Summary
Mens multifotonavbildning bare er effektiv på begrensede dybder fra vevets overflate, er det mulig å oppnå 3 μm oppløsningsavbildning på hvilken som helst dybde via pCLE. Her presenterer vi en protokoll for å gjennomføre pCLE-avbildning for å måle mikrovaskulær dynamikk i hippocampus hos iktale og villtypemus.
Abstract
Målet med denne protokollen er å beskrive fiberoptisk-bunt-koblet preklinisk konfokal laserskanning endomikroskopi (pCLE) i sin spesifikke anvendelse for å belyse kapillære blodstrømningseffekter under anfall, drevet av veggmalericeller. Kortikal avbildning in vitro og in vivo har vist at kapillærinnsnevringer drevet av pericytter kan skyldes funksjonell lokal nevral aktivitet, så vel som fra legemiddelanvendelse, hos friske dyr. Her presenteres en protokoll om hvordan man bruker pCLE for å bestemme rollen som mikrovaskulær dynamikk i nevral degenerasjon ved epilepsi, ved hvilken som helst vevsdybde (spesielt i hippocampus). Vi beskriver en hodestøtteteknikk som er tilpasset for å registrere pCLE hos våkne dyr, for å adressere potensielle bivirkninger av anestetika på nevral aktivitet. Ved hjelp av disse metodene kan elektrofysiologiske og bildebehandlingsopptak utføres over flere timer i dype nevrale strukturer i hjernen.
Introduction
I motsetning til andre mikroskopiske avbildningsmetoder 1,2,3,4,5,6,7,8, tillater in vivo fiberoptisk basert konfokalmikroskopi måling av blodstrømningsdynamikk i en hvilken som helst hjernegruppe, uansett dybde, ved høy hastighet (opptil 240 Hz avhengig av synsfelt størrelse9). En fiberoptisk sonde muliggjør in vivo konfokal laserskanningsavbildning ved 3 μm oppløsning fordi sondens spiss (et linseløst mål som består av et bunt på 5000-6000 3 μm diameter individuelle fibre) kan plasseres med en mikroelektrodes nøyaktighet, innenfor 15 μm av det fluorescerende målet av interesse. Som med in vivo to-foton avbildning, må fluoroforer tidligere innføres i avbildningsmålet. For eksempel kan fluorescein dextran (eller kvanteprikker) injiseres i vaskulaturen, eller genetisk kodede fluorescerende proteiner kan transfekteres til celler, eller fluorescerende fargestoffer som Oregon Green BAPTA-1 kan bulkbelastes i celler, før avbildning.
Nyere forskning ved hjelp av disse teknikkene har funnet at veggmalericellemotoraktivitet som fører til iktale kapillære vasospasmer - plutselige innsnevringer som oppstår ved veggmaleriets posisjon under anfall 9 - kan bidra til nevrodegenerasjon i iktal hippocampus9. Mens tidligere bildestudier in vitro og in vivo pericyttinnsnevringer knyttet til legemiddelapplikasjoner 6,7,10,11,12, fant Leal-Campanario et al. det første beviset på in vivo spontane kapillærinnsnevringer i murine hjernen. For å etablere relevans for human temporallappsepilepsi, studerte de mannlige (P30-40 gamle) knockout (KO) Kv1.1 (kcna1-null) mus 14,15 (JAX stock #003532), en genetisk modell av human episodisk ataksi type 115. Pericytter drev både patologiske og fysiologiske hippocampusveggmalerier vasokonstriksjoner9 hos spontant epileptiske dyr og deres villtype (WT) kullkamerater. Disse observasjonene ble replikert hos WT-dyr som ble epileptisk med kainsyre, og indikerte dermed generalisering til andre former for epilepsi. Leal-Campanario et al bestemte dessuten, ved hjelp av nye stereologiske mikroskopiske tilnærminger, at apoptotiske - men ikke sunne - nevroner i epileptiske dyr var romlig koblet til hippocampus-mikrovaskulaturen. Fordi eksitotoksisitet ikke har noen kjent romlig tilknytning til vaskulaturen, indikerte dette resultatet at unormal kapillær vasospasmisk iskemi-indusert hypoksi bidrar til nevrodegenerasjon ved epilepsi. Figur 1 viser et skjema over det generelle oppsettet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen følger NIHs retningslinjer for stell og bruk av forsøksdyr. Alle prosedyrer ble godkjent av Barrow Neurological Institute's Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Stereotaksisk posisjonering for kraniotomi
- Vei og bedøv musen med en ketamin-xylazin (100 mg / kg-10 mg / kg i.p.) cocktail. Sørg for at dyret er fullt bedøvet ved å observere dets manglende reaksjon på hale og / eller tåklemme.
- Plasser en varmepute under musen og bruk et rektalt termometer for kontinuerlig å overvåke kroppstemperaturen under den første bedøvede implantasjonsoperasjonen (figur 2A).
- Påfør oftalmisk salve for å forhindre øyetørrhet.
- Stabiliser dyrets hode i en gnager stereotaksisk ramme, utstyrt med en museadapter. For å orientere musen riktig i den stereotaktiske rammen, plasser dyrets tenner inne i hullet på bite-bar (figur 2A og figur 3A, element g). Stram neseklemmen til den sitter godt (figur 2A,B og figur 3A, punkt h). Musens kroppsposisjonering skal være så rett som mulig (som i figur 2A).
- Fest dyrets hode ytterligere ved hjelp av musestolper med kjeveholdermansjetter (figur 2A og figur 3A, punkt i), for å klemme de zygomatiske prosessene i skallen.
MERK: Når den er sikret, bør musens hode ikke ha noen rekkevidde av horisontal bevegelse.
- Fest dyrets hode ytterligere ved hjelp av musestolper med kjeveholdermansjetter (figur 2A og figur 3A, punkt i), for å klemme de zygomatiske prosessene i skallen.
- Når musen er justert til den stereotaktiske rammen (figur 3B, punkt j), rengjør og steriliser hodebunnen ved å tørke den med klor-hexedinskrubb 2-3 ganger, hver gang etterfulgt av en alkoholskylling. Påfør deretter aktuell lidokain på toppen av hodet.
- Lag et snitt langs midtlinjen fra bakre til fremre (start snitt ved skallebunnen og fullfør det mellom øynene, 12-15 mm) langs den sagittale midtlinjen av skallen, enten ved hjelp av fin saks eller et blad. Trekk inn kantene i hodebunnen med fire 28 mm bulldog serrefine klemmer for å eksponere skallen og maksimere arbeidsområdet (figur 2B og figur 3C).
- Bruk en skalpell eller mikrospatel (figur 3C) for å skrape periosteum til snittets kanter. Bruk vevseparerende saks eller tang (figur 3C) til å trekke musklene bakerst i nakken forsiktig inn (figur 2B).
- Tørk toppen av skallen med en bomullstippet applikator, fuktet med alkohol eller 30% hydrogenperoksid, for å optimalisere visualiseringen av kranialsuturene. Påfør saltvann på skallen når bindevevet er fjernet.
- Når musens hode er stabilisert i det stereotaktiske apparatet, plasser en sprøytenålespiss (21 G) i elektrodeholderen (figur 3B, punkt l), og fest elektrodeholderen til den stereotaktiske mikromanipulatoren, senk nålespissen til nivået på skallen (figur 2D).
- Juster medial-lateral retning av skallen ved å måle høyden på skallen i hvilken som helst avstand bakre til bregma (dvs. -2,0 mm), og to like avstander lateral fra midtlinjen på hver side av skallen (dvs. ± 1,5 mm) (figur 2D). Ta sikte på en høydeforskjell på tvers av steder som er mindre enn 0,05 mm i dorsal-ventral retning.
- Hvis den er større enn 0,05 mm, roterer du musens skalle ved hjelp av bittstangen, eller flytter musens hode ved å løsne ørestengene forsiktig, forskyve hodet og ørestengene sideveis etter behov, og deretter stramme ørestengene på nytt.
- Når skallen er plassert i den stereotaksiske enheten, bestem og registrer de stereotaktiske koordinatene til bregma- og lambda-skallesuturene langs anteroposterior (AP), mediale laterale (ML) og dorsale ventrale (DV) akser.
- Identifiser målpunktet (høyre hippocampus) ved hjelp av et stereotaktisk atlas. Finn deretter på skallen målpunktkoordinatene i forhold til bregma (AP: -2,7 mm, ML: -2,7 mm) (figur 2E).
- Ved hjelp av en kirurgisk markør markerer du fire hjørner av et 1,4 mm x 2 mm bildevindu på skallen med prikker, sentrert rundt målpunktet rett over hippocampus (figur 2F), for påfølgende kraniotomi.
- Bruk operasjonsmarkøren til å tegne ytterligere to prikker: en over øverste venstre parietalben (figur 2G) og en annen over høyre frontalbein (figur 2H), for å indikere fremtidig plassering av to beinskruer (figur 3A, punkt b) som vil forankre hodehetten (figur 3B, punkt m) til skallen.
- Bruk operasjonsmarkøren til å tegne ytterligere tre prikker som indikerer hvor de epidurale EEG-registreringselektrodene skal settes inn: en prikk plassert 1 mm på hver side av midtlinjen, og en ekstra prikk på midtlinjen plassert 1 mm bak Lambda (figur 2E, figur 4A og figur 5B).
2. Installasjon av hodestykke
- Bruk en boring med en diameter på 0,7 mm (figur 3C) til å bore forsiktig to små hull i hodeskallen ved punktposisjonene som indikerer plasseringen av beinskruene (se trinn 1.15 ovenfor). Ta deretter to beinskruer (rustfritt stålslisset, lengde: 4 mm; diameter: 0,85 mm) som tidligere er desinfisert med etanol 70-80%, og skru dem fast i skallen for ytterligere stabilitet i hodedekselet (figur 2I-J og figur 3A, punkt b).
- Sørg for at skruespissene ikke stikker utover bunnen av beinet inn i skallen, og risikerer skade på hjernen. Legg merke til at den ene av de to beinskruene vil være fremre for de to skruene med hodedeksel, og den andre bakre for dem (figur 2G-J).
- Sprut saltvann over skallen for å kjøle den ned og rengjør den. Tørk deretter skallen helt og påfør et tynt lag cyanoakrylat rundt skruene.
- Bruk et tilpasset justeringsstykke (figur 3A, punkt c) festet til mikrostasjonen montert på den stereotaksiske enheten (figur 2F-J og figur 3A, punkt d), slik at posisjonen til hodehetten er justert langs midtlinjen, med den fremre ryggen overliggende bregma. Dette tilpassede stykket i rustfritt stål er L-formet (vinklet 90°), med to hull atskilt med 4 mm (figur 2F-J og figur 3A, punkt c).
- Bruk den stereotaktiske manipulatoren til å plassere det L-formede justeringsstykket, med to Fillister Head Slotted drivskruer festet (M1.6 x 0.35 Metric Coarse, 12 mm Lengde; Figur 3A, punkt a) over bregma, til skruebunnen ligger flatt på skallen, og pass på at du ikke utøver press på skallen (figur 2I-J).
- Påfør cyanoakrylat etterfulgt av dental sement for å feste bunnen av skruene til skallen. Vær forsiktig så du ikke blokkerer referansemerkene for bildevinduet over hippocampus (figur 2K).
3. Imaging vindu kraniotomi kirurgi
- Ved hver av posisjonene til kraniotomireferansemerkene som angir hjørnene i bildevinduet (se trinn 1.14 ovenfor), bores et burrhull med en diameter på 0,7 mm, etterfulgt av forsiktig avgrensning av periferien av kraniotomivinduet på 1,4 mm x 2 mm med boret, med iterativt dypere kutt (figur 2L).
- Pass på at du ikke borer for dypt eller med for mye kraft på skallen, som er tynn og skjør, med en tykkelse på ca. 300 μm. Når beinlappen er fullført, lirker du den løse klaffen opp med spissen av en skalpell, og vær oppmerksom på å ikke skade den underliggende dura materen.
- Dekk det åpne vinduet med benvoks (figur 2M).
- Bruk en burr med diameter på 0,9 mm til å bore tre hull for fremtidig plassering av de epidurale EEG-elektrodene (se trinn 1.15 ovenfor), og pass på at du ikke skjærer gjennom dura materen (figur 2E,L).
- Dekk de tre hullene med beinvoks.
- Påfør cyanoakrylat forsiktig rundt kantene på det beinvoksdekkede bildevinduet og EEG-hullene, og pass på at kraniotomiene ikke forsegles (figur 2L).
- Bygg en vegg av dental sement som omfatter bildevinduet og EEG-hullene og binder den til den tidligere sementerte hodehetten (figur 2M og figur 3B, punkt m).
- La sementen tørke i minst 10 minutter.
- Lukk eventuelle løse sårmarginer med enkle avbrutte suturer, bruk 4-0 eller 5-0 svart flettet silke (figur 2N og figur 3C).
4. Etter operasjonen
- Bruk en bomullstippet applikator for å påføre lidokainsalve rundt den eksponerte huden for å døyve følelsen rundt sårkanten.
- Bruk en steril bomullstippet applikator for å påføre Neosporin på den eksponerte huden.
- Fjern dyret fra den stereotaktiske rammen (figur 2N).
- Injiser ketoprofen (5 mg / kg) IP eller IM for postkirurgisk analgesi.
- Observer dyret til det er våkent og i bevegelse (dette vil vanligvis skje i løpet av få minutter).
- Plasser dyret i et varmt bur og fortsett å overvåke utvinningen til den drikker eller spiser og er klar til å overføre til dyrehus.
- Kontroller dyret minst én gang daglig i ca. en uke etter operasjonen, og se etter tegn på sløv atferd og/eller utilstrekkelig spising/drikking (figur 2O).
5. Fargestoffinjeksjon og EEG-opptak
- Vent minst én dag etter implantasjonsoperasjonen for å starte opptakene.
- Plasser musen i en skumsikringsanordning som er støpt til kroppen, innenfor den stereotaktiske rammen (figur 3B, punkt n & j).
- Fest hodehetten (figur 3 B-I, punkt m) til en tilpasset monteringsstang som er festet til den stereotaksiske rammen (figur 3A,B, elementene e & j og figur 4A). Den lange delen av element e (figur 3A,B) skal ha en lengde mellom 9,4 – 13 mm. Fest element f (en monteringsplate med dimensjoner 1,5 cm x 0,5 cm, med to hull atskilt 4 mm fra senter til senter) til punkt e (figur 3A,B, elementer e, f og k). Dette justeringssystemet vil plassere den våkne musen sikkert til den stereotaksiske rammen gjennom avbildningsøktene (figur 4).
- Sett inn de epidurale EEG-opptakselektrodene (figur 5A), plasser jordelektrodene (hvite ledninger) i det bakre sentrale hullet og opptakselektrodene (røde ledninger) i det fremre venstre og høyre hullet (figur 2E, figur 4E og figur 5E). Plasser hver av ledningene i en L-form mellom skallen og dura materen (figur 5C) for å optimalisere elektrisk kontakt.
- Injiser halevenen med grønt fluoresceinlysinfikserbart dextran (0,2 ml / 25 g kroppsvekt av fluorescein 5% w / w), for å visualisere blodstrømmen i hippocampus.
- For å øke utvidelsen av den sentrale venen i musens hale før injeksjon, bruk en eller flere av følgende strategier: a) Påfør 70% etanol på den sentrale venen ved hjelp av en bomullstippet applikator; b) Dypp halen i varmt vann (35-40 °C) i 1-3 minutter; c) Utsett halen for en varmelampe i noen minutter.
- Fest musens hale med to fingre og finn den sentrale venen, som ligger rett under huden. Stikk nålen (ultrafin insulinsprøyte med integrert nål 30G), med skråningen opp, inn i venen, omtrent halvveis til to tredjedeler fra haleroten. Hold nålen parallelt med halen under injeksjonen.
- Injiser fargestoffet sakte og jevnt, og pass på å unngå endringer i nålens eller halens stilling.
MERK: Det skal ikke være motstand når sprøytestempelet trykkes inn. - Etter å ha fullført injeksjonen, trekk ut nålen og trykk forsiktig på stikkstedet for å forsegle beholderen.
- Tillat koagulering å skje.
6. In vivo fiberoptisk-buntkoblet preklinisk konfokal laserskanning endomikroskopi (pCLE)
- Rett etter injeksjon av haleåren (trinn 5.5.3 ovenfor), klemmer du den 300 μm skrå fiberoptiske bunten (inneholdende 5000–7000 3 μm fibre i hver bunt) i nedadgående retning til den mobile armen til den robotiske stereotaksiske stasjonen.
- Fjern beinvoks fra kraniotomi.
- Fjern duraen ved hjelp av den bøyde spissen av en sprøytekanyle.
- Ved hjelp av robotposisjoneringssystemet flytter du først fibermålet til riktig fremre-bakre og venstre-høyre stereotaksiske plassering, med spissen nullet i z-aksen på overflaten av cortex.
- Start EEG-opptaket (figur 5D).
- Start konfokal laserskanning av fiberobjektivets bakplan, etterfulgt direkte av å synke objektivet sakte ned i z-aksen ved hjelp av robotmikrostasjonens z-kontroller, til den når måldybden i hjernen (figur 4C). Se bilderesultatene i den mikroskopiske programvaren mens du synker.
- Hvis fiberspissen er innenfor målområdet X-Y-Z-opptak, og to eller flere fartøy går inn i bildevinduets FOV, stopper du nedstigningen og starter videoopptak. Få live full-field time-lapse-filmer av blodstrømmen ved 11,7 Hz ved hjelp av Cellvizio Labs bildebehandlingsprogramvare. (Høyere hastigheter kan oppnås med en mindre FOV). Opptak kan foregå i 4-5 timer av gangen, i påfølgende dager om nødvendig.
- Bruk en 10 ml sprøyte med skrå silisiumslange festet til spissen av nålen, mate dyret under opptakene ved regelmessig å gi pasta laget med muspellets malt med vann.
- På slutten av bildeøkten, avslutt opptakene.
- Fjern forsiktig EEG-ledningene og rengjør dem med Tergazyme.
- Fjern sakte den fiberoptiske bunten fra dyrets hjerne ved å reversere fiberen langs z-aksen for oppføring.
- Frigjør dyret fra hodepinnen og kroppsstøttene.
- Hvis det er hensiktsmessig, følg de nødvendige eutanasi- og vevsbehandlingsprotokollene for å visualisere blodkar og utføre immunhistokjemi.
- Hvis du planlegger å ta opp fra samme dyr i en fremtidig økt, dekk til bildevinduet med benvoks eller silastikk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi utviklet disse metodene for å vurdere om unormale pericyttdrevne kapillære vasospasmer i hippocampus - som oppstår som følge av anfall - kan forårsake ærlig hypoksi som bidrar til celledød i iktalfokus 9,13.
Utviklingen av hodehetten og riktig installasjon ga høy stabilitet i opptakene, slik at samtidig registrering av EEG og blodstrøm dypt i hippocampus hos villtype og epileptiske våkne mus i både iktale og interiktale perioder. Fangst av blodstrømhendelser relatert til anfall krever registrering i lengre perioder, slik at aperiodiske blodstrømhendelser (som vasospasmer) kan fanges opp som respons på både induserte og naturlig forekommende epileptiske anfall. Fastholdelsessystemet tillot stabile blodstrømsregistreringer av dype hjernemikrokar og deres proksimale veggmalericeller over lange timer (figur 6A-R). Vi fant at i hele mikrofartøyer oppstod blodstrømstopp ved posisjonene til merkede veggmalericeller.
Vi lokaliserte pålitelig fartøy i hippocampus ved hjelp av en robotisk stereotaksisk enhet målrettet med interne koordinater fra et standard stereotaktisk atlas. Vi verifiserte kvaliteten på fiberopptakene ved å sammenligne dem med høyoppløselige to-foton bildeopptak av blodstrøm og ekvivalente vasospasmer fra kortikalt vev, på dybder som to-foton avbildning kan nå (figur 6S-AA). Vi verifiserte videre pCLE-resultatene ved hjelp av immunhistokjemi på opptakssteder, for å vise med tradisjonell konfokal mikroskopi at hippocampus-veggmalericeller ble målrettet riktig, og at de ikke bare var sammentrekkende, men også romlig forbundet med strikturer i mikrokar langt fra arterioler15 (figur 7).
De publiserte funnene med disse metodene viser faktisk unormale hippocampus kapillære vasospasmer drevet av anfall, samt korrelert celledød i Kv1.1 epileptiske muterte mus og kainate modell epileptiske mus 9,13. Disse resultatene indikerer en rolle for lokal iktal iskemi / hypoksi i celledød under anfall, på grunn av unormale vasospasmer, og bidrar til en voksende arbeidsgruppe som utvider de potensielle mekanismene for iktalcelledød.
Figur 1: Skjematisk fremstilling av det eksperimentelle designet. Vi registrerte EEG mens vi gjennomførte konfokalmikroskopi i hippocampuskapillærer hos både våkne epileptiske mus og WT-kullkamerater. Etter å ha injisert halevenen med fluorescein, brukte vi en ny preklinisk konfokal laserskanning endomikroskopi (pCLE), med et fibermål med en spissdiameter på 0,3 mm for å registrere kapillær blodstrømningsdynamikk dypt i hjernen. Gult indikerer økt blodgjennomstrømning, og rødt indikerer jevn eller redusert strømning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Protokoll for implantasjonskirurgi med hodelokk. A) Det bedøvede dyret ble plassert på en varmepute og plassert innenfor den stereotaktiske rammen (se figur 3B, punkt j) og festet med museørebøyler (figur 3A, punkt i) og kjeveholdermansjetter (figur 3A, punkt g,h), over en varmepute. B) Eksponering av kranialsuturene. C-D) Målinger av Bregma og Lambda. E) Visualisering av boresteder over dyrets skalle. De svarte punktene og firkanten indikerer vinduet over hippocampus som vil tillate pCLE-innsettingen. De to røde sirklene markerer innsettingsposisjonene for EEG-opptakstrådene. Den hvite prikken markerer innsettingspunktet til EEG-jordledningene. F) De fire svarte prikkene på hodeskallen markerer de fremtidige hjørnene av bildevinduets kraniotomi over hippocampus. Det egendefinerte justeringsstykket (figur 3A, punkt c) med hodestolpeimplantatene (figur 3A, punkt a) festet til den stereotaktiske mikrostasjonsposisjoneringen (figur 3A, punkt d). G-H) Ytterligere to prikker, en bakre (G) og en fremre (H) markerer den fremtidige plasseringen av ankerskruene (figur 3A, punkt b). I-J) To små skruer forankrer hodehetten til hodeskallen (figur 3A, punkt b). K) Cyanoakrylat og dental sement påføres ankerskruene fra panel I &; J. L) Bildevinduets kraniotomi over hippocampus, og de tre hullene til EEG-elektrodene, er boret. M) Bildekammeret er bygget (figur 3B, elementer i, m) ved å skulpturere en berm med ekstra tannsement for å omringe de tre EEG-hullene og bildevinduet. N) Overhead visning av den ferdige head-cap. O) Den gjenopprettede musen tilbake i buret etter implantasjonsoperasjonen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Materialer brukt i protokollen (spesifikke elementer oppregnet med små bokstaver). A) Materialer som brukes til å bygge hodehetten. (a) To M1,6 x 12 mm maskinskruer (hodestolpeimplantatene). (b) To små bolter for å feste hodehetten til skallen. (c) Et tilpasset L-formet justeringsstykke i rustfritt stål, med to hull 4 mm fra hverandre, som fester de to M1.6-skruene under operasjonen. (d) En standard microdrive montert på en stereotaksisk enhet holder element c. (e) En tilpasset monteringsstang med et (f) justeringsstykke som samsvarer med de to hullene fra punkt c. (g) En bitestang og (h) neseklemme for å stabilisere posisjonen til dyrets hode. B) Oppsett under opptakene. (i) Hodehetten festes til punkt f under den bedøvede implantasjonsoperasjonen. (j) En stereotaktisk ramme plasserer microdrive (element d). (l) En 21G kanyle er festet til microdrive (punkt d) og brukes til å bestemme posisjonene til Bregma og Lambda kraniale suturer. (m) En simulert hodehette er avbildet her, festet til punkt f, for å demonstrere plasseringen av musen i (n) det skumforede fastholdelsesrøret (mus ikke til stede). Element n former seg til formen på musens kropp. C) Instrumenter og forsyninger som trengs for å utføre operasjonen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Oppsett av opptaksøkt. A) Dyrets hode er fast. B) Plassering av EEG-opptakskablene. Hvite EEG-ledninger plasseres separat, i hver side av skallen. Røde EEG-ledninger er plassert sammen i det midterste bunnen (bakken) hullet. C) Den fiberoptiske bunten settes inn i målvinduet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: EEG-registreringer. A) Epidural EEG-opptak utføres med Physiotel F20-EET-sendere, samtidig med de fiberoptiske pCLE-opptakene i det våkne dyret. B) Plassering av de borede hullene for innsetting av ledningene for EEG-registreringer. De to røde ledningene går til de to hullene indikert med røde prikker. De to hvite ledningene settes sammen i hullet indikert med den hvite prikken. Den røde firkanten betegner målvinduet over dyrets hippocampus. Bokstaven 'B' på musens hodeskalle indikerer bregma. C) EEG-opptakstrådene er bøyd i en L-form for å forbedre elektrisk kontakt mellom skallen og dura-saken. D) Eksempler på EEG-opptak hos våkne mus. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Opptak av vasokonstriksjoner av veggmalericeller hos mus. A-R) In vivo fiberoptisk dual-band pCLE bilde av kapillær vasospasme (kar i grønt, merket med 2MD fluorescein-konjugert dextran) kolokalisert til veggmaleri celler (rød, merket via intravenøs vene hale injeksjon av Alexa Fluor 647) i våkne knockout mus under anfall (pil indikerer veggmaleri celle og tilhørende vasospasme). Se Video 1 og Video 2. S-W) In vivo to-foton skanning laser mikroskopi (TPLSM) stabel av kapillærkar (grønn) og veggmaleri celler (rød) av en vill type mus. Se video 3. X-Z) In vivo TPLSM av en veggmaleri-celle-lokalisert (rød) kapillær innsnevring av kainiske mus. Se video 4. AA) Kvantifisering av fartøyinnsnevring fra panel X-Z målt ved hvit linje. Vekter for paneler A-R = 5 μm; S-W = 25 μm; X-Z= 5 μm. Videoer ble spilt inn ved 11,7 Hz. Fra Leal-Campanario et al.8. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7 Immunhistokjemi i registrert hjerne. AB) Fartøy med forskjellige forstørrelser injisert med fluoresceindextran (grønn). DAPI-fargede cellekjerner i blått (hvite piler). Skalastang for A = 200 μm; skala bar for B = 100 μm. C) Ulike deler av hjernen injisert med fluorescein hvor en rød blodcelle (rød pil) er tydelig sett. Skala bar = 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Video 1: Vasospasme og veggmaleri celle blodstrøm registrert (11,7 Hz) i en KO hippocampus kapillær. Se bilder fra samme opptak i figur 6A-H. Klikk her for å laste ned denne videoen.
Video 2: Vasospasme, leukocyttblokkeringer, blodstrøm og veggmalericeller registrert i en WT hippocampus-kapillær (11,7 Hz). Se bilder fra samme opptak i figur 6I-R. Klikk her for å laste ned denne videoen.
Video 3: Ujevn blodstrøm i in vivo WT mus parietal cortex registrert med TPLSM. Se bilder fra samme opptak i figur 6S-W. Klikk her for å laste ned denne videoen.
Video 4: Freske celledrevet (rød) kapillær (grønn) innsnevring fra parietal cortex av beslagleggende kainisk dyr registrert med TPLSM. Se bilder fra samme opptak figur 6X-Z. Klikk her for å laste ned denne videoen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi utviklet et hodekappesikringssystem for samtidige elektrofysiologiske og fiberoptiske pCLE-eksperimenter i våkne mus, noe som reduserer potensiell responsforurensning på grunn av bedøvelsesmidler. Hodehetten og monteringsapparatet er enkle å konstruere og er gjenbrukbare for kroniske oppvåkningseksperimenter. Vi sjekket kvaliteten på opptakene opp mot gullstandarden for in vivo mikroskopisk blodstrømsavbildning, TPLSM.
Gode kirurgiske ferdigheter er nødvendig for å implementere protokollen vi beskriver her. Operasjonen må gjøres under aseptiske forhold og alltid under et operasjonsmikroskop, samtidig som du tar vare på å la dura materen være intakt når du borer vinduet over hippocampus. Kjennskap til den underliggende vaskulaturen er viktig, da kutting over et stort blodkar skaper risiko for uønsket blødning.
Plassering av dyret riktig i stereotaktisk justering sikrer at det fremre-bakre planet er i vater før du fester hodehetten. Denne beskyttelsen gjør det lettere å finne hjernesteder ved hjelp av et hjerneatlas.
Musebevegelser kan føre til skade på fartøy eller feilaktige opptak av vasospasmer (det vil si fiberbevegelse i stedet for ekte vasomotion), så det er viktig å redusere dyrs bevegelse under opptakene. Skumpolstring i fastholdelsesrøret bidrar til å forlenge varigheten av opptaksøktene samtidig som stress og bevegelse fra musen minimeres. Mus foretrekker å passe godt inn i skummet, slik at riktig tilpasning reduserer overdreven bevegelse. Uten denne forholdsregelen kan mus slite. Hvis musen viser tegn til kamp, bør opptaksøkten avsluttes. Opptakene kan gjenopptas neste dag, når fysiologiske stressreaksjoner har avtatt. I våre opptak var dyrene tydeligvis rolige mesteparten av tiden.
Vi bemerker at bevegelsen som mest negativt påvirker pCLE-avbildningsmetoden oppstår når sonden beveger seg differensielt til hjernevevet. Pust, anfall og bevegelse av dyret er irrelevant med mindre de fortrenger fibersonden i forhold til vevet. Det vil si at når bildesonden beveger seg differensielt til vevet, beveger hele bildefeltet seg som en enhet, noe som gjør bevegelsesartefakter tydelige. Derfor er det viktig å alltid registrere fra to eller flere fartøy om gangen: Hvis alle fartøyene beveger seg samtidig, kan det skyldes fiberstabilitet, mens hvis minst ett fartøy ikke endres, skyldes endringene som ses i andre fartøy sannsynligvis faktiske variasjoner i blodstrømmen, inkludert vasospasmer.
En begrensning ved pCLE-avbildningsmetoden sammenlignet med TPLSM er at fibersonden punkterer pia og dermed er invasiv for hjernen. Når sonden går ned, forårsaker den skade på nevralvevet den passerer gjennom. Dermed kan opptak fra samme fartøy på to påfølgende dager være svært vanskelig, selv når du bruker de samme eksakte koordinatene i begge øktene (og ofte bare mulig hvis den første opptaksøkten har kort varighet). Ved gjennomføring av kroniske opptaksstudier er det derfor kritisk å gjøre opptak på stadig større dyp i senere innspillinger.
Resultatene av blodstrømsforsøkene tyder på at eksitotoksisitet ikke er den eneste mekanistiske veien for iktalcelledød og hippocampus sklerose13. Funnet at kapillær blodstrømsbegrensning spiller en rolle i iktal nevrodegenerasjon baner vei for å utvide metodene beskrevet her til identifisering av mikroskopiske blodstrømningsendringer i hvilken som helst dybde av kroppen, og i hvilket som helst vev, for kliniske diagnostiske formål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Prosjektet ble finansiert av en forskningsinitiativpris fra American Epilepsy Society, og en pris fra Arizona Biomedical Research Commission til SLM, samt et utfordringsstipend fra Research to Prevent Blindness Inc. til Institutt for oftalmologi ved SUNY Downstate Health Sciences University, New York State Empire Innovation Program, og ytterligere tilskudd fra National Science Foundation (0726113, 0852636, &; 1523614), Barrow Neurological Foundation, fru Marian Rochelle, fru Grace Welton og Dignity Health SEED-priser, og ved føderale tilskudd fra National Science Foundation (0726113, 0852636, &; 1523614) og av National Institute of Health (Awards R01EY031971 AND R01CA258021), til SLM og SMC Dette arbeidet ble også støttet av kontoret til assisterende forsvarsminister for helsesaker under tildeling nr. W81XWH-15-1-0138, til SLM. L.-C. ble støttet av et José Castillejo-stipend fra det spanske utdanningsdepartementet. Vi takker O. Caballero og M. Ledo for deres tekniske råd og assistanse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.7 mm diameter burr | Fine Science Tools | 19007-07 | For Screws No. 19010-00 |
| 0.9 mm diameter burr | Fine Science Tools | 19007-09 | |
| ASEPTICO AEU-12C TORQUE PLUS | from Handpiece solution | AEU12C | |
| Bull dog serrifine clump | Fine Science Tools | 18050-28 | |
| CellVizio dual band | Mauna Kea Technologies | ||
| CellVizio single band | Mauna Kea Technologies | ||
| Confocal Microprobe 300 microns (Serie S) | Mauna Kea Technologies | ||
| Custom-made alignment piece | L-shaped (angled at 90 deg) and made of stainless steel with two holes drilled on it, with a 4 mm separation from center to center | ||
| Custom-made mounting bar | The long section piece of the mounting bar should be between 9.4 - 13mm. Fixed to this piece of the mounting bar, position a stainless-steel plate 1.5 cm long and 0.5 cm wide that has two holes drilled separated 4 mm from center to center, the same distance that the L-shaped alignment piece. | ||
| Cyanoacrylate adhesive-Super Glue | |||
| Dumont forceps #5 | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| DuraLay Inlay Resin – Standard Package | Reliance Dental Mfg Co. | 602-7395 (from patterson dental) | |
| Fillister Head, Slotted Drive, M1.6x0.35 Metric Coarse, 12mm Length Under Head, Machine Screw | MSC industrial direct co. | 2834117 | |
| Fine Point scissor | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Fluorescein 5% w/w lysine-fixable dextran (2MD) | Invitrogen, USA | D7137 | |
| Halsey smooth needle holder | Fine Science Tools | 12001-13 | |
| Kalt suture needle 3/8 curved | Fine Science Tools | 12050-03 | |
| lab standard stereotaxic, rat and mouse | Stoelting Co. 51704 | 51670 | |
| Methocel 2% | Omnivision GmbH | PZN: 04682367 | Eye ointment to prevent dryness. |
| Mouse Temperature controller, probe (YSI-451), small heating pad-TC-1000 Mouse | CWE Inc. | 08-13000 | |
| PhysioTel F20-EET transmitters | DSI | 270-0124-001 | |
| Robot Stereotaxic, Manipulator Arm, ADD-ON, 3 Axis, LEFT | Stoelting Co.C13 | 51704 | |
| Sel-Tapping bone screws | Fine Science Tools | 19010-10 | |
| Standard Ear Bars and Rubber Tips for Mouse Stereotaxic | Stoelting Co | 51648 | |
| Suture Thread - Braided Silk/Size 4/0 | Fine Science Tools | 18020-40 | |
| Tissue separating microspatula | Fine Science Tools | 10091-121 |
References
- Denk, W., et al. Anatomical and functional imaging of neurons using 2-photon laser scanning microscopy. Journal of Neuroscience Methods. 54 (2), 151-162 (1994).
- Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 15741-15746 (1998).
- Helmchen, F., Fee, M. S., Tank, D. W., Denk, W. A miniature head-mounted two-photon microscope. High-resolution brain imaging in freely moving animals. Neuron. 31, 903 (2001).
- Chaigneau, E., Oheim, M., Audinat, E., Charpak, S. Two-photon imaging of capillary blood flow in olfactory bulb glomeruli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 13081-13086 (2003).
- Larson, D. R., et al. Water-soluble quantum dots for multiphoton fluorescence imaging in vivo. Science. 300, 1434-1436 (2003).
- Hirase, H., Creso, J., Singleton, M., Bartho, P., Buzsaki, G. Two-photon imaging of brain pericytes in vivo using dextran-conjugated dyes. Glia. 46, 95-100 (2004).
- Hirase, H., Creso, J., Buzsaki, G. Capillary level imaging of local cerebral blood flow in bicuculline-induced epileptic foci. Neuroscience. 128, 209-216 (2004).
- Schaffer, C. B., et al. Two-photon imaging of cortical surface microvessels reveals a robust redistribution in blood flow after vascular occlusion. PLoS Biology. 4, 22 (2006).
- Leal-Campanario, R., et al. Abnormal Capillary Vasodynamics Contribute to Ictal Neurodegeneration in Epilepsy. Scientific Reports. 7, 43276 (2017).
- Peppiatt, C. M., Howarth, C., Mobbs, P., Attwell, D. Bidirectional control of CNS capillary diameter by pericytes. Nature. 443, 700-704 (2006).
- Yemisci, M., et al. Pericyte contraction induced by oxidative-nitrative stress impairs capillary reflow despite successful opening of an occluded cerebral artery. Nature Medicine. 15, 1031-1037 (2009).
- Fernandez-Klett, F., Offenhauser, N., Dirnagl, U., Priller, J., Lindauer, U. Pericytes in capillaries are contractile in vivo, but arterioles mediate functional hyperemia in the mouse brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 22290-22295 (2010).
- Leal-Campanario, R., Alarcon-Martinez, L., Martinez-Conde, S., Calhoun, M., Macknik, S. Blood Flow Analysis in Epilepsy Using a Novel Stereological Approach. Neurostereology: Unbiased Stereology of Neural Systems. Mouton, P. R. , John Wiley & Sons, Inc. Ames, USA. (2013).
- Smart, S. L., et al. Deletion of the K(V)1.1 potassium channel causes epilepsy in mice. Neuron. 20, 809-819 (1998).
- Zuberi, S. M., et al. A novel mutation in the human voltage-gated potassium channel gene (Kv1.1) associates with episodic ataxia type 1 and sometimes with partial epilepsy. Brain. 122, 817-825 (1999).
