In vivo fiberkopplad preklinisk konfokal laserskanningsendomikroskopi (pCLE) av hippocampuskapillärer hos vakna möss

Summary

Medan multifotonavbildning endast är effektiv på begränsade djup från vävnadens yta, är det möjligt att uppnå 3 μm upplösning på vilket djup som helst via pCLE. Här presenterar vi ett protokoll för att utföra pCLE-avbildning för att mäta mikrovaskulär dynamik i hippocampus hos iktal- och vildtypsmöss.

Abstract

Målet med detta protokoll är att beskriva fiberoptisk buntkopplad preklinisk konfokal laserskanningsendomikroskopi (pCLE) i dess specifika tillämpning för att belysa kapillära blodflödeseffekter under anfall, drivna av väggceller. In vitro och in vivo kortikal avbildning har visat att kapillärförträngningar som drivs av pericyter kan bero på funktionell lokal neural aktivitet, såväl som från läkemedelstillämpning, i friska djur. Här presenteras ett protokoll för hur man kan använda pCLE för att bestämma den mikrovaskulära dynamikens roll i neural degeneration vid epilepsi, på vilket vävnadsdjup som helst (specifikt i hippocampus). Vi beskriver en huvudstödsteknik som har anpassats för att registrera pCLE hos vakna djur, för att hantera potentiella biverkningar av anestesimedel på neural aktivitet. Med hjälp av dessa metoder kan elektrofysiologiska och avbildningsinspelningar utföras under flera timmar i djupa neurala strukturer i hjärnan.

Introduction

Till skillnad från andra mikroskopiska avbildningsmetoder 1,2,3,4,5,6,7,8 möjliggör in vivo fiberoptisk konfokalmikroskopi mätning av blodflödesdynamik i vilken hjärnregion som helst, på vilket djup som helst^, med hög hastighet (upp till 240 Hz beroende på synfältsstorlek⁹). En fiberoptisk sond möjliggör in vivo konfokal laserskanningsavbildning med 3 μm upplösning eftersom spetsen på sonden (ett linslöst objektiv som består av en bunt av 5000-6000 3 μm diameter enskilda fibrer) kan positioneras med en mikroelektrods noggrannhet, inom 15 μm från det fluorescerande målet av intresse. På samma sätt som vid in vivo-avbildning med två fotoner måste fluoroforer föras in i avbildningsmålet. Till exempel kan fluoresceindextran (eller kvantprickar) injiceras i kärlen, eller genetiskt kodade fluorescerande proteiner kan transfekteras in i celler, eller fluorescerande färgämnen som Oregon Green BAPTA-1 kan bulkladdas in i celler före avbildning.

Ny forskning med hjälp av dessa tekniker har visat att muralcellernas motoriska aktivitet som leder till iktala kapillära vasospasmer - plötsliga sammandragningar som uppstår vid väggcellernas position under anfall 9 - kan bidra till neurodegeneration i iktal hippocampus⁹. Medan tidigare avbildningsstudier visade in vitro och in vivo pericytsammandragningar kopplade till läkemedelsapplikationer 6,7,10,11,12^, fann Leal-Campanario et al. de första bevisen på spontana kapillärsammandragningar in vivo i den murina hjärnan. För att fastställa relevans för human temporallobsepilepsi studerade de hanmöss (P30-40 gamla) knockout (KO) Kv1.1 (kcna1-null) möss ^14,15 (JAX stock #003532), en genetisk modell av human episodisk ataxi typ 1¹⁵. Pericyter drev både patologiska och fysiologiska hippocampus vasokonstriktioner⁹ hos de spontant epileptiska djuren och deras vilda kullsyskon. Dessa observationer replikerades i WT-djur som gjorts epileptiska med kainsyra, vilket indikerar deras generalisering till andra former av epilepsi. Leal-Campanario et al fastställde dessutom, med hjälp av nya stereologiska mikroskopimetoder, att apoptotiska - men inte friska - neuroner hos epileptiska djur var rumsligt kopplade till hippocampus mikrovaskulatur. Eftersom excitotoxicitet inte har någon känd rumslig koppling till kärlen, indikerade detta resultat att onormal kapillär vasospasmisk ischemi-inducerad hypoxi bidrar till neurodegeneration vid epilepsi. Figur 1 visar ett schema över den allmänna inställningen.

Protocol

Protokollet följer NIH:s riktlinjer för vård och användning av försöksdjur. Alla procedurer godkändes av Barrow Neurological Institute's Institutional Animal Care and Use Committee.

1. Stereotaktisk positionering för kraniotomi

1. Väg och bedöva sedan musen med en ketamin-xylazincocktail (100 mg/kg–10 mg/kg i.p.). Se till att djuret är helt bedövat genom att observera dess brist på reaktion på svans och/eller tåklämning.
2. Placera en värmedyna under musen och använd en rektal termometer för att kontinuerligt övervaka dess kroppstemperatur under den första bedövade implantationsoperationen (Figur 2A).
3. Applicera ögonsalva för att förhindra torrhet i ögonen.
4. Stabilisera djurets huvud i en stereotaktisk ram för gnagare, utrustad med en musadapter. För att korrekt orientera musen i den stereotaktiska ramen, placera djurets tänder i hålet på bettstången (Figur 2A och Figur 3A, punkt g). Dra åt nosen clamp tills den sitter tätt (Figur 2A, B och Figur 3A, artikel h). Musens kroppspositionering ska vara så rak som möjligt (som i figur 2A).
   1. Fäst djurets huvud ytterligare med hjälp av musöronstänger med käkhållarmanschetter (figur 2A och figur 3A, punkt i), för att hålla fast skallens zygomatiska utskott.
      OBS: När mushuvudet väl är säkrat bör det inte ha något horisontellt rörelseomfång.
5. När musen har justerats till den stereotaktiska ramen (Figur 3B, punkt j), rengör och sterilisera hårbotten genom att torka av den med klor-hexedinskrubb 2-3 gånger, varje gång följt av en alkoholsköljning. Applicera sedan aktuellt lidokain ovanpå huvudet.
6. Gör ett snitt längs mittlinjen från bakre till främre (börja snittet vid skallbasen och slutför det mellan ögonen; 12-15 mm) längs skallens sagittala mittlinje, antingen med en fin sax eller ett blad. Dra tillbaka kanterna på hårbotten med fyra 28 mm bulldogg-serrefine-klämmor för att exponera skallen och maximera arbetsområdet (Figur 2B och Figur 3C).
7. Använd en skalpell eller mikrospatel (Figur 3C) för att skrapa benhinnan till snittets kanter. Använd en vävnadsseparerande sax eller pincett (Figur 3C) för att försiktigt dra tillbaka musklerna på baksidan av nacken (Figur 2B).
8. Torka toppen av skallen med en bomullsapplikator, fuktad med alkohol eller 30 % väteperoxid, för att optimera visualiseringen av kranialsuturerna. Applicera koksaltlösning på skallen när bindväven har tagits bort.
9. När mushuvudet har stabiliserats i den stereotaktiska apparaten, placera en sprutnålsspets (21 G) i elektrodhållaren (Figur 3B, pos. l) och fäst elektrodhållaren på den stereotaktiska mikromanipulatorn och sänk nålspetsen till skallens nivå (Figur 2D).
10. Justera skallens mediala-laterala riktning genom att mäta skallens höjd på vilket avstånd som helst bakom bregma (dvs. -2,0 mm) och två lika stora avstånd lateralt från mittlinjen på vardera sidan av skallen (dvs. ± 1,5 mm) (Figur 2D). Sikta på en höjdskillnad mellan platser som är mindre än 0,05 mm i dorsal-ventral riktning.
    1. Om det är större än 0.05 mm, rotera musens skalle med hjälp av bitstången, eller flytta musens huvud genom att lossa öronstängerna försiktigt, flytta huvudet och öronstängerna i sidled efter behov och sedan dra åt öronstängerna igen.
11. När skallen är placerad i den stereotaktiska enheten, bestäm och registrera de stereotaktiska koordinaterna för bregma- och lambdaskallsuturerna längs de anteroposteriora (AP), mediala laterala (ML) och dorsala ventrala (DV) axlarna.
12. Identifiera målpunkten (höger hippocampus) med hjälp av en stereotaktisk atlas. Hitta sedan målpunktskoordinaterna på skallen i förhållande till bregma (AP: -2,7 mm, ML: -2,7 mm) (Figur 2E).
13. Använd en kirurgisk markör och markera fyra hörn av ett 1,4 mm x 2 mm bildfönster på skallen med prickar, centrerade runt målpunkten direkt ovanför hippocampus (Figur 2F), för efterföljande kraniotomi.
14. Använd den kirurgiska markören för att rita ytterligare två prickar: en över det övre vänstra parietalbenet (Figur 2G) och en annan över det högra pannbenet (Figur 2H), för att indikera den framtida placeringen av två benskruvar (Figur 3A, punkt b) som kommer att förankra huvudkåpan (Figur 3B, punkt m) till skallen.
15. Använd den kirurgiska markören för att rita ytterligare tre prickar som anger var epidural-EEG-registreringselektroderna kommer att sättas in: en prick placerad 1 mm på vardera sidan av mittlinjen och ytterligare en prick på mittlinjen placerad 1 mm bakom Lambda (Figur 2E, Figur 4A och Figur 5B).

2. Installation av huvudlock

1. Använd en borr med en diameter på 0.7 mm (Figur 3C) och borra försiktigt två små hål i skallen, vid punktpositionerna som indikerar benskruvarnas placering (se steg 1.15 ovan). Ta sedan två benskruvar (slitsade i rostfritt stål, längd: 4 mm; diameter: 0,85 mm) som tidigare desinficerats med etanol 70-80 % och skruva fast dem på skallen för ytterligare stabilitet på huvudet (figur 2I-J och figur 3A, punkt b).
   1. Se till att skruvspetsarna inte sticker ut utanför benets botten in i skallhålan, vilket riskerar att skada hjärnan. Observera att en av de två benskruvarna kommer att vara framför de två huvudskruvarna och den andra bakom dem (Figur 2G-J).
2. Spruta koksaltlösning över skallen för att kyla ner den och rengöra den. Torka sedan skallen helt och applicera ett tunt lager cyanoakrylat runt skruvarna.
3. Använd ett anpassat justeringsstycke (Figur 3A, punkt c) fastspänt på mikrodrivenheten som är monterad på den stereotaktiska enheten (Figur 2F-J och Figur 3A, punkt d), så att huvudkåpans position är i linje längs mittlinjen, med den främre åsen över bregma. Denna anpassade bit i rostfritt stål är L-formad (vinklad i 90°), med två hål åtskilda av 4 mm (figur 2F-J och figur 3A, punkt c).
   1. Använd den stereotaktiska manipulatorn för att placera det L-formade inriktningsstycket, med två Fillister Head Slitsade drivskruvar fästa (M1.6 x 0.35 Metrisk Grov, 12 mm längd; Figur 3A, punkt a) över bregma, tills basen av skruvarna ligger platt på skallen, var noga med att inte utöva tryck på skallen (Figur 2I-J).
4. Applicera cyanoakrylat följt av tandcement för att fästa skruvarnas bas på skallen. Var noga med att inte blockera bildfönstrets referensmarkeringar över hippocampus (Figur 2K).

3. Avbildning av fönsterkraniotomikirurgi

1. Vid var och en av positionerna för kraniotomireferensmärkena som indikerar hörnen på avbildningsfönstret (se steg 1.14 ovan), borra ett borrhål med en diameter på 0,7 mm, följt av att försiktigt avgränsa periferin av det 1,4 mm x 2 mm kraniotomifönstret med borren, med iterativt djupare snitt (Figur 2L).
2. Var noga med att inte borra för djupt eller med för mycket kraft på skallen, som är tunn och ömtålig och har en tjocklek på cirka 300 μm. När benfliken är klar, bänd upp den lösa fliken med spetsen på en skalpell, var uppmärksam på att inte skada den underliggande dura mater.
3. Täck det öppna fönstret med benvax (Figur 2M).
4. Använd en borr med en diameter på 0,9 mm och borra tre hål för framtida placering av epidurala EEG-elektroderna (se steg 1.15 ovan) och var noga med att inte skära igenom dura mater (Figur 2E,L).
5. Täck de tre hålen med benvax.
6. Applicera försiktigt cyanoakrylat runt kanterna på det benvaxtäckta avbildningsfönstret och EEG-hålen, var noga med att inte försegla kraniotomierna (Figur 2L).
7. Bygg en vägg av tandcement som omsluter avbildningsfönstret och EEG-hålen och binder den till den tidigare cementerade huvudkåpan (Figur 2M och Figur 3B, punkt m).
8. Låt cementen torka i minst 10 minuter.
9. Stäng alla lösa sårkanter med enkla avbrutna suturer, med 4-0 eller 5-0 svart flätat silke (Figur 2N och Figur 3C).

4. Efter operationen

1. Använd en applikator med bomullsspets för att applicera lidokainsalva runt den exponerade huden för att dämpa känslan runt sårkanten.
2. Använd en steril applikator med bomullsspets för att applicera Neosporin på den exponerade huden.
3. Ta bort djuret från den stereotaktiska ramen (Figur 2N).
4. Injicera ketoprofen (5 mg/kg) IP eller IM för postoperativ smärtlindring.
5. Observera djuret tills det är vaket och rör sig (detta sker vanligtvis inom några minuter).
6. Placera djuret i en varm bur och fortsätt att övervaka dess återhämtning tills det dricker eller äter och är redo att flyttas till djurstallar.
7. Kontrollera djuret minst en gång dagligen i ungefär en vecka efter operationen, och var uppmärksam på tecken på håglöst beteende och/eller otillräckligt ätande/drickande (Figur 2O).

5. Färginjektion och EEG-registrering

1. Vänta minst en dag efter implantationen av huvudlocket för att påbörja inspelningarna.
2. Placera musen i en skumfasthållningsanordning som är gjuten på kroppen, inom den stereotaktiska ramen (figur 3B, punkterna n och j).
3. Fäst huvudkåpan (figur 3 BI, artikel m) på en anpassad monteringsstång som är fäst vid den stereotaktiska ramen (figur 3A, B, punkterna e och j och figur 4A). Den långa delen av punkt e (figur 3A,B) bör ha en längd mellan 9.4 – 13 mm. Fäst artikel f (en monteringsplatta med måtten 1.5 cm x 0.5 cm, med två hål separerade 4 mm från centrum till centrum) på artikel e (Figur 3A, B, punkterna e, f och k). Detta justeringssystem kommer att placera den vakna musen säkert till den stereotaktiska ramen under hela bildtagningssessionerna (figur 4).
4. Sätt i epidural-EEG-registreringselektroderna (Figur 5A), placera jordelektroderna (vita trådar) i det bakre centrala hålet och registreringselektroderna (röda trådar) i de främre vänstra och högra hålen (Figur 2E, Figur 4E och Figur 5E). Placera var och en av ledningarna i en L-form mellan skallen och dura mater (Figur 5C) för att optimera den elektriska kontakten.
5. Injicera svansvenen med grönt fluorescein-lysinfixerbart dextran (0,2 ml/25 g kroppsvikt av fluorescein 5 % vikt/vikt), för att visualisera blodflödet i hippocampus.
   1. För att öka utvidgningen av den centrala venen i musens svans före injektion, använd en eller flera av följande strategier: a) Applicera 70 % etanol på den centrala venen med hjälp av en applikator med bomullsspets; b) Doppa svansen i varmt vatten (35-40 °C) i 1-3 minuter; c) Utsätt svansen för en värmelampa i några minuter.
   2. Fäst musens svans med två fingrar och lokalisera den centrala venen, som ligger omedelbart under huden. Stick in nålen (ultrafin insulinspruta med integrerad nål 30G), med fasningen uppåt, i venen, ungefär halvvägs till två tredjedelar från svansroten. Håll nålen parallell med svansen under injektionen.
   3. Injicera färgen långsamt och stadigt, var noga med att undvika förändringar i nålens eller svansens position.
      OBS: Det ska inte finnas något motstånd när du trycker in sprutkolven.
   4. När injektionen är klar drar du ut nålen och trycker lätt på stickstället för att försegla kärlet.
   5. Låt koagulering ske.

6. In vivo fiberoptisk buntkopplad preklinisk konfokal laserskanningsendomikroskopi (pCLE)

1. Direkt efter svansveninjektionen (steg 5.5.3 ovan) klämmer du fast det 300 μm fasade fiberoptiska knippet (innehållande 5000–7000 3 μm fibrer i varje knippe) i nedåtriktad riktning mot den mobila armen på den stereotaktiska robotdrivenheten.
2. Ta bort benvaxet från kraniotomin.
3. Ta bort duran, med hjälp av den böjda spetsen på en sprutnål.
4. Använd robotpositioneringssystemet, flytta först fiberobjektivet till lämplig främre-posterior och vänster-höger stereotaktisk plats, med spetsen nollställd i z-axeln på ytan av cortex.
5. Starta EEG-registreringen (Figur 5D).
6. Initiera konfokal laserskanning av fiberobjektivets bakre plan, följt direkt av att sänka objektivet långsamt i z-axeln med hjälp av robotmikroenhetens z-kontroller, tills det når måldjupet i hjärnan (Figur 4C). Visa bildresultaten i den mikroskopiska programvaran medan du sjunker.
   1. Om fiberspetsen är inom målområdet för X-Y-Z-inspelning och två eller flera kärl kommer in i bildfönstrets FOV, stoppa nedstigningen och starta videoinspelningar. Få live time-lapse-filmer i fullfält av blodflödet vid 11.7 Hz med hjälp av Cellvizio Labs bildbehandlingsprogram. (Högre hastigheter kan erhållas med ett mindre synfält). Inspelningar kan ske i 4-5 timmar åt gången, i följd om det behövs.
7. Använd en 10 ml spruta med avfasad silikonslang fäst vid nålspetsen och mata djuret under inspelningarna genom att regelbundet ge pasta gjord av muspellets som malts med vatten.
8. I slutet av bildsessionen avslutar du inspelningarna.
9. Ta försiktigt bort EEG-elektroderna och rengör dem med Tergazyme.
10. Ta långsamt bort det fiberoptiska knippet från djurets hjärna genom att vända fibern längs z-axeln för inträde.
11. Lossa djuret från huvudstolpen och kroppsstöden.
12. Om så är lämpligt, följ de nödvändiga eutanasi- och vävnadsbearbetningsprotokollen för att visualisera blodkärl och utföra immunhistokemi.
13. Om du planerar att spela in från samma djur i en framtida session, täck avbildningsfönstret med benvax eller silastik.

Representative Results

Vi utvecklade dessa metoder för att bedöma om onormala pericytdrivna kapillärvasospasmer i hippocampus – som uppstår som ett resultat av anfall – kan orsaka uppriktig hypoxi som bidrar till celldöd i iktalfokuset ^9,13.

Utvecklingen av huvudmössan och dess korrekta installation gav hög stabilitet i registreringarna, vilket möjliggjorde samtidig registrering av EEG och blodflöde djupt inne i hippocampus hos vilda och epileptiska vakna möss under både iktala och interiktala perioder. Registrering av blodflödeshändelser relaterade till anfall kräver registrering under längre tidsperioder, så att aperiodiska blodflödeshändelser (såsom vasospasmer) kan fångas som svar på både inducerade och naturligt förekommande epileptiska anfall. Fasthållningssystemet möjliggjorde stabila blodflödesregistreringar av djupa hjärnmikrokärl och deras proximala väggceller under långa timmar (Figur 6A-R). Vi fann att i hela mikrokärl inträffade blodflödesstopp vid positionerna för märkta väggceller.

Vi lokaliserade fartyg i hippocampus på ett tillförlitligt sätt med hjälp av en stereotaktisk robotenhet riktad mot interna koordinater från en standard stereotaktisk atlas. Vi verifierade kvaliteten på fiberinspelningarna genom att jämföra dem med högupplösta tvåfotonavbildningsinspelningar av blodflöde och ekvivalenta vasospasmer från kortikal vävnad, på djup som tvåfotonavbildning kan nå (Figur 6S-AA). Vi verifierade vidare pCLE-resultaten med hjälp av immunhistokemi på inspelningsställen, för att visa med traditionell konfokalmikroskopi att hippocampus muralceller var korrekt riktade och att de inte bara var sammandragande utan också rumsligt associerade med strikturer i mikrokärl långt från arterioler¹⁵ (Figur 7).

De publicerade resultaten med dessa metoder visar verkligen onormala kapillära vasospasmer i hippocampus som drivs av kramper, såväl som korrelerad celldöd i Kv1.1 epileptiska muterade möss och kainatmodellepileptiska möss ^9,13. Dessa resultat indikerar en roll för lokal iktal ischemi/hypoxi i celldöd under anfall, på grund av onormala vasospasmer, och bidrar till en växande mängd arbete som utökar de potentiella mekanismerna för iktalcellsdöd.

Figur 1: Schematisk framställning av försöksplaneringen. Vi registrerade EEG när vi utförde konfokalmikroskopi i hippocampuskapillärer hos både vakna epileptiska möss och WT-kullsyskon. Efter att ha injicerat svansvenen med fluorescein använde vi en ny preklinisk konfokal laserskanningsendomikroskopi (pCLE), med ett fiberobjektiv med en spetsdiameter på 0,3 mm för att registrera kapillär blodflödesdynamik djupt inne i hjärnan. Gult indikerar ökat blodflöde och rött indikerar jämnt eller minskat flöde. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 2: Protokoll för implantation av huvudskydd. A) Det sövda djuret placerades på en värmedyna och placerades inom den stereotaktiska ramen (se figur 3B, punkt j) och fästes med musöronstänger (figur 3A, punkt i) och käfthållarmanschetter (figur 3A, punkt g, h) över en värmedyna. B) Exponering av kranialsuturerna. C-D) Mätningar av Bregma och Lambda. E) Visualisering av borrplatser över djurets skalle. De svarta prickarna och fyrkanten indikerar fönstret över hippocampus som tillåter pCLE-insättning. De två röda cirklarna markerar insättningspositionerna för EEG-registreringstrådarna. Den vita pricken markerar insättningspunkten för EEG-jordledningarna. F) De fyra svarta prickarna på skallen markerar de framtida hörnen av avbildningsfönstrets kraniotomi över hippocampus. Det anpassade justeringsstycket (figur 3A, punkt c), med huvudstolpsimplantaten (figur 3A, punkt a) fäst vid den stereotaktiska mikrodrivlägesställaren (figur 3A, punkt d). G-H) Ytterligare två punkter, en bakre (G) och en främre (H) markerar den framtida placeringen av huvudlockets ankarskruvar (Figur 3A, punkt b). I-J) Två små skruvar förankrar huvudkåpan i skallen (Figur 3A, punkt b). K) Cyanoakrylat och tandcement appliceras på ankarskruvarna från panelerna I & J. L) Avbildningsfönstrets kraniotomi över hippocampus och de tre hålen för EEG-elektroderna har borrats. M) Bildkammaren byggs (figur 3B, punkterna i, m) genom att skulptera en vall med ytterligare tandcement för att omsluta de tre EEG-hålen och avbildningsfönstret. N) Ovanifrån view av den färdiga huvudkåpan. O) Den återfunna musen tillbaka i sin bur efter implantationsoperationen. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 3: Material som används i protokollet (specifika punkter uppräknade med gemener). A) Material som används för att bygga huvudkåpan. a) Två maskinskruvar av märket M1,6 x 12 mm (implantat till huvudstolpen). b) Två små bultar för att fästa huvudkåpan i skallen. (c) Ett anpassat L-format justeringsstycke i rostfritt stål, med två hål 4 mm från varandra, som säkrar de två M1.6-skruvarna under operationen. d) En standardmikroenhet som är monterad på en stereotaktisk enhet innehåller punkt c. e) En anpassad monteringsstång med en f) justeringsdel som matchar de två hålen från punkt c. g) En bettstång och h) nosklämma för att stabilisera positionen för djurets huvud. B) Inställningar under inspelningarna. i) Huvudkåpan är fäst vid föremål f under den bedövade implantationsoperationen. (j) En stereotaktisk ram positionerar mikroenheten (punkt d). l) En 21G-nål fästs på mikrodrivenheten (punkt d) och används för att bestämma positionerna för Bregma- och Lambda-kraniets suturer. m) En simulerad huvudkapsel avbildas här, fäst vid punkt f, för att demonstrera musens placering i (n) det skumfodrade fasthållningsröret (mus saknas). Objekt n formar sig efter formen på musens kropp. C) Instrument och förnödenheter som behövs för att utföra operationen. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Bild 4: Inställning av inspelningssession. A) Djurets huvud är fixerat. B) Placering av EEG-registreringskablarna. Vita EEG-trådar placeras separat, på varje sida av skallen. Röda EEG-trådar placeras tillsammans i det mellersta bottenhålet (jordhålet). C) Det fiberoptiska knippet sätts in i målfönstret. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 5: EEG-registreringar. A) Epidurala EEG-registreringar utförs med Physiotel F20-EET-sändare, samtidigt med de fiberoptiska pCLE-registreringarna i det vakna djuret. B) Placering av de borrade hålen för införande av ledningarna för EEG-registreringar. De två röda ledningarna går till de två hålen som indikeras av röda prickar. De två vita ledningarna sätts in tillsammans i hålet som indikeras av den vita pricken. Den röda fyrkanten anger målfönstret över djurets hippocampus. Bokstaven "B" på musens skalle indikerar bregma. C) EEG-inspelningstrådarna är böjda i en L-form för att förbättra den elektriska kontakten mellan skallen och dura-materian. D) Exempel på EEG-registreringar hos vakna möss. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 6: Inspelningar av vasokonstriktioner i väggceller hos möss. A-R) In vivo fiberoptisk dual-band pCLE-bild av kapillär vasospasm (kärl i grönt, märkta med 2MD fluorescein-konjugerad dextran) samlokaliserade till väggceller (röd, märkt via intravenös vensvansinjektion av Alexa Fluor 647) i vakna knockoutmöss under anfall (pilen indikerar väggcell och tillhörande vasospasm). Se video 1 och video 2. S-W) In vivo tvåfotonskanningslasermikroskopi (TPLSM) stack av kapillärkärl (gröna) och muralceller (röda) från en vildtypsmus. Se video 3. X-Z) In vivo TPLSM av en väggcelllokaliserad (röd) kapillär sammandragning av kainiska möss. Se video 4. AA) Kvantifiering av kärlförträngning från panelerna X-Z mätt vid vit linje. Skalor för paneler A-R= 5 μm; S-W= 25 μm. X-Z= 5 μm. Videor spelades in med 11,7 Hz. Från Leal-Campanario et ^al.8. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 7: Immunhistokemi i den registrerade hjärnan. A-B) Kärl vid olika förstoringar injicerade med fluoresceindextran (grönt). DAPI-färgade cellkärnor i blått (vita pilar). Skalstapel för A= 200 μm. skalstapel för B = 100 μm. C) Olika delar av hjärnan injiceras med fluorescein där en röd blodkropp (röd pil) syns tydligt. Skalstapel = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Videoklipp 1: Vasospasm och muralcellernas blodflöde registreras (11,7 Hz) i en KO hippocampus kapillär. Se bildrutor från samma inspelning i figur 6A-H. Klicka här för att ladda ner videon.

Videoklipp 2: Vasospasm, leukocytblockeringar, blodflöde och muralceller registrerade i en WT hippocampus kapillär (11,7 Hz). Se bildrutor från samma inspelning i figur 6I-R. Klicka här för att ladda ner videon.

Videoklipp 3: Ojämnt blodflöde i in vivo WT musens parietala cortex registrerad med TPLSM. Se bildrutor från samma inspelning i figur 6SW. Klicka här för att ladda ner videon.

Videoklipp 4: Mural celldriven (röd) kapillär (grön) sammandragning från parietal cortex av gripande kainiskt djur registrerat med TPLSM. Se bildrutor från samma inspelning Figur 6X-Z. Klicka här för att ladda ner videon.

Discussion

Vi utvecklade ett fasthållningssystem för huvudmössor för samtidiga elektrofysiologiska och fiberoptiska pCLE-experiment i vakna möss, vilket minskar potentiell responskontaminering på grund av anestesiläkemedel. Huvudkåpan och monteringsapparaten är enkla att konstruera och kan återanvändas för avbildningsexperiment med kroniskt vaket beteende. Vi kontrollerade kvaliteten på inspelningarna mot guldstandarden för in vivo mikroskopisk blodflödesavbildning, TPLSM.

Skickliga kirurgiska färdigheter är nödvändiga för att implementera det protokoll vi beskriver här. Operationen måste göras under aseptiska förhållanden och alltid under ett operationsmikroskop, samtidigt som man ser till att lämna dura mater intakt när man borrar fönstret över hippocampus. Det är viktigt att känna till den underliggande blodkärlsbildningen, eftersom det finns risk för oönskade blödningar vid avskärning ovanför ett större blodkärl.

Att placera djuret korrekt i stereotaktisk inriktning säkerställer att det främre-bakre planet är plant innan huvudlocket fästs. Detta skydd gör det lättare att lokalisera hjärnans loci med hjälp av en hjärnatlas.

Musrörelser kan resultera i skador på kärl eller felaktiga registreringar av vasospasmer (det vill säga fiberrörelse snarare än verklig vasorörelse), så det är viktigt att minska djurens rörelser under inspelningarna. Skumstoppning i fasthållningsröret hjälper till att förlänga inspelningssessionerna samtidigt som stress och rörelse från musen minimeras. Möss föredrar att passa tätt i skummet, så korrekt passform minskar överdriven rörelse. Utan denna försiktighetsåtgärd kan möss kämpa. Om musen visar tecken på kamp bör inspelningssessionen avslutas. Inspelningarna kan återupptas nästa dag, när de fysiologiska stressreaktionerna har avtagit. I våra inspelningar var djuren uppenbarligen lugna för det mesta.

Vi noterar att den rörelse som mest negativt påverkar pCLE-avbildningsmetoden uppstår när sonden rör sig differentiellt till hjärnvävnaden. Andning, anfall och rörelse hos djuret är irrelevanta om de inte förskjuter fibersonden med avseende på vävnaden. Det vill säga, när avbildningssonden rör sig differentiellt mot vävnaden rör sig hela avbildningsfältet som en enhet, vilket gör rörelseartefakter uppenbara. Därför är det viktigt att alltid registrera från två eller flera kärl åt gången: om alla kärl rör sig samtidigt kan det bero på fiberinstabilitet, medan om minst ett kärl inte förändras beror förändringarna som ses i andra kärl sannolikt på faktiska variationer i blodflödet, inklusive vasospasmer.

En begränsning med pCLE-avbildningsmetoden jämfört med TPLSM är att fibersonden punkterar pia och därmed är invasiv för hjärnan. När sonden sjunker ner orsakar den viss skada på nervvävnaden som den passerar igenom. Således kan det vara mycket svårt att spela in från samma fartyg under två på varandra följande dagar, även om man använder samma exakta koordinater i båda sessionerna (och ofta bara möjligt om den första inspelningssessionen har en kort varaktighet). Det är därför viktigt att vid kroniska inspelningsstudier spela in på allt större djup i efterföljande inspelningssessioner.

Resultaten av blodflödesexperimenten tyder på att excitotoxicitet inte är den enda mekanistiska vägen för iktalcellsdöd och hippocampus skleros¹³. Upptäckten att kapillär blodflödesbegränsning spelar en roll i iktal neurodegeneration banar väg för att utvidga de metoder som beskrivs här till att identifiera mikroskopiska blodflödesförändringar på vilket djup som helst i kroppen, och i vilken vävnad som helst, för kliniska diagnostiska ändamål.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.7 mm diameter burr	Fine Science Tools	19007-07	For Screws No. 19010-00
0.9 mm diameter burr	Fine Science Tools	19007-09
ASEPTICO AEU-12C TORQUE PLUS	from Handpiece solution	AEU12C
Bull dog serrifine clump	Fine Science Tools	18050-28
CellVizio dual band	Mauna Kea Technologies
CellVizio single band	Mauna Kea Technologies
Confocal Microprobe 300 microns (Serie S)	Mauna Kea Technologies
Custom-made alignment piece	L-shaped (angled at 90 deg) and made of stainless steel with two holes drilled on it, with a 4 mm separation from center to center
Custom-made mounting bar	The long section piece of the mounting bar should be between 9.4 - 13mm. Fixed to this piece of the mounting bar, position a stainless-steel plate 1.5 cm long and 0.5 cm wide that has two holes drilled separated 4 mm from center to center, the same distance that the L-shaped alignment piece.
Cyanoacrylate adhesive-Super Glue
Dumont forceps #5	Fine Science Tools	11252-20
DuraLay Inlay Resin – Standard Package	Reliance Dental Mfg Co.	602-7395 (from patterson dental)
Fillister Head, Slotted Drive, M1.6x0.35 Metric Coarse, 12mm Length Under Head, Machine Screw	MSC industrial direct co.	2834117
Fine Point scissor	Fine Science Tools	14090-09
Fluorescein 5% w/w lysine-fixable dextran (2MD)	Invitrogen, USA	D7137
Halsey smooth needle holder	Fine Science Tools	12001-13
Kalt suture needle 3/8 curved	Fine Science Tools	12050-03
lab standard stereotaxic, rat and mouse	Stoelting Co. 51704	51670
Methocel 2%	Omnivision GmbH	PZN: 04682367	Eye ointment to prevent dryness.
Mouse Temperature controller, probe (YSI-451), small heating pad-TC-1000 Mouse	CWE Inc.	08-13000
PhysioTel F20-EET transmitters	DSI	270-0124-001
Robot Stereotaxic, Manipulator Arm, ADD-ON, 3 Axis, LEFT	Stoelting Co.C13	51704
Sel-Tapping bone screws	Fine Science Tools	19010-10
Standard Ear Bars and Rubber Tips for Mouse Stereotaxic	Stoelting Co	51648
Suture Thread - Braided Silk/Size 4/0	Fine Science Tools	18020-40
Tissue separating microspatula	Fine Science Tools	10091-121