Summary
虽然多光子成像仅在距组织表面的有限深度有效，但可以通过pCLE在任何深度实现3μm分辨率成像。在这里，我们提出了一种进行pCLE成像的方案，以测量发作期和野生型小鼠海马体中的微血管动力学。
Abstract
该协议的目的是描述光纤束耦合的临床前共聚焦激光扫描内窥镜（pCLE）的具体应用，以阐明癫痫发作期间由壁细胞驱动的毛细血管血流效应。体外和体内皮质成像表明，由周细胞驱动的毛细血管收缩可由健康动物的功能性局部神经活动以及药物应用引起。在这里，提出了如何使用pCLE确定微血管动力学在任何组织深度（特别是在海马体中）癫痫神经变性中的作用的方案。我们描述了一种头枕技术，该技术已被用于记录清醒动物的pCLE，以解决麻醉剂对神经活动的潜在副作用。使用这些方法，可以在大脑的深层神经结构中进行数小时的电生理和成像记录。
Introduction
与其他显微成像方法1,2,3,4,5,6,7,8相比，基于光纤的活体共聚焦显微镜允许以高速（高达240 Hz，取决于视场大小9）测量任何大脑区域、任何深度、任何深度的血流动力学).光纤探针能够以 3 μm 的分辨率进行体内共聚焦激光扫描成像，因为探针的尖端（由一束 5000-6000 根直径为 3 μm 的单根光纤组成的无透镜物镜）可以以微电极的精度定位在目标荧光靶标的 15 μm 范围内。与体内双光子成像一样，必须事先将荧光团引入成像靶标。例如，可以将荧光素葡聚糖（或量子点）注射到脉管系统中，或者可以将遗传编码的荧光蛋白转染到细胞中，或者在成像之前将荧光染料（如俄勒冈绿BAPTA-1）批量加载到细胞中。
最近使用这些技术的研究发现，导致发作性毛细血管痉挛的壁细胞运动活动（癫痫发作期间壁细胞位置突然收缩9）可导致发作性海马神经退行性变9。虽然先前的影像学研究显示体外和体内周细胞收缩与药物应用有关 6,7,10,11,12，但 Leal-Campanario 等人发现了小鼠大脑中体内自发毛细血管收缩的第一个证据。为了确定与人类颞叶癫痫的相关性，他们研究了雄性（P30-40 岁）敲除 （KO） Kv1.1 （kcna1-null） 小鼠 14,15 （JAX stock #003532），这是人类发作性共济失调 1 型的遗传模型15.周细胞在自发性癫痫动物及其野生型 （WT） 同窝动物中驱动病理性和生理性海马壁画血管收缩9。这些观察结果在用红藻氨酸使癫痫的WT动物中复制，从而表明它们适用于其他形式的癫痫。此外，Leal-Campanario等人使用新颖的立体显微镜方法确定，癫痫动物的凋亡神经元（但不是健康的神经元）在空间上与海马微血管系统耦合。由于兴奋性毒性与脉管系统没有已知的空间关联，因此该结果表明异常毛细血管痉挛性缺血引起的缺氧会导致癫痫的神经退行性变。图 1 显示了总体设置的原理图。
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Protocol
该协议遵循美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南。所有程序均由巴罗神经学研究所的机构动物护理和使用委员会批准。
1. 立体定位用于开颅手术
- 称重，然后用氯胺酮 - 甲苯噻嗪（100mg / kg - 10mg / kg腹腔注射）混合物麻醉小鼠。通过观察动物对尾巴和/或脚趾捏合没有反应，确保动物完全麻醉。
- 在初始麻醉植入手术期间，将加热垫放在鼠标下方，并使用直肠温度计连续监测其体温（图2A）。
- 涂抹眼药膏以防止眼睛干涩。
- 将动物的头部稳定在配备鼠标适配器的啮齿动物立体定位框架中。为了在立体定位框架中正确定位鼠标，将动物的牙齿放在咬杆的孔内（图2A和图3A，g项）。拧紧鼻子夹，直到它紧贴（图 2A、B 和图 3A，h 项）。鼠标的身体位置应尽可能笔直（如图 2A 所示）。
- 使用带有下颌支架袖口的鼠标耳杆进一步固定动物的头部（图2A和图3A，i项），以牢固地夹住头骨的颧骨突。
注意： 固定后，鼠标的头部不应有水平运动范围。
- 使用带有下颌支架袖口的鼠标耳杆进一步固定动物的头部（图2A和图3A，i项），以牢固地夹住头骨的颧骨突。
- 一旦将鼠标调整到立体定位框架（图3B，j项），通过用氯己定擦洗膏擦拭头皮2-3次来清洁和消毒头皮，每次然后用酒精冲洗。然后，在头顶涂抹局部利多卡因。
- 使用细剪刀或刀片，沿着颅骨矢状中线从后到前沿中线切开一个切口（从颅骨底部开始切开，并在眼睛之间完成切口;12-15 毫米）。用四个28毫米斗牛犬serrefine夹缩回头皮的边缘，以暴露头骨并最大化工作区域（图2B 和 图3C）。
- 使用手术刀或微刮刀（图3C）将骨膜刮到切口的边缘。使用组织分离剪刀或镊子（图3C）小心地缩回颈部后部的肌肉（图2B）。
- 用蘸有酒精或30%过氧化氢的棉签擦干颅骨顶部，以优化颅缝线的可视化。切除结缔组织后，将生理盐水涂抹在颅骨上。
- 一旦小鼠的头部稳定在立体定位装置中，将注射器针尖（21G）放入电极支架（图3B，l项）中，并将电极支架连接到立体定位显微操纵器上，将针尖降低到颅骨的水平（图2D）。
- 通过测量前囟后任何距离处的颅骨高度（即-2.0mm）以及颅骨两侧中线的两个相等的横向距离（即±1.5mm）来调整颅骨的内侧 - 外侧方向（图2D）。目标是在背腹方向上，不同位置的高度差小于 0.05 毫米。
- 如果大于 0.05 毫米，请使用咬杆旋转鼠标的头骨，或者通过小心地松开耳杆来重新定位鼠标的头部，根据需要横向移动头部和耳杆，然后重新拧紧耳杆。
- 将颅骨定位在立体定位装置中后，确定并记录前后 （AP）、内侧外侧 （ML） 和背腹 （DV） 轴沿线的囟和 lambda 颅骨缝合线的立体定向坐标。
- 借助立体定位图谱确定目标点（右海马体）。然后，在颅骨上找到相对于囟的目标点坐标（AP：-2.7 mm，ML：-2.7 mm）（图2E）。
- 使用手术标记，在颅骨上用点标记 1.4 mm x 2 mm 成像窗口的四个角，以海马体正上方的目标点为中心（图 2F），用于随后的开颅手术。
- 使用手术标记画出两个额外的点：一个在左上顶骨（图2G）上，另一个在右额骨（图2H）上，以指示未来放置两个骨螺钉（图3A，b项），将头帽（图3B，m项）固定在颅骨上。
- 使用手术标记再画三个点，指示硬膜外脑电图记录电极的插入位置：一个点位于中线两侧 1 毫米处，中线上另一个点位于 Lambda 后方 1 毫米处（图 2E、 图 4A 和 图 5B）。
2. 头盖安装
- 使用直径为0.7毫米的毛刺（图3C），小心地在头骨上钻两个小孔，在指示接骨螺钉位置的点位置（参见上面的步骤1.15）。然后，取两个接骨螺钉（不锈钢开槽，长度：4 mm;直径：0.85 mm），事先用乙醇 70-80% 消毒，并将它们拧到颅骨上以增加头帽稳定性（图 2I-J 和 图 3A，b 项）。
- 确保螺钉尖端不会从骨头底部突出到颅腔中，以免损坏大脑。请注意，两个接骨螺钉中的一个位于两个头帽螺钉的前面，另一个位于它们的后面（图 2G-J）。
- 将生理盐水喷在头骨上，使其冷却并清洁。然后将头骨完全干燥，并在螺钉周围涂上一层薄薄的氰基丙烯酸酯。
- 使用定制的对准件（图3A，c项），夹紧到安装在立体定位装置上的微型驱动器（图2F-J和图3A，d项），使头帽的位置沿中线对齐，前脊覆盖前囟。这种定制的不锈钢件呈 L 形（成 90° 角），两个孔相隔 4 毫米（图 2F-J 和图 3A，c 项）。
- 使用立体定位机械手定位 L 形对准件，并连接两个 Fillister Head 开槽驱动螺钉（M1.6 x 0.35 公制粗，12 mm 长;图 3A，a） 项）在前囟上，直到螺钉的底部平放在颅骨上，注意不要对颅骨施加压力（图 2I-J）。
- 先涂上氰基丙烯酸酯，然后涂上牙胶，将螺钉的底部连接到颅骨上。注意不要阻挡海马体上的成像窗口参考标记（图2K）。
3.成像窗口开颅手术
- 在指示成像窗口角的开颅参考标记的每个位置（参见上面的步骤1.14），钻一个直径为0.7mm的毛刺孔，然后用钻头轻轻描绘1.4 mm x 2 mm开颅手术窗口的外围，迭代更深的切口（图2L）。
- 注意不要在头骨上钻得太深或用力过大，头骨薄而脆弱，厚度约为 300 μm。骨瓣完成后，用手术刀的尖端撬开松散的皮瓣，注意不要损坏下面的硬脑膜。
- 用骨蜡盖住打开的窗户（图2M）。
- 使用直径为 0.9 毫米的毛刺，钻三个孔以备将来放置硬膜外脑电图电极（参见上面的步骤 1.15），注意不要切穿硬脑膜（图 2E，L）。
- 用骨蜡盖住三个孔。
- 轻轻地在骨蜡覆盖的成像窗口和脑电图孔的边缘周围涂抹氰基丙烯酸酯，注意不要密封开颅手术（图2L）。
- 构建一堵牙胶壁，包括成像窗口和脑电图孔，并将其与先前粘合的头盖结合（图2M 和 图3B，m项）。
- 让水泥干燥至少 10 分钟。
- 使用4-0或5-0黑色编织丝（图2N 和 图3C），用简单的中断缝合线闭合任何松散的伤口边缘。
4. 术后
- 使用棉签涂抹器在暴露的皮肤周围涂抹利多卡因软膏，以减轻伤口边缘的感觉。
- 使用无菌棉签涂抹器将新孢菌素涂抹在暴露的皮肤上。
- 将动物从立体定位框架中取出（图2N）。
- 注射酮洛芬 （5 mg/kg） IP 或 IM 用于术后镇痛。
- 观察动物，直到它警觉并移动（这通常会在几分钟内发生）。
- 将动物放在温暖的笼子里，继续监测其恢复情况，直到它喝水或进食并准备转移到动物舍。
- 手术后约一周内每天至少检查一次动物，观察是否有任何无精打采的行为和/或进食/饮水不足的迹象（图2O）。
5.染料注入和脑电图记录
- 在头帽植入手术后至少等待一天以开始记录。
- 将鼠标置于立体定位框架内模制到其身体上的泡沫约束装置中（图3B，n项和j项）。
- 将头盖（图 3 B-I，m 项）固定到连接到立体定位框架的定制安装杆上（图 3A、B、e 和 j 项以及图 4A）。e 项的长截面（图 3A、B）的长度应在 9.4 – 13 毫米之间。将项目 f（尺寸为 1.5 cm x 0.5 cm 的安装板，两个孔从中心到中心分开 4 mm）固定到 e 项目（图 3A、B、项目 e、f 和 k）。在整个成像过程中，该对准系统将唤醒鼠标牢固地定位到立体定位框架上（图 4）。
- 插入硬膜外脑电图记录电极（图5A），将接地电极（白线）置于后中心孔内，将记录电极（红线）置于前左孔和右孔中（图2E，图4E和图5E）。将每根电线放置在颅骨和硬脑膜之间的L形位置（图5C）以优化电接触。
- 用绿色荧光素赖氨酸固定葡聚糖（0.2 mL / 25 g 体重 5% w / w）注射尾静脉，以可视化海马体内的血流。
- 为了在注射前增强小鼠尾巴中央静脉的扩张，请使用以下一种或多种策略：a）使用棉签涂抹器将70%乙醇施加到中央静脉;b） 将尾巴浸入温水（35-40°C）中1-3分钟;c） 将尾巴暴露在加热灯下几分钟。
- 用两根手指固定鼠标的尾巴，并找到位于皮肤正下方的中央静脉。将针头（带集成针头 30G 的超细胰岛素注射器）插入静脉，斜面朝上，距离尾部底部约一半至三分之二处。注射过程中保持针头与尾部平行。
- 缓慢而稳定地注入染料，注意避免针头或尾巴位置发生任何变化。
注意： 按下注射器柱塞时不应有阻力。 - 完成注射后，拔出针头，对穿刺部位施加轻轻的压力以密封血管。
- 允许凝血发生。
6. 体内光纤束耦合临床前共聚焦激光扫描内窥镜（pCLE）
- 紧接尾静脉注射（上述步骤5.5.3），将300μm斜面光纤束（每束包含5000-7000 3μm光纤）向下夹紧到机器人立体定位驱动器的移动臂。
- 从开颅手术中取出骨蜡。
- 使用注射器针头的弯曲尖端取出硬脑膜。
- 使用机器人定位系统，首先将光纤物镜移动到适当的前后和左右立体定位位置，尖端在皮层表面的 z 轴上归零。
- 启动脑电图记录（图5D）。
- 启动光纤物镜背板的共聚焦激光扫描，然后使用机器人微驱动器的 z 轴直接将物镜沿 z 轴缓慢下降，直到它到达大脑内的目标深度（图 4C）。下降时在显微软件中查看成像结果。
- 如果光纤尖端在目标 X-Y-Z 记录区域内，并且两只或多根血管进入成像窗口的 FOV，则停止下降并开始视频录制。使用 Cellvizio Lab 的成像软件以 11.7 Hz 的频率获得血流的实时全场延时电影。（较小的 FOV 可以获得更高的速度）。录音可以一次进行 4-5 小时，如果需要，可以连续几天进行。
- 使用固定在针尖上的斜面硅胶管的10mL注射器，在记录期间通过定期提供用水研磨的小鼠颗粒制成的糊状物来喂养动物。
- 在映像会话结束时，终止录制。
- 轻轻移除脑电图导线并用Tergazyme清洁它们。
- 通过沿进入的z轴反转光纤，从动物的大脑中缓慢移除光纤束。
- 将动物从头柱和身体约束装置中释放出来。
- 如果合适，请遵循必要的安乐死和组织处理方案，以可视化血管并进行免疫组织化学。
- 如果计划在将来的会话中记录同一只动物，请用骨蜡或硅酸盐覆盖成像窗口。
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Representative Results
我们开发了这些方法来评估海马体中异常的周细胞驱动的毛细血管痉挛（由于癫痫发作而发生）是否会导致明显的缺氧，从而导致发作灶的细胞死亡9,13。
头帽的开发及其正确安装为记录提供了高稳定性，允许在发作期和发作间期同时记录野生型和癫痫清醒小鼠海马深处的脑电图和血流。捕获与癫痫发作相关的血流事件需要长时间记录，以便可以捕获非周期性血流事件（例如血管痉挛），以应对诱发和自然发生的癫痫发作。约束系统允许长时间稳定地记录深部脑微血管及其近端壁细胞的血流（图 6A-R）。我们发现，在整个微血管中，血流停止发生在标记的壁细胞的位置。
我们使用机器人立体定位设备可靠地定位了海马体中的血管，该设备以标准立体定位图谱的内部坐标为目标。我们通过将它们与皮质组织血流和等效血管痉挛的高分辨率双光子成像记录进行比较来验证纤维记录的质量，在双光子成像可以达到的深度（图 6S-AA）。我们在记录位点使用免疫组化进一步验证了 pCLE 结果，以显示传统的共聚焦显微镜显示海马壁细胞被正确靶向，并且它们不仅收缩，而且在空间上与远离小动脉15 的微血管中的狭窄相关（图 7）。
这些方法的已发表结果确实显示了由癫痫发作驱动的异常海马毛细血管痉挛，以及 Kv1.1 癫痫突变小鼠和红藻氨酸模型癫痫小鼠的相关细胞死亡 9,13。这些结果表明，由于异常血管痉挛，局部发作性缺血/缺氧在癫痫发作期间的细胞死亡中起作用，并有助于越来越多的工作扩展发作性细胞死亡的潜在机制。
图 1：实验设计的示意图。 我们在清醒癫痫小鼠和WT同窝小鼠的海马毛细血管中进行共聚焦显微镜检查时记录了脑电图。在尾静脉注射荧光素后，我们使用了一种新型的临床前共聚焦激光扫描内窥镜 （pCLE），其尖端直径为 0.3 mm 的纤维物镜记录了大脑深处的毛细血管血流动力学。黄色表示血流量增加，红色表示血流量稳定或减少。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：头帽植入手术方案。 A）将麻醉的动物放置在加热垫上并定位在立体定位框架内（参见图3B，j项），并用小鼠耳杆（图3A，i项）和颚架袖带（图3A，g，h项）固定在加热垫上。B） 颅缝线暴露。C-D）Bregma 和 Lambda 的测量。E） 动物头骨上的钻孔位置可视化。黑点和正方形表示海马体上允许插入pCLE的窗口。两个红色圆圈标记了脑电图记录线的插入位置。白点标记了脑电图地线的插入点。F） 头骨上的四个黑点标记了海马体成像窗口开颅术的未来角。定制对准件（图3A，c项），头柱植入物（图3A，a项）连接到立体定向微驱动器定位器（图3A，d项）。G-H）另外两个点，一个后部（G）和一个前部（H）标记了头盖地脚螺钉的未来位置（图3A，b项）。I-J）两个小螺钉将头盖固定在头骨上（图3A，b项）。K）氰基丙烯酸酯和牙科水泥被涂在面板I和J.L.的锚钉上，海马体上的成像窗口开颅术，以及EEG电极的三个孔，已经钻了。M）通过用额外的牙科水泥雕刻护堤来构建成像室（图3B，i，m项），以包围三个脑电图孔和成像窗口。N） 成品头盖的俯视图。O） 植入手术后恢复的小鼠放回笼子里。请点击这里查看此图的较大版本.
图3：《议定书》中使用的材料（用小写字母列举的具体项目）。 A） 用于制造头盖的材料。（a） 两颗 M1.6 x 12 mm 机械螺钉（头柱植入物）。（二）两个小螺栓将头帽固定在头骨上。（c） 一个定制的 L 形不锈钢对准件，有两个相距 4 毫米的孔，用于在手术过程中固定两个 M1.6 螺钉。（d） 安装在立体定位装置上的标准微型驱动器固定 c 项。 （e） 带有 （f） 对准件的定制安装杆，与 c 项中的两个孔相匹配。 （g） 咬杆和 （h） 鼻夹，用于稳定动物头部的位置。 B） 在录制过程中进行设置。（i） 在麻醉植入手术期间，头帽固定在 f 项上。（j） 立体定位框架定位微型驱动器（d项）。（l） 将 21G 针连接到微型驱动器（d 项）上，用于确定 Bregma 和 Lambda 颅缝线的位置。（m） 此处显示了附在项目 f 上的模拟头帽，以演示鼠标在 （n） 泡沫衬里约束管（不存在鼠标）中的位置。第 n 项将自己塑造成鼠标身体的形状。 C） 进行手术所需的器械和用品。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 4：录制会话设置。 A） 动物的头部是固定的。 B） 脑电图记录线的位置。白色脑电图线分别放置在颅骨的每一侧。红色脑电图线一起放置在中间底部（接地）孔中。 C） 将光纤束插入目标窗口。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 5：脑电图记录。 A） 硬膜外脑电图记录使用 Physiotel F20-EET 发射器进行，与清醒动物的光纤 pCLE 记录同时进行。B） 用于插入脑电图记录导线的钻孔的位置。两条红色引线通向红点指示的两个孔。将两根白色引线一起插入白点指示的孔中。红色方块表示动物海马体上的目标窗口。老鼠头骨上的字母“B”表示囟。C） 脑电图记录线弯曲成 L 形，以增强颅骨和硬脑膜物质之间的电接触。D）清醒小鼠脑电图记录的例子。请点击这里查看此图的较大版本.
图 6：小鼠壁细胞血管收缩的记录。 A-R）毛细血管痉挛（绿色血管，用 2MD 荧光素偶联葡聚糖标记）共定位到壁细胞（红色，通过静脉内静脉尾部注射 Alexa Fluor 647 标记）的体内光纤双频 pCLE 图像在癫痫发作期间清醒的敲除小鼠（箭头表示壁细胞和相关的血管痉挛）。请参阅视频 1 和 视频 2。 西南）野生型小鼠毛细血管（绿色）和壁细胞（红色）的体内双光子扫描激光显微镜（TPLSM）堆栈。请参阅 视频 3。 X-Z）kainic小鼠壁细胞定位（红色）毛细血管收缩的体内TPLSM。请参阅 视频 4。 AA级）在白线处测量的面板 X-Z 的血管收缩量化。面板的刻度 A-R= 5 μm;S-W= 25 微米;X-Z= 5 微米。视频以 11.7 Hz 录制。摘自 Leal-Campanario 等人 8. 请点击这里查看此图的较大版本.
图 7：记录的大脑的免疫组化。 A-B）在不同放大倍率下注射荧光素葡聚糖（绿色）的血管。DAPI染色的细胞核为蓝色（白色箭头）。比例尺 A= 200 μm;B = 100 μm 的比例尺。 C） 注射荧光素的大脑不同部分，其中可以清楚地看到红细胞（红色箭头）。比例尺 = 50 μm。 请点击这里查看此图的较大版本.
视频1： 在 KO 海马毛细血管中记录血管痉挛和壁细胞血流 （11.7 Hz）。请参阅 图 6A-H 中同一记录的帧。 请按此下载此影片。
视频2： 血管痉挛、白细胞阻塞、血流和壁细胞记录在 WT 海马毛细血管 （11.7 Hz） 中。请参阅 图 6I-R 中同一记录的帧。 请按此下载此影片。
视频3： 用 TPLSM 记录体内 WT 小鼠顶叶皮层中的不均匀血流。请参阅 图 6S-W 中同一记录的帧。 请按此下载此影片。
视频4： 用 TPLSM 记录的癫痫发作动物顶叶皮层的壁细胞驱动（红色）毛细血管（绿色）收缩。请参阅同一记录中的帧， 图 6X-Z。 请按此下载此影片。
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Discussion
我们开发了一种头帽约束系统，用于在清醒小鼠中同时进行电生理和光纤 pCLE 实验，从而减少麻醉药物引起的潜在反应污染。头盖和安装装置结构简单，可重复用于慢性清醒成像实验。我们根据体内显微血流成像的金标准TPLSM检查了记录的质量。
熟练的手术技能是实施我们在这里描述的方案的必要条件。手术必须在无菌条件下进行，并始终在手术显微镜下进行，同时在海马体上钻孔窗口时注意保持硬脑膜完好无损。熟悉下面的脉管系统是必不可少的，因为在大血管上方切开会产生不良出血的风险。
将动物正确地置于立体定位对齐中可确保在连接头帽之前前后平面水平。这种保护措施有助于在大脑图谱的帮助下定位脑位点。
小鼠运动可能导致血管损伤或血管痉挛的错误记录（即纤维运动而不是真正的血管运动），因此在记录过程中减少动物运动很重要。约束管内的泡沫衬垫有助于延长录制会话的持续时间，同时最大限度地减少鼠标的压力和移动。小鼠更喜欢紧贴泡沫，因此正确贴合可减少过度运动。如果没有这种预防措施，老鼠可能会挣扎。如果鼠标确实出现挣扎迹象，则应终止录制会话。一旦生理应激反应减弱，第二天可能会恢复录音。在我们的录音中，这些动物在大多数时候显然都很平静。
我们注意到，当探针向脑组织差异移动时，对pCLE成像方法产生最大负面影响的运动。动物的呼吸、癫痫发作和运动是无关紧要的，除非它们相对于组织移位了纤维探针。也就是说，当成像探头以差异方式移动到组织时，整个成像场作为一个整体移动，使运动伪影变得明显。因此，始终一次记录两条或多条血管至关重要：如果所有血管同时移动，可能是由于纤维不稳定，而如果至少一条血管没有变化，则其他血管中观察到的变化可能是由于血流的实际变化，包括血管痉挛。
与 TPLSM 相比，pCLE 成像方法的一个局限性是纤维探针刺穿软脑膜，因此对大脑具有侵入性。当探针下降时，它会对它所通过的神经组织造成一些损害。因此，连续两天从同一艘船上进行录音可能非常困难，即使在两个会话中都使用相同的精确坐标（通常只有在初始录制会话持续时间较短的情况下才有可能）。因此，在进行慢性录音研究时，在随后的录音过程中以越来越深的录音进行录音至关重要。
血流实验结果表明，兴奋性毒性并不是发作期细胞死亡和海马硬化的唯一机制途径13。毛细血管血流受限在发作性神经退行性变中起作用的发现为将本文描述的方法扩展到识别身体任何深度和任何组织中的微观血流变化铺平了道路，用于临床诊断目的。
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Disclosures
我们没有什么可透露的。
Acknowledgments
该项目由美国癫痫学会的研究倡议奖、亚利桑那州生物医学研究委员会授予SLM的奖项以及预防失明研究公司向纽约州立大学下州健康科学大学眼科系提供的挑战资助，纽约州帝国创新计划， 以及美国国家科学基金会（0726113、0852636和1523614）、巴罗神经学基金会、玛丽安·罗谢尔夫人、格蕾丝·韦尔顿夫人和尊严健康 SEED 奖的进一步资助，以及美国国家科学基金会（0726113、0852636 和 1523614）和美国国立卫生研究院（R01EY031971 AND R01CA258021 奖项）对 SLM 和 SMC 的进一步资助。 这项工作也得到了负责卫生事务的助理国防部长办公室的支持，奖励编号为。W81XWH-15-1-0138，至 S.L.M. L.-C.得到了西班牙教育部José Castillejo奖学金的支持。我们感谢 O. Caballero 和 M. Ledo 提供的技术咨询和援助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.7 mm diameter burr | Fine Science Tools | 19007-07 | For Screws No. 19010-00 |
| 0.9 mm diameter burr | Fine Science Tools | 19007-09 | |
| ASEPTICO AEU-12C TORQUE PLUS | from Handpiece solution | AEU12C | |
| Bull dog serrifine clump | Fine Science Tools | 18050-28 | |
| CellVizio dual band | Mauna Kea Technologies | ||
| CellVizio single band | Mauna Kea Technologies | ||
| Confocal Microprobe 300 microns (Serie S) | Mauna Kea Technologies | ||
| Custom-made alignment piece | L-shaped (angled at 90 deg) and made of stainless steel with two holes drilled on it, with a 4 mm separation from center to center | ||
| Custom-made mounting bar | The long section piece of the mounting bar should be between 9.4 - 13mm. Fixed to this piece of the mounting bar, position a stainless-steel plate 1.5 cm long and 0.5 cm wide that has two holes drilled separated 4 mm from center to center, the same distance that the L-shaped alignment piece. | ||
| Cyanoacrylate adhesive-Super Glue | |||
| Dumont forceps #5 | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| DuraLay Inlay Resin – Standard Package | Reliance Dental Mfg Co. | 602-7395 (from patterson dental) | |
| Fillister Head, Slotted Drive, M1.6x0.35 Metric Coarse, 12mm Length Under Head, Machine Screw | MSC industrial direct co. | 2834117 | |
| Fine Point scissor | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Fluorescein 5% w/w lysine-fixable dextran (2MD) | Invitrogen, USA | D7137 | |
| Halsey smooth needle holder | Fine Science Tools | 12001-13 | |
| Kalt suture needle 3/8 curved | Fine Science Tools | 12050-03 | |
| lab standard stereotaxic, rat and mouse | Stoelting Co. 51704 | 51670 | |
| Methocel 2% | Omnivision GmbH | PZN: 04682367 | Eye ointment to prevent dryness. |
| Mouse Temperature controller, probe (YSI-451), small heating pad-TC-1000 Mouse | CWE Inc. | 08-13000 | |
| PhysioTel F20-EET transmitters | DSI | 270-0124-001 | |
| Robot Stereotaxic, Manipulator Arm, ADD-ON, 3 Axis, LEFT | Stoelting Co.C13 | 51704 | |
| Sel-Tapping bone screws | Fine Science Tools | 19010-10 | |
| Standard Ear Bars and Rubber Tips for Mouse Stereotaxic | Stoelting Co | 51648 | |
| Suture Thread - Braided Silk/Size 4/0 | Fine Science Tools | 18020-40 | |
| Tissue separating microspatula | Fine Science Tools | 10091-121 |
References
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