängd för SDS-PAGE analys och plats vid-20 ° C.
5. hans6-tagga borttagning med hjälp av TEV proteas (tillval)
- Förbereda och svalka ned till 4 ° C, 4 L av buffert H (TEV klyvning buffert, 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 1% (v/v) glycerol, 2 mM DTT).
- Skär ca 5-7 cm av dialys slangar (diameter 2-3 cm) och fördjupa det i 200 mL ddH2O.
- Lägg till hans6-taggade TEV proteas till hans6-taggen protein bereddes i steg 4,5 till en slutlig molar förhållandet 1 TEV: 8 protein.
- Fäst ena änden av slangen med dialys slangar förslutning och fyll den med protein/TEV proteas blandningen. Stäng den andra änden och säkerställa det inte finns några läckor.
- Plats dialysen röret i den nedkylda 4 L av buffert H (från steg 5.1) och inkubera det vid 4 ° C med kontinuerlig omrörning för 2 h. förändring bufferten och fortsätta dialys över natten att tillåta TEV-medierad klyvning reaktionen att slutföra.
- Under tiden förbereder och cool (4 ° C) 4 L av buffert jag (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 1% (v/v) glycerol) som förberedelse för nästa dag.
- Efter övernattning dialysen, utbyta bufferten till buffert jag bereddes i steg 5,6 och elektrodialys för en ytterligare 1-2 h vid 4 ° C.
- Ta bort röret från dialys skopan, lossa ena änden av röret och överföra protein lösningen till en 50 mL falconrör. Filtrera lösningen genom ett 0,43 µm porstorlek storlek spruta filter och hålla den på is, om inte annat anges.
- Mäta volymen av provet och justera Tris, NaCl och Imidazol koncentration till sammansättningen av buffert F (t.ex. för 25 mL protein lösning i buffert J Lägg 0,25 mL 1 M Tris-HCl pH 8,0, 1.75 mL 5 M NaCl och 0,25 mL 2 M Imidazol).
- Förbereda en 5 mL HiTrap kelaterande HP kolumn som beskrivs i steg 4.1.
- Ladda provet till kolonnen (flödeshastighet: 5 mL/min) och samla den genomströmmande, som innehåller de otaggade Tlp3-LBD (rester 42-291). Uncleaved protein, den klyvs hans6-tagg och hans6- TEV behålls av kolumnen.
- Tvätta kolonnen med 5 mL buffert F (lastning buffert) för att tillåta alla otaggade protein att flöda genom och samla eluatet.
- Eluatet erhålls i steg 5.11 och 5.12 och mäta proteinkoncentration. Ta en liten delmängd och lagra den på-20 ° C för SDS-PAGE analys.
6. storlek-utslagning kromatografi (gelfiltrering) av Tlp3-LBD
- Förbereda 1 L buffert A (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl) och filtrera det med hjälp av ett 0,43 µm membran.
- Temperera en 26/60 storlek-utslagning kolumn med buffert A med en flödeshastighet av 4 mL/min.
- Koncentrera sig protein provet erhålls i steg 5.13 till en volym på 3-4 mL med 15 mL centrifugal koncentrator med en 10 kDa cut-off (4 ° C, 4000 x g).
- Klargöra protein lösningen genom centrifugering vid 13 000 x g, 4 ° C under 30 minuter att ta bort alla utfällda proteinet.
- Fyll provet på kolumnen för filtrering av pre skakad 26/60 gel. Utföra kromatografi i buffert A med en flödeshastighet av 4 mL/min. Monitor UV spårningen. Tlp3-LBD eluerar vid lagring volym 210-220 ml. Poolen peak fraktioner.
- Mätning av protein koncentrationen. Ta en liten delmängd för SDS-PAGE analys.
7. SDS-PAGE analys av prover som tagits i olika faser av Protein rening
- Förbereda 1 L av SDS-PAGE rinnande buffert (buffert J), som innehåller 25 mM Tris, 250 mM glycin pH 8,3 och 0,1% (w/v) sodium dodecyl sulfate (SDS).
- Förbereda 10 mL 5 x SDS-PAGE lastning buffert (buffert K), som innehåller 0,25 M Tris-HCl pH 6,8, 10% (w/v) SDS, 50% (v/v) glycerol, 1 mM DTT och 0,05% bromophenol blå.
- Tillåta de alikvoter som samlats in under de olika stegen i rening (steg 1.3, 2.3, 2.13, 4.6, 5.13, 6,6) Tina.
- För varje prov, blanda den volym som motsvarar 15 µg totalt protein med 2 µL av 5 x SDS-PAGE lastning buffert och justera volymen till 10 µL med ddH2O.
- Värm proverna vid 95 ° C i 5-10 min, snurra dem vid 10 000 x g i 30 s och överföring proverna i en ren röret.
- Förbereda en SDS-PAGE gel, med 15% polyakrylamid separera gel (för 5 mL: 2,5 mL 30% (w/v) bis-akrylamid, 1,2 mL 1,5 M Tris-HCl pH 8,8, 1,2 mL ddH2O, 50 µL 10% (w/v) SDS, 50 µL 20% (w/v) ammonium persulfatoxidation (APS), 3 µL tetramethylethylenediamine (TEMED) och 5% polyakrylamid stapling gel (för 2 mL: 340 µL 30% (w/v) bis-akrylamid, 250 µL 1 M Tris pH 6.8, 1.37 mL ddH2O, 20 µL 10% (w/v) SDS, 20 µL 20% (w/v) APS, 2 μl TEMED).
- Montera elektrofores apparaten och fyll den med 1 x SDS sida kör buffert enligt tillverkarens rekommendation.
- Ladda en protein molekylvikt markör och de prover som bereddes i steg 7,5. Utföra elektrofores vid en konstant ström av 25 mA.
- Överföra gelen i en behållare och skölj den med ddH2O. Tillsätt 150 mL Coomassie blå färgning lösning innehållande 25% (v/v) isopropanol, 10% (v/v) ättiksyra och 0,03% (w/v) lysande blå R-250. Placera behållaren på en horisontell rotation plattform för 30 min i rumstemperatur.
- Skölj gelen med ddH2O och placera i destaining lösning som innehåller 5% (v/v) metanol och ättiksyra 7% (v/v). Avfärga medan blandning med en horisontell rotation plattform för 1 h.
- Bild gelen och analysera.
8. cirkulär Dichroism (CD) spektroskopi analys av sekundärt strukturera av refolded rent Protein
- Överföra 0,5 - 1 mg av refolded protein som erhölls i steg 6,6 till en dialys rör och placera den i en dialys hink som innehåller 5 L buffert L (50 mM natriumfosfat pH 7,4), förhandskyld till 4 ° C. Elektrodialys provet vid 4 ° C under kontinuerlig omrörning och utföra minst 3-4 buffert förändringar över 2-4 h innan du lämnar provet för att elektrodialys under natten.
- Koncentrera sig dialysed protein lösningen på 0.06 mg mL-1 använder en 10 kDa cut-off centrifugal koncentrator.
- Klargöra lösningen genom centrifugering vid 13 000 x g, 4 ° C i 30 min.
- Spela in långt-UV CD spectrumen av provet vid 25 ° C över ett våglängdsområde 200-260 Nm med en spectropolarimeter med en avsökningshastighet av 20 nm min-1. Använda dialys bufferten som en tom kontroll. Upprepa inspelningen i tre exemplar och genererar i genomsnitt spektrumet.
- Beräkna halten sekundärt strukturera av deconvoluting CD spectra med programmet CDSSTR från DichroWeb sever25 (http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Rekombinant uttryck för hans6-Tlp3-LBD i E. coli resulterade i protein avlagring i inkludering organ. Uttryck avkastningen från 1 L av bakterieodling som beräknades i steg 2.13 var cirka 100 mg av hans6-Tlp3-LBD deponeras i inkludering organ. Förfarandet protein-isolering, beskrivs här och illustreras i figur 1, består av vävnadsupplösning för inkludering organ, protein vika och rening, genom affinitetskromatografi, tag borttagning och storlek-utslagning kromatografi , och ger 10-20 mg ren, otaggade Tlp3-LBD per 1 L av bakterieodling.
Det protein som elueras från kolonnen gel-filtrering som en enkel, symmetrisk topp som motsvarar en lagring volym 220 mL (figur 2A). Beräkning med molekylvikt (MW) med en kalibreringskurva log (MW) kontra kvarhållna volymen (Vretention (mL) = 549,3-73,9 x log(MW)) tillgängliga på webbplatsen EMBL proteinuttryck och rening Core Facility (http://www.embl.de/ pepcore/pepcore_services/protein_purification/Chromatography/hiload26-0_superdex200/index.html), gav värdet av 29 kDa. Detta värde var mycket nära som beräknats från den amino syra ordnar (28,7 kDa), som föreslog att Tlp3-LBD är en monomer i lösning.
Utvärdera reningsprocessen, utvärderades prover som tagits på olika steg med hjälp av SDS-PAGE analys. Som visas i figur 2B, inkludering organ huvudsakligen innehöll hans6-Tlp3-LBD. Små mängder av detta protein var också närvarande i lösliga fraktionen av inducerad kultur (IPTG(+)), och i den uninduced kulturen (IPTG(-)) – tydligen till följd av läckande uttrycket av T7 polymerasen. Hans6-Tlp3-LBD migreras på Polyakrylamidgelen med en skenbar molekylvikt av 28 kDa, som ligger nära det värde som beräknats från den amino syra ordningen (31,8 kDa). Den hans6-tagga borttagning, affinitetskromatografi och gel filtrering steg gav mycket rent protein (> 90% genom elektrofores homogenitet).
Att bekräfta att det protein som erhållits genom detta förfarande var vikta, det sekundära strukturerar av hans6-Tlp3-LBD utvärderades av CD-spektroskopi. Uppskattning av α-helix och β-ark innehåll från CD spectrumen (figur 3) med CDSSTR gav värden av 31% α och 23% β. Dessa värden var nära de förutspådde från sekvens analysen med hjälp av Jpred3 server (http://www.compbio.dundee.ac.uk/www-jpred/) (37% α och 26% β), som anger att det protein som återhämtat sig från urea-denaturerat inkludering kroppar var vikta.
Figur 1: Schematisk av presenterade metoden. Rekombinant hans6-Tlp3-LBD är expressd i E. coli vid induktion med IPTG (se avsnitt 1). Efter 4 h uttryck, bakterieceller skördas och lyserat (se avsnitt 2). Det olösliga bråk som innehåller de inkludering organ (IB) tvättas för borttagning av membran och membranet proteiner orenheter, varefter IB löses i en buffert som innehåller urea vid hög koncentration (se avsnitt 2). Hans6-Tlp3-LBD är refolded genom utspädning till buffert E följt av uttömmande dialys för gradvis urea borttagning (avsnitt 3). Refolded hans6-Tlp3-LBD renas sedan av immobiliserade metall jonkromatografi affinitet som beskrivs i avsnitt 4. Den hans6-etiketten tas bort med TEV proteas (avsnitt 5). Otaggade Tlp3-LBD är koncentrerad och ytterligare renas genom gel filtrering kromatografi (avsnitt 6). Poäng för insamling av prov för SDS-PAGE analys är markerade med *. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: rening av rekombinant Tlp3-LBD. (A) storlek-utslagning kromatografi spår av otaggade Tlp3-LBD på en Superdex 200 HiLoad 26/60 gel filtrering kolumn. Det protein som elueras med en lagring volym på 220 mL. (B) minskat 15% SDS-PAGE Coomassie blå-färgade gel. M: protein molekylvikt markör; IPTG (-): uninduced kontrollprov som samlats in i steg 1.3; IPTG (+): lösliga fraktionen efter IPTG induktion (samlade i steg 2,3); IB: isolerade inkludering organ (steg 2.13); Refolded hans6-Tlp3-LBD: refolded protein prov från steg 4,6; Otaggade Tlp3-LBD: protein prov erhåller i steg 5.13; Gel filtrering 1 och 2: två fraktioner från protein toppen elueras från kolumnen gel-filtrering (steg 6,6). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: cirkulärdichroism spektrum av renat rekombinant Tlp3-LBD. Spektrumet spelades vid 25 ° C i 50 mM natriumfosfat pH 7,4. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En enkel procedur för uttryck och vika från inkludering organ av den periplasmic LBD av den bakteriella chemoreceptor Tlp3 presenteras. Förberedelse av ren protein innebär över uttrycket av genen pET-plasmid-kodad i E. coli, rening och vävnadsupplösning inkludering organ, vika av denaturerat protein och rening av på varandra följande affinitet och storlek-utslagning kromatografi steg. De urea-stödda denaturering och utspädning/dialys-medierad vika är de kritiska steg i protokollet, optimering av som ofta krävs för att säkerställa den rätt utvinningsarbete av protein deponeras i inkludering organ26.
Vika av Tlp3-LBD uppnåddes på ett sätt som två steg, först genom att späda ut denaturerade provet i en buffert som innehåller urea och sedan efter dialysing provet mot en buffert saknar det. Proteinet refolded erhålls med hjälp av detta protokoll var funktionella och kristalliserbart18,23. Denna metod har dock vissa begränsningar. Det är väl känt att carbamylation av amino grupper ofta inträffar när protein denatureras och refolded i närvaro av urea27,28,29. Detta är på grund av att den upplösta Ureaen bryts ned med tiden och producerar cyanat30 som reagerar med proteinet amino grupper att bilda en stabil carbamylated produkt och, i mindre utsträckning med andra funktionella grupper31, 32. nedbrytning av urea är snabbare under alkaliskt pH och förhöjd temperatur. Så, är det rekommenderat att göra färska urea lösningar från ultrarena (> 99%) solid reagens, och de stegen vika/dialys vid låg temperatur (4 ° C)30,33, för att minska cyanat bildandet. Dessutom är att välja bufferten som innehåller primära aminer, såsom Tris, glycin eller hjorthornssalt, den refolding blandningen viktigt så att rensning av de producerade cyanat29,33. Andra alternativ är att använda guanidin hydroklorid i stället för urea, guanidin hydroklorid har inte rapporterats till kemiskt ändra proteiner.
Utöver urea, reduktionsmedel (DTT eller β-merkaptoetanol) krävs ofta att solubilize införande organ och för att förhindra icke-infödda intra- och intermolekylära disulfide obligationer bildas genom att upprätthålla cystein rester i deras reducerat26 ,34. Tlp3-LBD har en intramolekylära disulfide bond, och i detta protokoll, 10 mM DTT införlivades inkludering organ denaturering bufferten (steg 2.10) till stöd resuspension av olösliga proteinet. DTT koncentration sedan minskade ~ 100 fold genom att späda provet i proteinet vika buffert, följt av dialys steget att gradvis avlägsna alla DTT. Det är viktigt att notera att tillämpningen av detta förfarande till att vika av proteiner med flera disulfide obligationer kan behöva optimering av koncentrationen av både oxiderande och reducerande medel (t.ex. oxideras och reduceras glutation (GSSH/GSH), GSSH/DTT, cysteaminklorhydrat/cysteamineor cystin/cystein) att främja korrekt bildandet av disulfide broar34,35. Dessutom om proteinet av intresse har oparade cysteines som inte är inblandade i disulfide bond bildandet, bör reduktionsmedel läggas till alla rening buffertar. Prediktion av de potentiella disulfidbryggor från den amino syra ordnar av ett protein kan utföras med flera i silico verktyg (t.ex. cys_rec: http://linux1.softberry.com/berry.phtml?topic=cys_rec&group=programs& Undergrupp = propt).
Användning av protokollet presenteras för rening av olika proteiner är också sannolikt att kräva optimering av koncentrationen av Imidazol under tvätt steg 4,4. Som visas i figur 2B (lane märkt IB), isolerade inkludering organ som finns, i detta fall huvudsakligen proteinet av intresse. Om ytterligare betydande band syns på SDS-PAGE gel provets IB öka Imidazol koncentrationen i steg 4.4 kommer att behöva ta bort främmande ämnen, men kan minska protein kapacitet36,37. Andra alternativ är att använda en linjär övertoning Imidazol koncentration och poolen de eluerade fraktioner som innehåller proteinet av intresse.
Det sista steget i reningen, storlek-utslagning kromatografi, ger möjlighet att samtidigt uppskatta det molekylära samlas av de eluerade partiklarna och härleda Oligomera staten av protein. Uppskattning av det molekylära samlas av storlek-utslagning kromatografi är dock endast korrekt för sfäriska molekylar, vilket inte är fallet för många proteiner38,39. Kan man bestämma proteinet molekylärt samlas och Oligomera stat med högre noggrannhet genom att använda storlek-utslagning kromatografi kopplas till flera vinklar ljusspridning (SEC-MALS)40 eller analytisk ultracentrifugering41. Vi har tidigare bekräftat att Tlp3-LBD är monomer i lösningen med hjälp av SEC-MALS analys23, och detta resultat är förenligt med rapporterna om andra dCACHE LBDs42,43.
Presenterade protokollet, har i sin ursprungliga eller något modifierad form, använts till refold och rena flera chemoreceptor LBDs från familjen dCACHE för röntgen kristallografiska studier17,18,19, 23 , 42 , 44. proceduren kan vara allmänt användbara för produktion av milligram mängder periplasmic LBDs av andra bakteriella kemoreceptorer i lösliga och kristalliserbart form. I varje enskilt fall behövs sannolikt protokoll optimering. Förutom de punkter som diskuterats ovan, optimal vävnadsupplösning inkludering organ och protein vika kan kräva användning av rengöringsmedel (t.ex. SDS eller N-acetyl trimetyl ammoniumklorid), tillsatser (t.ex. L-arginin) och justering av deras koncentration och inkubation tid i enskilda vika steg26,34,45,46. Vidare påverkar koncentrationen av protein i det refolding steget betydligt refolding avkastningen. Spänna av koncentrationer från 1 ng mL-1 till 10 mg mL-1 bör generellt testas. För Tlp3-LBD var den optimala koncentrationen av protein i refolding mix 0,2 mg mL-1.
Extremt låg vika avkastning är oftast ett tecken på att rättegång refolding villkoren är långt ifrån optimal. Man kan förvänta sig att hög avkastning är förenlig med en hopvikt protein, vilket kan valideras med hjälp av CD-spektroskopi (som beskrivs i den här proceduren). Dessutom kan crystallisability av proteinet resulterande sugguest proteinets vikta staten. Alternativt kan en funktionell analys (om tillgänglig) användas för att bekräfta att proteinet viks. När det gäller Tlp3-LBD, exempelvis visades proteinet refolded att behålla sin ligand-bindande förmåga, vilket framgår av isotermiska kalorimetri. 23
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inget konkurrerande finansiella intressen.
Acknowledgments
Vi tackar Yu C. Liu för hans tidiga verk på Tlp3-LBD produktion. Mayra A. Machuca är skuldsatta att Departamento Admistrativo de Ciencia, Tecnologia e Innovación COLCIENCIAS doktorand stipendium.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris base | AMRESCO | 497 | |
| Sodium chloride (NaCl) | MERK MILLIPORE | 1064041000 | |
| Ampicillin | G-BIOSCIENCES | A051-B | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | MERCK | 52332 | |
| Triton x-100 | AMRESCO | 694 | |
| Isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG) | ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD | AST0487 | |
| Urea | AMRESCO | VWRC0568 | |
| Dithiothreitol | ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD | C-1029 | |
| L-arginine monohydrochloride | SIGMA-ALDRICH | A5131 | |
| Reduced L-glutathione | SIGMA-ALDRICH | G4251 | |
| Oxidized L-glutathione | SIGMA-ALDRICH | G4376 | |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | SIGMA-ALDRICH | 7558-79-4 | |
| Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) | SIGMA-ALDRICH | 10049-21-5 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dehydrate (EDTA) | AMRESCO | VWRC20302.260 | |
| Imidazole | SIGMA-ALDRICH | I2399 | |
| Glycerol | ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD | BIOGB0232 | |
| Nickel chloride (NiCl2) | SIGMA-ALDRICH | 339350 | |
| Glycine | AMRESCO | VWRC0167 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | SIGMA-ALDRICH | L4509 | |
| Unstained Protein Ladder, Broad Range (10-250 kDa) | NEW ENGLAND BIOLABS | P7703 | |
| Amicon Ultracel centrifugal concentrator (Millipore) | MERCK | UFC901096 | |
| 50 mL Falcon tube | FALCON | BDAA352070 | |
| Dialysis tubing | LIVINGSTONE INTERNATIONAL PTY | Dialysis | |
| Snakeskin dialysis tubing | THERMO SCIENTIFIC™ | 68100 | |
| Prepacked HiTrap Chelating HP column | GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES | 17-0408-01 | |
| EmulsiFlex-C5 high-pressure homogeniser | AVESTIN | EmulsiFlex™ - C5 | |
| Peristaltic Pump P-1 | GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES | 18-1110-91 | |
| Superdex 200 HiLoad 26/60 size-exclusion column | GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES | 28989336 | |
| JASCO J-815 spectropolarimeter | JASCO | J-815 |
References
- Dasti, J. I., Tareen, A. M., Lugert, R., Zautner, A. E., Gross, U. Campylobacter jejuni: a brief overview on pathogenicity-associated factors and disease-mediating mechanisms. Int J Med Microbiol. 300 (4), 205-211 (2010).
- Josenhans, C., Suerbaum, S. The role of motility as a virulence factor in bacteria. Int J Med Microbiol. 291 (8), 605-614 (2002).
- Morooka, T., Umeda, A., Amako, K. Motility as an intestinal colonization factor for Campylobacter jejuni. J Gen Microbiol. 131 (8), 1973-1980 (1985).
- Zautner, A. E., Tareen, A. M., Gross, U., Lugert, R.
- Zhulin, I. B. The superfamily of chemotaxis transducers: from physiology to genomics and back. Adv Microb Physiol. 45, 157-198 (2001).
- Fernando, U., Biswas, D., Allan, B., Willson, P., Potter, A. A. Influence of Campylobacter jejuni fliA, rpoN and flgK genes on colonization of the chicken gut. Int J Food Microbiol. 118 (2), 194-200 (2007).
- Salah Ud-Din, A. I., Roujeinikova, A. Methyl-accepting chemotaxis proteins: a core sensing element in prokaryotes and archaea. Cell Mol Life Sci. , (2017).
- Parkhill, J., et al. The genome sequence of the food-borne pathogen Campylobacter jejuni reveals hypervariable sequences. Nature. 403 (6770), 665-668 (2000).
- Hartley-Tassell, L. E., et al. Identification and characterization of the aspartate chemosensory receptor of Campylobacter jejuni. Mol Microbiol. 75 (3), 710-730 (2010).
- Rahman, H., et al. Characterisation of a multi-ligand binding chemoreceptor CcmL (Tlp3) of Campylobacter jejuni. PLoS Pathog. 10 (1), e1003822 (2014).
- Li, Z., et al. Methyl-accepting chemotaxis proteins 3 and 4 are responsible for Campylobacter jejuni chemotaxis and jejuna colonization in mice in response to sodium deoxycholate. J Med Microbiol. 63 (Pt 3), 343-354 (2014).
- Tareen, A. M., Dasti, J. I., Zautner, A. E., Gross, U., Lugert, R. Campylobacter jejuni proteins Cj0952c and Cj0951c affect chemotactic behaviour towards formic acid and are important for invasion of host cells. Microbiology. 156 (Pt 10), 3123-3135 (2010).
- Day, C. J., et al. A direct-sensing galactose chemoreceptor recently evolved in invasive strains of Campylobacter jejuni. Nat Commun. 7, 13206 (2016).
- McKellar, J. L., Minnell, J. J., Gerth, M. L. A high-throughput screen for ligand binding reveals the specificities of three amino acid chemoreceptors from Pseudomonas syringae pv. actinidiae. Mol. Microbiol. 96 (4), 694-707 (2015).
- Fernandez, M., Morel, B., Corral-Lugo, A., Krell, T. Identification of a chemoreceptor that specifically mediates chemotaxis toward metabolizable purine derivatives. Mol. Microbiol. 99 (1), 34-42 (2016).
- Corral-Lugo, A., et al. Assessment of the contribution of chemoreceptor-based signaling to biofilm formation. Environ. Microbiol. , (2015).
- Machuca, M. A., Liu, Y. C., Roujeinikova, A. Cloning, expression, refolding, purification and preliminary crystallographic analysis of the sensory domain of the Campylobacter chemoreceptor for aspartate A (CcaA). Acta Crystallogr F Struct Biol Commun. 71 (Pt 1), 110-113 (2015).
- Machuca, M. A., Liu, Y. C., Beckham, S. A., Roujeinikova, A. Cloning, refolding, purification and preliminary crystallographic analysis of the sensory domain of the Campylobacter chemoreceptor for multiple ligands (CcmL). Acta Crystallogr F Struct Biol Commun. 71 (Pt 2), 211-216 (2015).
- Liu, Y. C., Roujeinikova, A. Expression, refolding, purification and crystallization of the sensory domain of the TlpC chemoreceptor from Helicobacter pylori for structural studies. Protein Expr. Purif. 107, 29-34 (2015).
- Upadhyay, A. A., Fleetwood, A. D., Adebali, O., Finn, R. D., Zhulin, I. B. Cache Domains That are Homologous to, but Different from PAS Domains Comprise the Largest Superfamily of Extracellular Sensors in Prokaryotes. PLoS Comput. Biol. 12 (4), e1004862 (2016).
- Bardy, S. L., Briegel, A., Rainville, S., Krell, T. Recent advances and future prospects in bacterial and archaeal locomotion and signal transduction. J. Bacteriol. , (2017).
- Glekas, G. D., et al. The Bacillus subtilis chemoreceptor McpC senses multiple ligands using two discrete mechanisms. J. Biol. Chem. 287 (47), 39412-39418 (2012).
- Liu, Y. C., Machuca, M. A., Beckham, S. A., Gunzburg, M. J., Roujeinikova, A. Structural basis for amino-acid recognition and transmembrane signalling by tandem Per-Arnt-Sim (tandem PAS) chemoreceptor sensory domains. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 71 (Pt 10), 2127-2136 (2015).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Whitmore, L., Wallace, B. A. Protein secondary structure analyses from circular dichroism spectroscopy: methods and reference databases. Biopolymers. 89 (5), 392-400 (2008).
- Singh, S. M., Panda, A. K. Solubilization and refolding of bacterial inclusion body proteins. J Biosci Bioeng. 99 (4), 303-310 (2005).
- Lippincott, J., Apostol, I. Carbamylation of cysteine: a potential artifact in peptide mapping of hemoglobins in the presence of urea. Anal Biochem. 267 (1), 57-64 (1999).
- Cejka, J., Vodrazka, Z., Salak, J. Carbamylation of globin in electrophoresis and chromatography in the presence of urea. Biochim Biophys Acta. 154 (3), 589-591 (1968).
- Sun, S., Zhou, J. Y., Yang, W., Zhang, H. Inhibition of protein carbamylation in urea solution using ammonium-containing buffers. Anal Biochem. 446, 76-81 (2014).
- Hagel, P., Gerding, J. J., Fieggen, W., Bloemendal, H. Cyanate formation in solutions of urea. I. Calculation of cyanate concentrations at different temperature and pH. Biochim Biophys Acta. 243 (3), 366-373 (1971).
- Volkin, D. B., Mach, H., Middaugh, C. R. Degradative covalent reactions important to protein stability. Mol Biotechnol. 8 (2), 105-122 (1997).
- Stark, G. R. Reactions of cyanate with functional groups of proteins. 3. Reactions with amino and carboxyl groups. Biochemistry. 4 (6), 1030-1036 (1965).
- Lin, M. F., Williams, C., Murray, M. V., Conn, G., Ropp, P. A. Ion chromatographic quantification of cyanate in urea solutions: estimation of the efficiency of cyanate scavengers for use in recombinant protein manufacturing. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 803 (2), 353-362 (2004).
- Fischer, B., Sumner, I., Goodenough, P. Isolation, renaturation, and formation of disulfide bonds of eukaryotic proteins expressed in Escherichia coli as inclusion bodies. Biotechnol Bioeng. 41 (1), 3-13 (1993).
- Vallejo, L. F., Rinas, U. Strategies for the recovery of active proteins through refolding of bacterial inclusion body proteins. Microb Cell Fact. 3 (1), 11 (2004).
- Porath, J. Immobilized metal ion affinity chromatography. Protein Expr Purif. 3 (4), 263-281 (1992).
- Bornhorst, J. A., Falke, J. J. Purification of proteins using polyhistidine affinity tags. Methods Enzymol. 326, 245-254 (2000).
- Stulik, K., Pacakova, V., Ticha, M. Some potentialities and drawbacks of contemporary size-exclusion chromatography. J Biochem Biophys Methods. 56 (1-3), 1-13 (2003).
- Kunji, E. R., Harding, M., Butler, P. J., Akamine, P. Determination of the molecular mass and dimensions of membrane proteins by size exclusion chromatography. Methods. 46 (2), 62-72 (2008).
- Folta-Stogniew, E. Oligomeric states of proteins determined by size-exclusion chromatography coupled with light scattering, absorbance, and refractive index detectors. Methods Mol Biol. 328, 97-112 (2006).
- Lebowitz, J., Lewis, M. S., Schuck, P. Modern analytical ultracentrifugation in protein science: a tutorial review. Protein Sci. 11 (9), 2067-2079 (2002).
- Machuca, M. A., Liu, Y. C., Beckham, S. A., Gunzburg, M. J., Roujeinikova, A. The Crystal Structure of the Tandem-PAS Sensing Domain of Campylobacter jejuni Chemoreceptor Tlp1 Suggests Indirect Mechanism of Ligand Recognition. J. Struct. Biol. 194 (2), 205-213 (2016).
- Rico-Jimenez, M., et al. Paralogous chemoreceptors mediate chemotaxis towards protein amino acids and the non-protein amino acid gamma-aminobutyrate. Mol. Microbiol. 88 (6), 1230-1243 (2013).
- Salah Ud-Din, A. I. M., Roujeinikova, A. The periplasmic sensing domain of Pseudomonas fluorescens chemotactic transducer of amino acids type B (CtaB): Cloning, refolding, purification, crystallization, and X-ray crystallographic analysis. Biosci. Trends. 11 (2), 229-234 (2017).
- Stockel, J., Doring, K., Malotka, J., Jahnig, F., Dornmair, K. Pathway of detergent-mediated and peptide ligand-mediated refolding of heterodimeric class II major histocompatibility complex (MHC) molecules. Eur J Biochem. 248 (3), 684-691 (1997).
- Cardamone, M., Puri, N. K., Brandon, M. R. Comparing the refolding and reoxidation of recombinant porcine growth hormone from a urea denatured state and from Escherichia coli inclusion bodies. Biochemistry. 34 (17), 5773-5794 (1995).
