שיטת microdilution מרק קל וישימה לסינון תרכובות פטריות ותמציות.
זיהומים פטרייתיים הפכו מצב רפואי חשוב בעשרות השנים האחרונות, אך מספר תרופות נגד פטריות זמין הוא מוגבל. בתרחיש זה, החיפוש אחר תרופות נגד פטריות חדשות הכרחי. פרוטוקול דיווח על פרטי שיטה פפטידים מסך עבור מאפייניהם נגד פטריות. הוא מבוסס על ציר microdilution רגישות הבדיקה מן ההנחיות קלינית ומכון תקנים מעבדה (CLSI) M27-A3 עם שינויים שיתאימו למחקר של פפטידים מיקרוביאלית כמו תבחיני חדשים פוטנציאליים. פרוטוקול זה מתאר assay פונקציונלי כדי להעריך את הפעילות של תרכובות נגד פטריות, ניתן לשנות בקלות כדי להתאים כל סוג מסוים של מולקולות תחת חקירה. מאז מבחני מבוצעות ב- 96-ובכן צלחות באמצעות אמצעי אחסון קטן, הקרנה בקנה מידה גדול וניתן להשלים את כמות קצרה של זמן, במיוחד אם יבוצע באווירה אוטומציה. הליך זה מדגים איך פרוטוקול קליני מתוקנן, הניתנים לשינוי יכול לעזור המרדף ספסל-עבודה של מולקולות חדשות כדי לשפר את הטיפול של מחלות פטרייתיות.
זיהומים פטרייתיים הפכו הדאגה הרפואית חשובה במהלך העשורים האחרונים, נתקל גדל במידה ניכרת בעיקר בשל עלייה במספר של יחידים immunocompromised כגון אלה עוברת טיפול בסרטן, אלה החיים עם HIV/איידס או מושתלים איברים1,2. עם זאת, מערך מוגבל מאוד של תרופות נגד פטריות זמין, הגדלת מספר דיווחים על ההתנגדות פטרייתי להם לתרום הבעיות העיקריות לגבי הרפוי של mycoses מערכתית3.
מקור פוטנציאלי של תרכובות חדשות פטריות הם פפטידים מיקרוביאלית (אמפר), קטן פפטידים cationic המיוצר על ידי אורגניזמים רבים כחלק שלהם תגובה חיסונית מולדת זיהום4. למרות זאת, שיטת ההקרנה כדי לבדוק את המשחות נגד פתוגנים ופטריות אינה אחידה. הליכים שונים שימשו כדי להעריך את הפעילות פטרת של אמפר, לפעמים על אותו מודל מיקרואורגניזם5,6,7. הבדלים אלה וחוסר פרט פרוטוקולים מסוימים לסבך השוואות בין הפארמצבטית תרכובות ואת הסלים.
דרך אחת כדי לתקנן את הבדיקות למועמדים סמים חדשים היא לעקוב אחר הנחיות המשמש להגדרת הרגישות פטריות בהגדרות קליני, כגון קלינית והנחיות M27 מכון תקנים מעבדה (CLSI)-A3. עם זאת, בדיקות רגישות פטריות אלה מגבילות מדי, לא עשה שיקול וריאציה בחילוף החומרים על פני מינים, כפי שהם הוקמו רק עבור כמה סוכנים בחר. לדוגמה, הם לא לוקחים בחשבון את צרכי חילוף החומרים שאינם התססת שמרים.
פרוטוקול זה מאפשר את ההערכה של פעילות של תרכובות פטריות פוטנציאליים והוא מיושם כאן לחיפוש פטריות פפטידים. הוא מבוסס על ציר microdilution רגישות הבדיקה מן ההנחיות CLSI M27-A3 עם שינויים לייעל את ההקרנה של תרכובות חדשות8,9. שינויים אלה מאפשרים השימוש כמויות קטנות של המתחם, וריאציות של טמפרטורה או inoculum הראשונית, מדיה שונים לצמיחה pre-test אופטימלית, תוך המתקנות את התוצאות עם השימוש של הפניה תבחיני כפקדים. שיטה זו, עם השימוש של תרבות רב טוב צלחות, מאפשר למסך במהירות ובאמינות מספר רב של תרכובות.
עקב הגמישות שלה, פרוטוקול זה יכול לשמש עם מחלקות שונות הכימי של תרכובות ונגד מיקרואורגניזמים אחרים, עם כמה עיבודים.
בדיקות Microdilution יכול לנתח את הפעילות נגד פטריות פוטנציאלי של מטרה מורכבים באמצעות כמויות קטנות של המתחם, באותו זמן לבחון אותה בטווח ריכוזים. בהתאם לכך, פרוטוקול זה מומלץ כשלב ראשון סינון עבור פוטנציאל תרכובות חדשות נגד פטריות. פרוטוקול המובאת כאן מבוססת על פרוטוקול M27-A3, תוכנן בתחילה כדי לס?…
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים שכמיות-ברזיל, CNPq-ברזיל, FAP/DF עבור תמיכה כספית. אנחנו אסירי תודה ד ר הוגו קוסטה פאיס עבור תיקון כתב היד.
Media and Reagents | |||
RPMI 1640 medium with l-glutamine, without sodium bicarbonate | Thermo Fisher | 31800-022 | |
3-(N-morpholino) propane sulfonic acid (MOPS) (o que a gente usa tem um sódio, completa o nome dele please) | Sigma-Aldrich | Use to buffer 2X RPMI medium | |
Sodium chloride (NaCl) | Dinâmica | 1528-1 | 137 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
Potassium chloride (KCl) | J.T.Baker | 3040-01 | 2.7 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | V000129 | 10 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | 60230 | 2 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
BD Difco Sabouraud dextrose broth | BD | 238230 | |
BD Difco Sabouraud Dextrose Agar | BD | 210950 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | V000123 | 35% for (solução de estoque? Criopreservação?) |
Sterile water | Para diluição das drogas na diluição seriada | ||
Antifungal drugs | |||
Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2942 | |
Fluconazole | Sigma-Aldrich | F8929 | |
Caspofungin | Sigma-Aldrich | PHR1160 | |
Plastics | |||
50 mL conical tube | Sarstedt | 62.547.254 | |
Dish petri | J.Prolab | 0304-5 | |
96 well plate | Corning | 3595 | |
Sterile Solution Reservoir | KASVI | K30-208 | Use to pippet the solutions using the multichannel pippet |
Equipment and other materials | |||
Optical microscope | Nikon | E200MV | |
Centrifugue | Thermo Fisher | MegaFuge 16R | |
Incubator | Ethik Technology | 403-3D | Set to 37° C |
Shaker | New Brunswick Scientific | Excella E25 | Set to 37° C, 200 RPM |
Cell counting chamber, Neubauer | BOECO Germany | BOE 13 | |
Multichannel pipette | HTL | 5123 |