Summary
Mantar önleyici bileşikler ve özleri süzmek için bir kolay ve uyarlanabilir suyu microdilution yöntem.
Abstract
Mantar enfeksiyonları son yıllarda önemli bir sağlık sorunu haline gelmiştir, ancak kullanılabilir antifungal ilaçlar sayısı sınırlıdır. Bu senaryoda, yeni antifungal ilaçlar için arama gereklidir. Rapor burada protokol ekran peptidler bir yönteme antifungal özellikleri için ayrıntıları. Suyu microdilution duyarlılık testi olarak potansiyel yeni Antifungaller antimikrobiyal peptidler araştırma uygun değişiklikler klinik ve laboratuvar Standartları Enstitüsü (CLSI) M27-A3 kurallarına dayanmaktadır. Bu iletişim kuralı antifungal bileşikler etkinliğini değerlendirmek için işlevsel bir tahlil açıklar ve soruşturma altında moleküllerin belirli herhangi bir sınıf uyacak şekilde kolayca değiştirilebilir. Deneyleri 96-şey levha küçük birimleri kullanarak gerçekleştirilen bu yana, büyük ölçekli bir tarama zaman, kısa bir miktarda Eğer özellikle bir otomasyon ortamda yürütülen tamamlanabilir. Bu yordamı bir standart ve ayarlanabilir klinik protokol Mantar hastalıkları tedavi geliştirmek için yeni moleküller tezgah-iş arayışı nasıl yardımcı gösterilmiştir.
Introduction
Mantar enfeksiyonları haline gelmiştir önemli bir tıbbi endişe son yıllarda önemli ölçüde ana toprak dolay iden bu kanser tedavisi ve HIV/AIDS ile yaşayan geçiyor gibi immün sayisi bir artış artış veya organ1,2nakledilmektedir. Ancak, çok sınırlı bir dizi kullanılabilir antifungal ilaçların ve onlara mantar direnç raporlarda artan sayıda büyük sorunlar sistemik Mikozlar3tedavi ile ilgili katkıda bulunur.
Yeni mantar önleyici bileşikler potansiyel kaynağı antimikrobiyal peptidler (Amper), enfeksiyon4onların doğuştan gelen bağışıklık yanıtı parçası olarak çoğu organizma tarafından üretilen küçük Katyonik peptidler vardır. Yine de, bu bileşiklerin mantar patojenlere karşı test etmek için tarama yöntemi standart değil. Farklı yordamlar aynı modeli mikroorganizma5,6,7bazen amper, antifungal faaliyetten değerlendirmek için kullanılmaktadır. Bu farklılıklar ve ayrıntılı olarak bazı protokoller eksikliği engellemektedir ve bileşikleri tekrarlanabilirlik arasında karşılaştırmalar karıştırmak.
Yeni ilaç adaylarının test standart hale getirmek için bir yol antifungal duyarlılık gibi klinik klinik ayarları tanımlamak için kullanılan kurallar ve laboratuvar Standartları Enstitüsü (CLSI) M27-A3 yönergeleri takip etmektir. Ancak, bu antifungal duyarlılık testleri fazla kısıtlayıcıdır ve onlar sadece birkaç seçim maddeleri için kuruldu gibi metabolizma dikkate varyasyon içine türler arasında yapmayız. Örneğin, onlar sigara fermantasyon Mayalar metabolik ihtiyaçlarını dikkate almayın.
Bu iletişim kuralı değerlendirme faaliyet potansiyel antifungal bileşiklerin sağlar ve burada aramak için antifungal peptidler uygulanır. Suyu microdilution duyarlılık testi yeni bileşikler8,9tarama en iyi duruma getirme değişiklikler CLSI M27-A3 kurallarına dayanmaktadır. Bu değişiklikler sonuçları başvuru Antifungaller denetimleri olarak kullanımı ile standartlaştırılması ise en iyi ön-test büyüme için az miktarda bileşik, sıcaklık veya ilk inoculum ve farklı medya kullanımı için izin verir. Bu yöntemle çok iyi kültür Kaplamalar, kullanımı hızla ve güvenle bileşikler çok sayıda ekran olanak sağlar.
Doğal esnekliği nedeniyle bu protokolü farklı kimyasal sınıflar bileşiklerin ve birkaç uyarlamalar ile diğer mikroorganizmalar karşı kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. çözümler ve medya
- 2 X Roswell Park Memorial Enstitüsü (RPMI) 1640 orta, fosfat tamponlu tuz (PBS), Sabouraud dekstroz suyu ve Sabouraud dekstroz agar Tablo 1göre hazırlayın.
2. mantar Inoculum büyüme koşulları
- İhtiyaç kadar % 35 gliserol-80 ° C'de donmuş hisselerinde olarak tüm mantar suşları depolar.
- Her deneme önce aşağıdaki adımları uygulayın.
- Candida albicans suşları için:
- Bir hisse senedi şişe çözülme ve Sabouraud dekstroz suyu bir kap ve kültür gecede 30 ° C'de ajitasyon (200 devir/dakika) ile bir steril 50 mL polipropilen tüp 10 mL 200 µL aktarmak. Tüp eğim ve kapağı biraz kültür daha iyi havalandırma için açık bırakmak hatırlıyorum.
- Cryptococcus neoformans suşları için:
- Hisse senedi bir şişe donmuş yüzeyi kazıyorum. Hücreleri Sabouraud dekstroz agar plakalar üzerine plaka ve 30 ° C'de 48 h için kuluçkaya Sonra görünür büyüme izole kolonileri tabak buzdolabında (4 ° C) ile parafin film 15 gün için kapalı tutun.
- Bir orta ölçekli izole koloni bir steril kürdan veya steril aşı döngü kullanarak plaka toplamak ve Sabouraud dekstroz suyu bir steril 50 mL konik tüp 10 mL aşılamak. Ajitasyon (200 devir/dakika) altında 30 ° C'de yaklaşık 24 h için kuluçkaya.
- 24 saat kuluçka fazla olamaz. Tüp eğim ve kapağı biraz daha iyi havalandırma için açık bırakmak hatırlıyorum. Bu Antimikrobiyal direnç etkileyen önemli bir faktör olduğu için önce her test hücreleri büyüme aşamasında standardize etmek her zaman iyidir.
Not: Her iki mantarlar bizim deneylerde hızlı yayılma için 30 ° C'de yetiştirilmiştir ancak sıcaklık çalışma, örneğin klinik tedavi (37 ° C) amaçlarını yansıtacak şekilde değiştirilebilir. En önemlisi, bu ilk kuluçka süresi önceden her mantar izole etmek için kurulan ve tekrarlanabilirlik emin olmak için tüm testler muhafaza gerekir.
- Candida albicans suşları için:
- Sonra mantar büyüme, konik tüpler 1200 x g oda sıcaklığında 5 min için de centrifuging tarafından hücreleri toplamak. Süpernatant atın ve PBS 10 mL ekleyin.
- Hücreleri ve santrifüj 1200 x g oda sıcaklığında 5 min için de tekrar resuspend.
- PBS yıkama ve aralıklarla iki kez daha tekrarlayın. Sonra üçüncü yıkama, 2 X RPMI-1640 orta 5 mL (göre Pelet boyutu) hücrelerde resuspend.
- 1 mL 1: 100 veya 1:1,000 seyreltme (bağlı olarak hücre süspansiyon bulanıklık) bir microcentrifuge tüp hazırlayın.
- Bu seyreltme aliquot 10 µL hemasitometre odasında yerleştirin ve dört köşe çeyrek dairelerin mikroskop altında hücrelerde toplam sayısını saymak. Konsantrasyonu formülüne göre hesaplamak: (Toplam cep numarası/4) x seyreltme faktörü x 104 (odası seyreltme Sabit).
- % 100 canlılığı canlılığı sayar ve büyüme koşulları sistematik olarak okudu izole etmek için korelasyon düşünün.
Not: Arka-kaplama uygun olarak Mayalar10 için antimikrobiyal duyarlılık testi (EUCAST) antifungal Minimum inhibitör konsantrasyonu (MIC) yöntemi Avrupa Komitesi tarafından standardizasyon ve kalite kontrol canlılığı sayıları yapılabilir . - Büyüme/canlılığı korelasyon altında eğitim izole etmek için kurulmuştur değil, bir hemasitometre phloxine B11, trypan mavi gibi ölü hücreleri seçerek renk boya yardımı ile canlı hücrelerde sayarak mantar canlılığı ölçmek 12, veya Janus yeşil13. Mantar hücreleri yalnızca canlılık bu noktada nüfusunun % 90'ı ise veya yukarıda bu iletişim kuralı için kullan.
Not: Ölü/canlı boyalar de seçim mantar ile çalışmayabilir. Lütfen onları kullanmadan önce sınayın. Örneğin, trypan mavi boya de C. neoformansile çalışmaz.
- % 100 canlılığı canlılığı sayar ve büyüme koşulları sistematik olarak okudu izole etmek için korelasyon düşünün.
- Bundan sonra hücre süspansiyonlar 2 X RPMI-1640 ortamda hazırlamak (2 X düzeltilmiş RPMI-1640 orta inoculum). 96-şey plakalar için her plaka için 5 mL hacmi göz önünde bulundurun.
- Tüm C. albicans suşları için 4 x 103 hücre/mL bir hisse senedi hücre süspansiyon hazırlamak. Bu 2 X her iyi (2 x 103 hücre/mL) son hücre konsantrasyon bölgedir.
- C. neoformans suşları için hücreleri 2 x 104 hücre/mL stok kültürünün hazırlayın. Bu iki kez her şey (1 x 104 hücre/mL) son hücre konsantrasyon bölgedir.
- Hangi konsantrasyon kuluçka süresi ile ilgili olarak belirli çalışma için ideal olacak bilinen bir antifungal ile diğer mantarlar için sınayın. Metabolizma ve çoğaltma zaman mantar göz önünde bulundurun.
3. peptidler (bilinmeyen Aracısı)
- -20 ° C'de lyophilized peptidler depolamak ve onları her deneme önce deiyonize su geçiyoruz. Bir kez suda en fazla saklama süresi her peptid niteliğine bağlıdır.
- İki kez tahlil (2 X) test en son yoğun aliquots hazırlayın. İdeal olarak, aliquots ile yeterli peptid donma-çözülme döngüsü önlemek tek seferlik kullanım için az sayıda hazır olun.
Not: Seçtiğiniz toplama bir edebiyat ve peptid özelliklerini dayanmalıdır. Bu seri dilutions peptid, yaklaşık 100 µM ile başlamak ve daha sonra azaltmak veya bağlı olarak elde edilen sonuçları bu konsantrasyon aralığı artırmak için önerilir.
4. başvuru Antifungaller (pozitif denetimleri)
- Bu suda seyreltilmiş için: en yüksek konsantrasyon analizi 2 X çözeltisi hazırlamak (bkz. Bölüm 5: Antifungal tahlil seyreltme adımları için).
- C. albicans suşları için bir çözüm Flukonazol 128 µg/mL veya 128 µg/mL caspofungin hazırlayın. Her ikisi için de plaka konsantrasyon 64 µg/mL olacaktır.
- C. neoformans suşları için bir çözüm olarak 32 µg/mL amfoterisin b (suda çözünen çözelti) hazırlayın. Plaka konsantrasyon 16 µg/mL olacaktır.
Not: Bu anti-mantar kötü suda çözünür olduğundan normal Amfoterisin B Dimetil sülfoksit (DMSO), seyreltilmiş. Ancak, piyasada bulunan suda çözünen Amfoterisin B hazırlıklar vardır.
- Organik bir çözücü içinde seyreltilmiş Antifungaller için: 100 X hisse senedi DMSO çözümde hazırlamak, sonra su kullanmak için 10 X oranında seyreltin.
Not: Böylece, kuyuda, DMSO son konsantrasyonu % 1'i geçmeyecektir. Verilen bu bazı mantarlar iyi çözücü bu konsantrasyon tahammül yok nerede mantar %1 DMSO denetimi olarak içeren medya artacak bir de gereklidir. DMSO ışığa duyarlı olduğunu unutmayın, bu yüzden plaka folyo ile kapak veya kuluçka dönemi süresince karanlık bir odaya yerleştirin.
5. antifungal tahlil
Not: Vitro antifungal deneyleri suyu microdilution duyarlılık testi bazı değişiklikler klinik ve laboratuvar Standartları Enstitüsü (CLSI) M27-A3 kurallarına göre gerçekleştirilir.
- İki kat seri seyreltme her peptid, hazırlamak ve antifungal son hacmiyle 50 µL 96-şey polistren Mikroplaka içinde kontrol.
- Bir pipet kullanarak ekleyin antifungal/peptid 2 X konsantrasyon en yüksek 100 µL istediğiniz sütundaki son konsantrasyonu 1-3, içinde satır A.
- Bir çok kanallı pipet kullanarak, steril su 50 µL diğer wells, satırların H. B ekleyin.
- Wells en yüksek konsantrasyon (a satır) ile 50 µL kaldırmak, iyi bir sonraki konsantrasyonu (satır B) diğerine aktarmak ve homojenize.
- Kadar iyi en düşük konsantrasyon ile yukarıdaki adımları tekrarlayın ve bu iyi (satır H) 50 µL atın. Sütunları 11 ve 12 (satır A, B, C) boş denetim veya negatif/büyüme kontrol için sadece su ile bırakın.
- 50 µL ayarlanan inoculum X 2 RPMI-1640 ortamda her şey (sütun 1-3 artı sütun 11 (negatif/büyüme denetimi)); ekleyin. C. neoformans suşları 104 hücre/mL olacaktır son konsantrasyonu C. albicans için 2 x 103 hücre/mL ve nihai toplama olacaktır.
- Boş denetimleri hazırlamak (50 µL su + 50 µL 2 X RPMI-1640 orta hücreleri olmadan) ve negatif/büyüme kontrol (50 µL su + 50 µL ayarlanabilir inoculum 2 X RPMI-1640 orta antifungal olmadan) ve yük içine iyi plaka yukarıda açıklandığı gibi.
- Test edilecek her bileşik için prosedür ve seçilen antifungal denetim (sütunlar 4-10) yineleyin.
Not: Seri dilutions dikey olarak aşağıdaki deney olarak veya yatay olarak plaka (dilutions ekstresinin verilen bileşik/test edilmesi gereken sayısı sekiz veya daha fazla iseYani, ) yapılabilir.- Bileşikler başvurursanız uyuşturucu, ya da herhangi bir bileşen ışığa duyarlı, düşük ışıkta tahlil yapmak, folyo ile kuruyucu veya karanlık bir odaya incubations sırasında yer.
- Aşağıdaki isteğe bağlı önerileri göz önünde bulundurun.
- Bu yardımcı olur buharlaşma azaltmak gibi gaz değişimi, izin veren bir açık kapak plakasını ile plaka mühür.
- Plaka nemli bir odaya yerleştirin; Ayrıca buharlaşma azaltmak yardımcı olacaktır.
- Plakayı 37 ° C'de 24 saat veya 48 h 48 h ve tüm C. albicans suşları için 200 C. neoformansiçin sallayarak RPM kuluçkaya. Alt son hacim (100 µL) hiçbir yayılma oluştuğunu sağlar.
Not: 24 h mikrofon ölçümlere ve C. albicans suşları için 48 h arasında anlamlı bir fark gözlendi. Yine de, okuma, 48 h görselleştirmek kolaydır. - Morfoloji de bulaşma belirtileri kontrol olarak değişiklikleri doğrulamak için kuluçka dönemi önce ve sonra ters bir optik mikroskobu yardımı ile tüm wells, gözlemlemek.
Not: Okuma görsel olarak yapılır ve deneme sonunda fotoğraflandı. Her okumadan önce biraz plaka lunaparkçı. Okur da onun OD 600 ölçerek gerçekleştirilebilir hücre kümeler Eğer nm, ya da filamentation değil görülmektedir. - Deneyler en az üç kez ayrı tarihlerde gerçekleştirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mikrofon tamamen kuluçka dönemi sonundaki görünür mantar büyümesini engeller en düşük antimikrobiyal bileşik toplama olarak tanımlanır. Amacı bu iletişim kuralı, ekran potansiyel Antifungaller hızlı bir yönteme sahip olduğundan, herhangi bir şey ile bulanıklık negatif/büyüme denetim wells için benzer ise herhangi bir şey ile açık kitle iletişim araçları için boş wells benzer olumlu bir sonuç olarak kabul edilir negatif olarak kabul. Ancak, belirli bir AMP fungistatic veya mantar olduğunu bilerek bir ilgi ise, olumlu kuyulardan Medya Ayrıca Sabouraud dekstroz Agar kaplama veya başka bir canlılık testi ile kontrol.
Bileşik bir romanın etki mekanizması bilinmemektedir olduğunu göz önüne alındığında, bu nedenle mantar (onay resmi kurallar, tabloları veya veri edebiyat) denetlemeden önce yalıtmak için başvuru antifungal beklenen aralıkta düşerse doğrulamak için gerekli test mikrofon bileşiği (Bu durumda, bir ampul; Şekil 1 ve Şekil 2) koşullar ideal olduğunu doğrulamak için. Eğer saygın aralığında düşmek değil, gözlenen değişiklikleri yalnızca test edilmiş bileşik nedeniyle olup olmadığını belirlemek imkansız olacağından deneme yeniden çalıştırmak gerekli olacaktır. Önce ve sonra morfoloji ve kirlenme değişiklikleri denetlemek için kuluçka dönemi bir optik mikroskop altında bütün wells gözlemlemek eşit derecede önemlidir.
Şekil 1. Mantar önleyici faaliyet için suyu microdilution tahlil kullanarak Cryptococcus neoformanskarşı üç peptidler değerlendirilmesi. Mantar 1 x 104 hücre/mL bölgedir. Üç peptidler test edildi (AMP1, sütun 1-3; AMP2, sütun 5-7; AMP3, sütun 8-10) 100 µM (a satır) 0,78 µM (satır H) arasında değişen konsantrasyonları ile. Büyüme denetim ve boş sütunlar 11 ve 12, sırasıyla vardır. Görüntü bir dijital kamera ile kuluçka 48 saat sonra satın alınmıştır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2. Mantar önleyici faaliyet için suyu microdilution tahlil kullanarak Candida albicans karşı üç peptidler değerlendirilmesi. Mantar 2 x 103 hücre/mL bölgedir. Üç peptidler test edildi (AMP1, sütun 1-3; AMP2, sütun 4-6; AMP3, sütunları 7-9) 100 µM (a satır) 0,78 µM (satır H) arasında değişen konsantrasyonları ile. Büyüme kontrol ve boş assay olarak dahil edildi, ama değil gözükmek içinde belgili tanımlık fotoğraf. Görüntü bir dijital kamera ile kuluçka 48 saat sonra satın alınmıştır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 1 ve Şekil 2gözlemlediği gibi 48 h yeterli zaman pozitif ve negatif wells görsel olarak C. neoformans ve C. albicansiçin ayırt etmektir. C. neoformans için sonuçları 24 h elde edilmiştir kayda değer değişiklik yapmadan CSLI kurallar altında daha erken. Her nüsha, pozitif ve negatif iyi ve her bileşik için mikrofon için bu nedenle, kolayca ayırt vardır. Bu hızlı mikrofon belirlenmesi için hangi molekülleri hak daha fazla araştırma seçimi gelince birden çok bileşikleri de olanak sağlar. Bu arada, şekil 3 fakir sonucunda yanlış seyreltme adımı sırasında pipetting gelen büyük olasılıkla örneğidir. Bu sütundaki 5, satır C, bir farkın C. neoformans büyüme çoğaltır (sütun 5-7) mevcut olduğu görülebilmektedir.
Şekil 3. Teknik bir hataya örnek olarak bir seri seyreltme tahlil çoğaltır. Görüntü 100 µM (a satır) 0,78 µM (satır H) arasında değişen amper seri bir seyreltme gösterir. C. neoformans büyüme farklılıkları çoğaltır sütunlar arasında mevcut seyreltme hazırlık sırasında 5-7, satır C, pipetting hata nedeniyle büyük olasılıkla. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Tabakları gelince, şekil 1 ' de orada yorumudur antifungal bir tahlil karşı C. neoformanssütun 1-3 AMP1 için AMP2 için sütun 5-7 ve sütunları 8-10 AMP3 için değişen 100 µ konsantrasyonları ile yer alan, üç farklı amper için M (a satır) 0,78 µM (satır H). Boş denetim 12, satır A c sütununda yerleştirildi ise negatif/büyüme denetim sütun 11, satırları A'dan C'ye, yerleştirildi (Satırlar sütun 1-3, A-C) AMP1 ve AMP2 (satırlar sütun 5-7, A-D), yoğun yarı saydam ve orada medya olduğunu unutmayın hiçbir görünür büyüme içindir. Buna ek olarak, düşük konsantrasyonlarda kuyuları opak (sütun 1-3, satırları D-H ve sütun 5-7, satır E-H). Bu nedenle, satır C AMP2 için mikrofon satır D, yani, 25 µM ve 12.5 µM, sırasıyla ' AMP1 için mikrofon içerir kabul edilir. Mantar test tüm konsantrasyonlarda büyüdükçe AMP3 yeniden değerlendirilmek üzere olacaktır. AMP3 için reexamination testi orta bileşik, mikrobiyal kirlenme antifungal aktivite ile müdahale ediyor veya test aracısı mantar daha yüksek bir direnç olabilir nedenini belirlemek gereklidir. Son olasılık için test konsantrasyon aralığı artırmak gerekli olacaktır. Böylece onlar da aşırı doz ölçüm 600 tarafından değerlendirildi gözlemlediği gibi no inhibisyonu ve denetim wells homojen, nm.
Şekil 2gelince, üç ayrı peptidler C. albicanskarşı test edilmiştir. AMP1 için mikrofonlar (sütun 1-3), AMP2 (sütunlar 4-6) ve AMP3 (sütunlar 7-9) 50 µM, 6 µM ve 25 µM, sırasıyla vardı. C. albicans, filamentation kuluçka sıcaklık nedeniyle no inhibisyonu ve denetim wells, kümeleri içinde aşırı doz ölçüm okumak için kullanmak zorlaştırır görülebilmektedir.
Bazen, hiçbir büyüme wells görülmektedir. Bu toksin kirlenme (hiçbir büyüme de büyüme denetimleri bu durumda göster) medya veya aracı daha yüksek bir duyarlılık nedeniyle olabilir (Bu durumda, büyüme denetimlerini göster büyüme). Buna göre ikinci durumda konsantrasyon aralığı bir düşüş gerekli olabilir.
| Orta | Hazırlık | |
| 2 X Roswell Park Memorial Enstitüsü (RPMI) 1640 orta – 500 mL | 10.4 g RPMI-1640 (desteklenen L-glutamin ve fenol kırmızı; bikarbonat olmadan) | |
| 3 - 330 mM (N- morpholino) propan sülfonik asit (MOPS) | ||
| PH 7,0 ile küçültme/büyütme NaOH | ||
| Filtrasyon (0,22 µM filtre) tarafından sterilize | ||
| Fosfat tamponlu tuz (PBS) | 137 mM NaCl | |
| 2.7 mM KCl | ||
| 10 mM Na2HPO4 | ||
| 2 mM KH2PO4 | ||
| Otoklav 121° C'de 15 dakika. | ||
| Sabouraud dekstroz suyu | 15 g toz 500 mL distile su içinde. | |
| PH 7,0 NaOH ile uyum | ||
| Otoklav 121° C'de 15 dakika. | ||
| Sabouraud dekstroz Agar | 32,5 g toz 500 mL distile su içinde. | |
| PH 7,0 NaOH ile uyum | ||
| Otoklav 121° C'de 15 dakika. | ||
Tablo 1. Medya ve reaktif hazırlık.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Microdilution testleri bir hedef bahçedeki küçük miktarlarda kullanarak bileşik potansiyel antifungal etkinliğini analiz ve aynı zamanda konsantrasyonları bir dizi test. Buna göre bu iletişim kuralı tarama potansiyel yeni mantar önleyici bileşikler için bir ilk adım olarak önerilir. Burada sunulan Protokolü başlangıçta klinikler, antifungal tedavi seçiminde yardımcı olmak için tasarlanmış M27-A3 Protokolü dayanmaktadır ve yeni mantar önleyici bileşikler çeşitli için adapte edilebilir. Genel olarak, bu iletişim kuralını özü veya bileşik fizikokimyasal özellikleri üzerinde odaklanabilirsiniz. Örneğin, bir bileşik medya RPMI etkisi Histatin 514gibi mantar hücre ile etkileşimi engelleyebilir için tahlil potansiyel aday etkisiz yanlış görünebilir. Bu durumda, ne zaman RPMI engelleyen için alternatif bir orta BEZLERİ pH 715ile Maya azot Bankası (YNB) tampon var.
Başvuru antifungal sonuçları yönergeleri aralığı içinde olduğu sürece iletişim kuralı da değişiklikler öncesi büyüme koşulları, inoculum konsantrasyonu, inkübasyon sıcaklığı ve ışığa duyarlı bileşenleri sağlar. Başvuru antifungal test mantar türleri için geçerli terapi dayanmalıdır. Ayrıca, bir başvuru ise bileşik bu doğada potansiyel uyuşturucu – örneğin, test edilmiş mantar modeli karşı antifungal aktivite ile bilinen bir antimikrobiyal peptid benzer-bir ek başvuru denetimi olarak kullanılmalıdır.
Öncesi büyüme koşulları mantarlar uygun ve ihtiyaçlarını araştırma için değiştirilebilir. Protokolü olduğu gibi daha iyi yayma için 30 ° C'de, C. neoformans ve C. albicans yetiştirilmiştir. Yine de, bu sıcaklık mantarlar metabolizma bağlı olarak değiştirilebilir: Örneğin, Paracoccidioides brasiliensis 37 ° C'de mantar şeklini korumak için büyüme gerektirir ve onun yavaş çoğaltma oranı nedeniyle 5-7 gün için yetişkin olmak gerekiyor. Bu nedenle, potansiyel yeni uyuşturucu testi için mantar özellikleri anlamak önemlidir. Ayrıca, yaş ve kullanılan hücre büyüme aşamasında her çalışma amacı göre tanımlanmış olmalıdır ve, en önemlisi, ilk kuluçka süresi önceden kurulmuş ve tekrarlanabilirlik emin olmak için tüm testler muhafaza .
Bileşik/özü, başvuru antifungal veya seyreltici ışığa duyarlı ise, aynı şekilde, adımları ile düşük ışıklı, folyo ile plakalar kapsayan veya sırasında karanlık bir odasında Plakayı yerleştirmek gibi onun yıkımı önlemek için eklenmelidir Kuluçka kez.
Ayrıca, kenar efekti ve buharlaşma boş Wells, su ilavesi ile dış kuyu kullanmayan ve su ile veya doldurarak plaka nemli bir odaya yerleştirerek azalmış.
Bu yöntem kullanılırken ana sınırlamaları, mantar veya fungistatic etkileri arasında ayrım karşı test edilmiş bir bileşim, inhibitör etkinliği üzerindeki odağını biridir. Yine de, olası yeni antifungal, hızlı bir tarama hedefi olduğu gibi ilk görsel değerlendirme mikrofon ile net pozitif (' açık/sigara-bulanıklık' kuyu) ve negatif ('bulanıklık' kuyu) sonucu, yardımcı olur bileşikleri çalışmada ilgi tanımlamak daha fazla ve bu nedenle tarama yeni bileşikler için genel maliyetini azaltma.
Bu yeni bileşiklerin etki mekanizması bilinmemektedir, bu aynı iletişim kuralını bileşik'ın yeteneği inhibe veya pozitif wells kaplama veya canlı/ölü boya kullanarak gibi birkaç ilave adımlar ekleyerek mantar hücrelerini öldürmek belirlemek için kullanılabilir. Diğer küçük değişiklikler herhangi bir sinerjik etkisi Bahçedeki diğer ilaçlar ile tanımlamak için bir Dama Tahtası titrasyon tahlil için protokolünü kullanmak üzere ilave edilebilir.
Her ne kadar tahlil'ın okuma genellikle iyi büyüme yok antifungal ajan (negatif/büyüme denetimi) ile karşılaştırıldığında farklı koşullar altında mantar büyüme görsel analiz tarafından gerçekleştirilir, bu da onun OD 600 ölçerek yapılabilir nm. Ancak, aşırı doz ölçüm için homojen çözümler doğru olsa da, bazı mantarlar böylece kırma yöntemi – duyarlığını kümeleri : Örneğin, Candida spp. kuluçka dönemi sırasında filamentation sonucu olarak büyümek.
Öte yandan, burada, CLSI M27-A3 yönergeleri ile karşılaştırıldığında, açıklanan protokol önemli avantajlarından bunun hesabı havalandırma Mantarlar, Sigara fermantasyon için medyanın içine gibi alır biri C. neoformans. Ayrıca, CLSI yönergeleri sadece böylece mantar büyüme ve mikrofon tanımı için kuluçka uzun bir süre gerektiren küçük bir ilk inoculum kullanır. Bazı çalışmalar daha yüksek baş harfleri inoculums ve plaka kuluçka sırasında sallayarak mikrofon belirlenmesi16,17üzerinde önemli etkileri olmadan antifungal duyarlılık testleri geliştirmek gösterdi. Bizim protokol 48 72 h CLSI kurallar tarafından önerilen göre h içinde bir kısaltılmış kuluçka döneminde C. neoformans karşı yeni bileşikler için mikrofon tam olarak belirleyebilirsiniz.
Başka bir avantaj bizim protokol 200 µL CLSI kurallar, bu nedenle antifungal tayini için gerekli test edilmiş yeni bileşik miktarını azaltarak tarafından tavsiye yerine 100 µL son hacim kullanıyor olması. Ancak, buharlaşma dış Wells bir endişe olabilir ama zaten buharlaşma azaltmak için bu bölümde açıklanan çözümler tahlil sonuçları ödün vermeden kullanılabilir.
Ayrıca, doğrudan plaka dilutions performans ve böylece microcentrifuge tüpler kullanılacak CLSI seyreltme yönergelerin atlayarak, çok kanallı Pipetler kullanılabilir. Bu iletişim kuralı derleme CLSI yönergeleri olandan daha az karmaşık ve aynı zamanda daha az malzeme kullanır.
Mantar hücre hazırlık ile ilgili önemli bir adım olarak taze hücre kullanımıdır. Ondan beri var çeşitli raporlar antifungal duyarlılık farklılıkları hakkında edebiyat kültürü18,19yaş zaman hücreleri ile tüm deneyleri aynı büyüme aşamasında gerçekleştirmek önemlidir. Başvuru suşları dikkatli seçimi de önemlidir. Bir çok önemli veya nadiren izole tür antifungal potansiyeli net bir resim üretmeyebilir. Aynı şekilde, olarak fazla değişken tahlil için değil eklemek için alt kodlamayla adımları önlemek yardımcı olur. Örneğin, Candida suşları, (ki daha hızlı büyümek) için doğrudan sıvı medya inoculum yaparak agar plaka adım atlamak tercih ediyoruz.
Test edilecek fizikokimyasal özellikleri özü veya bileşik düşünmeye önemli olduğunu unutmayın. Örneğin, özü veya bileşik ihtiyaçları solventler dışında su içinde çözünmüş gerekir yaparsanız bir uygun mantar büyüme kontrol sahibi olmak emin yalnız mantar ile aynı çözelti konsantrasyonu içeren. Bu herhangi bir büyüme inhibisyon gözlenen test edilmiş bileşik yerine çözücü nedeniyle değil garanti ya da hulâsa etmektir. Bu durumda, uyuşturucunun en az 100 kere daha yüksek çözücü yüzdesi azaltmak için en test edilmiş yoğun bir konsantrasyon içinde eriterek gibi antifungal ilaçlar seyreltilmiş DMSO, CLSI-M27A3 önerilerini takip etmek daha iyi olabilir plaka.
İstikrar ile ilgili olarak, bu küçük aliquots analiz özleri veya bileşikler tutmak için tavsiye edilir. Tek bir tahlil uygun sıcaklık, aşırı aliquot manipülasyon ve dondurulmuş özleri veya bileşikler depolanıyorsa, donma-çözülme çevrimleri önlenebilir için gerekli birim depolayarak.
Son olarak, verilen bu pipetting herhangi bir hata ardışık dilutions yayılır en temel adımlardan birini Mikroplaka seri seyreltme doğruluğunu var. Şu andan itibaren pipet hassas ve uygun pipetting teknikleri tekrarlanabilirlik sağlamak için olağanüstü vardır. Yani, bu kalibre kullanım Pipetler ve her zaman onay doğru birimin eklenen ve kaldırılan her kuyudan ise zorunludur. Kalıntı veya eser uyuşturucuyu pipet ucu kalır değil emin olun. Bileşik ucuna kadar sopa eğilimindedir, ipuçları dilutions arasında geçiş yapmak daha iyi olur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
BURUNLARI-Brezilya, CNPq-Brezilya, FAP/DF mali destek için teşekkür ediyoruz. El yazması gözden geçirilmesi için Dr. Hugo Costa Paes için minnettarız.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media and Reagents | |||
| RPMI 1640 medium with l-glutamine, without sodium bicarbonate | Thermo Fisher | 31800-022 | |
| 3-(N-morpholino) propane sulfonic acid (MOPS) (o que a gente usa tem um sódio, completa o nome dele please) | Sigma-Aldrich | Use to buffer 2X RPMI medium | |
| Sodium chloride (NaCl) | Dinâmica | 1528-1 | 137 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| Potassium chloride (KCl) | J.T.Baker | 3040-01 | 2.7 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | V000129 | 10 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | 60230 | 2 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| BD Difco Sabouraud dextrose broth | BD | 238230 | |
| BD Difco Sabouraud Dextrose Agar | BD | 210950 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | V000123 | 35% for (solução de estoque? Criopreservação?) |
| Sterile water | Para diluição das drogas na diluição seriada | ||
| Antifungal drugs | |||
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2942 | |
| Fluconazole | Sigma-Aldrich | F8929 | |
| Caspofungin | Sigma-Aldrich | PHR1160 | |
| Plastics | |||
| 50 mL conical tube | Sarstedt | 62.547.254 | |
| Dish petri | J.Prolab | 0304-5 | |
| 96 well plate | Corning | 3595 | |
| Sterile Solution Reservoir | KASVI | K30-208 | Use to pippet the solutions using the multichannel pippet |
| Equipment and other materials | |||
| Optical microscope | Nikon | E200MV | |
| Centrifugue | Thermo Fisher | MegaFuge 16R | |
| Incubator | Ethik Technology | 403-3D | Set to 37° C |
| Shaker | New Brunswick Scientific | Excella E25 | Set to 37° C, 200 RPM |
| Cell counting chamber, Neubauer | BOECO Germany | BOE 13 | |
| Multichannel pipette | HTL | 5123 |
References
- Armstrong-James, D., Meintjes, G., Brown, G. D. A neglected epidemic: fungal infections in HIV/AIDS. Trends Microbiol. 22 (3), 120-127 (2014).
- Romani, L. Immunity to fungal infections. Nat Rev Immunol. 11 (4), 275-288 (2011).
- Pfaller, M. A. Antifungal drug resistance: mechanisms, epidemiology, and consequences for treatment. Am J Med. 125 (1 Suppl), S3-S13 (2012).
- Hancock, R. E., Diamond, G. The role of cationic antimicrobial peptides in innate host defences. Trends Microbiol. 8 (9), 402-410 (2000).
- Wang, Y., et al. Snake cathelicidin from Bungarus fasciatus is a potent peptide antibiotics. PLoS One. 3 (9), e3217 (2008).
- Du, Q., et al. AaeAP1 and AaeAP2: novel antimicrobial peptides from the venom of the scorpion, Androctonus aeneas: structural characterisation, molecular cloning of biosynthetic precursor-encoding cDNAs and engineering of analogues with enhanced antimicrobial and anticancer activities. Toxins (Basel). 7 (2), 219-237 (2015).
- Benincasa, M., et al. Fungicidal activity of five cathelicidin peptides against clinically isolated yeasts. J Antimicrob Chemother. 58 (5), 950-959 (2006).
- CLSI. Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibiliy Testing of Yeasts; Approved Standard -Third Edition. CLSI document M27-A3. , Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2008).
- Guilhelmelli, F., et al. Activity of Scorpion Venom-Derived Antifungal Peptides against Planktonic Cells of Candida spp. and Cryptococcus neoformans and Candida albicans Biofilms. Front Microbiol. 7, 1844 (2016).
- The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Method for the determination of broth dilution minimum inhibitory concentrations of antifungal agents for yeasts, version, 7.3.1 2017. , Available from: http://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/AFST/Files/EUCAST_E_Def_7_3_1_Yeast_testing__definitive.pdf (2017).
- Roongruangsree, U. T., Kjerulf-Jensen, C., Olson, L. W., Lange, L. Viability Tests for Thick Walled Fungal Spores (ex: Oospores of Peronospora manshurica). Journal of Phytopathology. 123 (3), 244-252 (1988).
- Boedijn, K. B. Trypan blue as stain for fungi. Stain Technol. 31 (3), 115-116 (1956).
- Goihman-Yahr, M., et al. Studies on plating efficiency and estimation of viability of suspensions of Paracoccidioides brasiliensis yeast cells. Mycopathologia. 71 (2), 73-83 (1980).
- Tati, S., et al. Histatin 5-spermidine conjugates have enhanced fungicidal activity and efficacy as a topical therapeutic for oral candidiasis. Antimicrob Agents Chemother. 58 (2), 756-766 (2014).
- Petrou, M. A., Shanson, D. C. Susceptibility of Cryptococcus neoformans by the NCCLS microdilution and Etest methods using five defined media. J Antimicrob Chemother. 46 (5), 815-818 (2000).
- Zaragoza, O., et al. Process analysis of variables for standardization of antifungal susceptibility testing of nonfermentative yeasts. Antimicrob Agents Chemother. 55 (4), 1563-1570 (2011).
- Rodriguez-Tudela, J. L., et al. Influence of shaking on antifungal susceptibility testing of Cryptococcus neoformans: a comparison of the NCCLS standard M27A medium, buffered yeast nitrogen base, and RPMI-2% glucose. Antimicrob Agents Chemother. 44 (2), 400-404 (2000).
- Beggs, W. H. Growth phase in relation to ketoconazole and miconazole susceptibilities of Candida albicans. Antimicrob Agents Chemother. 25 (3), 316-318 (1984).
- Alcouloumre, M. S., Ghannoum, M. A., Ibrahim, A. S., Selsted, M. E., Edwards, J. E. Jr Fungicidal properties of defensin NP-1 and activity against Cryptococcus neoformans in vitro. Antimicrob Agents Chemother. 37 (12), 2628-2632 (1993).
